JP2012244910A - 操作装置 - Google Patents

Abstract

【課題】対象細胞を高効率で操作可能な操作装置を提供すること。
【解決手段】近接部としてのＺ駆動部４４により、対象操作部であるチップ部３６を操作対象に近接させ、この近接させた状態で、駆動部としてのピエゾアクチュエータ３８Ａによって、チップ部３６を対象の方向へ駆動することにより、対象を操作する。
【選択図】図１

Description

本発明は、操作対象として細胞や卵子などの微細物を操作する操作装置に関する。

従来より、細胞や卵子などの微細物を操作する操作装置が知られている。
例えば、特許文献１には、内部に遺伝子等の導入物質の充填された微小な注入針を対象である細胞に挿入することにより、細胞内に導入物質を導入操作する細胞操作装置が開示されている。

特開２０１０−２６１９２９号公報

上記特許文献１に開示された細胞操作装置は、中空の注入針を利用することで、導入物質を細胞内に導入するように細胞を操作している。しかしながら、上記特許文献１に開示された細胞操作装置は、細胞へのアプローチのためのアクチュエータと細胞を操作するためのアクチュエータが一緒なので、細胞操作或いは細胞へのアプローチに特化した駆動ができなくなり、効率的に細胞を操作できない課題があった。また、このような針を利用すれば細胞に力学的刺激を与える等、その他の細胞操作を行うことも可能だが、やはり同じ問題点を有している。

本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、対象を高効率で操作可能な操作装置を提供することを目的とする。

本発明の操作装置の一態様は、
対象を操作するための対象操作部と、
前記対象操作部を前記対象に近接させる近接部と、
前記対象を操作するように、前記対象に近接させられた対象操作部を駆動する駆動部と、
を具備することを特徴とする。

本発明によれば、対象を高効率で操作可能な操作装置を提供することができる。

図１は、本発明の操作装置の第１実施形態に係る細胞操作装置を示す全体構成図である。 図２（Ａ）は、第１実施形態に係る細胞操作装置の特徴部の構成を示す図であり、図２（Ｂ）は、カンチレバーチップの構成を示す図であり、図２（Ｃ）は、チップ部の斜視図であり、図２（Ｄ）は、ピエゾアクチュエータの伸長方向を説明するための図である。 図３は、第１実施形態に係る細胞操作装置の電気的な構成を示すブロック図である。 図４は、第１実施形態に係る細胞操作装置を用いたチップ駆動方法を説明するためのフローチャートを示す図である。 図５（Ａ）乃至（Ｃ）はそれぞれ、信号発生部からの信号とそれに応じたピエゾアクチュエータの変位の時間変化の例を示す図である。 図６は、第１実施形態に係る細胞操作装置において図５（Ａ）の信号発生部からの信号を用いた場合の細胞操作の実験結果を示す図である。 図７は、第１実施形態に係る細胞操作装置による細胞操作の別の実験結果を示す図である。 図８は、本発明の操作装置の第２実施形態に係る細胞操作装置の特徴部の構成を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態を図面を参照して説明する。
［第１実施形態］
まず、本発明の操作装置の第１実施形態を、細胞操作装置を例にして、図１乃至図４を参照して説明する。

本細胞操作装置１０は、図１に示すように、操作対象である細胞を観察するための倒立顕微鏡１２に装着して使用される。

倒立顕微鏡１２は、細胞を収容したディッシュ１４上の細胞を照明する照明装置１６と、上記ディッシュ１４をＸ方向及びＹ方向に移動する顕微鏡ＸＹステージ１８と、該顕微鏡ＸＹステージ１８を駆動する顕微鏡ＸＹステージハンドル２０と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察するための図示しない対物レンズ及び接眼レンズ２２と、を備えている。

なお、ディッシュ１４は、細胞の観察を行えるよう、少なくともその底面は透明な材料、例えばガラスで形成されている。

なお、ここでは、手動操作される倒立顕微鏡１２を説明したが、コンピュータにより顕微鏡ＸＹステージ１８を駆動制御する電動の倒立形顕微鏡であっても良い。更に、ＣＣＤカメラ等を備え、モニタに観察画像を表示するような倒立形顕微鏡でも良い。

また、上記照明装置１６には、細胞に対して、上記接眼レンズ２２とは反対側から照明光を照射する透過照明光源２４と、該透過照明光源２４から発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ２６と、細胞に対して上記接眼レンズ２２と同一方向から照明光を照射する落射照明光源２８とが備えられている。

そして、本実施形態に係る細胞操作装置１０は、装置本体３０と、該装置本体３０のコンデンサレンズ２６への取り付け部である顕微鏡アダプタ３２と、上記装置本体３０に図示しないケーブルを介して接続され、任意の位置に設置可能な操作モジュール３４と、から構成されている。図１では、装置本体３０を、接眼レンズ２２が設けられた側である倒立顕微鏡１２の前面側に対し、コンデンサレンズ２６の右側に装着した状態を示している。

装置本体３０は、駆動対象であるチップ部３６が装着されるピエゾアクチュエータ３８Ａを備えるアダプタ４０を取り付けるためのアダプタ保持部４２と、該アダプタ保持部４２をＺ方向に移動することで上記チップ部３６をＺ方向に移動させるＺ駆動部４４と、上記アダプタ保持部４２をＸ方向及びＹ方向に移動することで上記チップ部のＸＹ位置を調整する針先ＸＹ調整ノブ４６と、を備えている。

ここで、アダプタ保持部４２には、図２（Ａ）に示すように、Ｚ駆動部４４の図示しない直線移動機構に、図示しないＸＹ駆動機構（針先ＸＹ調整ノブ４６はこの駆動機構によりアダプタ保持部４２を駆動する）を介して取り付けるためのＺ駆動部取付部４８とは長手方向反対側に、上記アダプタ４０を着脱自在に装着するための装着部材、例えばアダプタ４０が金属製ないしは対応する箇所に金属部を設けたものであればマグネット５０、が設けられている。なお、図２（Ａ）において、一点鎖線の右側が装置本体３０内に収容される部分である。即ち、上記マグネット５０は、装置本体３０外部となる位置に設けられている。また、このマグネット５０の近傍に、アダプタ４０の位置決めのために、アダプタ４０に設けられた穴や溝に嵌合する嵌合部５２が配設されている。嵌合部５２は、倒立顕微鏡１２の前面側に向けて突出しており、アダプタ４０がこの前面側から差し込みにより装着できるようになっている。

なお、装置本体３０がコンデンサレンズ２６の左側に装着された際にもアダプタ４０を装着できるように、マグネット５０及び嵌合部５２をアダプタ保持部４２の裏面側にも設けても良い。あるいは、装置本体３０の装着位置に応じて、アダプタ保持部４２を交換可能に構成しても良い。

上記アダプタ４０のピエゾアクチュエータ３８Ａには、対象操作部であるチップ（ｔｉｐ）部３６を形成したカンチレバーチップ（Ｃｈｉｐ）５４が、例えば接着により装着されている。カンチレバーチップ５４は、シリコンプロセスにより製造されるもので、図２（Ｂ）に示すように、他の部分との接着用のシリコンベース部５８と、該シリコンベース部５８から延在し、例えば厚み２．７μｍ、長さ２４０μｍで２Ｎ／ｍ程度の弾性定数を持つ可撓性のレバー部６０と、該レバー部６０の自由端に、該レバー部６０の長手方向に対しておおむね９０度の角度で形成された上記チップ部３６とからなる。即ち、図２（Ｃ）に示すように、チップ部３６は、中空ではない針部であり、それを保持する弾性部材であるレバー部６０から略直角方向に延伸した構造となっている。ここで中空でない針部とは、その内部が充填された針部であれば形態を問わない。

本実施形態に係る細胞操作装置１０では、このようなカンチレバーチップ５４を、対象としての細胞を操作するようにチップ部３６を駆動する駆動部として機能する、アダプタ４０のピエゾアクチュエータ３８Ａに装着した後、該カンチレバーチップ５４を装着したアダプタ４０を装置本体３０に装着するようになっている。こうすることで、基本的に交換品度の高い構成品（消耗品）であるカンチレバーチップ５４を交換することができ、コンタミネーションの虞なく、該細胞操作装置１０を繰り返し使用することができる。

また、微細なカンチレバーチップ５４を、装置本体３０から延伸する部材に直接装着する構成とすると、作業性が悪く、装着作業時にチップ部３６が顕微鏡ＸＹステージ１８等の倒立顕微鏡１２の何処かに当たって破損してしまう虞がある。本実施形態では、装置本体３０から取り外したアダプタ４０にカンチレバーチップ５４を装着した上で、該アダプタ４０を装置本体３０の前面側から装着するようにしているので、そのような破損の虞を少なくすることができる。

なお、アダプタ４０は、ピエゾアクチュエータ３８Ａを、一方の端部がＺ駆動部取付部４８によりＺ駆動部４４に接続されるアーム部５６の、他端側に設けているが、さらに、図２（Ｄ）に示すように、第２のピエゾアクチュエータ３８Ｂを、該アーム部５６を介してピエゾアクチュエータ３８Ａと対向する位置に配置している。ここで、ピエゾアクチュエータ３８Ａと第２のピエゾアクチュエータ３８Ｂとは、ほぼ同じ質量を持っているが、ほぼ逆相で駆動されることにより、同図中に矢印で示すように、対向する方向に伸長するようになっている。

コンデンサレンズ２６からの光のけられを防ぎ、良好な細胞観察をするためには、カンチレバーチップ５４（チップ部３６）と、コンデンサレンズ２６からの照明光の範囲外にある装置本体３０（Ｚ駆動部４４）との間を、長いアーム部５６で接続する必要があるが、一方で、ピエゾアクチュエータ３８Ａは、チップ部３６を確実に急速駆動させるため、チップ部３６の直近に置く必要がある。これは、ピエゾアクチュエータとチップ部３６とを途中に長いアームのような大きい構造物を介して接続すると、その構造物の低周波数の共振のために、チップ部３６はピエゾアクチュエータの変位とは全く異なる変位を起こしてしまうからである。

また、ピエゾアクチュエータ３８Ａがチップ部３６の直近にあっても、ピエゾアクチュエータ３８Ａの振動は、やはり背後のアーム部５６の共振を引き起こすことに変わりはない。そこで、本実施形態では、ピエゾアクチュエータ３８Ａと同等な性能をもった第２の駆動部としての第２のピエゾアクチュエータ３８Ｂを、アーム部５６に対して対称的な位置におき、逆相で駆動することで、アーム部５６への励振を最小限に抑えるようにしている。

なお、ピエゾアクチュエータ３８Ａの駆動軸と第２のピエゾアクチュエータ３８Ｂの駆動軸とは、略一致していることが好ましいが、完全に同軸上になくても良い。一方のピエゾアクチュエータの駆動軸の延長線上に他方のピエゾアクチュエータの一部が重なっていればアーム部５６への励振を抑える効果が得られる。

アダプタ４０は、装置本体３０に装着された際に、所定の角度で斜め下方に向けて延伸するように、アーム部５６の形状が設定されている。そして、カンチレバーチップ５４は、このアーム部５６のピエゾアクチュエータ３８Ａに対して所定の角度となるように取り付けられている。また、上記したようにチップ部３６は、レバー部６０の長手方向から略直角方向に延びるように設けられている。従って、アダプタ４０が装置本体３０に装着された状態では、チップ部３６は、レバー部６０の自由端において、先端をほぼ鉛直下方に向けて保持されることとなる。

上記アダプタ４０のアーム部５６が延伸する角度については、アーム部５６が、コンデンサレンズ２６に干渉したり、逆に、ディッシュ１４の側壁に干渉してしまわないような角度とすることが必要である。

一方、細胞操作装置１０の操作モジュール３４は、図１に示すように、Ｚ調整用ハンドル６４、速度設定ダイアル６６、微調整（上）ボタン６８、微調整（下）ボタン７０、移動量設定ダイアル７２、Ｚ値セットボタン７４、及びトリガボタン７６を備えている。

ここで、Ｚ調整用ハンドル６４及び速度設定ダイアル６６は、アダプタ保持部４２の粗いＺ方向の移動（ｍｍ単位）に使用するものである。Ｚ調整用ハンドル６４の回転操作により、その回転方向に応じて上記Ｚ駆動部４４を用いてアダプタ保持部４２がＺ方向に駆動され、速度設定ダイアル６６は、Ｚ調整用ハンドル６４の回転操作に応じた駆動量を大・中・小の３段階で切り替え設定するためのものである。

また、微調整ボタン６８，７０及び移動量設定ダイアル７２は、アダプタ保持部４２の細かいＺ方向の移動（μｍ単位）に使用するものである。微調整（上）ボタン６８又は微調整（下）ボタン７０の操作により、そのボタンに応じて上記Ｚ駆動部４４を用いてアダプタ保持部４２がＺ方向に微小駆動され、移動量設定ダイアル７２は、１回の微調整ボタン６８，７０のＯＮ操作に応じた微小駆動量を大・中・小の３段階で切り替え設定するためのものである。

Ｚ値セットボタン７４は、Ｚ方向任意の位置を記憶する指示を行うためのボタンであり、上記Ｚ調整用ハンドル６４や上記微調整ボタン６８，７０を操作しても該Ｚ値セットボタン７４により記憶された位置よりも下（ディッシュ１４内のサンプルの方向）にはアダプタ保持部４２が下降しないようにするものである。なお、このＺ値セットボタン７４は、図示しないラッチ機構を備えており、操作者が押下操作即ちＯＮ操作すると、再度押下操作されるまで、その押下状態即ちＯＮ状態を維持する。以降、Ｚ値セットボタン７４がＯＦＦ状態におけるＺ調整用ハンドル６４及び微調整ボタン６８，７０の操作を「第１モード」と呼び、Ｚ値セットボタン７４がＯＮ状態におけるＺ調整用ハンドル６４及び微調整ボタン６８，７０の操作を「第２モード」と呼ぶ。

トリガボタン７６は、駆動部であるピエゾアクチュエータ３８Ａ（及び第２の駆動部であるピエゾアクチュエータ３８Ｂ）を動作させる指示を行うためのボタンである。

図３は、本実施形態に係る細胞操作装置１０の電気的な構成を示すブロック図である。
装置本体３０は、上記Ｚ駆動部４４に加えて、アダプタ保持部４２の位置を検出するための位置検出部７８を備えている。この位置検出部７８としては、アダプタ保持部４２の位置を、光学的に直接検出するものであっても良いし、Ｚ駆動部４４の駆動量を検出することで間接的に検出するものであっても良い。また、位置検出部７８を、装置本体３０とは別体に設けても構わない。

操作モジュール３４は、入力部８０、記憶部８２、判定部８４、表示灯８６、制御部８８、パワーアンプ９０、及び電源９２を備えている。

入力部８０は、上記Ｚ調整用ハンドル６４及び上記微調整ボタン６８，７０のＯＮ操作に応じて移動指示信号を出力する移動指示部８０Ａと、上記速度設定ダイアル６６によって設定された移動速度を示す速度設定信号を出力する速度設定部８０Ｂと、上記移動量設定ダイアル７２によって設定された移動量を示す移動量設定信号を出力する移動量設定部８０Ｃと、上記Ｚ値セットボタン７４のＯＮ操作に応じてＺ値セット信号を出力するＺ値セット部８０Ｄと、予め記憶されたパターンを有する第１の駆動信号とその逆相の第２の駆動信号とを上記トリガボタン７６のＯＮ操作に応じて出力する信号発生部８０Ｅと、を含む。この入力部８０の内、移動指示部８０Ａ、速度設定部８０Ｂ、移動量設定部８０Ｃ、及びＺ値セット部８０Ｄから出力される各信号は、制御部８８に入力される。一方、信号発生部８０Ｅから出力される第１及び第２の駆動信号は、パワーアンプ９０に入力される。

記憶部８２は、上記Ｚ値セットボタン７４がＯＮ操作されたときの、上記位置検出部７８で検出されたアダプタ保持部４２の位置をＺ値として記憶するものである。判定部８４は、上記位置検出部７８で検出したアダプタ保持部４２の位置と記憶部８２に記憶されているＺ値とを比較して、アダプタ保持部４２が上記Ｚ値の位置に到達したか否かを判定するものである。表示灯８６は、上記Ｚ値セット部８０Ｄからの上記Ｚ値セット信号に応じて点灯するものであり、操作者は該表示灯８６の点灯によりＺ値の記憶を確認できるようにしている。なお、Ｚ駆動部４４がステッピングモータで構成される場合は、Ｚ値セットボタン７４がＯＮ操作された位置からのステップ数（上向きを＋、下向きを−とする）を記憶部８２で記憶することにより、総ステップ数が０になることをもってＺ値の位置への到達を判定することが可能となる。よって、この場合は、位置検出部７８からの情報は不要であるので、位置検出部７８を省略することができる。

制御部８８は、該細胞操作装置１０の全体を制御するものである。パワーアンプ９０は、信号発生部８０Ｅから出力される第１の駆動信号を増幅してピエゾアクチュエータ３８Ａに印加すると共に、信号発生部８０Ｅから出力される上記第１の駆動信号とは逆相の第２の駆動信号を増幅してピエゾアクチュエータ３８Ｂに印加する。そして、電源９２は、該細胞操作装置１０の各部を動作させる電力を供給するものである。

以下、このように構成された本実施形態に係る細胞操作装置１０を用いたチップ駆動方法について説明する。

ここでは、本実施形態に係る細胞操作装置１０を用いて、ディッシュ１４内の培養液中で培養される細胞に物質を導入する場合を例に説明する。

即ち、図４に示すように、まず、装置本体３０の取付けサイドを選択して、コンデンサレンズ２６に顕微鏡アダプタ３２を介して装着する（ステップＳ１０）。

次に、装置本体３０から取り外されているアダプタ４０のピエゾアクチュエータ３８Ａに、カンチレバーチップ５４を装着する（ステップＳ１２）。そして、そのカンチレバーチップ５４が装着されたアダプタ４０を、倒立顕微鏡１２の前面側から、装置本体３０のアダプタ保持部４２に装着する（ステップＳ１４）。

その後、チップ位置決めを行う（ステップＳ１６）。即ち、接眼レンズ２２で観察しながら装置本体３０の針先ＸＹ調整ノブ４６と操作モジュール３４のＺ調整用ハンドル６４を操作して、目視により、ピエゾアクチュエータ３８Ａの先端に形成されているチップ部３６の位置を、図示しない対物レンズの中央位置（視野中央位置）に設定する。これは、顕微鏡ＸＹステージ１８にディッシュ１４を載置せずに行う。なお、Ｚ方向に関しては、操作モジュール３４の速度設定ダイアル６６を大又は中にセットして、Ｚ調整用ハンドル６４の操作により、視野にカンチレバーチップ５４のレバー部６０が目視で確認できるところまで、チップ部３６の下降動作を行う。

こうしてチップ位置決めがなされたならば、次に、サンプルのセット、即ち、顕微鏡ＸＹステージ１８上へのディッシュ１４の載置を行う（ステップＳ１８）。これは、操作モジュール３４のＺ調整用ハンドル６４を操作してアダプタ４０先端のチップ部３６を安全な領域（Ｚ方向上側）に退避し、かつ、倒立顕微鏡１２の支柱９４を後ろ側に倒し（装置本体３０全体が移動）、サンプルセットのスペースを確保した上で、ディッシュ１４（サンプル）を顕微鏡ＸＹステージ１８に載置し、その後に倒立顕微鏡１２の支柱９４を元に戻すというようにして実施する。なお、ディッシュ１４（サンプル）は、当該ディッシュ１４内の培養液中で培養される細胞に物質を導入するために、その導入しようとする物質を分散させた状態でセットされる。

そして、導入対象の細胞を選択する（ステップＳ２０）。これは、まず、接眼レンズ２２で観察しながら、顕微鏡ＸＹステージハンドル２０を操作することで、顕微鏡ＸＹステージ１８を作動させ、ディッシュ１４内の観察したい細胞を顕微鏡観察下に配置する。その後、Ｚ駆動部４４を作動させ、チップ部３６を細胞の上方から細胞に近接させる。即ち、まず、接眼レンズ２２で観察しながら視野にカンチレバーチップ５４のレバー部６０が目視で確認できるところまで、チップ部３６のＺ方向への下降動作を行う。これは、操作モジュール３４の速度設定ダイアル６６を小にセットして、Ｚ調整用ハンドル６４の操作により行う。ディッシュ１４内の細胞とチップ部３６とが同じ高さではないので、チップ部３６には合焦しておらず、チップ部３６を観察することは困難であり、よって、チップ部３６よりも大きく合焦していなくても大まかに識別可能なレバー部６０を指標としてＺ方向への下降動作を行う。そして、視野にレバー部６０が目視で確認できるところまで下降させたならば、次に、接眼レンズ２２で観察しながら目視で、顕微鏡ＸＹステージのＸＹ方向への調整を行い、導入対象の細胞の真上にチップ部３６と思われる位置を設定する。以上のようにして、導入対象の細胞を選択する（決定する）。

その後の動作は、操作モジュール３４の記憶部８２にＺ値をセットしているか否かにより異なる。

１回目のチップ駆動では、まだ記憶部８２にＺ値をセットしていないので（ステップＳ２２）、第１モード（Ｚ値なし）でのチップ導入を行う。即ち、操作モジュール３４のＺ調整用ハンドル６４又は微調整ボタン６８，７０を操作しながら、接眼レンズ２２で観察して、「細胞の歪み」を確認しながら、Ｚ方向の最適位置であるディッシュ１４内の細胞に接触する位置を決める（ステップＳ２４）。このとき、Ｚ調整用ハンドル６４の操作は、速度設定ダイアル６６の大・中・小でその感度を適宜切り替えながら行うことになる。また、微調整ボタン６８，７０の操作は、移動量設定ダイアル７２の大・中・小でその感度適宜切り替えながら行うことなる。このような操作に応じて、Ｚ駆動部４４がアダプタ４０のアーム部５６の先端部に取り付けられたチップ部３６を下降させディッシュ１４の底面へ近づけていく。そして、チップ部３６の先端が下降していく途中において、ディッシュ１４内の細胞に接触したことを確認したならば、そこで、操作モジュール３４のＺ調整用ハンドル６４又は微調整ボタン６８，７０の操作を終了する。このように、Ｚ駆動部４４は、中空でない針部であるチップ部３６を操作対象の細胞に近接させる近接部として機能する。

このとき、操作モジュール３４のＺ値セットボタン７４を押すことで、位置検出部７８で検出されるそのときのアダプタ保持部４２の位置を最適位置を示すＺ値（Ｚ_０）として、記憶部８２に記憶させる（ステップＳ２５）。

そして、操作モジュール３４のトリガボタン７６を押すことで、駆動部であるピエゾアクチュエータ３８Ａを、上記近接部としてのＺ駆動部４４が近接させる速度よりも速い速度でチップ部３６を細胞の方向へ駆動させることにより、細胞の細胞膜を穿孔する（ステップＳ２６）。このように、ピエゾアクチュエータ３８Ａは、細胞にチップ部３６を近接させた状態で、該チップ部３６に対して、上記近接部としてのＺ駆動部４４が近接させるときと異なる速度で、細胞の細胞膜を穿孔する駆動を行う駆動部としても機能する。具体的には、ピエゾアクチュエータ３８Ａは、チップ部３６を介して細胞に撃力を与えることにより、細胞の細胞膜を穿孔することとなる。このとき、ピエゾアクチュエータ３８Ａの最大の伸長量を、チップ部３６がディッシュ１４の底面に到達する前に伸長が停止するようなものとしておくことで、チップ部３６がディッシュ１４の底面との衝突で壊れる虞を無くすことができる。

ここでは撃力を与えることにより穿孔した例を示したが、細胞に対して圧力を与えられれば力の度合は問わない。細胞に対して、穿孔に至らない程度の力学的刺激を与えることにより細胞の特定の機能を活性化させる等のツールとして利用することができる。

このようにして細胞膜が穿孔されると、その孔にディッシュ１４内に分散された物質が流通されることとなり、物質が細胞内に流入する。導入しようとする粒子のサイズ等によっては、完全に穿孔しなくてもチップ部３６で細胞を変形させることによる物理的刺激でストレッチレセプター等に結合されたチャンネルが開くことによっても流入する。

その後、操作モジュール３４のＺ調整用ハンドル６４を操作して、アダプタ４０のアーム部５６を上昇させることで、チップ部３６を退避させる（ステップＳ２７）。この際には、操作モジュール３４の速度設定ダイアル６６を中又は小にセットして、Ｚ調整用ハンドル６４の操作により、チップ部３６の上昇動作を行う。

なお、チップ部３６を上昇させてチップ部３６を細胞から引き抜いた後は、ある一定時間が経過すると、細胞膜は自己修復により回復し、細胞内に物質が取り込まれた状態となる。

以下、任意のサンプル細胞個々に対して物質の導入を繰り返し行う。
即ち、接眼レンズ２２で観察しながら、顕微鏡ＸＹステージハンドル２０を操作することで、顕微鏡ＸＹステージ１８を作動させ、導入対象の細胞の真上にチップ部３６を設定する。つまり、導入対象の細胞を選択する（ステップＳ２０）。

２回目からのチップ駆動では、記憶部８２にＺ値をセットしているので（ステップＳ２２）、第２モード（Ｚ値セットあり）でのチップ導入動作を実施することになる（ステップＳ２９）。この場合には、Ｚ値が記憶部８２にセットされているので、水平方向を位置決めした後は、Ｚ調整用ハンドル６４及び微調整ボタン６６、６８による行き過ぎた操作を気にせずに、チップ部３６を十分下降させる操作をするだけで、最適位置まで下降させることができる。即ち、操作モジュール３４の判定部８４が位置検出部７８で検出したアダプタ保持部４２の位置と記憶部８２にセットされているＺ値とを比較して、アダプタ保持部４２（チップ部３６）が上記Ｚ値の位置に到達したと判定したならば、操作モジュール３４の制御部８８は、Ｚ調整用ハンドル６４及び微調整ボタン６６、６８が操作されても、それ以上Ｚ駆動部４４が下降しないように制御することができる。

なお、最適Ｚ位置が記憶部８２にセットされているので、その位置まで自動でアダプタ保持部４２（チップ部３６）が下降するようにしても良い。即ち、第２モードでのハンドル操作を自動化しても良い。

また、細胞毎にチップ部３６を近接させてチップ部３６の細胞への接触を確認した後、いったんチップ部３６を所定の距離退避させ、接触位置から所定距離上方まで再度近接させた後、急速駆動を行っても良い。例えば、ピエゾアクチュエータ３８Ａによる急速駆動に要する距離が３μｍであったとすれば、それより短い、接触位置から２μｍ上方にチップ部３６を再接近させた後に急速駆動を行う。この操作により、チップ部３６のディッシュ１４の底面への衝突や、細胞に深く刺し過ぎることによる細胞の生存率の劣化を抑えることができる。この「所定距離退避→再接近」の流れは、装置のバックラッシュによる位置ずれを防ぐために行っている。

また逆に、高さがある細胞では、接触位置よりも所定距離下方にセットして、急速駆動を行うことにより、確実な挿入を行うことも考えられる。

要するに、細胞への接触またはその他の手段でチップ部３６をいったん位置決めし、その位置を基準にしてそこから所定の距離移動させた後に急速駆動を行うことで、より確実に、またはチップ部３６の破損や生存率の劣化なく物質の導入が可能になる。その他の手段としては、ディッシュ１４底面への接触が考えられる。チップ部３６の細胞への接触は細胞の変形を観察すること等により検出でき、チップ部３６のディッシュ１４の底面への接触は、その接触に伴ってチップ部３６が持ち上げられ、レバー部６０が変形することによりチップ部３６の水平方向の位置がずれること、またはレバー部６０の変形に伴い、チップ部３６上にコートされたピエゾ抵抗の値が変わること、またはレバー部６０の変形そのものを光てこ等の技術により測定することで、鋭敏に検出できる。

また、この一連の動き（所定の距離退避→再接近→急速駆動）を自動化して、ボタンを押す等の１回の操作で行うことで操作を簡便にすることができる。

また、手動操作型の倒立顕微鏡１２ではなく、コンピュータにより顕微鏡ＸＹステージ１８を駆動制御すると共に、ＣＣＤカメラ等を備え、モニタに観察画像を表示するような電動型の倒立形顕微鏡においては、物質の導入が必要な細胞を予め画像上で選択しておき、自動でその位置まで移動するようにしても良い。即ち、顕微鏡ＸＹステージ１８のＸＹ方向への調整も自動化しても良い。

なお、細胞内に導入する物質としては、遺伝子、色素、量子ドットなどの蛍光試薬、イオン、ペプチド、タンパク質、多糖類、等、ディッシュ１４内に分散できるものであれば良い。

［実験例１］
信号発生部８０Ｅから急峻な立上りの信号を入力するとピエゾアクチュエータ３８Ａは急峻に伸長し、チップ部３６を急速駆動する。この急速駆動の速度をどの程度にすれば細胞に物質が導入されるかについて以下の実験を行った。

細胞はＨｅＬａ細胞を利用した。３枚のディッシュにＨｅＬａ細胞を培養した。各ディッシュの培養液を、ＳＹＴＯＸ（分子量１ｋＤａ）を５μＭ含むＨＢＳＳに置換した。ＳＹＴＯＸは、ＤＮＡと結合することにより４８８ｎｍ励起（Ｂ励起）で５２３ｎｍの蛍光を放出する特性を持つため、穿孔により細胞内に進入したことを蛍光観察により確認できる。各ディッシュのＨｅＬａ細胞に対して以下の実験を行った。使用したカンチレバーチップ５４のレバー部６０の弾性定数は１．８Ｎ／ｍ、チップ部３６の先端径は１０ｎｍである。

実験は、次の１〜３のように行った。
１．細胞にチップ部３６を接触させる。
２．信号発生部８０Ｅよりパワーアンプ９０を介して図５（Ａ）の左側に示すような形状の信号をピエゾアクチュエータ３８Ａに供給する（ピエゾアクチュエータ３８Ｂには、逆相の信号を供給する）。これにより、ピエゾアクチュエータ３８Ａは、図５（Ａ）の右側に示すように変位する。
３．Ｂ励起で蛍光観察を行い、穿孔を確認する。

この実験を、立上り時間と変位（ピエゾアクチュエータ３８Ａの変位量。従って針の変位量である）を図６のパラメータの範囲で変更しながら行った。この実験を３枚のディッシュについて行い、結果をまとめたのが図６である。図６は、３つのディッシュ全てにおいて穿孔できた条件を丸印、３つのディッシュとも穿孔できなかった条件をバツ印、１又は２つのディッシュで穿孔できたものを三角印で表した。ここで、変位／立上り時間により、立上り速度を計算して、１００ｍｍ／ｓ超の条件を斜線のハッチング、５０ｍｍ／ｓ超で１００ｍｍ／ｓ以下を横線のハッチング、５０ｍｍ／ｓ以下を縦線のハッチングで表示してある。この速度分布と導入結果の比較から、５０ｍｍ／ｓ超の立上り速度をもつ信号を与えることで、導入が可能であることがわかる。さらに１００ｍｍ／ｓ超の立上り速度の信号を与えることで、細胞の条件によらず導入が可能になる。

特性の異なるカンチレバーチップ５４（レバー部６０の弾性定数２６Ｎ／ｍ、チップ部３６の先端径７ｎｍ）でも同じ実験を行い、ほぼ同様の結果が得られている。

［実験例２］
また、より大きい分子量の色素に対しても導入実験を行った。
細胞はＨｅＬａ細胞を利用した。ディッシュにＨｅＬａ細胞を培養して、培養液を、Ａｌｅｘａ４８８ ｄｅｘｔｒａｎ（分子量１０ｋＤａ）を２０μＭ含むＨＢＳＳに置換した。その後、上記実験例１の１．と２．の操作を繰り返し行った。信号の条件は、図６における立上り時間５μｓ、変位０．５μｍ、１μｍ、１．５μｍの３種類である。

上記操作終了後、色素を含むＨＢＳＳを色素を含まないＨＢＳＳに置換して、Ｂ励起で蛍光観察を行った（色素Ａｌｅｘａ４８８ ｄｅｘｔｒａｎはＳＹＴＯＸと異なり、Ｂ励起によりＤＮＡとの結合によらず蛍光を放出するため、細胞への導入確認のためには、実験後に溶液を、色素を含まないものに置換する必要がある）。図７は、その結果を示す図で、（Ａ）は変位０．５μｍの場合、（Ｂ）は変位１μｍの場合、（Ｃ）は変位１．５μｍの場合、をそれぞれ示しており、上段は位相差像、下段は蛍光像である。

図７に示すように、変位１μｍ、１．５μｍでは操作を行ったコロニーの細胞全てが光っているが、変位０．５μｍでは光っていない（変位０．５μｍで中心部が白く光っているのは、細胞膜に付着した色素で、導入はできていない）。従って、より分子量の大きい色素に対しても、１００ｍｍ／ｓを超える領域で導入可能であることが判った。

本実験例２と上記実験例１を比較すると、５０ｍｍ／ｓ超１００ｍｍ／ｓ以下の条件は、より分子量の小さい物質を導入可能な条件であることが判る。

これらの実験より、チップ部３６での穿孔は、チップ部３６の速度と強い相関があり、ある幅をもった、穿孔可能な閾値があることがわかった。その閾値は、急速駆動の変位量によらないことも、本実験により明らかになった。

従って、信号の形状は、最大速度が上記５０ｍｍ／ｓ、好ましくは１００ｍｍ／ｓ、を超える充分な高速になれば、図５（Ａ）のような急速な立上りを持つ駆動でも良く、図５（Ｂ）のような振動駆動でも良い。また、その組み合わせでも良い。

また、図５（Ｃ）のように、急速な立上りを持つ信号を与えた時に生じるメカ的な共振（アーム部５６、ピエゾアクチュエータ３８Ａ，３８Ｂ等の共振）で高速の共振的な変位が変位信号に重畳された場合、合計速度が上記５０ｍｍ／ｓ、好ましくは１００ｍｍ／ｓ、を超えれば導入可能である。

以上のように、本第１実施形態に係る細胞操作装置によれば、針部（チップ部３６）が中空でないため、例えばディッシュ１４の底面に接触したときに針部の先端の破損の危険が少ない。

また、レバー部６０のような弾性部材で針部（チップ部３６）を支えることにより、さらに破損の危険が少ない。

また、注入針と異なり、中空でない針部（チップ部３６）を含むカンチレバーチップ５４は、駆動させる部分に注入する溶液、溶液輸送部等を含まず、ＭＥＭＳプロセスで作製された微細な針部（チップ部３６）とその支持部（レバー部６０）、シリコンベース部５８だけから構成され、非常に小型軽量である。このような針部（チップ部３６）は、駆動部（ピエゾアクチュエータ３８A）が近接部（Z駆動部４４）と独立して備えられた別体のユニットであるため以下のようなメリットを持つ。駆動部（ピエゾアクチュエータ３８A）は針部（チップ部３６）と非常に近い、つまり針部と近接した位置でシリコンベース部５８と接着される。そのため駆動部（ピエゾアクチュエータ３８A）の駆動波形が途中の構造体で緩和されたり、近接部等の周囲に備えられた構造体による共振等による変調を受けずにダイレクトに伝達され、効率のよい穿孔が可能になる。また中空でない針部（チップ部３６）は前述のように軽量に構成でき、慣性が小さいため、大きな加減速が可能で、結局高速駆動が可能になる。すなわち、細胞への接触状態またはその数μｍ上の位置から急速駆動を行い、５０ｍｍ／ｓを超える速度を出して穿孔を行った後、ディッシュ１４の底面に到達する前にチップ部３６を停止することができる。また、小型の駆動部（ピエゾアクチュエータ３８A）だけが針部（チップ部３６）に近接しており、よりストロークが長いため大型の近接部（Z駆動部４４）はアーム部５６を介して別体に配置されているため、コンデンサレンズ２６からの光のけられが最小限でおさえられ、細胞の観察に適した配置をとることができる。

一般に、細胞は高さ数μｍから１０μｍのものが多いため、駆動部分の質量が大きいマイクロインジェクションではディッシュ１４の底面への衝突を避けるための充分な減速ができず、本実施形態のような高速の駆動は不可能である。従って、本実施形態によれば、導入確率の高い速度を維持しながら、針がディッシュ底面への衝突を起こさず、針の破損の危険が少ない細胞操作装置を構成できる。

また、本実施形態では細胞を対象としたが、対象は他の微細物であっても良い。ここで、微細物とは、近接部としてのＺ駆動部４４によって対象操作部であるチップ部３６を対象に近接させる際や、駆動部としてのピエゾアクチュエータ３８Ａによってチップ部３６を駆動して対象を操作する際に、対象とチップ部３６の位置関係を目視で正確に把握するのが困難であって拡大観察が必要な大きさ程度のものであることを意味している。この微細物としては、具体的には、細胞のほかに卵子、リポソーム、人工膜構造、等が挙げられる。膜構造の対象には急速駆動等により穿孔することができ、それにより遺伝子、タンパク質等の物質導入を行うことができる。また、細胞、卵子等は急速駆動で撃力を与えることにより力学刺激を与えることができる。

また、本実施形態では、穿孔動作が近接する操作より速いことを特徴とする場合を示したが、細胞の特性によっては、近接する操作と方向が異なる駆動、速度が遅い駆動、異なる駆動パターンによりより効率のよい穿孔が可能であることも考えられる。また、細胞に近づく方向だけでなく、他の軸に向いた駆動も合わせることで穿孔その他の操作を効率的に行うことができる場合がある。たとえば細胞をなぞる動き、なぞる動きを往復または表面上を２次元スキャンしつつ針を細胞内に陥入する動き、細胞方向に対する振動的運動を行いつつ細胞表面をなぞるまたは振動的運動を行いつつ２次元スキャンする動き、等である。また、穿孔以外の動作、たとえば力学刺激のような細胞操作を行う場合にも、細胞膜の特性によっては、近接する操作と方向が異なる駆動、速度が遅い駆動、異なる駆動パターン、２軸、３軸の駆動等により、より効率のよい細胞操作が可能になることも考えられる。

いずれの場合も、近接操作を行うアクチュエータ（Ｚ駆動部４４）と異なる独立のアクチュエータ（ピエゾアクチュエータ３８Ａ）によって駆動することにより、より効率的な細胞操作を行うことが可能になる。

［第２実施形態］
次に、本発明の第２実施形態に係る細胞操作装置について、図８を参照して説明する。図８は、本実施形態に係る細胞操作装置の特徴部の構成を示す図である。

本実施形態においては、細胞操作装置１０の装置本体３０は、上記第１実施形態のようにコンデンサレンズ２６に装着される構成ではなく、顕微鏡下部から顕微鏡上側の顕微鏡ＸＹステージ１８にブリッジ状の支持部材９６を渡して、そこに取り付ける構成としたものである。

このような構成としても、上記第１実施形態と同様の効果が得られる。
以上、実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。

例えば、細胞操作装置１０の装置本体３０の装着位置は、コンデンサレンズ２６を支持する支持部等、上記第１及び第２実施形態で説明した以外の位置としても良い。

１０…細胞操作装置、 １２…倒立顕微鏡、 １４…ディッシュ、 １８…顕微鏡ＸＹステージ、 ２６…コンデンサレンズ、 ３０…装置本体、 ３２…顕微鏡アダプタ、 ３４…操作モジュール、 ３６…チップ部、 ３８Ａ…ピエゾアクチュエータ、 ３８Ｂ…第２のピエゾアクチュエータ、 ４０…アダプタ、 ４２…アダプタ保持部、 ４４…Ｚ駆動部、 ４６…ＸＹ調整ノブ、 ４８…Ｚ駆動部取付部、 ５０…マグネット、 ５２…嵌合部、 ５４…カンチレバーチップ、 ５６…アーム部、 ５８…シリコンベース部、 ６０…レバー部、 ７４…Ｚ値セットボタン、 ７６…トリガボタン、 ７８…位置検出部、 ８０…入力部、 ８０Ａ…移動指示部、 ８０Ｂ…速度設定部、 ８０Ｃ…移動量設定部、 ８０Ｄ…Ｚ値セット部、 ８０Ｅ…信号発生部、 ８２…記憶部、 ８４…判定部、 ８６…表示灯、 ８８…制御部、 ９０…パワーアンプ、 ９２…電源、 ９６…支持部材。

Claims (18)

1. 対象を操作するための対象操作部と、
   前記対象操作部を前記対象に近接させる近接部と、
   前記対象を操作するように、前記対象に近接させられた対象操作部を駆動する駆動部と、
   を具備することを特徴とする操作装置。
2. 前記駆動部は、前記対象に撃力を与えるように前記対象操作部を駆動することを特徴とする請求項１に記載の操作装置。
3. 前記駆動部は、前記対象を穿孔するような操作をするように前記対象操作部を駆動することを特徴とすることを特徴とする請求項１または２に記載の操作装置。
4. 前記駆動部は、前記対象に近接させられた前記対象操作部を、前記近接部が近接させるときと異なる速度で駆動することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の操作装置。
5. 前記駆動部は、前記対象に近接させられた前記対象操作部を、前記近接部が近接させるときよりも速い速度で駆動することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の操作装置。
6. 前記駆動部は、前記対象操作部の直近にあり、
   前記駆動部は、アーム部を介して前記近接部と接続されていることを特徴とする請求項請求項１乃至５のいずれかに記載の操作装置。
7. 前記駆動部は、前記対象操作部の前記対象の方向の速度成分が５０ｍｍ／ｓを超えるように、前記対象操作部を駆動することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の操作装置。
8. 前記駆動部は、前記対象操作部の前記対象の方向の速度成分が１００ｍｍ／ｓを超えるように、前記対象操作部を駆動することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の操作装置。
9. 前記駆動部は、前記対象操作部に対して、少なくとも３軸の自由度を持った運動を与えることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の操作装置。
10. 前記対象操作部は、前記駆動部に接続された弾性部材によって保持され、該弾性部材から略直角方向に延伸され、
    前記対象操作部の前記弾性部材からの延伸の方向が、前記対象の方向であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の操作装置。
11. 前記アーム部を介して前記駆動部と対向する位置に配置され、前記駆動部とは逆相で動作する第２の駆動部を更に具備することを特徴とする請求項６に記載の操作装置。
12. 前記駆動部と前記第２の駆動部は、一方の駆動軸の延長線上に他方の一部が設置されることを特徴とする請求項１１に記載の操作装置。
13. 前記駆動部の駆動軸と前記第２の駆動部の駆動軸とは、略一致していることを特徴とする請求項１１に記載の細胞操作装置。
14. 前記近接部と前記対象操作部は、拡大された前記対象の像の情報を用いることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の操作装置。
15. 前記対象は、微細物であることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の操作装置。
16. 前記対象は、薄膜構造をもつことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載の操作装置。
17. 前記駆動部は、前記近接部と独立して備えられていることを特徴とする請求項１乃至１6のいずれかに記載の操作装置。
18. 前記駆動部は、前記針部と近接して備えられていることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれかに記載の操作装置。

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