JP2004069428A

JP2004069428A - 原子及び分子間力顕微鏡

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Publication number: JP2004069428A
Application number: JP2002227569A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Kobayashi; 小林　茂
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-08-05
Filing date: 2002-08-05
Publication date: 2004-03-04

Abstract

【課題】光刺激に対する生体試料の局所的な部位の反応をＡＦＭ観察できる原子及び分子間力顕微鏡を提供する。
【解決手段】原子及び分子間力顕微鏡は、ステージ２７１・対物レンズ２７２・レボルバーＺ移動機構２７６・接眼レンズ２７３・照明光源１０８・透過照明装置２７４を含む倒立型顕微鏡２７０と一体化されている。原子及び分子間力顕微鏡は更に、カンチレバー２０７と、それ用の変位検出ユニット２３０と、カンチレバー２０７を走査する走査機構２１３とを有しており、更に、レーザ１０５と、レーザ光照射の位置と領域と光量と時間を指定する光強度・時間指定部１０３と照射位置・領域指定部１０４と、レーザ光照射の位置と領域と光量と時間を制御する照射位置・領域制御部１００と照射時間制御部１０１と照射光量制御部１０２と、試料全体の蛍光像を得るための撮像部１０６とを有している。
【選択図】　　図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料表面の情報を高い分解能で生態メカニズムを経時的に観察測定することのできる走査型プローブ顕微鏡等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
走査型プローブ顕微鏡のひとつに原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）がある。これは微細加工によって作られたカンチレバーを試料に接触または近接させ、カンチレバーの先端に付けられた探針と試料間に働く原子間力によるカンチレバーのたわみを検出することにより、試料表面の形状を測定するものである。カンチレバーのたわみを測定する手段としては、光テコ法や光干渉計やピエゾ抵抗等があげられるが、最も簡便な手段である光テコ法が最も多く用いられている。
【０００３】
この原子間力顕微鏡は、光学顕微鏡を遙かに上回る分解能を持ちながら、電子顕微鏡のように試料を真空中に入れる必要がない、という利点を有している。従って、空気中や、水溶液をはじめ各種液体中でも観察できる。
【０００４】
また他の利点として、有機分子、ＤＮＡ、蛋白質、蛋白質集合体であるアクチン、微小管、バクテリアの繊毛、各種細胞骨格、核膜と核孔、ウイルスなどの微細構造を固定や染色をせずにとらえることができる。さらに、培養中の生きている動物細胞の微細な形態変化を時間を追って観察することができる。
【０００５】
従来のＡＦＭ装置の典型的な構成例を説明する。図９は、従来の典型的なＡＦＭの全体構成を示す模式図である。この図の装置は、倒立型顕微鏡２７０と一体化されており、透過照明装置２７４を備えている。試料２１１は、ステージ２７１に載せられ支持されている。カンチレバー２０７の先端部下面には、探針２０９が下方に突出するように形成されている。カンチレバー２０７の先端の探針２０９は試料２１１の表面に当てられている。円筒形ＸＹＺスキャナー２１３は、試料面上に対して水平方向（Ｘ，Ｙ）と垂直方向（Ｚ）にカンチレバー２０７を走査する。円筒形ＸＹＺスキャナー２１３は、通常は、ピエゾアクチュエータで構成されており、顕微鏡２７０のアーム２７５に固定されている。カンチレバー２０７は、一般的に剛性の高いアームを介して支柱に保持されている。
【０００６】
カンチレバー２０７の上面には、装置上方に設置されている変位測定用のレーザ発振器２２１から、レーザ光（入射光２３１）が当てられる。この入射光２３１は、カンチレバー２０７の上面に焦点が合った状態で、その表面上で反射される。その反射光２３２は、上方に設置されている検出器２３５に当る。
【０００７】
検出器２３５は、例えば上下二分割型のフォトディテクタ（ＰＤ）で構成され、図１０に示されるように、上下に並べて配置された二つのセンサ、すなわち上側センサＡと下側センサＢを有しており、反射光２３２の入射位置を検出することができる。例えば、反射光２３２が上側に当たると、上側センサＡの光量の方が下側センサＢの光量よりも多くなる。反射光２３２が下に当たると逆となる。
【０００８】
ＰＤ２３５の信号は、アナログ信号のため、Ａ／Ｄ変換器２６１で一旦デジタル信号に変換され、データ処理部２６２に送られる。データ処理部２６２は、ＰＤ２３５の各センサＡとＢの信号の和信号と差信号を算出し、その結果は、システム全体を制御するＣＰＵ２５７を介して、Ｚ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４に制御信号として送られる。Ｚ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４は送られてくる制御信号に従って円筒形ＸＹＺスキャナー２１３を駆動する。また、ＣＰＵ２５７は、取得したデータに基づいて所望のデータを表示部２５５に表示させる。
【０００９】
次に、図９のＡＦＭの調整及び動作について説明する。最初、レーザ発振器２２１からレーザ光をカンチレバー探針２０９の先端の表面上に合わせる必要がある。そのため、位置と焦点面が一致するように、レーザ発振器２２１の位置を組立調整時又は測定前に精密に調整する。次に、その反射レーザ光２３２を二分割ＰＤ２３５の指定した中心位置に合わせる調整が必要である。二分割ＰＤ２３５の和信号（Ａ＋Ｂ）が最大になるようにレーザ入射光２３１の位置を調節し、次に差信号（Ａ−Ｂ）が最小になるように二分割ＰＤ２３５の位置を調整する。
【００１０】
これらの調整が終わった後にカンチレバー２０７を試料に接触させ、サンプルスキャンの場合は試料２１１をカンチレバー２０７で走査する。このとき二分割ＰＤ２３５の差信号をモニタすることによって、試料２１１表面の形状を表示部２５５で画像表示することができる。また、二分割ＰＤ２３５の差信号が一定になるように、すなわちカンチレバー２０７と試料２１１の間に働く力が一定になるようにフィードバックをかけながら、試料表面の形状を画像化することも可能である。また、検出器２３５は四分割ＰＤが用いられてもよい。
【００１１】
上記の制御を行うことにより、たわみとねじれを一定値に保つように制御しながら走査し、各々の制御電圧の結果を画像化することにより、試料表面の形状が分かる。
【００１２】
また、表面形状観察以外の測定方法には、注目する分子の力定数測定がある。これは、Ｚ方向の制御を行うのみで実行できる。
【００１３】
また、光学顕微鏡を用いた光学観察は、透過照明装置２７４から照明し、対物レンズ２７２を通して接眼レンズ２７３で観察ができる。これにより、ＡＦＭ観察を行いながら、試料全体の光学像が観察でき、測定位置等が容易に確認できる。
【００１４】
一方、ＡＦＭ観察が普及されるかなり前から、生態観察においては蛍光を利用した観察もバイオイメージングとして広く利用されている。これは、蛍光試薬を蛍光標識として生態内に取り込み、光励起し発生する蛍光信号を観察する。ＣＣＤカメラで像を検出することで、又は励起光を走査することで画像が得られる。さらに、それを発展させた研究では、単なる蛍光画像化にとどまらず、光刺激などを応用した生物フィジオロジーアプリケーションがある。
【００１５】
例えば、Ｃａｇｅｄは、細胞内で（局所的に）活性物質の濃度を上昇させ、どのような反応が引き起こされるかを観察できるという手法である。従来、細胞外から何らかの刺激を働きかけることで活性化する物質、例えば神経伝達物質、ホルモン、細胞内情報伝達物質が注目されている。これらは、すぐに働き出してしまう反応性分子であるが、反応前には不活性なかたちで細胞に導入しておき、光照射を与えると分子が動き出し反応が開始するようにする。この光照射のタイミングが反応開始のトリガーになり、その後の変化や反応の現象を経時的に画像化して捉える。これらを観察し生態のメカニズムを解明する手がかりをつかんでいく。この場合、一般的に光源は、簡単で安価な為、Ｈｇランプなどが使われている。
【００１６】
また、ＣＡＬＩ（Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）という手法は、生体内の蛋白質の機能を分子レベルで解析する手段として使われている。具体的にはレーザによるダメージを興味ある蛋白質にだけ局所的に与える方法であり、ダメージにより細胞に機能障害が発生する。その障害の様子を経時的に観察し、失活させた蛋白質の細胞内での役割を調べる。主に使われるレーザには、Ｎｄ−ＹＡＧ　ｐｕｍｐｅｄ　ｄｙｅ　ｌａｓｅｒ、Ｎ２　ｄｙｅ　ｌａｓｅｒがある。
【００１７】
いずれも、レーザ光を使った生態内の蛋白質の局所的な動きなどを解明する手法であり、蛍光やレーザを使った試みが広まっている。
【００１８】
前述の生物標本に対して、蛍光を使った検出手段と、原子分子間力と使った手段との両者を併用し、新たな観察手段として従来例が提案されている。
【００１９】
特開平１０−２６０１９０号公報には、倒立顕微鏡と組合せた蛍光ＡＦＭが提案されている。
【００２０】
一般に、この種の走査型蛍光プローブ顕微鏡においては、探針には所定の波長成分の光に励起されて蛍光を発する蛍光物質が付されており、一方、顕微鏡ステージにセットされた試料にも、所定の波長成分の光に励起されて蛍光を発する蛍光物質が付されている。測定開始に際し、所定の波長成分の光を試料及び探針に照射すると、探針及び試料から蛍光が発せられる。実際の測定に際し、探針を試料に位置付ける場合、例えばＣＣＤカメラによって探針の蛍光像及び試料の蛍光像の位置関係をモニタしながら顕微鏡ステージを移動させる。そして、各蛍光像が相互に重なったときに、探針が試料に位置付けられたものとみなして、その試料に対する種々の測定を行っている。
【００２１】
この蛍光の光強度は、相互の蛍光分子間の距離に依存し、励起された蛍光色素の近接する位置にそのエネルギーを吸収する蛍光色素がある場合に本来蛍光として光となるべきエネルギーが第二の蛍光色素の励起光として利用されるエナジー・トランスファー（ＦＲＥＴ）という現象を利用している。
【００２２】
これにより探針の測定位置を所定の蛍光の発光によって確認でき、蛍光観察も行えるシステムである。この際、蛍光観察の為の励起光源として励起水銀ランプやキセノンランプ等を適用可能な光源としている。
【００２３】
特開平８−３０４４２０号公報には、倒立型顕微鏡を用いた原子間力顕微鏡装置に、レーザ共焦点顕微鏡の光学系を導入した装置が開示されており、この装置では、レーザ励起による試料の蛍光観察画像とカンチレバー蛍光画像とが鮮明に観察でき、かつ同時にＡＦＭ観察できる。尚、この実施形態に適用されるカンチレバーにも蛍光処理が施されている。
【００２４】
この従来例の光学顕微鏡の構成を図１１に示す。この光学顕微鏡は、試料２５に対してレーザ光を走査して、その際に発生する試料２５及びカンチレバー１９からの蛍光像を目視観察することによって、試料２５に対するカンチレバー１９の位置合わせを行うように構成されている。
【００２５】
この動作において、レーザ発振器６５から発振された所定波長のレーザ光は、ガルバノメータ６７で反射された後、ダイクロイックミラー６９及び対物レンズ４３を介してステージ２３上の試料２５に照射されると共に、この試料２５を透過してカンチレバー１９に到達する。このとき、ガルバノメータ６７を図中矢印方向に所定角度だけ回動させることにより、レーザ光は、試料２５及びカンチレバー１９上に走査される。
【００２６】
レーザ光が走査された試料２５及びカンチレバー１９から発生した蛍光像は、対物レンズ４３によって取り込まれた後、ダイクロイックミラー６９に導光される。このとき、ダイクロイックミラー６９で反射された蛍光像は、後述するフィルタ７１を透過した後、共焦点用ピンホール７３を通過して光センサ７５に導光され、所定の信号に変換される。光センサ７５から出力された信号は、コントローラ７７によって画像処理された後、モニタ７９上に蛍光像として写し出される。この結果、モニタ７９内には、カンチレバー１９と試料２５の蛍光像が呈示され、試料２５に対する蛍光観察を行いながら同時にカンチレバー１９を用いたＳＰＭ測定を行うことが可能となる。尚、接眼レンズ５１の観察視野にも同様の蛍光像が呈示される。
【００２７】
上述した動作において、レーザ発振器６５からのレーザ光は、その一部が試料２５を透過した透過光又は試料２５からの散乱光となって、ＳＰＭ装置２７内の変位検出光学系５５に伝波されてしまう。このような透過光又は散乱光等の外乱光が変位検出光学系５５に伝波した場合には、試料２５に対するカンチレバー１９の変位を高精度に検出することができなくなってしまう。
【００２８】
そのような不具合を避けるため、ＳＰＭ装置２７には、外乱光のみを除去する外乱光除去フィルタ８１が内蔵されている。この結果、変位検出光学系５５には、外乱光が除去されたカンチレバー１９からの反射光のみが伝波される。
【００２９】
また、ＳＰＭ装置２７の変位検出光学系５５からカンチレバー１９に変位検出用レーザが照射された際、カンチレバー１９からは散乱光が発生する。この散乱光は、試料２５を透過した後、対物レンズ４３からダイクロイックミラー６９及び共焦点用ピンホール７３を介して光センサ７５に導光され、この光センサ７５から出力される信号にノイズとなって表れる。
【００３０】
そのような不具合を避けるため、カンチレバー１９からの散乱光を除去するように、ダイクロイックミラー６９と共焦点用ピンホール７３との間の光路中にはフィルタ７１が配置されている。これにより、モニタ７９内には、カンチレバー１９と試料２５の蛍光像のみが鮮明に呈示される。その結果、試料２５に対する蛍光観察を行いながら同時にカンチレバー１９を用いたＳＰＭ測定を行うことが可能となり、カンチレバー１９を試料２５に対して高精度に位置決めすることができる。従って、試料２５に対する蛍光観察と同時に所定のＳＰＭ測定を行うことが可能な光学顕微鏡を実現することが可能となる。
【００３１】
この従来例は、カンチレバーの位置合わせ精度を向上させる為、またＬＳＭ蛍光観察を行いながら、同時にカンチレバーを用いたＳＰＭ測定を行うことが可能となる例である。
【００３２】
【発明が解決しようとする課題】
近年、医学生物分野の研究が進むにつれて、生体観察試料を光刺激によって、局部的な生態反応を観察・測定したいという要望が高まっている。これらの現象を、蛍光信号を使って画像化する手法はいくつかがあるが、さらに原子分子レベルでの観察となると、ＡＦＭを使ったナノレベルの観察が必須となってくる。
【００３３】
特開平１０−２６０１９０号公報においては、励起光源として水銀ランプやキセノンランプ等を用いている。これは、探針に付着している蛍光物質を励起するための光源として用いられており、あくまでも探針の位置を可視化することを目的としている。従って、ケーラー照明に代表される照明光学系で、探針への光照射を行うか又は試料全体に当てることを主目的としているので、試料の局部的な光刺激反応をみる顕微鏡として利用できない。また、試料の全体照射で観測を試みても、注目部位に対してはエネルギー密度の高いレーザでない為、各種反応に関して適用範囲が狭い。
【００３４】
特開平８−３０４４２０号公報においては、ＬＳＭ光学系を組み合わせて、励起光源としてレーザを使っている。しかし、これも観察用のレーザとしての用途を目的としており、観察視野全体に対しレーザ走査はラスタスキャンを通常行っている為、局部的な照射を行わない。仮に、局部的な照射制御を行おうとした場合、カルバノミラー単独の照射制御の為、微細領域に対する高精度な位置や領域制御、正確な時間制御、照射光量の瞬時の切り替えを実現できず、また照射不要部位にも光があたることもあり、正確な観測ができない。
【００３５】
本発明の目的は、分子の局在の現象解析要望に答える為、光刺激に対する生体試料の局所的な部位の反応をＡＦＭ観察できる原子及び分子間力顕微鏡を提供することである。
【００３６】
【課題を解決するための手段】
本発明の原子及び分子間力顕微鏡は、先端に探針を備えるカンチレバーと、カンチレバーの変位を光学的に検出する変位検出手段と、変位検出手段で得られた検出信号を処理する処理手段と、試料に対してカンチレバーをＸＹＺ走査する走査手段と、試料の全体像を得るための撮像手段と、試料に光刺激を与えるための光ビームを発する光源手段と、光源手段からの光ビームの照射の位置と領域と光量と時間を指定する指定手段と、光源手段からの光ビームの照射の位置と領域と光量と時間を制御する制御手段とを備えている。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００３８】
第一実施形態
本実施形態による原子及び分子間力顕微鏡について図１〜図６を参照して説明する。
【００３９】
本実施形態の原子及び分子間力顕微鏡は、図１に示されるように、倒立型顕微鏡２７０と一体化されており、倒立型顕微鏡２７０は、試料２１１が載せられるステージ２７１と、ステージ２７１の下方に配置された対物レンズ２７２と、対物レンズ２７２を上下に移動させるレボルバーＺ移動機構２７６と、対物レンズ２７２と共働して試料２１１の光学像を得る接眼レンズ２７３と、照明光を発する照明光源１０８と、試料２１１を上方から照明する透過照明装置２７４と、透過照明装置２７４を支持するアーム２７５を備えている。
【００４０】
原子及び分子間力顕微鏡は更に、下方に突出する探針２０９を先端部下面に備えるカンチレバー２０７と、カンチレバー２０７を支持すると共にカンチレバー２０７の変位を検出する変位検出ユニット２３０と、カンチレバー２０７を試料面上に対して水平方向（Ｘ方向とＹ方向）と垂直方向（Ｚ方向）にカンチレバー２０７を走査する走査機構である円筒形ＸＹＺスキャナー２１３とを有している。
【００４１】
円筒形ＸＹＺスキャナー２１３は、通常、ピエゾアクチュエータで構成され、顕微鏡２７０のアーム２７５に固定されている。カンチレバー２０７は、測定時、に、試料２１１に近づけられ、その先端の探針２０９が試料２１１の表面に当てられる。
【００４２】
変位検出ユニット２３０は、カンチレバーの背面に光ビーム２３１を照射する変位測定用光源であるレーザ発振器２２１と、カンチレバーの背面からの反射光ビーム２３２の位置を検出する検出器２３５とを備えている。レーザ発振器２２１からの光ビーム２３１は、カンチレバー２０７の背面に焦点が合った状態で照射される。
【００４３】
検出器２３５は、例えば上下二分割型のフォトディテクタ（ＰＤ）で構成され、受けた光量に対応する信号を出力する上側センサと下側センサとを有する。反射光ビーム２３２の入射位置は、二分割ＰＤ２３５の上側センサと下側センサの受ける光量の差、すなわちそれらの出力信号の差に基づいて求めることができる。
【００４４】
原子及び分子間力顕微鏡は更に、検出器２３５から出力されるアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器２６１と、Ａ／Ｄ変換器２６１からのデジタル信号を処理するデータ処理部２６２と、円筒形ＸＹＺスキャナー２１３を駆動するＺ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４と、システム全体を制御するＣＰＵ２５７と、ＣＰＵ２５７に外部から情報を与えるための入力部１０９と、データを表示する表示部２５５とを有している。
【００４５】
データ処理部２６２は、二分割ＰＤ２３５の上側センサと下側センサの出力の差信号と和信号を算出し、制御情報としてこれをＣＰＵ２５７に送る。ＣＰＵ２５７は、データ処理部２６２からの情報に従ってＺ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４を制御すると共に、Ｚ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４から探針２０９の位置情報を取得して試料２１１のデータを取得し、得られたデータに基づいて所望のデータを表示部２５５に表示させる。
【００４６】
また、原子及び分子間力顕微鏡は、蛍光観察用の励起光ビームを発する光源であるレーザ１０５と、励起光ビーム照射の位置と領域と光量と時間を指定する手段である光強度・時間指定部１０３と照射位置・領域指定部１０４と、励起光ビーム照射の位置と領域と光量と時間を制御する手段である照射位置・領域制御部１００と照射時間制御部１０１と照射光量制御部１０２と、試料２１１の全体の蛍光像を得るための撮像部１０６と、試料２１１からの蛍光を撮像部１０６に方向付けるミラー例えばダイクロイックミラー１０７とを有している。
【００４７】
次に、本実施形態の原子及び分子間力顕微鏡の動作について述べる。
【００４８】
生態試料の全体のアウトラインを把握し照射位置等の設定をする為、撮像部１０６により蛍光像観察を行う。照明光源１０８からの光が、透過照明装置２７４によって、円筒形ＸＹＺスキャナー２１３の中を通って試料に照射される。この照明光により試料の蛍光色素が励起され蛍光を発する。この蛍光像を撮像部１０６において撮像し試料全体の観察像を得る。
【００４９】
照明光源１０８には、一般的に蛍光色素の励起波長域を多く持つ水銀ランプやキセノンランプが用いられる。また、安価なハロゲンランプが用いられてもよいが、その場合には、蛍光色素の励起光源として十分使えない為、アナライザーとポラライザーを試料の前後の光路上に配置して微分干渉像による観察を行う。もちろん、この場合においても、試料の全体像を見ることができる。
【００５０】
画像の焦点合わせはレボルバーＺ移動機構２７６により行われる。焦点面の画像は、撮像部１０６で撮像され、ＣＰＵ２５７を介してキャプチャーされ、表示部２５５において観察される。
【００５１】
図２（ａ）に示されるように、所望の画像が得られたら、その試料中のどの位置に光を照射するのかを指定する。指定方法は、例えば取得画像を表示部２５５で見ながら、入力部１０９から位置や領域を設定する。入力部１０９は、例えば、画面上で位置を指定できるＩ／Ｆであるマウス等で構成され、図２（ｂ）に示されるように、照射位置を示す指標を画像上にオーバーレイすることで、領域の指定を行う。
【００５２】
また、複数の波長の光を用いる場合には、その波長あるいはレーザ１０５を選択する。例えば、細胞のあるＺ位置におけるエリアを円で指定し、そのときの照射レーザの設定、例えば波長４８８ｎｍのＡｒレーザといったレーザの種類と波長の選択を行なう。
【００５３】
加えて、照射強度の選択設定を行う。つまり、照射強度として、０から１００％中の任意の値、例えば５０％を選択するといった設定を行う。さらには何秒間照射するかといった照射時間の設定Ｔ１を行う。
【００５４】
これらは、画像や選択メニュー等の画面を見ながらマウスで設定する。その設定用のソフトウェアはＣＰＵ２５７でコントロールされる。
【００５５】
このような操作により、照射の位置と領域と時間と光量のパラメーター情報が設定される。ＣＰＵ２５７は、照射位置・領域制御部１００と照射時間制御部１０１と照射光量制御部１０２に情報を送り、光強度・時間指定部１０３と照射位置・領域指定部１０４の光学的位置を初期化する。
【００５６】
入力部１０９から照射の開始が入力されると、各部にレーザ照射のトリガーとして伝えられ、レーザ光が、光強度・時間指定部１０３、照射位置・領域指定部１０４を経由した後、図２（ｃ）に示されるように、試料に照射される。照射位置や領域を光学的に制御する照射位置・領域指定部１０４は、例えばガルバノミラーやＡＯＭ素子で構成される。ガルバノミラーは１００からの信号に応答し、それに対応したガルバノの位置に移動する。これを用いれば、図３に示されるように、レーザ光を観察範囲全体にラスター走査することができる。さらに領域を指定することにより、走査範囲が限定される。
【００５７】
これは、一回の走査の説明であるが、高速現象が見たい場合や、繰り返し何回も照射を行う場合、走査速度が速いことが重要である。このような場合、ＡＯＭ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ　Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）がよく利用される。ＡＯＭは音響光学変調素子であり、同様に照射位置・領域指定部１０４からの信号に対して、レーザ光の照射位置を高速で走査できる。
【００５８】
また、時間と光量の制御は、光強度・時間指定部１０３によって行われ、指定された強度と時間だけ、レーザ光が透過される。光強度・時間指定部１０３は、例えばＡＯＴＦ素子（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ　Ｔｕｎａｂｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ）つまり音響光学チューナブルフィルターで構成される。ＡＯＴＦ素子は、高速シャッター機能により光の透過／遮断を高速で切り換えることができ、これにより高精度な領域指定と時間指定が実現される。つまり、レーザ照射する微小な領域に対するレーザＯＮ／ＯＦＦ制御が達成される。
【００５９】
その様子は図４を用いて説明される。レーザ光が入力されるＡＯＴＦ素子１０３には、照射位置・領域制御部１００と照射時間制御部１０１と照射光量制御部１０２からの制御信号が入力される。入力される制御信号に従って、指定された領域に対してのみレーザ光を通過させる信号が求められる。これは、レーザ光の照射時間に換算され、ＡＯＴＦ素子１０３がレーザ光を通過させる時間、すなわちＡＯＴＦ素子１０３の照射ＯＮ時間となる。
【００６０】
ＡＯＴＦ素子１０３を通過したレーザ光は、ガルバノミラー１０４により指定領域に割り振られ試料に照射される。ＡＯＴＦ素子１０３の照射ＯＮ時間と、ガルバノミラー１０４の走査範囲はリンクしており、指定した試料領域への照射に関連付けられている。また、レーザ光照射のＯＮとＯＦＦの境界は、ＡＯＴＦ素子１０３のスイッチング機能により決まるので、試料上の領域を高精度に区分けできる。
【００６１】
さらには、Ｚ方向に移動する機構を利用して、例えば対物レンズ２７２により、図５に示されるように、空間照射を行うことができる。
【００６２】
ＡＦＭ観察は従来技術で述べた通りに行う。特に、本システムは光反応前後の生態の挙動を観測測定するので、試料の測定部分にカンチレバーを設定し、レーザ照射前後の反応を見る。例えば、フォースカーブから力測定を行う場合、レーザ照射前つまり反応前から測定を始め、図６に示されるように、さらに照射後の生態の反応を観測できる。また、レーザ照射中に照射タイミング信号を発生しているので、照射中や照射後のタイミング時間が分かるとともに、その反応の進展も経時的に照らし合わせながら観測できる。図６には、時刻Ｔ１でレーザ照射を開始し、時刻Ｔ２で照射を終了し、時刻Ｔ２以降何らかの反応が生じて分子間力の値が変わっていく例が示されている。
【００６３】
また、表面形状の観測であれば、円筒形ＸＹＺスキャナー２１３を用いてＸＹＺスキャンを行い画像化する。これによりＡＦＭの機能により三次元情報が得られる。この場合もレーザ照射前後の反応を３Ｄ画像化して見ることができるので、経時変化を伴った４Ｄ画像を得ることができる。このＡＦＭのＸＹＺスキャンの速度が速ければ速いほど、より時間分解能を上げたリアルタイム画像が得られる。これにより、分子形状の変化、１分子の動き、距離、結合角度の算出に役立つデータをとることができる。
【００６４】
また、ＡＦＭ観測中にも平行して撮像部１０６で試料の蛍光画像や透過微分干渉画像を同時に観察でき、ＣＰＵ２５７上でオーバーレイして表示ができる。さらに、高速でかつＺ方向に分解能を高めるための観察組合せ例として、撮像部１０６の直前の光路上に、試料と共役な位置に、ノイズ光やフレア光を除去するコンフォーカルディスクを配置することにより、リアルタイムの蛍光画像観察が可能となる。コンフォーカルディスクは、ディスク上に光を透過させる為の複数の小さいピンホールを持ち、試料面の合焦位置に関する蛍光のみを通過させ、その他の面からの蛍光はカットする。従って、フレア光のない鮮明な蛍光画像が得られるだけでなく、撮像部のフレームレートに依存したリアルタイム画像観察も得られる。
【００６５】
また、比較的長い波長の光を発するレーザを選択してもよく、この場合、レーザ光は、散乱せずに、厚みのある試料の中まで集光され得る。これにより、試料深部や、試料を透過してカンチレバーの探針付近に光刺激を与えて、反応を見ることができる。
【００６６】
第二実施形態
本実施形態による原子及び分子間力顕微鏡について図７を参照して説明する。図７において、図１に示された部材と同じ参照符号で示された部材は同等の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００６７】
本実施形態の原子及び分子間力顕微鏡は、第一実施形態の原子及び分子間力顕微鏡に、蛍光を検出する検出光学系を追加した構成を有している。検出光学系は共焦点光学系になっており、試料のＺ方向にシャープな観察画像を得ることができる。このようにレーザを用いて蛍光画像を共焦点光学顕微鏡で観察する装置はＬＳＭ（Ｌａｓｅｒ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）と言われる。またレーザ照射制御及び検出部分を含めた部分をスキャンユニット３００と言う。
【００６８】
通常のＬＳＭ画像観測を述べる。試料上の着目するＺ位置にＺ移動機構２７６により位置を合わせる。レーザ光は、ミラー３０５で反射された後、ダイクロイックミラー３０４を透過する。ダイクロイックミラー３０４は、レーザ１０５からのレーザ光は透過し、それより長い波長の光は反射する特性を有している。所望の励起用のレーザによりレーザ光を試料に照射し、一般には図３に示されるように観察のＸＹ平面をラスター走査する。
【００６９】
試料から発した蛍光は、ダイクロイックミラー３０４に戻り、そこで反射される。その後、蛍光は、ピンホール３０３によって焦点面以外からの光が除外され、さらにバリアーフィルター３０２によって不必要な波長成分が除去された後、検出器３０１によって検出される。これにより、指定したＺ位置でＸＹ画像が得られる。
【００７０】
本実施形態の原子及び分子間力顕微鏡は、第一実施形態と同様に、局部的にレーザ照射できる光学系も兼ね備えている。従って、前述した通り、所望の部位にレーザ照射を行った後に、画像観察用のレーザに切り替え、ＡＦＭ観察と同時に蛍光画像観察のＬＳＭ像を取得できる。
【００７１】
この応用として、Ｚ移動機構２７６により所望のステップでＺ位置を移動させながら各Ｚ位置での複数のＸＹ画像を取得することにより、ＸＹＺ画像の３Ｄ像を構築することもできる。
【００７２】
また、ダイクロイックミラー３０４やバリアーフィルター３０２の光学フィルターは、蛍光試薬の励起、蛍光波長により最適な選択が必要であり、所望の特性のものに交換可能である。
【００７３】
また、検出器３０１は、一般にＰＭＴ（フォトマルチプライヤー）で構成されるが、検出対象によってはＰＤやＣＣＤで構成されてもよい。
【００７４】
第三実施形態
本実施形態による原子及び分子間力顕微鏡について図８を参照して説明する。図８において、図７に示された部材と同じ参照符号で示された部材は同等の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００７５】
本実施形態の原子及び分子間力顕微鏡は、図８に示されるように、第二実施形態の原子及び分子間力顕微鏡に、試料２１１を透過したレーザ光を検出する検出器４０１を追加した構成を有している。
【００７６】
つまり、本実施形態の原子及び分子間力顕微鏡は、レーザ１０５から発せられ試料２１１を透過したレーザ光を検出する検出器４０１を備えている。検出器４０１はファイバーを介して透過照明装置２７４と光学的に接続されている。透過照明装置２７４はファイバーを介して照明光源１０８とも光学的に接続されている。つまり、照明光源１０８から照明光を導くファイバーと、透過照明装置２７４からレーザ光を導くファイバーとは二分岐になっており、透過照明装置２７４は照明と検出を兼ねた構成となっている。
【００７７】
レーザ１０５から発せられ試料２１１を透過し透過照明装置２７４を透過したレーザ光を検出器４０１で検出することによって、ＬＳＭ蛍光画像と同様に、レーザ光による試料２１１の透過画像を得ることができる。このように、ＬＳＭの蛍光観察像のみならず、検出器４０１によりレーザ透過画像を得ることができ、多方面の観察が可能となる。
【００７８】
光強度・時間指定部１０３は、ＡＯＴＦ素子の波長選択機能を用いて、複数の任意領域に、異なる波長の複数のレーザ光を、異なる強度で照射することも可能である。
【００７９】
照射領域は、ＸＹ平面やＸＹＺ空間のみならず、ＸＺ平面やＹＺ平面、あるいは任意の平面上の直線や曲線であってもよい。
【００８０】
また、これらの処理は、ハードウェアとソフトウェアのどちらによっても実現可能である。
【００８１】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べたが、本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【００８２】
例えば、上述した実施形態では、入力部１０９としてマウスを例示したが、入力部１０９はキーボードやジョイスティックなどで構成されてもよい。
【００８３】
また、走査機構は、円筒形ＸＹＺスキャナー２１３に限らず、照明光やレーザ光を遮らない構造であれば、任意のものが適用され得る。また、変位検出ユニット２３０の支持形態も上方から保持することに限定されない。例えば、円筒形ＸＹＺスキャナー２１３と同様の機能を持つ円筒形ＸＹＺステージスキャナーをステージ２７１上に配置し、これにより変位検出ユニット２３０を下方から支持してもよい。
【００８４】
【発明の効果】
本発明の原子及び分子間力顕微鏡によれば、試料の所望の位置と領域に光ビームを所望の時間と光強度で照射することにより、光刺激に反応して起こる試料の局所的な部位の各種反応をＡＦＭ観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一実施形態による原子及び分子間力顕微鏡の構成を示している。
【図２】図１の撮像部で得られる画像と、それに対して設定される照射エリアと、実際に照射されるレーザ光とを示している。
【図３】レーザ光が試料面に対してラスター走査される様子を示している。
【図４】微小な領域に対するレーザＯＮ／ＯＦＦ制御の様子を示している。
【図５】レーザ光が空間照射される様子を示している。
【図６】レーザＯＮ／ＯＦＦの時間制御とそれに対する試料の分子間力値の時間的変化を示している。
【図７】本発明の第二実施形態による原子及び分子間力顕微鏡の構成を示している。
【図８】本発明の第三実施形態による原子及び分子間力顕微鏡の構成を示している。
【図９】従来の典型的なＡＦＭの全体構成を示している。
【図１０】図９の上下二分割型ＰＤの上側センサＡと下側センサＢと、それに入射するカンチレバーからの反射光とを示している。
【図１１】特開平８−３０４４２０号公報に開示された、倒立型顕微鏡を用いた原子間力顕微鏡装置の構成を示している。
【符号の説明】
１００　照射位置・領域制御部
１０１　照射時間制御部
１０２　照射光量制御部
１０３　光強度・時間指定部
１０４　照射位置・領域指定部
１０５　レーザ
１０６　撮像部
２０７　カンチレバー
２０９　探針
２１３　ＸＹＺスキャナー
２２１　レーザ発振器
２３０　変位検出ユニット
２３５　検出器
２５５　表示部
２５７　ＣＰＵ
２６２　データ処理部
２６３　Ｚ走査駆動制御部
２６４　ＸＹ走査駆動制御部
２７０　倒立型顕微鏡

Claims

光刺激に対する生体試料の局所的な部位の反応をＡＦＭ観察する原子及び分子間力顕微鏡であり、
ＡＦＭ観察のための探針を先端に備えるカンチレバーと、
カンチレバーの変位を光学的に検出する変位検出手段と、
変位検出手段で得られた検出信号を処理する処理手段と、
試料に対してカンチレバーをＸＹＺ走査する走査手段と、
試料の全体像を得るための撮像手段と、
試料の局所的な部位に光刺激を与えるための光ビームを発する光源手段と、
光源手段からの光ビームの照射の位置と領域と光量と時間を指定する指定手段と、
光源手段からの光ビームの照射の位置と領域と光量と時間を制御する制御手段とを備えている、原子及び分子間力顕微鏡。
光源手段からの光ビームの照射に反応して試料が発する蛍光を検出する共焦点光学系の検出光学系を更に備えている、請求項１に記載の原子及び分子間力顕微鏡。
光源手段から発せられ試料を透過した光ビームを検出する検出手段を更に備えている、請求項１または請求項２に記載の原子及び分子間力顕微鏡。