BE1021451B1 - Inrichting voor in vitro fertilisatie - Google Patents

Abstract

Inrichting voor in vitro fertilisatie bestaande uit twee recipiënten voorzien van gasdichte rubberen stoppen in een thermostatische behuizing, daardoor gekenmerkt dat één recipiënt een mengsel bevat van natriumbicarbonaat en citroenzuur, en dat de andere recipiënt groeimedium voor embryo's bevat, en dat de gasfase van beide recipiënten met elkaar zijn verbonden door middel van een verbindingsbuis.

Description

Inrichting voor in vitro fertilisatie.

De huidige uitvinding heeft betrekking op een inrichting voor het uitvoeren van een in vitro fertilisatie.

Het gaat over een gesloten cultuursysteem waarbij zowel eicel als zaadcel onder optimale en stabiele atmosferische en pH voorwaarden aanleiding kunnen geven tot bevruchting in vitro en de ontwikkeling van een embryo voor terugplaatsing in de baarmoeder. Dit systeem vervangt de huidige dure en zeer complexe systemen om eenzelfde stabiele en optimale cultuuromgeving te creëren.

Het is bekend dat 8 tot 12 % van de koppels wereldwijd infertiel zijn. Waar deze conditie in de ontwikkelde landen in vele gevallen verholpen kan worden door een behandeling met geassisteerde reproductieve technologie (ART), is dit in de minder ontwikkelde landen dikwijls niet het geval wegens de te hoge kostprijs van een dergelijke behandeling.

In vitro fertilisatie (IVF) wordt in de ontwikkelde landen al gebruikt sinds 1978 en heeft inmiddels al geleid tot de geboorte van 3,5 miljoen kinderen. Toch blijft het belangrijkste probleem voor in vitro fertilisatie de hoge kost, ten gevolge van de dure infrastructuur van een IVF-laboratorium (laminar flow werktafels, microscopen, luchtzuiveringsinstallaties, materialen voor invriezen en opslag van eicellen, enz.), en van de dure wegwerpmaterialen en groeimedia. Dit alles leidt tot een kost voor de patiënt van meer dan 1.400,- € per cyclus in een land zoals België bijvoorbeeld.

De hoge kost is bijzonder spijtig voor de minder ontwikkelde landen omdat net in deze minder ontwikkelde landen de infertiliteit dikwijls het gevolg is van aandoeningen die maken dat alleen een behandeling met in vitro fertilisatie nog een uitweg kan bieden uit de infertiliteit.

Bovendien is ook net in de minder ontwikkelde landen het sociale stigma, verbonden aan infertiliteit, dikwijls zo groot dat het kan leiden tot isolatie, verlating door de omgeving of zelfs tot geweld zoals moord of zelfdoding bij de infertiele vrouw.

Om hieraan te verhelpen, werd het Arusha-projeet in het leven geroepen, dat zich onder andere toelegt op het verschaffen van een betaalbare infertiliteitsdiagnose en een toegankelijke infertiliteitsbehandeling, waarvan een vereenvoudigde in vitro fertilisatie de hoeksteen vormt (Ombelet et al. Facts, Views and Vision in Obgyn, 2010, 107-115) .

Een organisatie zonder winstgevend doel, The Walking Egg v.z.w., werd in het leven geroepen om deze doelstellingen te realiseren (N. Dhont in Facts, Views and Vision in ObGyn, 2011, 3(4):253-255).

De strategie van The Walking Egg werd toegelicht door W. Ombelet et al. in Facts, Views and Vision in ObGyn, 2012, 66-75, waarin methodes voor het organiseren van medische opleiding en training voor de ééndags-diagnostische fase worden beschreven voor het Walking Egg-proj eet.

Om de doelstellingen van het Arusha-projeet te halen, dient men onder meer te beschikken over een kostengunstige maar efficiënte laboratorium-omgeving.

De huidige uitvinding heeft tot doel voor de voornoemde en andere eisen een oplossing te bieden, doordat zij voorziet in een inrichting voor in vitro fertilisatie die toelaat een in vitro fertilisatie uit te voeren aan een lage kostprij s.

Hiertoe betreft de uitvinding een inrichting voor in vitro fertilisatie bestaande uit twee recipiënten, voorzien van gasdichte rubberen stoppen, daardoor gekenmerkt dat één recipiënt een mengsel bevat van natriumbicarbonaat en citroenzuur, en dat de andere recipiënt groeimedium voor embryo's bevat, en dat de gasfase van beide recipiënten met elkaar zijn verbonden door middel van een verbindingsbuis.

Het groeimedium voor embryo's bevat aminozuren, calciumcarbonaat, calciumchloride, magnesiumsulfaat, kaliumchloride en een variabele hoeveelheid koolzuur. Dergelijke groeimedia zijn commercieel verkrijgbaar.

Een voordeel van deze inrichting is dat ze toelaat een in vitro fertilisatie van menselijke eicellen met menselijke zaadcellen uit te voeren in een groeimedium met een strict gecontroleerde pH tussen 7,25 en 7,35.

Nog een voordeel van deze inrichting is dat ze zeer goedkoop is, gemakkelijk te verplaatsen is en onafhankelijk van de aanwezigheid van medische gassen kan worden aangewend,

Nog een voordeel van deze inrichting is dat de recipiënt met de chemicaliën natriumbicarbonaat en citroenzuur in droge toestand op voorhand bereid kan worden en lang kan bewaard worden.

Bij voorkeur bestaan de recipiënten uit twee proefbuizen uit een transparant materiaal zoals glas of een transparante kunststof.

Een voordeel van een transparant materiaal voor de proefbuizen is dat de proefbuizen dan van buiten uit gecontroleerd kunnen worden, en dat de vorming van het embryo doorheen de transparante wand kan worden waargenomen en geëvalueerd, en dit zonder de proefbuis te openen.

Het volstaat de inhoud van de proefbuis via een optische vergroting door middel van een microscoop of lens van een vergrootglas of een beeldcamera te onderzoeken.

Bij voorkeur bestaat het mengsel van natriumbicarbonaat en citroenzuur uit een verhouding van 75 gewichts% natriumbicarbonaat tot 25 gewichts% citroenzuur, bijvoorbeeld uit 30 mg natriumbicarbonaat en 10 mg citroenzuur.

Een eerste voordeel van een dergelijk mengsel is dat het bestaat uit goedkope chemicaliën, en dat een proefbuis gevuld met het mengsel in droge toestand lange tijd kan worden opgeslagen zonder zijn eigenschappen te verliezen.

Nog een voordeel is dat het mengsel door het toedienen van een kleine hoeveelheid water, bijvoorbeeld 3 ml steriel water, reageert met vorming van koolzuurgas (C02), dat in contact met de gasfase van de tweede reageerbuis, ervoor zorgt dat de pH van het groeimedium voor embryo' s in de tweede reageerbuis binnen zeer enge grenzen (7,25-7,35) gehouden wordt.

Een bijkomend voordeel van deze inrichting volgens de uitvinding is dat zij blootstelling aan de omgevingslucht minimaliseert, waar het bekend is dat de kwaliteit van de omgevingslucht de resultaten van een in vitro fertilisatie nadelig kan beïnvloeden.

Bij voorkeur bestaat het groeimedium voor embryo's uit een eenvoudig commercieel groeimedium op basis van een gebalanceerde zoutoplossing aangevuld met 5% menselijk serum albumine (HSA).

Een voordeel van dit groeimedium is dat het goedkoop is en dat zijn samenstelling bewezen heeft geschikt te zijn voor het opgroeien van bevruchte eicellen.

Bij voorkeur bestaat de thermostatische behuizing uit een doos met een houder voor de recipiënten, voorzien van een verwarmelement, dat op een temperatuur van 36,5 tot 37,5 °C wordt gehouden.

Een voordeel van een dergelijke behuizing met een verwarmelement, is dat de recipiënten bij de fertilisatie en het opgroeien van het embryo op een constante temperatuur tussen 36,5 en 37,5 °C worden gehouden, hetgeen de normale lichaamstemperatuur is van de baarmoeder.

Bij voorkeur kunnen de gasdichte rubberstoppen geperforeerd worden met een holle naald zonder delen van de rubberstop los te maken.

Een voordeel van de perforatie van de rubberstoppen met een holle naald is dat een vloeistof kan worden toegevoegd aan de eerste proefbuis, zonder lucht of andere gassen aan de proefbuis toe te voegen.

Nog een voordeel van de perforatie van de rubberstoppen is dat ze de rubberen stop van de proefbuis kan doorboren zonder hiervan delen los te maken, die de inhoud van de proefbuis zouden verontreinigen. Na injectie sluit de perforatie van de rubberen stop zich weer, zodat de gasfase in de proefbuis afgesloten blijft van de atmosfeer buiten de proefbuis.

Bij voorkeur kunnen de gasdichte rubberstoppen geperforeerd worden met een holle naald, waar doorheen één te fertiliseren menselijke eicel kan geïntroduceerd worden en waar doorheen ook menselijke zaadcellen kunnen geïntroduceerd worden. Na een gepaste incubatietijd kan het gevormde embryo opgezogen worden door een zelfde holle naald gekoppeld met een injectiespuit.

Een voordeel van een dergelijke holle naald doorheen de rubberen stop, is dat de naald in de proefbuis bewogen kan worden, zonder de gasfase in de proefbuis te verstoren.

Bij voorkeur bestaat de gasdichte verbindingsbuis uit een flexibele kunststofbuis die aan beide uiteinden door middel van een gasdichte schroefkoppeling verbonden is met een holle naald die doorheen de rubberen stoppen van beide recipiënten gestoken kan worden om de gasfase van beide proefbuizen met elkaar te verbinden.

Een voordeel van een dergelijke verbindingsbuis is dat de koolzuurhoudende gasfase van de eerste proefbuis doordringt tot boven de inhoud van de tweede proefbuis, zodat de pH van het groeimedium voor embryo's in de tweede proefbuis binnen zeer enge grenzen op de juiste pH (7,25-7,35) gehouden worden ingevolge de uitwisseling van het koolzuurgas met de oplossing in de tweede proefbuis.

Bij voorkeur wordt de inrichting voor in vitro fertilisatie in een stabiele omgeving van 31° Celsius opgeborgen. Voor de manipulaties zoals eicel identificatie, inseminatie en embryo transfer bestaat er een specifieke broedinrichting waarin door middel van gasdichte handschoenen van buitenuit gewerkt kan worden in isotherme en steriele omstandigheden.

Een broedinrichting zoals deze die gebruikt wordt voor het behandelen van prematuren, biedt voldoende ruimte om de bewerkingen voor in vitro fertilisatie uit te voeren en is reeds voorzien van de nodige hulpmiddelen om in steriele voorwaarden te kunnen werken.

Een voordeel van een dergelijke broedinrichting is dat ze klein is en geen laboratorium vereist om gebruikt te kunnen worden, wat de kosten voor de in vitro fertilisatie beperkt.

Nog een voordeel van een dergelijke broedinrichting is dat ze door de kleine afmetingen mobiel is en gemakkelijk getransporteerd kan worden naar plaatsen die zich op afstand van het in-vitro fertilisatie laboratorium bevinden.

Met het inzicht de kenmerken van de uitvinding beter aan te tonen, is hierna, als voorbeeld zonder enig beperkend karakter, een voorkeurdragende uitvoeringsvorm beschreven van een inrichting voor in vitro fertilisatie volgens de uitvinding, met verwijzing naar de bijgaande tekeningen, waarin :

Figuur 1 schematisch en in zijaanzicht een inrichting voor in vitro fertilisatie volgens de uitvinding weergeeft; figuur 2 schematisch en in perspectief de inrichting van figuur 1 weergeeft geplaatst in een ge-thermostatiseerde doos; figuur 3 schematisch en in perspectief figuur 2 weergeeft, geplaatst in een broedinrichting; figuren 4 tot 7 schematisch opeenvolgende stappen in de in vitro fertilisatie weergeeft; figuur 8 schematisch een embryo weergeeft verkregen door in vitro fertilisatie in de inrichting volgens de uitvinding en dit in het blastomeer stadium.

In figuur 1 is schematisch de inrichting voor in vitro fertilisatie 1 volgens de uitvinding weergegeven, bestaande uit twee recipiënten 2, 3 elk afgesloten met een gasdichte rubberen stop 4, 4', waarvan één recipiënt 2 een mengsel 5 bevat van natriumbicarbonaat en citroenzuur, en de andere recipiënt 3 groeimedium 6 voor embryo's bevat, en waarbij de gasfase 7, 7' van beide recipiënten met elkaar zijn verbonden door middel van een flexibele verbindingsbuis 8 die aan beide uiteinden door middel van een gasdichte schroefkoppeling 9, 9' verbonden is met een holle naald 10, 10' die doorheen de rubberen stoppen 4, 4' van beide recipiënten 2, 3 gestoken is.

Zoals in figuur 2 is weergegeven, wordt de inrichting voor in vitro fertilisatie 1 geplaatst in een houder 11 die op een constante temperatuur wordt gehouden door een voedingsbron 12, en die bovendien is geplaatst in een doos 13 die gethermostatiseerd blijft.

Figuur 3 geeft weer hoe de inrichting 1 voor in vitro fertilisatie geplaatst is in een houder en in zijn gethermostatiseerde doos, die vervolgens geplaatst wordt in een broedinrichting 14, die uitgerust is met gasdichte handschoenen 15, voor het uitvoeren van bewerkingen in de broedinrichting 14 onder steriele en thermostatische condities.

De figuren 4 tot 7 geven opeenvolgende stappen weer in het gebruik van de inrichting 1 voor · in vitro fertilisatie volgens de uitvinding.

In figuur 4 wordt de eerste stap weergegeven, bestaande uit het toevoeren van water aan het droge mengsel van natriumbicarbonaat/citroenzuur door middel van een injectiespuit 16, waarvan de holle naald 17 doorheen de rubberen stop 4 van de eerste recipiënt 2 wordt gestoken.

In een volgende stap, voorgesteld in figuur 5, wordt de gasdichte rubberstop 4' van de tweede recipiënt 3 geperforeerd met een holle naald 18 van een injectiespuit 16, waar doorheen één te fertiliseren menselijke eicel 20 in het groeimedium 6 voor embryo's wordt geïnjecteerd.

In een daaropvolgende stap, voorgesteld in figuur 6, wordt opnieuw een holle naald 18 van een injectiespuit, doorheen de gasdichte rubberstop 4' van de tweede recipiënt 3 gestoken, ditmaal voor het introduceren van zaadcellen 21, waarna de fertilisatie in vitro kan plaatsvinden.

Tenslotte worden in een verdere stap, voorgesteld in figuur 7, één embryo uit het groeimedium 6 opgezogen na de nodige incubatietijd door middel van een holle naald 18 van een injectiespuit die gestoken werd doorheen de gasdichte rubberstop 4' van de tweede recipiënt 3.

De werking van de inrichting 1 voor in vitro fertilisatie kan als volgt worden toegelicht.

De eerste recipiënt 2 wordt gevuld met 30 g natriumbicarbonaat en 10 mg citroenzuur in droge toestand. Aan dit mengsel wordt 3 ml steriel water toegevoegd door middel van een injectiespuit 16 waarvan de holle naald 17 doorheen de rubberen stop 4 van de eerste recipiënt 2 wordt gestoken waarna het water wordt ingespoten bij het mengsel dat vervolgens gedurende 5 tot 10 seconden krachtig geschud wordt, en waarna de eerste recipiënt 2 met de tweede recipiënt 3 wordt verbonden door middel van de flexibele verbindingsbuis 8.

De chemische reactie van het mengsel met water stelt koolzuurgas (C02) vrij in de gasfase van de eerste recipiënt 2, dat doorheen de verbindingsbuis 8 naar de gasfase van de tweede recipiënt wordt geleid en daardoor de pH in het groeimedium op de optimale waarde tussen 7,25 en 7,35 brengt bij de temperatuur van 36,5 tot 37,5 °C van de houder die op deze temperatuur wordt gehouden.

De recipiënten bestaan in deze uitvoeringsvorm uit glazen of kunststof testbuizen met een diameter van 150 mm en een lengte van 980 mm.

De holle metalen naalden die op beide uiteinden van de verbindingsbuis 8 zijn geschroefd, hebben een diameter van 1,1 mm, zijn 360 mm lang en steken met een lengte van 260 mm doorheen de rubberen stoppen 4, 4'. De verbindingsbuis 8 uit Nalgene zelf heeft een totale lengte van 110 mm en een inwendige diameter van 50 mm.

Om de tijd die nodig is om de pH van het groeimedium op de optimale waarde van 7,25 tot 7,35 te kennen wordt de pH gemeten in functie van de tijd. Deze tijd voor een 30+10 mg bicarbonaat/citroenzuur mengsel bedraagt voor het gebruikte groeimedium ongeveer 17 uren en blijft stabiel tot minimum 22 uren reactietijd.

Aangezien de recipiënt 3 na het verwijderen van de naald 10' en de verbindingsbuis 8 gesloten blijft, blijven de gasfase en de pH van het groeimedium voor langere tijd stabiel, hetgeen toelaat groeimedium voor in vitro fertilisaties op voorhand te bereiden en gekoeld op te slaan in de recipiënt 3 in de vorm van afgesloten proefbuizen tot een in vitro fertilisatie gestart wordt.

De eigenlijke fertilisatie wordt gestart door één eicel uit gepreleveerde oocyte-cumulus complexen van eicellen in een proefbuis met groeimedium te injecteren dat in evenwicht is, en dit door middel van een holle naald 18 van een injectiespuit die doorheen de rubberen stop 4' van de proefbuis met groeimedium wordt gestoken. De holle naald is dun genoeg om de gasfase boven het groeimedium niet te verstoren, en de rubberen stop sluit zich weer nadat de holle naald eruit is verwijderd.

Hierna volgt de inseminatie-stap waarbij sperma standaard bereid wordt door een gradiënt centrifugatie gevolgd door een was-stap. De typische concentratie voor normaal sperma is 1000 bewegende spermatozoïden in 10 tot 15 μΐ cultuurmedium.

Ongeveer 5 tot 10 internationale eenheden (IU) hyaluronidase kunnen toegevoegd worden aan het sperma in de inseminatie-oplossing. Het hyaluronidase kan chromatografisch gezuiverd, gedialyseerd en gelyofiliseerd hyaluronidase zijn. De toevoeging van hyaluronidase kan de navolgende controle voor bevruchting vergemakkelijken door het bevorderen van de spontane dispersie van cellen in de cumulus oophorus en de verdringing van corona-cellen uit de zona pellucida.

Daarna wordt door middel van een injectiespuit met holle naald een volume zaadcellen toegevoegd aan het groeimedium, equivalent met ten minste 1.000 goed bewegende zaadcellen van normale morfologie.

De geïnsemineerde proefbuis wordt geïncubeerd bij 37 °C in een bij voorkeur draagbare incubator.

De fertilisatie wordt gecontroleerd binnen 17 tot 20 uren na de inseminatie wanneer de pronucleï nog aanwezig zijn en dit door de proefbuis in een horizontale positie te houden en doorheen het glas de embryo's te bekijken met een vergrotende optiek.

Het toevoegen van hyaluronidase bij de inseminatie bevordert de visualisering van het ooplasma om het optreden van een mono- of dispersmische penetratie op te sporen.

Een eerste inspectie na fertilisatie is de pronucleaire check, waarbij alleen een embryo dat twee pronucleï vertoont hetgeen op een normale fertilisatie wijst, wordt overgebracht naar een nieuwe proefbuis, ditmaal met een ander groeimedium zijnde Global 'let the embryo choose' medium, op basis van een gebalanceerde zoutoplossing aangevuld met 5 % menselijk serum albumine (HSA).

Het IVF systeem volgens de uitvinding is ontworpen om dezelfde proefbuis te gebruiken vanaf het inbrengen van de eicel tot de embryo overdracht, zonder het embryo intussen uit de proefbuis te moeten nemen.

Het embryo met twee pronucleï wordt individueel gegroeid tot de dag van overdracht. De kwaliteit van het embryo wordt op gestelde tijden gecontroleerd door inspectie doorheen de glazen testbuis waarbij de celdelingsstadia gevolgd worden door de horizontaal geplaatste proefbuis te onderzoeken met ofwel een dissectiemicroscoop of een geïnverteerde microscoop met objectieven met een lange werkingsafstand.

De stadia en de morfologie van het embryo kunnen gedocumenteerd worden door een fotografische camera of video camera.

Een voorbeeld van een embryo 23 bestaande uit acht cellen, zoals gefotografeerd doorheen de glazen wand van de testbuis, is schematisch in figuur 8 voorgesteld.

Overblijvende embryo's kunnen worden ingevroren en desgevallend worden ontdooid voor een overdracht in een latere cyclus.

Voor de overdracht van het embryo naar de draagmoeder, wordt het embryo uit de proefbuis opgezogen door middel van een holle naald met een injectiespuit voor overdracht naar een katheter op de conventionele manier ofwel door het rechtstreeks opzuigen van het embryo uit de proefbuis in de katheter die door een afgeschuinde holle naald in de proefbuis wordt geschoven, waarbij 5 tot 10 μΐ medium opgezogen wordt voor de embryo overdracht naar de baarmoeder.

De huidige uitvinding is geenszins beperkt tot de als voorbeeld beschreven en in de figuren weergegeven uitvoeringsvorm, doch een inrichting voor in vitro fertilisatie volgens de uitvinding kan in allerlei vormen en afmetingen worden verwezenlijkt zonder buiten het kader van de uitvinding te treden.

Uit recente experimentele gegevens uit het laboratorium van de aanvrager blijkt dat deze vereenvoudigde inrichting voor in vitro fertilisatie volgens de uitvinding vergelijkbare slaagpercentages kent in vergelijking met het meer ingewikkelde reguliere cultuursysteem dat in de ontwikkelde landen toegepast wordt en dit voor een beduidend lagere kost.

Claims (10)

1. Conclusies .

   1. - Inrichting voor in vitro fertilisatie bestaande uit twee recipiënten voorzien van gasdichte rubberen stoppen in een thermostatische behuizing, daardoor gekenmerkt dat één recipiënt een mengsel bevat van natriumbicarbonaat en citroenzuur, en dat de andere recipiënt groeimedium voor embryo's bevat, en dat de gasfase van beide recipiënten met elkaar zijn verbonden door middel van een verbindingsbuis.
2. 2. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat de recipiënten proefbuizen zijn.
3. 3. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat de recipiënten bestaan uit een transparant materiaal zoals glas of een transparante kunststof.
4. 4. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat het mengsel van natriumbicarbonaat en citroenzuur bestaat uit een verhouding van 75 gewichts% natriumbicarbonaat tot 25 gewichts% citroenzuur.
5. 5. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat het groeimedium voor embryo's bestaat uit aminozuren, calciumcarbonaat, calciumchloride, magnesiumsulfaat, kaliumchloride en een variabele hoeveelheid koolzuur, optioneel aangevuld met 5 % menselijk serum albumine (HSA).
6. 6. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat de thermostatische behuizing bestaat uit een doos met een houder voor de recipiënten, voorzien van een verwarmelement, dat op een temperatuur van 36,5 tot 37,5 °C wordt gehouden.
7. 7. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat de gasdichte rubberstoppen kunnen worden geperforeerd met een holle naald zonder delen van de rubberstoppen los te maken.
8. 8. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat de gasdichte rubberstoppen kunnen worden geperforeerd met een holle naald van een injectiespuit voor het introduceren van één te fertiliseren menselijke eicel en van menselijke zaadcellen en na een gepaste incubatietijd voor het opzuigen van het gevormde embryo.
9. 9. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat de gasdichte verbindingsbuis bestaat uit een flexibele kunststofbuis die aan beide uiteinden door middel van een gasdichte schroefkoppeling verbonden is met een holle naald die doorheen de rubberen stoppen van beide recipiënten gestoken kan worden om de gasfase van beide recipiënten met elkaar te verbinden.
10. 10. - Inrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt dat ze in een broedinrichting wordt geplaatst waarin ze door middel van gasdichte handschoenen van buiten uit kan worden bediend in isotherme en steriele omstandigheden.