DE19714987C1 - Vorrichtung zur Isolation von Partikeln, insbesondere von Zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolation von Partikeln, insbesondere von Zellen, mit einer Kapillare zum Transport des oder der Partikel.

Bei Vorrichtungen zur Isolation von Partikeln, wie beispielsweise zur Isolation und Aufnahme von einzelnen Zellen klinischer Präparate, wird zunächst mittels der Mikrodissection die relevante Zelle freigestellt und anschließend mittels der Aspiration vom klinischen Präparat entfernt.

Zur Mikrodissection eignen sich vor allem feine Stahlkanülen (going et al., J. of Pathology, Vol. 179, S. 121-124 (1996)). Ein Transfer der freigestellten Zelle mit Stahlkanülen in ein Gefäß wird jedoch durch adhäsions- oder elektrostatische Kräfte behindert und es bedarf daher meist wiederholter, zeitraubender Versuche, um die Zelle an die Nadel zu heften. Beim Bewegen der Nadel vom Objektglas in die Nähe des Reaktionsgefäßes geht dann die Zelle häufig verloren und beim Einführen der Zelle in das Reaktionsgefäß stoßen oft elektrostatische Kräfte die Zelle von der Nadel. Auch zur Aspiration von Zellen eignen sich Stahlkanülen wegen der Dicke der Wandung, der Länge der Spitze sowie der Größe der Öffnung nicht.

Andererseits eignen sich Glaskapillaren sehr gut zur Aspiration mikrodissezierter Zellen (Kristjansson et al., Nature Genetics, Vol. 6, S. 19-23 (1994)). Wegen ihrer Zerbrechlichkeit eignen sie sich jedoch nur sehr beschränkt zur Mikrodissection. Das Einführen der Glaskapillare mit der aspirierten Zelle in ein Reaktionsgefäß zum Ausstoßen der Zelle führt häufig zum Verlust oder zu einer Kontamination der Zelle und ist sehr zeitaufwendig.

Außerdem ist der Umgang mit einer Nadel und einer Kapillaren, die jeweils von einem Mikromanipulator geführt werden unter dem Mikroskop sehr schwierig.

Aus diesem Grunde hat die molekulare Diagnostik, die nur eine einzelne Zelle benötigt, bisher nur geringe Verbreitung gefunden.

US-A-5,063,791 betrifft eine Vorrichtung zum Sammeln von Material, z. B. aus einer mikrobiologischen Kultur, mit einem Sammelfaden, der durch eine röhrenför­ mige Führung laufen kann, so daß eine Spitze des Fadens unten herausschaut.

US-A-4,619,899 betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, um Mikroeingriffe an Zellen vorzunehmen, wobei die Zellmembran mit einem Mikroinstrument durchbohrt wird.

Patent Abstracts of Japan, C-559, Vol. 13/No. 15, 13. Januar 1989 (JP-A-63-222 680) beschreibt eine Injektionsnadel zur schnellen Injektion von Chemikalien in ein zu behandelndes Objekt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine gattungsgemäße Vorrichtung zu entwickeln, die den Zeitaufwand zur Zellgewinnung verkürzt und einfach hand­ zuhaben ist.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 gelöst. Vor­ teilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe insbesondere mit einer gattungsgemäßen Vorrichtung gelöst, bei der um die Kapillare eine Kanüle angeordnet ist, in der die Kapillare längs ihrer Längsachse verschiebbar ist.

Die Führung der Kapillare in einer Kanüle bringt den Vorteil, daß die Kanüle in einem festeren Werkstoff ausgeführt sein kann und der Mikrodissection dient. In der Kanüle ist die feine Kapillare geschützt geführt und kann zum einen ebenfalls zur Mikrodissection genutzt werden oder diese unterstützen und zum anderen dient die Kapillare der Aufnahme des Partikels bzw. der Zelle.

Die Verschiebbarkeit der Kapillare in der Kanüle ermöglicht es, bei zurückgezoge­ ner Kapillare die Kanüle ausschließlich zur Mikrodissection zu verwenden. Die nach vorne herausgefahrene Kapillare kann ebenfalls zur Mikrodissection einge­ setzt werden. Sie dient jedoch vor allem der Aspiration des Partikels.

Die beschriebene Kombination aus Kapillare und Kanüle verbindet somit Mikro­ dissectionsnadel und Aspirationskapillare und erlaubt es, mit einer einzigen Vorrichtung beide Arbeitsschritte durchzuführen.

Vorteilhaft ist es, wenn die Kapillare in der Kanüle um ihre Längsachse verdreh­ bar ist. Damit kann die oft unregelmäßige Öffnung der Kapillare so an eine dissezierte Zelle plaziert werden, daß deren Aspiration in die Kapillare mühelos gelingt.

Obwohl für Kapillare und Kanüle unterschiedlichste Werkstoffe in Frage kom­ men, hat sich in der Praxis die Herstellung der Kapillare aus Glas und die der Kanüle aus Metall besonders bewährt. Die extrem feine Glaskapillare wird dabei durch die härtere Metallkanüle mit ihrem größeren Durchmesser geschützt. Zur Erleichterung der Dissection weist die Metallkanüle ein vorderes Ende mit einer Spitze auf.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn ein Ende der Kapillare direkt in ein im wesent­ lichen geschlossenes Gefäß mündet. Dies erlaubt es, die Zelle oder ein beliebiges Partikel nach der Aufnahme in die Kapillare in der Kapillare weiter bis zum Aufnahmegefäß zu fördern.

Ein Ausführungsbeispiel sieht vor, daß das geschlossene Gefäß ein Deckel­ element mit einer kapillaren Öffnung und einer Pneumatiköffnung aufweist. Die kapillare Öffnung dient dem Einführen der Kapillare in das Gefäß und die Pneu­ matiköffnung der Erzeugung eines Unterdrucks im Gefäß, durch den das Partikel mit einem Flüssigkeitstropfen in das Gefäß hineingesaugt werden kann.

Alternativ kann es wünschenswert erscheinen, die freigestellte Zelle nur in den distalsten Abschnitt der Kapillare aufzunehmen, um diese dann unter Kontrolle des Mikroskopes in ein Reaktionsgefäß auszustoßen. Nachteilen wie Möglichkeit des Verlustes oder Kontamination der Zelle stehen Vorteile wie die Möglichkeit der Verminderung der Kontamination durch gelöste Bestandteile durch Minimie­ rung der Mitaufnahme von Flüssigkeit in die Kapillare sowie der mikroskopischen Kontrolle des Transfers der Zelle in das Reaktionsgefäß gegenüber.

Eine einfache Bedienung der Vorrichtung wird mit einem Manipulator erreicht, der die Kanüle hält, wobei die Kapillare am gleichen Manipulator längs der Längsachse verschiebbar angeordnet ist. Dies ermöglicht es, mit einem einzigen Manipulator Kapillare und Kanüle zu führen. Beispielsweise mittels einer Rädel­ schraube und eines Gewindes ist an diesem Manipulator die Kapillare relativ zur Kanüle axial verschiebbar, um die Kapillare aus der Kanüle heraus zum dissezier­ ten Objekt zu bewegen.

Dieser Manipulator ist vorteilhafterweise so ausgebildet, daß die Kanüle und die Kapillare gemeinsam mittels des Manipulators um eine Achse schwenkbar angeordnet sind. Dies erlaubt es, Kapillare und Kanüle einfach und schnell in das Gesichtsfeld eines Mikroskops zu führen und aus dem Gesichtsfeld wieder zu entfernen.

Ein einfacher Aufbau des Mikromanipulators wird dadurch erreicht, daß die Achse, um die Kanüle und Kapillare schwenkbar angeordnet sind, im wesentli­ chen senkrecht angeordnet ist.

Die Bedienung des Manipulators wird durch eine Positioniereinrichtung wesent­ lich erleichtert, die eine punktgenaue Positionierung im Gesichtsfeld und Focus eines Mikroskops oberhalb eines Objekts ermöglicht. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Positioniereinrichtung eine Rasteinrichtung aufweist, die so eingestellt werden kann, daß sie eine einfache, schnelle Grobeinstellung der gesamten Vorrichtung erlaubt.

Ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie der Umgang mit dieser Vorrichtung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.

Es zeigt,

Fig. 1 eine perspektivische Darstellung eines Aufnahmegefäßes mit Kapil­ lare und Kanüle,

Fig. 2 eine perspektivische Darstellung eines Mikromanipulators mit Auf­ nahmegefäß, Kapillare und Kanüle und

Fig. 3 schematisch in 3 Schritten den Umgang mit der erfindungsgemä­ ßen Vorrichtung (1. Ausführungsform)

Fig. 4 schematisch in 3 Schritten den Umgang mit der erfindungsgemä­ ßen Vorrichtung (2. Ausführungsform).

In Fig. 1 ist die Vorrichtung 1 ohne Manipulator 2 (vgl. Fig. 2) gezeigt. Sie besteht aus der Glaskapillare 3, die in einer Stahlkanüle 4 geführt ist und mit ihrem einen Ende 5 in ein Gefäß 6 hineinreicht. Das Gefäß 6 ist im wesentlichen verschlossen und hat nur eine Kapillarenöffnung 7, durch die die Kapillare ins Gefäß geführt ist, und eine Pneumatiköffnung 8, durch die ein Winkelrohr oder ein Schlauch 9 am Gefäß anschließbar ist.

Kapillarenöffnung 7 und Pneumatiköffnung 8 sind in einem Deckelelement 10 angeordnet, das mit einem Hohlkörperteil 11 gasdicht verbindbar ist. Am Hohl­ körperteil 11 ist ein Abschlußdeckel 12 vorgesehen, der so auf das Deckelteil 10 aufsetzbar ist, daß er die Kapillarenöffnung 7 und die Pneumatiköffnung 8 abdeckt.

Während die Kapillare 3 weit in das Hohlkörperteil 11 des Gefäßes 6 eingeführt ist, endet das im Gefäß 6 befindliche Ende 13 des Schlauches 9 im oberen Bereich des Gefäßes 11, d. h. in der Nähe des Deckelelementes 10.

Die Kanüle 4 weist ein vorderes Ende 14 auf und an ihrem entgegengesetzten Ende 16 ist ein durchbohrter Plastikstopfen 17 befestigt, in dem die Kapillare 3 verläuft.

Die in Fig. 1 gezeigten Vorrichtungsteile werden in einem Mikromanipulator 2 - vgl. Fig. 2 - gehalten. Dieser Mikromanipulator 2 besteht im wesentlichen aus einem Fuß 18 an dem drehbeweglich ein Arm 19 befestigt ist. Der Fuß 18 ist an der Arbeitsplatte eines umgekehrten Mikroskops befestigt und hat eine senkrech­ te Achse 20, um die der mittels einer Rändelmutter an einer Scheibe 21 befe­ stigte Arm 19 drehbeweglich gelagert ist. Auf der Unterseite der Scheibe 21 ist vergrößert ein Dorn 22 dargestellt, der in eine Nut 23 einrastbar ist.

An dem Arm 19 ist der Plastikstopfen 17, an dem die Kanüle 4 befestigt ist, eingesteckt. Das als Zellfalle dienende Gefäß 6 mit der Kapillare 3 ist um die Längsachse 24 der Kapillare 3 drehbeweglich am Arm 19 befestigt. Um die Kapillare 3 um ihre Längsachse zu drehen, wird mit einer Rändelmutter 25 eine Gefäßhalterung 26 um die Achse 24 gedreht.

Darüberhinaus ist zwischen der Gefäßhalterung 26 und dem Arm 19 ein Fein­ trieb 27 angeordnet, der es erlaubt, mit einer Schraube 28 den Behälter 6 und damit die Kanüle 3 längs der Achse 24 zu verschieben.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Glaskapillare 3, die in der Praxis einen Außendurchmesser von 80 µm und einen Innendurch­ messer von 40 µm aufweist, zunächst so in der Stahlkanüle 4 angeordnet, daß sich ihr vorderes Ende 29 vollständig innerhalb der Kanüle 4 befindet. Die Kanüle 4 hat einen Innendurchmesser von etwa 150 µm. Ein kleines Flüssigkeitsvolumen 30 am vorderen Ende 29 der Glaskapillare 3 erleichtert das spätere Aufnehmen einer Zelle 31.

Mit der Spitze 14 der Stahlkanüle 4 kann nun unter einem umgekehrten Mikro­ skop effizient das von einem Tropfen Flüssigkeit bedeckte Präparat disseziert werden, während die empfindliche Glaskapillare 3 vollständig geschützt im Inneren der Kanüle 4 liegt (Fig. 3a).

Nach erfolgreicher Mikrodissection wird die Kapillare 3 mittels der Schraube 28 durch den Feintrieb 27 des Mikromanipulators so weit innerhalb der Kanüle 4 vorgeschoben bis das vordere Ende 29 der Glaskapillare 3 sich in der Nähe der gelösten Zelle oder der gelösten Zellen befindet. Gegebenenfalls wird die Glaska­ pillare 3 mittels der Rändelmutter 25 um ihre Längsachse 24 gedreht, so daß sich ihre Öffnung unmittelbar an der Zelle befindet (Fig. 3b). Durch Sog am Schlauch 9 des Gefäßes 6 wird die Zelle 31 in die Glaskapillare 3 aspiriert (Fig. 3c).

Alternativ dazu kann die Glaskapillare 3 auch schon initial ausgefahren werden, um mit ihr zu mikrodissezieren. Dies wird durch die stabile und schützende Führung in der Stahlkanüle 4 ermöglicht.

Wenn die Zelle 31 in die Kapillare 3 aufgenommen ist, wird die Kanüle mit Kapillare vom Präparat weggezogen und der Manipulatorarm 19 seitlich wegge­ schwenkt.

Das Gefäß ist über den Schlauch 9 mit einer manuellen Kolbenpumpe verbun­ den, durch die im Gefäß 6 ein Unterdruck erzeugbar ist, der einen Sog in Rich­ tung des Pfeiles 32 auf das Flüssigkeitsvolumen 30 mit der mobilisierten Zelle 31 ausübt. Dadurch wird die Zelle in der Glaskapillare 3 zum Gefäß 6 gefördert.

Alternativ dazu können die Kapillare 3 und das Gefäß 6 nach Abziehen der Kanüle in einer Tischzentrifuge mit 4.000 rpm zentrifugiert werden. Die Zelle befindet sich danach in Öl bedeckt am Boden des Reaktionsgefäßes 6. Das Gefäß 6 wird von dem Deckelelement 10 entfernt, mit dem Abschlußdeckel 12 verschlossen und der weiteren Verwendung zugeführt.

Um die Kanüle 4 und Kapillare 3 punktgenau unter einem Mikroskop zu führen, ist der Mikromanipulator 2 an der Arbeitsplatte eines umgekehrten Mikroskopes befestigt. Das leichte Verschwenken des Armes 19 um die Achse 20 erleichtert die Beschickung mit dem Gefäß 6, der Kapillare 3, und der Kanüle 4. Der Arre­ tiermechanismus 22, 23 ist so eingestellt, daß im eingerasteten Zustand sich die Spitze 14 der Kanüle 4 punktgenau im Gesichtsfeld etwas oberhalb des Objektes und im Focus befindet. Dadurch muß nicht bei jedem Einschwenken nach dem Beschicken oder dem Entleeren der Vorrichtung erneut die Spitze mühsam in das Gesichtsfeld und in den Focus gebracht werden.

Besonders praktisch für den täglichen Umgang mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es, wenn als Gefäß 6 handelsübliche Reaktionsgefäße aus Kunststoff verwendet werden, auf die eine Einheit aus Glaskapillare 3, Deckel­ element 10 und Schlauch 9 aufsetzbar ist. Diese Einheit kann gebrauchsfertig aus einer sterilen Verpackung auf das geöffnete Reaktionsgefäß aufgesteckt werden.

Um die freigestellte Zelle nur in den distalsten Abschnitt der Kapillare aufzuneh­ men, mündet die Glaskapillare in einen Pneumatikschlauch und ein Reaktions­ gefäßschieber ist am Mikromanipulatorarm angebracht (Fig. 4). Mit zurückgefah­ renem Reaktionsschieber wird ungehindert disseziert und aspiriert (Fig. 4a). Danach wird der Mikromanipulationsarm ausgeschwenkt, der Reaktionsgefäß­ schieber ausgefahren und ein Reaktionsgefäß eingeklemmt (Fig. 4b). Ohne daß die Kapillare und Kanüle berührt werden, kann nun der Reaktionsgefäßschieber mit Reaktionsgefäß zurückgeschoben und die Zelle nach Einschwenken des Manipulatorarmes unter mikroskopischer Kontrolle in das Reaktionsgefäß pneu­ matisch ausgestoßen werden (Fig. 4c).

Die Vorrichtung eignet sich vor allem bei der molekularen Diagnostik von Krebs­ erkrankungen und Erbkrankheiten auf der Grundlage von Zytologie- und Histolo­ giepräparaten. Sie macht die molekulare Diagnostik aus morphologischen Präpa­ raten auch für klinische Routinelabors praktikabel. Die exakte Befundermittlung spielt insbesondere deshalb eine wichtige Rolle, weil der morphologische Befund zu weitreichenden Konsequenzen für den Patienten, wie Operation, Chemo­ therapie oder Bestrahlung führt. Es sind daher zusätzliche, objektive Parameter zur Beurteilung histologischer und zytologischer Präparate notwendig. Als solche bietet sich die molekulare Analyse an. Für solche Analysen müssen Zellen aus einem histologischen oder zytologischen Präparat entfernt werden. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es nun möglich, das in den meisten Fällen nur aus wenigen Zellen bestehende Präparat nicht zu zerstören und trotzdem einer weitergehenden Analyse, z. B. mittels PCR, zugänglich machen zu können. Außerdem können mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung einzelne verdächtige Zellen abgetrennt werden, ohne daß es zu einer Kontamination mit gesunden Zellen kommt. Außerdem ist nun durch die Möglichkeit des Zurückgreifens auf Zytologie- oder Histologiepräparate ein breiteres Spektrum an Untersuchungema­ terial der molekularen Analyse zugänglich, da die molekulare Analyse eigentlich immer auf frische oder zumindest gefrorene Zellen zurückgreifen mußte. So können dank der erfindungsgemäßen Vorrichtung Zellen aus histologischen oder zytologischen Präparaten jetzt besser der molekularen Analyse zugänglich gemacht werden und Mutationen sicherer nachgewiesen werden.

Ein weiteres Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Gewinnung von fetalen Zellen (z. B. Erythroblasten) aus mütterlichen peripheren Blutausstrichen zum Zweck der nichtinvasiven Pränataldiagnostik. Außerdem ist die Vorrichtung nützlich zur Gewinnung von einzelnen Oozyten, Spermatiden, Blastozysten oder Embryozellen zur Präimplantationsdiagnostik bei der in-vitro- Fertilisation beim Menschen sowie im Rahmen der Tierzucht.

Claims (10)

1. Vorrichtung zur Isolation von Partikeln, insbesondere von Zellen (31), mit einer Kapillare (3) zum Transport des oder der Partikel, dadurch gekenn­ zeichnet, daß um die Kapillare (3) eine Kanüle (4) angeordnet ist, in der die Kapillare (3) längs ihrer Längsachse (24) verschiebbar ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare (3) in der Kanüle (4) um ihre Längsachse (24) verdrehbar ist.

3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Kapillare (3) aus Glas und die Kanüle (4) aus Metall hergestellt ist.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Ende (5) der Kapillare (3) in ein nahezu ge­ schlossenes Gefäß (6) mündet.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das geschlos­ sene Gefäß (6) ein Deckelelement (10) mit einer kapillaren Öffnung (7) und einer Pneumatiköffnung (8) aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Manipulator (2) die Kanüle (4) hält und die Kapillare (3) am gleichen Manipulator (2) längs ihrer Längsachse (24) verschiebbar angeordnet ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kanüle (3) und die Kapillare (4) gemeinsam mittels des Manipulators (2) um eine Achse (20) schwenkbar angeordnet sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Achse (20) senkrecht angeordnet ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Manipulator (2) eine Positioniereinrichtung aufweist, die eine punktgenaue Positionierung des vorderen Endes (29) der Kapillare (3) im Gesichtsfeld und Focus eines Mikroskops oberhalb eines Objekts ermög­ licht.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Positio­ nierungseinrichtung eine Rasteinrichtung (22, 23) aufweist.