JP2007319038A

JP2007319038A - 細胞操作装置

Info

Publication number: JP2007319038A
Application number: JP2006150355A
Authority: JP
Inventors: Kiyohiko Tateyama; 清彦館山
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2007-12-13

Abstract

【課題】遺伝子導入作業等の細胞操作に要するコストを低減し、細胞内への遺伝子導入等の操作をより確実に行う。
【解決手段】生細胞に導入しようとする生理活性物質を保持する先端部１３Ａを備え、少なくとも該先端部１３Ａが生細胞内に挿入される針部１３と、該針部１３の先端部１３Ａを生細胞内に移動させる駆動手段１４と、該駆動手段１４により移動された針部１３の先端部１３Ａの位置に関する３次元情報を出力する位置情報出力部７とを備える細胞操作装置１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞操作装置に関するものである。

従来、細胞に導入する遺伝子等の導入物質を物理吸着により固定した原子間力顕微鏡のカンチレバー先端の針部を細胞内に侵入させることで遺伝子導入を行う技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この技術においては、カンチレバーを変位させながら、カンチレバーに作用する力の変動を監視することにより、カンチレバー先端の針部が細胞の細胞膜に刺さったことあるいは細胞膜から引き抜かれたことを検出することとしている。
特開２００３−３２５１６１号公報

しかしながら、特許文献１の技術では、カンチレバーに作用する力の変動を監視することにより、針部の先端が細胞の細胞膜に刺さったか否かを間接的に，検出するのみであり、現実に針部の先端が細胞膜に刺さったか否か、核に刺さったか否かを明確に判断することができないという問題がある。このため、遺伝子導入が安定せず、良好な導入率を得ることができないという不都合がある。

また、遺伝子を保持した針部の細胞膜内への侵入を原子間力顕微鏡により測定しながら行うこととしているが、原子間力顕微鏡は極めて高価であるため、遺伝子導入作業のコストが増大する不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、遺伝子導入作業等の細胞操作に要するコストを低減し、細胞内への遺伝子導入等の操作をより確実に行うことを可能とする細胞操作装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生細胞に導入しようとする生理活性物質を保持する先端部を備え、少なくとも該先端部が前記生細胞内に挿入される針部と、該針部の先端部を前記生細胞内に移動させる駆動手段と、該駆動手段により移動された前記針部の先端部の位置に関する３次元情報を出力する位置情報出力部とを備える細胞操作装置を提供する。

上記発明においては、前記生理活性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のうちいずれかを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、前記位置情報出力部は、前記先端部が前記細胞のどの部位に存在するかに関する情報を出力することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記位置情報出力部は、前記先端部が前記細胞の細胞膜、細胞質または核のいずれの部位に存在するかに関する情報を出力することとしてもよい。
また、前記位置情報出力部は、前記細胞の細胞膜、細胞質または核のいずれかと、前記先端部を含む前記針部との相対位置を示す画像を出力することとしてもよい。

また、上記発明によれば、前記位置情報出力部は、光学的な２次元方向の複数回の走査により得られた当該２次元方向と直交する方向に積層される複数枚の前記細胞の断面像または前記細胞の３次元像に基づいて情報を出力することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記位置情報出力部は、共焦点顕微鏡または第２高調波顕微鏡によって取得される前記細胞の画像に基づいて情報を出力することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記位置情報出力手段が、前記細胞膜に前記針部の接触していることを示す情報を出力するときに、前記針部を所定の方向に振動させる振動手段を備えることとしてもよい。

本発明によれば、遺伝子導入作業等の細胞操作に要するコストを低減し、細胞内への遺伝子導入等の操作をより確実に行うことができるという効果を奏する。

以下、本発明の第１の実施形態に係る細胞操作装置１および細胞操作方法について、図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞操作装置１は、図１に示されるように、細胞の３次元像を観察するための共焦点顕微鏡装置２に備えられる。

共焦点顕微鏡装置２は、細胞を収容した容器３載置するステージ４と、該ステージ４上の細胞に照射する励起光を発生する励起光源装置５、該励起光源装置５から発せられた励起光を２次元的に走査するスキャナ（図示略）と、該スキャナにより走査された励起光が細胞に照射されることにより細胞内の蛍光物質が励起されて発生し、スキャナを介して戻る蛍光を通過させる共焦点ピンホール（図示略）と、該共焦点ピンホールを通過した蛍光を検出する光検出器６と、前記スキャナによる走査位置と光検出器６により検出された蛍光の強度とに基づいて２次元的な蛍光画像を生成する画像処理装置（位置情報出力部）７と、ステージ４を駆動制御するステージコントローラ８と、励起光源装置５および光検出器６を制御する顕微鏡コントローラ９と、画像処理装置７により処理された画像を表示する表示装置１０とを備えている。

共焦点顕微鏡装置２は、ステージ４を上下に移動させることにより、細胞の２次元的な蛍光画像を得る断面位置を上下に変化させることができ、これにより得られた複数枚の２次元的な蛍光画像に基づいて、細胞の３次元情報を観察することができるようになっている。

また、前記共焦点顕微鏡装置２には、細胞を明視野観察するために、光検出器６とは反対側から照明光を照射する透過照明光源１１Ａおよび、該透過照明光源１１Ａから発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ１１Ｂと、細胞に対して光検出器６と同一方向から照明光を照射する落射照明光源１１Ｃとが備えられている。
また、共焦点顕微鏡装置２には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ１２とが備えられている。

本実施形態に係る細胞操作装置１は、前記共焦点顕微鏡装置２のステージ４近傍に配置され、細胞に対して先端１３Ａを挿入される挿入される針部１３と、該針部１３を移動させる駆動ユニット１４と、該駆動ユニット１４を制御する駆動ユニット制御回路１５とを備えている。駆動ユニット１４は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に針部１３を移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。

前記針部１３は、図２に示されるように、駆動ユニット１４に取り付けられた導入針保持具１６に、微動ユニット１７を介して取り付けられた取付部材１８の先端に斜め下向きに取り付けられたガラスキャピラリーチューブである。ガラスキャピラリーチューブからなる針部１３内には、細胞内に導入するためのＤＮＡ、ＲＮＡあるいはタンパク質のような生理活性物質（図示略）が収容されており、先端１３Ａから吐出させることができるようになっている。
また、針部１３内に収容された生理活性物質には、励起光により励起されて蛍光を発生するローダミン等の色素が予め混合されている。

取付部材１８と導入針保治具１６との間に配置された微動ユニット１７は、例えば、積層された圧電素子により構成され、所定の周波数の交流電圧を加えることにより、所定の周波数および振幅の振動を生じさせることができるようになっている。図２に示されるように圧電素子は取付部材１８と導入針保治具１６との間に水平方向に配置されているので、電圧を加えることにより導入針保治具１６に対して取付部材１８を水平方向に振動させ、該取付部材１８に斜め下向きに取り付けられている針部１３の先端１３Ａを水平方向に微動させることができるようになっている。

また、微動ユニット１７には、該微動ユニット１７を制御する微動ユニット制御回路１９が接続されている。微動ユニット１７による針部１３の先端１３Ａの動作範囲は、細胞にダメージを与え過ぎない範囲、例えば、細胞の核内のみに制限されている。

このように構成された本実施形態に係る細胞操作装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞操作装置１を用いて、遺伝子等の導入物質を細胞Ａ内に導入するには、ステージコントローラ８および顕微鏡コントローラ９を作動させ、ステージ４の作動により観察したい細胞Ａを顕微鏡観察下に配置する。共焦点顕微鏡装置２により観察する細胞Ａの断面位置と針部１３の先端１３Ａ位置とは予め座標系の較正を行っておく。

そして、図３（ａ）に示されるように、共焦点顕微鏡装置２による細胞Ａの観察断面Ｐを針部１３の先端１３Ａの目標侵入位置に一致させた状態で２次元的な蛍光画像の観察を行いながら、駆動ユニット制御回路１５の作動により、駆動ユニット１４を作動させる。これにより、遺伝子等の生理活性物質を収容したガラスキャピラリーチューブからなる針部１３を細胞Ａに近接させる。

駆動ユニット１４の作動により針部１３の先端１３Ａが細胞Ａの目標侵入位置に到達すると、針部１３内に収容されている生理活性物質に混合された色素が励起されて蛍光が発せられる。したがって、図４（ａ）に示されるように、共焦点顕微鏡装置２により取得される蛍光画像内に、高い輝度を有する点Ｓ_１として針部１３の先端１３Ａが表示されるようになる。そこで、駆動ユニット１４の作動を停止する。

次いで、微動ユニット制御回路１９の作動により微動ユニット１７を作動させる。微動ユニット１７を作動させることにより、針部１３の先端１３Ａが水平方向に微動して細胞Ａの細胞膜Ｂが破れると、図４（ｂ）に示されるように、針部１３内に収容されている生理活性物質が核Ｃ内に放出されるため、蛍光画像内に表示されている針部１３の周囲の蛍光範囲Ｓ_２が広がり始める。

これにより、針部１３の先端１３Ａが核Ｃに刺さったことを確認でき、微量の遺伝子等の生理活性物質を、より確実に核Ｃ内に導入することができる。その後、図４（ｃ）に示されるように、駆動ユニット１４を逆方向に移動させて針部１３を核Ｃ内から引き出す。

このように、本実施形態に係る細胞操作装置１によれば、共焦点顕微鏡装置２により細胞膜Ｂや核Ｃの断面像を取得し、取得された断面像に基づいて、針部１３の先端１３Ａを侵入させるため、針部１３の先端１３Ａの３次元情報を表示装置に表示させ、より確実に核Ｃ内に位置決めすることができる。また、共焦点顕微鏡装置２による細胞膜Ｂや核Ｃの断面像を観察しながら、微動ユニット１７の作動により細胞膜Ｂを破断させるので、より確実に生理活性物質の核Ｃ内への導入を行うことができる。

なお、本実施形態に係る細胞操作装置１においては、共焦点顕微鏡装置２により、細胞Ａの断面の蛍光画像を確認しながら針部１３を駆動し、蛍光画像内に現れる針部１３の先端１３Ａの像を針部１３の先端１３Ａの位置に関する３次元情報として表示装置１０に表示することとしたが、これに代えて、第２高調波顕微鏡を用いて、同様に３次元情報を表示装置１０に表示することとしてもよい。

また、本実施形態においては、細胞Ａに刺し入れる針部１３として、生理活性物質を収容したガラスキャピラリーチューブを採用したが、これに代えて、カンチレバーの先端に備えた針部１３の表面に、化学的あるいは電気的方法により生理活性物質を保持させたものを使用してもよい。
また、生理活性物質にローダミン等の色素を混合することとしたが、これに代えて、生理活性物質に光学的に検出可能な標識を施すこととしてもよい。

本発明の第１の実施形態に係る細胞操作装置を示す全体構成図である。図１の細胞操作装置の針部近傍の構造を示す拡大図である。図１の細胞操作装置を用いた細胞内への生理活性物質の導入作業を説明する図である。図３の導入作業における蛍光画像の変化を示す図である。

符号の説明

Ｂ細胞膜
Ｃ核
１細胞操作装置
２共焦点顕微鏡装置
７画像処理装置（位置情報出力部）
１３針部
１４駆動ユニット（駆動手段）
１７振動ユニット（振動手段）

Claims

生細胞に導入しようとする生理活性物質を保持する先端部を備え、少なくとも該先端部が前記生細胞内に挿入される針部と、
該針部の先端部を前記生細胞内に移動させる駆動手段と、
該駆動手段により移動された前記針部の先端部の位置に関する３次元情報を出力する位置情報出力部とを備える細胞操作装置。
前記生理活性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のうちいずれかを含む請求項１に記載の細胞操作装置。
前記位置情報出力部は、前記先端部が前記細胞のどの部位に存在するかに関する情報を出力する請求項１に記載の細胞操作装置。
前記位置情報出力部は、前記先端部が前記細胞の細胞膜、細胞質または核のいずれの部位に存在するかに関する情報を出力する請求項１に記載の細胞操作装置。
前記位置情報出力部は、前記細胞の細胞膜、細胞質または核のいずれかと、前記先端部を含む前記針部との相対位置を示す画像を出力する請求項１に記載の細胞操作装置。
前記位置情報出力部は、光学的な２次元方向の複数回の走査により得られた当該２次元方向と直交する方向に積層される複数枚の前記細胞の断面像または前記細胞の３次元像に基づいて情報を出力する請求項１に記載の細胞操作装置。
前記位置情報出力部は、共焦点顕微鏡または第２高調波顕微鏡によって取得される前記細胞の画像に基づいて情報を出力する請求項１に記載の細胞操作装置。
前記位置情報出力手段が、前記細胞膜に前記針部の接触していることを示す情報を出力するときに、前記針部を所定の方向に振動させる振動手段を備える請求項１に記載の細胞操作装置。