DE2904644C3

DE2904644C3 - Vorrichtung zum Präparieren, insbesondere Markieren, von biologischen Proben

Info

Publication number: DE2904644C3
Application number: DE2904644A
Authority: DE
Inventors: Soeren Wilken Kopenhagen Rasmussen
Original assignee: LKB-PRODUKTER STOCKHOLM SE AB; LKB-PRODUKTER STOCKHOLM AB
Current assignee: Leica AG Austria
Priority date: 1978-02-10
Filing date: 1979-02-07
Publication date: 1981-06-11
Also published as: DE2904644B2; FR2417095A1; US4358470A; FR2417095B1; DE2904644A1; JPS6156772B2; JPS54118893A; SE7801564L; GB2014330B; GB2014330A

Description

— die Flüssigkeit über einen oberen Anschluß in die Kammer eingebracht wird, wenn die einzubringende Flüssigkeit eine höhere spezifische Dichte aufweist als die in der Kammer befindliche Flüssigkeit und

— die Flüssigkeit über einen unteren Anschluß in die Kammer eingebracht wird, wenn die einzubringende Flüssigkeit eine geringere spezifische DLbte aufweist als die in der Kammer befindliche Flüssigkeit

2. Vorrichtung zum Präparieren, insbesondere Markieren, beispielsweise durch Färben, von biologischen Proben, mit einer geschlossenen Kammer für die Proben, die an eine Druck erzeugende Einrichtung oder an einen 3ehälter für eine Flüssigkeit, insbesondere ein Präparierungsmittel anschließbar ist, zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die Druck erzeugende Einrichtung (14) als auch der Behälter (11 bzw. 12 bzw. 13) über ein Ventil (9) entweder an d»n oberen oder unteren Teil der Kammer (3,4) angeschlossen sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter (11 bzw. 12 bzw. 13) über ein mehrkanaliges Ventil (10) an das Ventil (9) anschließbar sind.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Behälter (11) eine Reinigungsflüssigkeit enthält und in der Weise an das mehrkanalige Ventil (10) anschließbar ist, daß das gesamte Ventil (10) von der Reinigungsflüssigkeit durchflossen ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Präparieren, insbesondere Markieren, z. B. durch Einfärben von biologischen Proben nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. 2.

Beim Markieren von biologischen Proben wird in herkömmlicher Weise ein Kontrastmittel in Teile einer biologischen Probe, die sich in einem Elektronenmikroskop befindet, eingebracht. Dieses Verfahren ist ein sogenanntes Doppelmarkierungsverfahren in Uranylacetat und Bleicitrat. Diese Markierung wird durchgeführt mit Hilfe von Tropfen der Markierung!* bzw. Farblösung in Petrischalen. Jeder Probenteil, der von einem Gitter getragen wird, wird getrennt markiert bzw. gefärbt. Dabei ist ein beträchtlicher Aufwand an manueller Tätigkeit notwendig, wenn große Serien von Probenteilen markiert werden sollen. Außerdem besteht die Gefahr der Beeinträchtigung durch Verunreinigungen, welche aus Verunreinigungen in der Luft oder verschiedenen Niederschlägen in der Markierungsbzw. Farblösung oder auf der Oberfläche der Tropfen herrühren (beispielsweise entsteht Bleicarbonat aus der Reaktion zwischen Bleicitrat und Kohlendioxid). Vermutlich ergeben sich die meisten Verunreinigungen an den Probenteilen, wenn diese auf den oberen Teil der Tropfen aufgebracht werden oder wenn die Probenteile durch die Oberfläche der Markierungs- bzw. Farblösung (während die Gitter durch die Farblösungen hindurchgeführt werden) hindurchgebracht werden. Eine weitere Quelle der Verunreinigung ergibt sich beim Transport

ι u der Gitter von den Tropfen zu einem Reinigungswasserbad. Während dieses Transportes wird die Markierungslösung, welche an den Probenteilen haftet, mit Luft in Berührung gebracht. Wenn der Transport zu langsam erfolgt, kann an der Oberflächenschicht eine Verdunstung entstehen, wobei Niederschläge in der Markierungslösung sich bilden, und/oder Reaktionen zwischen Kohlendioxid und Bleicitrat können zu Verunreinigungen der Probenteile führen. Diese Markierungs- bzw. Färbungsverfahren sind in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben:

Hayat, M. A.: Principles und techniques of electron microscopy. Biological applications. Band 1. Van Nostrand Reinhold compl, New York 1970, oder
Lewis, P. R, Knight, D. P.: Staining methods for ²' sectioned material. Practical methods in electron microscopy Eds. A. M. Glaubert North-Holland Publishing Comp. 1977.

Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung der

ίο eingangs genannten Art ist es aus der DE-OS 15 98 706 bekannt, zum Einfärben von biologischen Präparaten mit Hilfe einer Pumpe aufeinanderfolgend verschiedene Flüssigkeiten, die in entsprechenden Flüssigkeitsbehältern untergebracht sind, in eine geschlossene Kammer

)5 für die Proben über eine einzige Zuleitung einzubringen. Nach Ablauf einer bestimmten Verweilzeit wird die Einfärbungsflüssigkeit über die einzige Zuleitung wieder in den entsprechenden Farbflüssigkeitsbehälter zurückgebracht. Danach schließt sich ein Spülvorgang der Kammer an, wobei das Spülwasser ebenfalls über die einzige Zuleitung zugeführt und abgeführt wird. Erst nach Beendigung des Spülvorganges kann in der Kammer ein neuer Einfärbvorgang vorgenommen werden. Dieser Arbeitsablauf ist relativ aufwendig und

•Ti erfordert insbesondere dann, wenn eine große Anzahl von Markierungen bzw. Einfärbungen vorgenommen werden müssen, einen relativ hohen Zeitaufwand.

Aufgabe der Erfindung ist es demgegenüber, einen gleichförmigen und rüschen Wechsel der Flüssigkeiten,

V) die zum Markieren bzw. Einfärben dienen, in der Kammer zu ermöglichen.

Diese Aufgabe wird verfahrensgemäß durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs I angegebenen Merkmale und vorrichtungsgemäß durch die im

Yi kennzeichnenden Teil des Anspruchs 2 angegebenen Merkmale gelöst.

Die Unteransprüche 3 und 4 enthalten vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung.
Aus der FR· PS 14 03 182 ist es bei einer doppelwandigen Probenkammer bekannt, mit Hilfe einer oberen und unteren Zu- bzw, Ableitung ein Kühl- oder Wärmemittel zirkulierend in die Doppelwandung einzuleiten. An eine Verfahrensführung, wie sie bei der Erfindung stattfindet, ist dabei jedoch nicht gedacht.

h^r) Zusätzlich zu der erheblichen Zeitersparnis sind bei der Erfindung Verunreinigungsgefahren erheblich verringert.
Die Erfindung soll anhand der beiliegenden Zeich-

nung, die ein Ausführungsbeispiel darstellt, noch näher erläutert werden.

In der Figur sind Gitter 2 dargestellt, auf die die zu markierenden Proben in einer biegbaren Kunststoffplatte 1 mit 40 verschiedenen Schlitzen, in denen die Gitter befestigt werden, aufgebracht werden. Beim Aufbringen der Gitter auf die Platte I wird die Platte gebogen, so daß die Schlitze sich öffnen und die Gitter in die geöffneten Schlitze eingefügt werden können. Die Platte wird dann in die Ausgangsstellung zurückgebracht, wobei die Gitter festgelegt sind. Die Platte I wird dann in einer Markierungskammer bzw. Färbungskammer untergebracht, die aus zwei Teilen 3 und 4 besteht. Der erste Teil 3 ist mit einem kreisrunden, etwa 3,5 mm tiefen Hohlraum versehen, dessen Volumen etwa 3 ml beträgt. Außerdem ist der Teil 3 mit zwei Bohrungen 5 und 6 versehen, die im oberen Teil der Kammer angeordnet sind. Ferner ist am Boden der Kammer eine Bohrung vorgesehen. Die Kammer ist außerdem mit einer nicht näher dargestellten Heizeinrichtung ausgestattet, so daß eine geeignete Temperatur während des Markierens bzw. Färbens aufrechte^rhalten werden kann. Der andere Teil 4 der Kammer besteht aus einem Deckel, mit dem die Platte 1 am Rand des Teiles 3 der Markierungskammer festgelegt werden kann. Außerdem übernimmt die Platte eine Abdichtfunktiori in der Markierungskammer. Die beiden Teile der Kammer werden mit einer nicht näher dargestellten Verriegelungseinrichtung zusammengehalten. Die Bohrungen 5 und 6 dienen als Eingänge und Ausgänge der Kammer und sind über Röhren 7 und 8, welche flexibel ausgebildet sein können, mit einem Ventil 9 verbunden. Der obere und der untere Teil der Kammer können daher abwechselnd an eine Pumpe 14 oder mehrkanaliges Ventil 10 angeschlossen werden. Das mehrkanalige Ventil 10 kann, wie in der Zeichnung dargestellt, mit vier Eingängen A, B, C, D ausgestattet sein. Der Eingang A ist mit einem Wasserbehälter 11 verbunden. Der Eingang β kann mit der Atmosphäre verbunden werden. Der Eingang Ckann an einen Behälter 12 angeschlossen sein, der eine der Markierungslösungen, beispielsweise Uranylacetat enthält Der Eingang D kann an einen Behälter 13 angeschlossen werden, der die andere Markierungslösung, wie beispielsweise Bleicitrat, enthält. Das Ventil 9 kann so eingestellt werden, daß der Fluß vom Ventil 10 ausgeht und über die Bohrung 6 in die Kammer gelangt und durch die Bohrung 5 die Kammer in Richtung Pumpe 14 verläßt Das Ventil 9 kann auch so eingestellt sein, daß der Fluß durch die Bohrung 5 in die Kammer eintritt und durch die Bohrung 6 in Richtung Pumpe aus der Kammer austritt. Das bedeutet daß die Kammer 3,4 entweder von oben her oder von unten her in Abhängigkeit von der Einstellung des Ventils 9 gefüllt werden kann.

Der Unterschied des spezifischen Gewichts der verschiedenen Markierungsflüssigkeiten und des Wassers, das für die Reinigung verwendet wird, bestimmt dabei die Flußrichtung durch die Kammer bzw. die Einstellung des Ventils 9. Eine Lösung, welche eine höhere Dichte aufweist als eine Lösung, die sich bereits in <kt Kammer befindet, wird vom oberen Teil der Kammer her in die Kammer eingebracht, während eine Lösung mit geringerer Dichte als die Lösung, welche sich bereits in der Kammer befindet, vom Boden der Kammer her in die Kammer eingebracht wird. Auf diese Weise erhält man einen raschen und gleichförmigen Wechsel der Lösungen in der Kammer.
Die Kammer 3. 4 ist außerdem mit einer anderen Verbindungsleitung 15, welche zur Pumpe 14 führt, versehen. Mit Hilfe dieser Leitung wird ein Unterdruck hinter der Platte 1 erzeugt, so daß ein Durchbiegen der Platte in den Hohlraum, der vom Teil 3 der Kammer

"·, gebildet wird, verhindert wird.

Die Behälter, welche die Markierungs- bzw. Farblösungen enthalten, können aus geschlossenen Kunststcffbehältern bestehen, die gegenüber Licht und Luft durch eine dünne Aluminiumschicht geschützt sind Bevor die

in Lösungen in die Kunststoffbehälter eingebracht werden, werden sie durch Erhitzen entgast. Die Behälter werden dann zusammengedrückt, um Restgase zu beseitigen und anschließend abgedichtet. Die dicht abgeschlossenen Kunststoffbehälter werden über Kapillarröhren,

π weiche nach dem dichten Abschließen in die Behälter eingebracht werden, mit dem Ventil 10 verbunden. Die Verwendung von abgedichteten Behältern für die Markierungslösungen ist in zweierlei Hinsicht gegenüber bekannten Behältern von Vorteil. Diese Behälter

2i) verhindern, daß Kohlendioxid mit der Bleicitratiösung in Berührung kommt Auf diese Weis:; »vird die Gefahr der Biidung von Niederschlägen aus 3ieikarbonat verhindert Ferner wird durch das Zusammendrücken der Behälter vor der Verwendung der Lösungen verhindert daß Gase in den Lösungen sich lösen. Es werden (iiher während des Markierungs- bzw. Färbungsvorganges keine Gase aus den Lösungen freigesetzt Wenn Vorsichtsmaßnahmen getroffen sind, welche während der Zubereitung des Bleicitrats den Zugang von Kohlendioxid verhindern, kann diese Lösung bei Raumtemperatur belassen werden, während sie an die Vorrichtung mehrere Monate angeschlossen bleibt, ohne daß Niederschläge sich bilden. Auch tritt keinerlei wesentlicher Abbau des Markierungs- bzw.

» Färbungsvermögens auf. Die Uranylacetatlösung kann an die Vorrichtung wählend einer noch längeren Zeitdauer angeschlossen bleiben.

Eine bevorzugte Ausbildung des Ventils 10 ist in der Figur dargestellt. Dieses Ventil ist an den Wasserbf hälter in der Weise angeschlossen, daß dann, wenn Wasser durch das Ventil fließt, das Wasser durch das gesamte Vent^hindurchströmt

Der Betrieb mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung ist folgender. Wenn die Gitter in der Markierungskammer angeordnet sind, besteht der erste Schritt des Markierungsvorgangs darin, daß die Probenteile bzw. Proben in destilliertem Wasser benetzt werden. Es ist dabei wesentlich, Verunreinigungen im Wasser, welches für die Benetzung verwendet wird, zu

so vermeiden. Außerdem muß die Markierungskammer so sauber wie möglich sein, weil Teilchen an der Wasseroberfläche oder an den Kammerwänden, die auf die Probenteile gelangt sind, nur schwierig beseitigt werder können. Das Wasser wird dann abgesaugt und durch Luft ersetzt, so daß Luftblasen an den Kammerwänden und den Probenteilen bzw. Probenschnitten beseitigt werden. Daraufhin wird die Kammer erneut mit Wasser gefüllt Das Wasser wird abgesaugt und gleichzeitig ersetzt durch die Uranylacetatlösung.

Der Luft/Uranylübergang, welcher bei dem vorbeschriebenen Tropfenmarkierungsverfahren vorhanden ist, ist demnach ersetzt durch einen Wasser-AJranylacetatübergang, bei welchem die Gefahr der Verunreinigung von der Oberfläche der Markierungslösung vernachlässigbar ist. Der Austausch der Lösungen erfolgt innerhalb von etwa 30 Sekunden durch den Betrieb der Pumpe. Während des Markierens bzw. Färbens wird die Pumpe angehalten. Wenn das

Markieren mit alkoholischem Uranylacetat (mehr als 25% Alkohol) bevorzugt wird, wird die Flußrichtung während des Füllens und während der Spülung geändert. Dies hat seinen Grund darin, daß eine alkoholische 5%ige Lösung von Uranylacetat mit mehr als 24% Alkohol eine Dichte geringer als I aufweist. Wenn während der Uranylacetatmarkierung eine Aufheizung erwünscht ist, wird die gewünschte Temperatur mit Hilfe eines Thermostaten festgelegt. Auf die Uranylacetatmarkierung folgt eine 5minütige Reinigung ifv destilliertem Wasser. Die zweite Markierung wird eingeleitet durch Umschalten auf die Bleicitratlösung. Während der Markierung wird die Pumpe ungehalten. Falls erwünscht, kann ein Aufhei/cn während der Bleicitratmarkierung stattfinden. Abschließend wird die Kammer dadurch entleert, daß das Wasser durch Luft ersetzt wird. Die netztragenden Cutter werden aus der Kammer entfernt und das auf den Cuttern noch vorhandene Wasser wird mit Hilfe von Filterpapier beseitigt. Natürlich ist es auch möglich, die Markierung unter Verwendung nur einer der Markierunpslösungen durchzuführen, wobei Abtrennmiltel zum Abtrennen

·, der anderen Lösung vorhanden sind. Die Kammer bleibt dann mit Wasser gefüllt (bei stehender Pumpe), während der Füll- und Reinigungszeit.

Durch die vorstehende Vorrichtung und das vorstehende Verfahren werden die meisten Schwierigkeiten

in bei der Markierung von Probenschnitten beseitigt, welche für die Elektronenrnikroskopic bestimmt sind. Die Verunreinigungen, welche als Kristalle, als kleine Körner, amorphe Niederschläge u. dgl. in Erscheinung treten, ergeben sich nicht mehr, wenn die Probenschnit-

! ι te in der crfindungsgcmäßcn Vorrichtung markten werden. Außerdem ist es möglich, die Vorrichtung während der Bleicilratmarkierung zu erhitzen, ohne daß dabei Niederschläge entstehen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zum Präparieren, insbesondere Markieren, z. B, durch Einfärben von biologischen Proben in einer geschlossenen Kammer, welche an eine druckerzeugende Einrichtung oder einen Behälter mit einer Flüssigkeit, insbesondere einem Präparierungsmittel, zum Einbringen der Flüssigkeit in die Kammer angeschlossen wird, dadurch gekennzeichnet, daß