DE4004198A1

DE4004198A1 - Geraet zum dosierten einfuehren einer substanz in eine anzahl von substraten

Info

Publication number: DE4004198A1
Application number: DE19904004198
Authority: DE
Inventors: Alison Dr Morrison; Juergen Huber
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1990-02-12
Filing date: 1990-02-12
Publication date: 1991-08-14

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gerät zum dosierten Einführen einer Substanz in vorgegebene Substrate.

In der biochemischen Forschung tritt häufig die Aufgabe auf, in eine vorgegebene Anzahl von Substraten jeweils eine dosierte Menge einer bestimmten Substanz einzuführen. Ein typisches Beispiel ist die Injektion von mRNA (Boten-Ribo nukleinsäure) in Oocyten (Eizellen). Dies wurde bisher mittels einer Kanüle in Form einer Glaskapillare von Hand durchgeführt. Solkhe Arbeiten sind zeitraubend, erfordern qualifiziertes Personal und sehr sorgfältiges Arbeiten.

Die in den Ansprüchen gekennzeichnete und im folgenden näher erläuterte Erfindung löst die Aufgabe, ein Gerät zum dosier ten Einführen einer Substanz in vorgegebene Substrate anzu geben, das selbsttätig, schnell und sehr exakt arbeitet.

Mit dem erfindungsgemäßen Gerät kann in jedes der auf einer Halterungsvorrichtung gelagerten Substrate eine exakt dosierte Substanzmenge eingeführt werden. Das Gerät arbeitet schnell und exakt. Es ist sehr flexibel.

Im folgenden wird ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Gerätes unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gerätes;

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Steuereinrichtung des Gerätes gemäß Fig. 1;

Fig. 3 eine Draufsicht auf eine Substrathalterungs vorrichtung des Gerätes gemäß Fig. 1 und 2, und

Fig. 4 eine weiter vergrößerte Schnittansicht in einer Ebene IV-IV der Fig. 3.

Das im folgenden beschriebene Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Gerätes dient dazu, in eine größere Anzahl von Oocyten jeweils eine dosierte, kleine Menge mRNA zu injizieren. Wie Fig. 1 zeigt, enthält das Gerät eine Halterungsvorrichtung 10 für die Oocyten, die anhand der Fig. 3 und 4 noch näher erläutert werden wird, ferner eine Positionierungsvorrichtung für die Halterungsvor richtung, die bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel aus einem motorgetriebenen Kreuztisch 12 besteht, eine Injek tionskanüle 14, einen Mikromanipulator 16 zur Bewegung der Injektionskanüle und ein nur teilweise dargestelltes Mikroskop 18, das zur Justierung und zur Beobachtung des Injektionsvorganges dient.

Wie Fig. 2 schematisch zeigt, ist die Kanüle 14 über ein erstes Magnetventil 20 mit einer Vakuumquelle 22, z. B. einer Vakuumpumpe mit Pufferbehälter, und über ein zweites Magnetventil 24 mit einer Druckgasquelle 26, insbesondere einer Stickstoff-Flasche verbunden.

Die Steuereinrichtung des Gerätes enthält eine Steuereinheit 28, insbesondere einen PC, die mit einer Eingabevorrichtung 30 verbunden ist und Signale zur Steuerung einer Antriebs vorrichtung 32 für den Kreuztisch 12, einer Antriebsvor richtung 34 für den Mikromanipulator 16 sowie der Magnet ventile 20 und 24 liefert. Die Eingabevorrichtung enthält einen Steuerhebel.

Die Halterungsvorrichtung 10, die durch den Kreuztisch in einer x-Richtung und einer y-Richtung verstellbar ist, enthält eine Wanne 36 aus PMMA oder einen anderen geeigneten Kunststoff, in der eine aus dem gleichen oder einem ähnli chen Material bestehende Lochplatte 38 angeordnet ist. Die Lochplatte 38 hat zwei Griffe 40 und weist eine Mehrzahl von Löchern 42 zur Aufnahme und Halterung jeweils einer Oocyte 44 (Fig. 4) auf. Die massiven Griffe 40 bestehen aus Metall und dienen zusätzlich zur Gewichtserhöhung um ein Schwimmen der Lochplatte in einer in der Wanne 36 enthalte nen Lösung zu verhindern. Auf dem einen, etwas verbreiterten Rand an der einen Schmalseite der Wanne 36 ist ein Behälter 46 für die zu injizierende Substanz, also hier mRNA, befes tigt. Der Behälter 46 besteht aus einem wärmesterilisier baren (autoklavierbaren) Material, wie einem Fluorkunststoff oder Polycarbonat.

Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel haben die beschriebenen Komponenten die folgenden Merkmale:

Die Wanne 36 ist etwa 80 × 40 mm groß.

Die Lochmaske hatte bei dem vorliegenden Beispiel 8 × 13 Löcher 42 mit einem Durchmesser von jeweils 1,1 mm.

Der Kreuztisch 10 hat einen Fahrweg von mindestens 80 × 40 mm sowie eine Schrittweite von 1/100 mm.

Die Injektionskanüle 14 hat als Spitze eine Glaskapillare 48 mit einem Spitzendurchmesser von 10 µm.

Der Mikromanipulator 16 ist mindestens zweiachsig, so daß die Glaskapillare 48 zuerst von oben auf die Oocyte 44 ge drückt werden kann, um eine Verdrehen der Oocyte zu ver hindern, wie in Fig. 4 durch einen Pfeil 50 und die ge strichelte Darstellung der Glaskapillare dargestellt ist. Anschließend erfolgt der Einstechvorgang durch axiales Verschieben der Glaskapillare 48, wie durch einen Pfeil 52 angedeutet ist.

Als Mikroskop 18 genügt eine Ausführung mit einer festen Vergrößerung von ca. 10-fach bis 15-fach. Besonders zweck mäßig ist eine schwenkbare Montierung, die ein genaues Positionieren der Kapillare in senkrechter Richtung und eine präzise Einstellung der Einstechtiefe aus einem Winkel von ca. 15° ermöglicht.

Der Mikromanipulator 16 hat eine Schrittweite von 300 nm, eine größere Schrittweite würde hier jedoch auch ausreichen.

Bei Beginn eines Injektionszyklus wird das Ventil 20 durch ein entsprechendes Signal von der Steuereinheit 28 geöffnet um eine größere Menge von Injektionsflüssigkeit, also mRNA, anzusaugen. Bei den anschließenden Injektionsvorgängen wird dann das Ventil 24 kurzzeitig geöffnet, um eine dosierte Menge der angesaugten Flüssigkeit zu injizieren, z. B. 50 nl pro Oocyte. Die derzeit verwendete Kapillare hat ein Auf nahmevermögen von ca. 30 µl, was für etwa 60 Injektionen ausreicht. Die Anordnung des Vorratsgefäßes 46 auf der Wanne 36 bzw. dem Kreuztisch hat den Vorteil, daß die Kanüle für mehrere Injektionen nachgefüllt werden kann, ohne daß eine Neujustierung des Gerätes erforderlich ist.

Durch geeignete Programmierung des PC lassen sich Anzahl und Ort der injizierten Substrate, sowie die injizierte Substanz menge nach Wunsch steuern. Im Progamm sind Funktionen zur Justierung der Kapillarenspitze, zur Bestimmung der Injektions- und Vakuumdauer, zur Steuerung von Einzel- und Reiheninjektionen gespeichert.

Das beschriebene Ausführungsbeispiel läßt sich selbstver ständlich in der verschiedensten Weise abwandeln ohne den Rahmen der Erfindung zu überschreiten. Das Gerät kann zur dosierten Injektion anderer Substanzen in andere Substrate als beschrieben dienen. Es können mehrere Substanzbehälter sowie Behälter für Reinigungsflüssigkeiten vorgesehen sein. Selbstverständlich sind die Abmessungen und Materialangaben ebenfalls nur Beispiele. Die Wanne 36 und/oder der bzw. die Substanzbehälter 46 und/oder die Lochplatte 38 können aus einem Stück eines sterilisierbaren Materials bestehen. An die Stelle des Mikroskops kann eine Videokamera mit geeig netem Objektivsystem verwendet werden oder das Mikroskop okular kann durch eine Videokamera ersetzt werden.

Claims

1. Gerät zum Einführen von jeweils einer dosierten Menge einer Substanz in eine Anzahl von Substraten (44), mit

a) einer Vorrichtung (10, 38) zum Haltern der einzelnen Substrate (44),
b) einer Injektionskanüle (14) zum Injizieren der Substanz in die Substrate,

gekennzeichnet durch

c) eine durch elektrische Signale steuerbare, motorge triebene Vorrichtung (12), zum Positionieren der Halte rungsvorrichtung (10, 38),
d) einen Manipulator (16) zur Bewegung der Injektionskanüle (14),
e) einer Vakuumquelle (22),
f) einer Druckmittelquelle (26),
g) einer Ventilanordnung (20, 24) zum Verbinden der Vakuum quelle (22) sowie der Druckmittelquelle (26) mit der In jektionskanüle (14), und
h) eine programmgesteuerte Steuereinrichtung (28) zur Steuerung der Positionierungsvorrichtung (12), des Mani pulators (16) sowie der Ventilanordnung (20, 24).

2. Gerät nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch mindestens einen Behälter (46) zur Aufnahme der Substanz, welcher zusammen mit der Halterungsvorrichtung (10, 38) durch die Positionierungsvorrichtung (12) positionierbar ist.

3. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (46) an der Substrathalterungsvorrichtung (10) angebracht ist.

4. Gerät nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (46) aus einem wärmesterilisierbaren Material besteht.

5. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Halterungsvorrichtung eine regelmä ßige Anordnung von Löchern (42) zur Aufnahme jeweils eines Substrats (44) aufweist.

6. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Halterungsvorrichtung (10) eine Wanne (36) sowie eine in die Wanne passende Platte (38) enthält, welche eine regelmäßige Anordnung von Löchern (42) zur Aufnahme jeweils eines Substrats (44) aufweist.

7. Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte (38) mit massiven Griffen (40) versehen ist, die der Platte ein solches Gewicht verleihen, daß sie in einer in der Wanne (36) enthaltenen Flüssigkeit nicht schwimmt.

8. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn zeichnet, daß der Manipulator (16) und die Steuereinrichtung (18) so ausgebildet sind, daß die Spitze (48) der Injek tionskanüle zuerst vertikal (50) und dann axial (52) beweg bar ist.

9. Gerät nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Positionierungsvorrichtung (12) einen Kreuztisch enthält.