JP2010505094A - 解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査 - Google Patents

Abstract

試料が、ルミネセンス放射を放出させる励起用放射（４、５）を照射することによって励起され、かつルミネセンスを発する試料（１０）の画像が取得され、その際、試料（１０）の第１の試料部分ボリューム内では励起用放射の第１のレーザ放射エリア（５）が照射され、かつ試料（１０）の第２の試料部分ボリューム内では励起用放射の第２のレーザ放射エリア（４）が照射され、その際、第１および第２の試料部分ボリュームが、部分的に、ただし完全にではなく重なり合っており、第１のレーザ放射エリア（５）だけが第１の周波数で変調されており、第１の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射が変調フィルタリング検出され、これにより第２の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射が抑制される、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査方法について説明する。

Description

本発明は、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査に関し、特に、検査すべきルミネセンスを発する試料を励起用放射で照明し、ルミネセンスが励起された試料の画像を取得する方法に関する。本発明はさらに、試料の解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査を行うための顕微鏡に関し、この顕微鏡は、ルミネセンスを励起するために試料内に励起用放射を照射するための手段および励起された試料の画像を取得するための手段を有する。

生物プレパラートを検査するための、光学顕微鏡検査の従来の適用分野はルミネセンス顕微鏡検査である。その際、細胞の一部などの試料を特異的に標識するために、特定の色素（いわゆるリン光体または蛍光体）を使用する。前述のように、試料を励起用放射で照明し、それにより励起されたルミネセンス光を適切な検出器で捕捉する。このために光学顕微鏡には通常、２色性ビーム・スプリッタがブロック・フィルタと組み合わせて設けられており、それらが蛍光放射を励起用放射から分離し、別々の観察を可能にする。この措置により、光学顕微鏡において、様々に着色された個々の細胞部分の表示が可能になる。もちろん、プレパラートの異なる構造に特異的に沈着する様々な色素で、プレパラートの複数の部分を同時に着色してもよい。この方法をマルチ・ルミネセンスと言う。それ自体が、つまり色素添加なしで、ルミネセンスを発する試料を測定することもできる。

ルミネセンスとは、ここでは通例どおり、リン光および蛍光の上位概念として理解されており、したがって両方の過程を含んでいる。
さらに、試料検査に走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭとも略す）を使用することが知られており、このＬＳＭは、３次元で照らし出された画像から、共焦点検出装置（共焦点ＬＳＭのこと）または非線形の試料相互作用（いわゆる多光子顕微鏡検査）によって、対物レンズの焦点面内にある平面だけを再現する。これにより、１つの光学的断面が取得され、引き続き試料の様々な深度での複数の光学的断面を記録すれば、適切なデータ処理装置を用いて、様々な光学的断面から構成される試料の３次元画像を生成することができる。このため走査型レーザ顕微鏡検査は、厚いプレパラートの検査に適している。

もちろん、ルミネセンス顕微鏡検査と走査型レーザ顕微鏡検査を組み合わせたものも使用されており、この場合は、ルミネセンスを発する試料を、様々な深度面において、ＬＳＭで結像させる。

原理的に、光学顕微鏡およびＬＳＭの光学的解像度は、物理法則により回折によって制限されている。この制限内で最良の解像を得るために、例えば４Ｐｉ装置または定在波場による装置のような特殊な照明装置が知られている。それにより、解像度は、典型的なＬＳＭに比べて、特に軸方向で、明らかに改善され得る。さらに非線形の抑制工程により、回折によって制限されている共焦点ＬＳＭに比べて解像度を最高で１０倍まで高めることができる。

近年、特にＬＳＭでの光学顕微鏡検査を、古典的なアッベの回折限界を超えた解像度で行うことを可能にする多数の技術が提案または開発されている［ワイ．ガリニ（Ｙ．Ｇａｒｉｎｉ）、ビー．ジェイ．フェルモーレン（Ｂ．Ｊ．Ｖｅｒｍｏｌｅｎ）、およびアイ．ティ．ヤング（Ｉ．Ｔ．Ｙｏｕｎｇ）、「Ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏ ｔｏ ｎａｎｏ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１６巻、３〜１２ページ（２００５年）を参照］。これに関しては、原則的に近視野法と遠視野法での区別が可能であり、その際、遠視野法は、その適用可能性から、生物医学的な領域での３次元結像のために特に関心をもたれている。

従来の蛍光顕微鏡検査の場合、所与の開口数（ＮＡ）および励起波長で、伝送可能な空間周波数のアッベ限界を有意に超えるには、励起光の強度と放出光の強度の間に前述の非線形の関係を作らなければならない［アール．ハインツマン（Ｒ．Ｈｅｉｎｔｚｍａｎｎ）、ティ．エム．ヨフィン（Ｔ．Ｍ．Ｊｏｖｉｎ）、およびシー．クレーマー（Ｃ．Ｃｒｅｍｅｒ）、「Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−ａ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ」、ＪＯＳＡ Ａ１９、１５９９〜１６０９ページ（２００２年）を参照］。これは例えば多光子顕微鏡検査によって達成される［ダブリュ．デンク（Ｗ．Ｄｅｎｋ）、ジェイ．エイチ．シュトリックラー（Ｊ．Ｈ．Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ）、およびダブリュ．ダブリュ．ウェッブ（Ｗ．Ｗ．Ｗｅｂｂ）、「Ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ａ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２４８巻、７３〜７６ページ（１９９０年）を参照］。

別の手法は、ヘルら（Ｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）によって提案された「基底状態抑制」法（ＧＳＤ）［米国特許第５８６６９１１号またはエス．ダブリュ．ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）およびエム．クロウク（Ｍ．Ｋｒｏｕｇ）、「Ｇｒｏｕｎｄ−ｓｔａｔｅ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ａ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ」、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ６０、４９５〜４９７ページ（１９９５年）を参照］もしくは「誘導放出抑制」法（ＳＴＥＤ）［独国特許発明第４４１６５５８号明細書（Ｃ２）、エス．ダブリュ．ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）およびジェイ．ヴィヒマン（Ｊ．Ｗｉｃｈｍａｎｎ）、「Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ：ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．第１９巻、７８０〜７８２ページ（１９９４年））；ティ．エー．クラール（Ｔ．Ａ．Ｋｌａｒ）、イー．エンゲル（Ｅ．Ｅｎｇｅｌ）、およびエス．ダブリュ．ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）、「Ｂｒｅａｋｉｎｇ Ａｂｂｅ’ｓ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｂｅａｍｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｈａｐｅｓ」、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ６４、０６６６１３ページ（２００１年）；（ブイ．ヴェストファル（Ｖ．Ｗｅｓｔｐｈａｌ）およびエス．ダブリュ．ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）、「Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｃａｌ ｐｌａｎｅ ｏｆ ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」、ＰＲＬ 第９４巻、１４３９０３ページ（２００５年）を参照］である。この場合に共通の原理は、試料内でそれぞれ励起強度分布の干渉極大が飽和強度分布の干渉極小と重なり合うように構造化される励起強度分布および飽和強度分布を適用することに基づいている。３重項状態の励起飽和（以下、ＧＳＤ）または蛍光状態の脱励起飽和（以下、ＳＴＥＤ）は、干渉極小のすぐ近くに局在していない分子蛍光を、狙いを定めて消すことを可能にする。その後の放射は、干渉極小からのみ発せられる。イケタキら（Ｉｋｅｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．）によって確立された「アップ・コンバージョン蛍光抑制」技術［ティ．ワタナベ（Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ）、ワイ．イケタキ（Ｙ．Ｉｋｅｔａｋｉ）、ティ．オマツ（Ｔ．Ｏｍａｔｓｕ）、ケイ．ヤマモト（Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ）、エム．サカイ（Ｍ．Ｓａｋａｉ）、およびエム．フジイ（Ｍ．Ｆｕｊｉｉ）「Ｔｗｏ−ｐｏｉｎｔ−ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐ．第２４巻、３２７１〜３２７６ページ（２００３年）を参照］も、類似の方式で機能する。

独国特許出願公開第１９９０８８８３号明細書（Ａ１）は、非線形工程として、蛍光遷移の直接的な飽和を提案している。その際、解像度の上昇は、試料の周期的に構造化された照明に基づいており、これにより高い対象空間周波数が顕微鏡の光学的伝送機能領域内に転送される。この転送は、労力のかかる計算によるデータの後処理によって達成され得る。

このため本発明の課題は、複数の波長に頼ることなく、または労力のかかる計算によるデータの後処理なしで、解像度上昇を達成するルミネセンス顕微鏡検査方法またはルミネセンス顕微鏡を提示することである。

この課題は本発明により、試料が、ルミネセンス放射を放出させる励起用放射を照射することによって励起され、かつルミネセンスを発する試料の画像が取得され、その際、試料の第１の試料部分ボリューム内では励起用放射の第１のレーザ放射エリアが照射され、かつ試料の第２の試料部分ボリューム内では励起用放射の第２のレーザ放射エリアが照射され、その際、第１および第２の試料部分ボリュームが、部分的に、ただし完全にではなく重なり合っており、第１のレーザ放射エリアだけが第１の周波数で変調されており、第１の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射が変調フィルタリング検出され、これにより第２の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射が抑制される、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査方法によって解決される。

さらに、この課題は、ルミネセンス放射の放出を励起するために試料上に励起用放射を照射するための手段と、ルミネセンスを発する試料の画像を取得するための手段とを備えており、その際、励起用放射を照射するための手段が、試料の第１の試料部分ボリューム内に第１のレーザ放射エリアを照射するための手段と、試料の第２の試料部分ボリューム内に第２のレーザ放射エリアを照射するための手段とを有しており、その際、第１および第２の試料部分ボリュームが、部分的に、ただし完全にではなく重なり合っており、第１のレーザ放射エリアを照射するための手段が、第１のレーザ放射エリアを第１の周波数で変調する変調器を有しており、画像を取得するための手段が、第１の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射を変調フィルタリング検出し、これにより第２の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射がフィルタリングによって抑制される、解像度を高めたルミネセンス顕微鏡によって解決される。

本発明による方法および相応の装置は、ＧＳＤまたはＳＴＥＤのように、少なくとも２つのレーザ放射エリアの非線形の協働作用によって、レーザ放射エリアの照射の解像度を超えて解像度を上昇させる「シングル・ポイント」技術に分類され得る。非線形工程としては、独国特許出願公開第１９９０８８８３号明細書（Ａ１）の場合と類似して、蛍光遷移の直接的な飽和を適用し得る。ただし、この場合は、３重項状態の同時の占有が必然的に悪影響を及ぼすということはなくなる。本質的なことは、変調による標識（ＭＭＦ：Modulation-marked-fluorescence「変調による標識蛍光」）ならびに適切な周波数敏感検出および位相敏感検出のうちの少なくとも一つを行うことで、励起レーザおよび飽和レーザによって生成された蛍光を互いに分離するということである。

つまり本発明によれば、解像度を高めるために２つのレーザ放射エリアを照射する。両方のレーザ放射エリアのうちの一方が変調される。このレーザ放射エリアを、以下に中心放射線または中心放射または中心レーザ放射と言う。このレーザ放射エリアに重なり合って、ただし完全には覆わずに、第２のレーザ放射エリアが照射され、その放射は線形には変調されていない。この第２のレーザ放射エリアをここでは以下に側レーザ放射または側レーザ放射線と呼ぶ。両方のレーザ放射エリアは、中心レーザ放射線の極大が側レーザ放射線の干渉極小と重なり合うように構造化されることが好ましい。原理的にこの解像度は、中心レーザ放射線および側レーザ放射線がカップリングされる解像度より改善されている。

本発明による手法は、既知のＧＳＤ方法およびＳＴＥＤ方法をさらに発展させたものである。ただしこの手法はそれらの方法に対して幾つかの利点を有しており、その利点をここで簡単に述べておく。

・ＧＳＤは、３重項占有の飽和に基づいており、このため項間交差率の大きい分子を必要とする。変調による標識蛍光ではこの制限は生じず、なぜなら側レーザ放射線のＴ_１，０励起も、側レーザ放射線のＳ_１，０励起も、中心レーザ放射線によって生成された信号に影響を及ぼさないからである。Ｔ_１，０励起の場合には蛍光を発生させず、一方でＳ_１，０励起の場合には変調されていない蛍光を発生させる。

・ＧＳＤ方法の欠点は、画像生成に必要な走査の際の１ピクセル滞在期間が相対的に長いことである。１つには、３重項飽和に必要な静態的均衡を達成するための期間が必要である（約１０μｓ）。さらに、１つの点を検出した後で隣接する点を検出するために、まず全ての分子で基底状態に戻る緩和が必要である（さらにまた約１０μｓ）。本発明によれば、３重項状態の飽和は必要なく、それにより、下記で基本的に中心レーザ放射線変調の周期によって制限される比較的短い滞在期間で働き得る。

・本発明の枠内で必要とされる強度は、ＳＴＥＤの場合より低くなる。
・本発明の本質的な利点は、色素の選択に関する柔軟性である。ＧＳＤの場合には項間交差が必要なことによる制限がある一方で、ＳＴＥＤの場合は、Ｓ_１，０状態をできるだけ効率よく脱励起し得る分子が必要とされる。これに対し、本発明は、図１に概略的に描かれたエネルギー準位図にだいたい相応するほぼ全ての色素を用い得る。（例えば中程度に長めの蛍光寿命に関し）反応率の最適化は有利であり、だからといって方法を原理的に制限しない。強調すべきは、従来の技術に対する本質的な変更が、励起および検出の種類において求められ得るということであり、検査すべき試料の選択においてはほとんどない（例えば、独国特許出願公開第１０３２５４６０号明細書（Ａ１）とは全く異なる）。

・これまでに実現されたＳＴＥＤの実験では、２つの波長が必要であり、それに引き換え、本発明は１つだけの波長で働く。複数の２色性ビーム・スプリッタを適用する必要はない。そのため、比較的単純な構造を使用し得る。

・ＳＴＥＤの実験では一般的に集中的なパルス・レーザの適用が有意義であり、というのも、側レーザ放射線領域内では励起状態のポピュレーションを蛍光が始まる前に取り払うべきだからである。それに対し、本発明は、同時に照射されるｃｗレーザで働き得る。ただし、中心レーザ放射線による照射を、側レーザ放射線に対して約１０ｎｓ遅らせることが有利であり、なぜなら、このとき既に基底状態の大部分のデポピュレーションが行われているからである（図７を参照）。場合によっては変調をパルス・レーザの形で実現することも可能である。

本発明による変調による標識蛍光（ＭＭＦ）は、高解像の光学結像をさらにまた改善させ得る。ＭＭＦは、既に知られている「シングル・ポイント」方法ＧＳＤおよびＳＴＥＤの両方に対する代替案である。既知の方法のようにＭＭＦも、少なくとも２つのレーザ放射エリア（中心レーザ放射線および側レーザ放射線）によって働く。ただし、ＧＳＤまたはＳＴＥＤでは、側レーザ放射線領域内の蛍光を完全に抑制することに煩わされる一方で、ＭＭＦでは、例えば変調された中心レーザ放射線で励起することで、それに続く関心信号の位相敏感検出により、中心試料領域および側部に励起された試料領域を判別可能になり、したがって、分離可能になる。例えばロック・イン技術による変調周波数敏感検出の適用が、このための中心点である。側レーザ放射線領域内での標識蛍光の回避、つまり中心レーザ放射エリアの光子による励起は、レーザ放射エリアの間の不均衡な強度割合によって、または基底状態のデポピュレーション飽和によって達成可能である。既知の方法のＧＳＤまたはＳＴＥＤに対するＭＭＦの本質的な利点は、蛍光体の選択における自由、および中心レーザと側レーザを同じ波長で実施し得るという可能性である。

以下に本発明を、例のための図面に関連させてさらに詳しく説明する。

本発明の枠内で使用される色素分子または試料の例示的なエネルギー準位図。 本発明による方法または本発明による装置における側放射線および中心放射線に関し、可能な強度分布を示すグラフ。 本発明に基づく装置に関する具体例を示す図。 本発明の様々な実施形態に関し、中心放射線と側放射線の強度割合を示すグラフ。 本発明の枠内で使用し得る例示的な色素に関し、照射されたレーザ放射強度の関数として平衡ポピュレーションを示すグラフ。 ３つの異なる可能なピーク強度に関し、本発明による方法において側レーザ放射線を照射した場合の、正規化座標に沿った基底状態の平衡ポピュレーションを示すグラフ。 別の色素パラメータに関する図６に類似のグラフ。 本発明の特定の実施形態の場合の、照明時間の関数として基底状態および励起状態のポピュレーションを示すグラフ。

図１は、蛍光性色素分子に関し、それ自体既知の一番低いエネルギー準位の典型的な構成を概略的に示している。通常はエネルギーｈｖの光子が、状態Ｓ_０，０（近似的には、一番低い電子状態における振動基底状態）から、振動励起された振電状態Ｓ_１，ｖへと分子を励起する。もちろんその逆も同様に、誘導放出によって可能である。状態Ｓ_１，ｖから状態Ｓ_１，０への速い振動緩和が起こり、次いで蛍光が、または後のリン光を伴う３重項状態Ｔ_１，ｖへの遷移が、競争過程として起こる。

本発明によれば、既知のＧＳＤ方法またはＳＴＥＤ方法での励起レーザ放射エリアおよび飽和レーザ放射エリアと同じように配置された少なくとも２つの異なる光エリアによって励起が行われる。このレーザの使用は有意義であると思われ、だからといって全般的に方法を制限しない。

図２は、規格化座標ｖ＝ｋｒ×Ｎ．Ａ．（ＮＡ：開口、ｋ：波数 ２π／λ、およびｒ：中心からの径方向の距離）に沿ったレーザ放射エリアの可能なエアリー強度分布を示している。これらのエリアを、以下に中心放射線および側放射線と言う。これらの放射線は同じ波長を有し得る。

図３は装置の実施形態を示しており、この装置は、ここではマッハ・ツェンダーに類似の構造を有している。光源１の後ろでは、ビーム・スプリッタ２を介して中心放射線経路４および側放射線経路３への分割が行われ、その際、側放射線経路内には、空間的に放射線を成形するためのユニット５がある。このユニットは、試料１０上に結像されるリング開口などを含み得る。別の可能性は、例えば（ティ．エー．クラール（Ｔ．Ａ．Ｋｌａｒ）、イー．エンゲル（Ｅ．Ｅｎｇｅｌ）、およびエス．ダブリュ．ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）、「Ｂｒｅａｋｉｎｇ Ａｂｂｅ’ｓ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｂｅａｍｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｈａｐｅｓ」、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ６４、０６６６１３ページ（２００１年））に記載されている。もちろん２つの別々の放射線源を使用してもよい。

空間的に放射線成形されない中心放射線経路４に関しては、この放射線を周波数ｆ_ｃで変調する変調ユニット６が設けられている。両方の放射線は、重ね合わされた後で、回折によって制限されて試料１０内に合焦される。このためには対物レンズ９が用いられる。焦点はさらに、スキャン・ユニット８によって２次元で変位される。

したがって試料１０内の様々な位置で、図２に示した中心放射線と側放射線の重なりが現れる。これにより励起された蛍光は、対物レンズ９、スキャン・ユニット８、および好ましくは２色性ビーム・スプリッタ７を介して、例えば共焦点に形成され得る検出器１２によって記録される。機器の稼働は、（図示されていない）制御ユニットが制御する。

ここで、本質的なことは、このようにして測定された蛍光信号を、変調を考慮することによりそれぞれの放射線３、４に分類し得ることであり、つまり蛍光が相応に標識されている。これは変調効果を活用することで達成される。最も簡単な場合には、例えば側放射線は変調させず（ｆ_ｓ＝０）、一方で中心放射線の強度を、典型的には１〜１００ＭＨｚの周波数ｆ_ｃで正弦波状に変化させ、このために中心放射線経路内には相応の変調ユニット６が組み込まれている。この場合、中心放射線によって生成された蛍光信号も同様に周波数ｆ_ｃで変調される。この効果は、とりわけ蛍光寿命を測定するための位相法でも適用される効果に相応する（例えば（エム．ジェイ．ブース（Ｍ．Ｊ．Ｂｏｏｔｈ）およびティ．ウィルソン（Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ）、「Ｌｏｗ−ｃｏｓｔ，ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ 第２１４巻、３６ページ（２００４年））を参照）。代替案として、側放射線および中心放射線をそれぞれ周波数ｆ_ｓおよびｆ_ｃで変調してもよく、その際はｆ_ｓ≠ｆ_ｃとする。

変調周波数ｆ_ｃは、色素に相応に最適化され得る。こうして、図３に具体例として示したようにロック・イン増幅器（１３）を用いて、周波数ｆ_ｃで位相敏感検出すれば、中心放射線によって生成された蛍光信号が抽出される。これに対し、側レーザ放射線によって（も）励起された分子は、非変調蛍光を示し、このため出力口１４での信号には寄与しない。この効果をもっと強化するため、さらに蛍光偏光を活用した偏光敏感検出を行ってもよい。

図２および図３に相応する装置では、側レーザがゼロとは異なる強度を有する試料領域内にある分子が、できるだけ高い確率で、側レーザ放射線によって励起されることが保証される場合、分子単位の解像度が達成され得る。その際、側レーザ放射線によって励起された状態が、１重項特性を有するか、または３重項特性を有するかは重要ではない。本質的なことは、側レーザ放射線によって励起された分子から放出された放射の強度が、周波数ｆ_ｓでは変調されておらず、このためロック・イン方法によって抑制されるということだけである。もちろんロック・イン技術は、位相敏感検出方法または周波数敏感検出方法のための一例でしかない。

前述の条件は、例えば側レーザ放射線５が、試料１０内で蛍光遷移の飽和を起こすほど高い強度を有する場合に満たされ得る。図１に基づいており、振動状態または３重項状態が存在せず、かつ蛍光がＳ_１，ｖから誘導されるか、または自然に起こる２準位系Ｓ_０，０／Ｓ_１，ｖがある場合、静態的均衡におけるＳ_１，ｖ状態のポピュレーションＮ_１，ｖ＝１−Ｎ_０，０が当てはまる：

この場合、Ｎ_ｐ，ｓは（側レーザ放射線５の）光子束であり、σは光学遷移の吸収断面積である。蛍光放射の強度はＮ_１，ｖに比例しており、これにより、直接的に、上述の、高い解像度に必要な、励起光の強度と放出光の強度の非線形の関係を立証し得る。非常に高い光子束に対しては、状態の同等の占有が、したがって飽和が達成される。これに加え、変調された中心レーザ放射線４の強度が側レーザ放射線５に比べてかなり小さい場合（つまりＮ_ｐ，ｓ＞＞Ｎ_ｐ，ｃ）、中心レーザ放射線４による蛍光励起の確率が、干渉極小でだけ著しくゼロと異なる。この状況は、図２での強度推移に相応する割合Ｉ_ｃ／Ｉ_ｓ（中心放射線強度対側放射線強度）が正規化座標ｖの関数として供された図４に基づき明らかになる。その際、それぞれの積分強度の３つの異なる割合が考慮されている。０．０１（つまり側レーザ放射線４が中心レーザ放射線５より１００倍強い）の積分割合の場合、領域１ｖ１＞１では、中心レーザ放射線５による励起の確率が非常に少ないことが認識される。ここに局在する分子は、相応にほとんど変調されていない蛍光を示し、したがって、変調周波数敏感検出の際に抑制される。このため、このメカニズムは、回折限界を超える解像度上昇を達成する。

変形形態では、個々の電子状態の、図１に記入されている振動レベルを共に考慮に入れる。ここでも、まずは３重項状態を無視することとする（ｋ_ＩＳＣ＝０）。側レーザ放射線４を照射した場合の個々の状態の占有を算定するため、第１の近似（コヒーレンス項の無視）において、様々なレーザ強度に対するレート方程式が解かれ得る。図５は、レーザ放射線強度の関数として状態Ｓ_０，０とＳ_１，０のポピュレーション（Ｎ_０，０またはＮ_１，０）を示している。その際、具体例として吸収断面積ｓ＝１０^−１６ｃｍ^−２、振動緩和率ｋ_ｖｉｂ＝（１０^−１２ｓ）^−１、および蛍光率ｋ_ｆｌｕｏ＝（２×１０^−９ｓ）^−１として仮定した。約１０ｎｓの照明期間後に常に達成される静態的均衡に関する値が示されている。全てのポピュレーションについての合計は１で規格化されている。１００ＭＷ／ｃｍ^２より大きい強度に関しては、基底状態がほぼ完全にデポピュレーションされることが分かる。図５でのＮ_０，０曲線からさらに、図６に示した曲線を導き出すことができ、この図６の曲線は、側レーザ放射線によって生成された基底状態デポピュレーションを、座標ｖの関数として具体的に説明している。強度プロフィルは、３つの異なるピーク強度値（極大での強度：２ＭＷ／ｃｍ^２、２０ＭＷ／ｃｍ^２、２００ＭＷ／ｃｍ^２）で、図２に相応に仮定された。基底状態のポピュレーションが干渉極小に絞られる飽和効果が明らかに認識され得る。この時にさらに、変調された中心レーザ放射線を小さな強度で照射すれば、変調励起は基本的に領域ｖ＝０に制限される。これに関しデポピュレーション効果は、上述した異なる励起確率（図４）の状況と共に作用する。

もちろん図６における曲線の特殊な形態は、とりわけ選択された蛍光体または試料１０の特性に依存する。上述の例は、２ｎｓの蛍光寿命に基づいている。より効率のよい飽和（したがってより低い強度）は、より寿命が長い色素を使用する場合に実現され得る。図７は図６に相応しており、その際、ここでは寿命を１０ｎｓと仮定した。この場合、既に２０ＭＷ／ｃｍ^２で、ポピュレーション曲線に平らな部分が現れることが明らかに認識され得る。

現実の系では、極僅かの項間交差という条件は、一般的に完全には満たされない。これに関する典型的な値としては、例えばローダミン６Ｇに関して記録されているようなｋ_ＩＳＣ＝（１０^−６ｓ）^−１およびｋ_Ｐｈ＝（２×１０^−６ｓ）^−１の率を仮定し得る［エム．ホイペル（Ｍ．Ｈｅｕｐｅｌ）、「Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｓｐｅｋｔｒｏｓｋｏｐｉｅ ａｌｓ ｎｅｕｅ Ｍｅｓｓｍｅｔｈｏｄｅ ｚｕｒ ｈｏｅｃｈｓｔｅｍｐｆｉｎｄｌｉｃｈｅｎ Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｒ Ｚｕｓｔａｅｎｄｅ」、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｎｉ−Ｓｉｅｇｅｎ（２００１年）を参照］。図８は、この条件下で、および照射強度を２０ＭＷ／ｃｍ^２と仮定した場合に、状態Ｓ_０，０、Ｓ_１，０、およびＴ_１，０（図１を参照）のポピュレーションが１μｓ内でどのように変化するかを示している。この照明期間はおおよそ、１０ＭＨｚより少し大きい範囲内での変調を検出すべき場合に必要である。選択されたパラメータの場合、ここで示された時間周期の間に、一番低い励起１重項状態と３重項状態がほぼ等しく占有することを認識し得る。静態的均衡において占有は、３重項状態が有利になるようにずれ、３重項状態はその後、この例では約２倍高いポピュレーションを有する。いずれにしても、基底状態は大部分が抑制されている。抑制の程度は、照明期間にはあまり依存せず、むしろ使用したレーザ強度により多く依存する。図２のような側レーザ放射線プロフィルを適用する場合、ここでもまた、図６または図７の飽和効果に類似した飽和効果が生じる。３重項状態の占有は、しばしば、１重項酸素を介して進行する光退色過程と関係付けられるので［（シー．エッゲリング（Ｃ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ）、エー．フォルクマー（Ａ．Ｖｏｌｋｍｅｒ）、およびシー．エー．エム．ザイデル（Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｓｅｉｄｅｌ）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ６Ｇ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｎｅ− ａｎｄ ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ 第６巻、７９１〜８０４ページ（２００５年））を参照］、どちらかと言えば、短い露光期間が有利であろう。ただし中心レーザ放射線５の変調を検出可能に維持することが保証されなければならず、つまり十分な数の蛍光サイクルが必要になる。

ここで、別のレーザ放射エリア配置および変調型式も、上述の方法として考え得ることを述べておく。そうして例えば和周波数または差周波数ｆ_ｓ＋ｆ_ｃまたはｆ_ｓ−ｆ_ｃでのロック・イン検出を適用することにより、２つのレーザ放射エリアが重なった領域内の分子蛍光を、狙いを定めて検出し得る（その場合、中心エリアおよび側エリアという名称は場合によっては該当しなくなる）。その際、２つの単純な（部分的に重なっている）エアリー・プロフィルを選択すれば、いわゆる「点広がり自己相関関数イメージング」の場合に類似した解像度を達成可能である［ジー．ジェイ．ブラケンホフ（Ｇ．Ｊ．Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ）およびエム．ミュラー（Ｍ．Ｍｕｅｌｌｅｒ）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｘｉａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．第２１巻、１７２１〜１７２３ページ（１９９６年）を参照］。

Claims (14)

1. 試料（１０）が、ルミネセンス放射を放出させる励起用放射（４、５）を照射することによって励起され、かつ該ルミネセンスを発する試料（１０）の画像が取得され、その際、
   該試料の第１の試料部分ボリューム内では該励起用放射の第１のレーザ放射エリア（５）が照射され、かつ該試料（１０）の第２の試料部分ボリューム内では該励起用放射の第２のレーザ放射エリア（４）が照射され、その際、
   第１および第２の試料部分ボリュームが、部分的に、ただし完全にではなく重なり合っており、
   該第１のレーザ放射エリア（５）だけが第１の周波数で変調されており、
   該第１の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射が変調フィルタリング検出され、これにより該第２の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射が抑制される、
   解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査方法。
2. 前記第２の試料部分ボリュームが、前記第２のレーザ放射エリア（４）によってルミネセンス飽和にもって行かれる、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２のレーザ放射エリア（４）の強度が、前記第１のレーザ放射エリア（５）の強度より少なくとも５０倍、好ましくは１００倍大きい、請求項１または２に記載の方法。
4. 少なくとも前記第１のレーザ放射エリア（５）が回折によって制限されて前記試料（１０）上に合焦される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記第２のレーザ放射エリア（４）が前記第１の周波数と異なる第２の周波数で変調される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記変調フィルタリング検出がロック・イン技術によって行われる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第１の周波数が１〜１００ＭＨｚである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 解像度を高めたルミネセンス顕微鏡であって、ルミネセンス放射の放出を励起するために試料（１０）上に励起用放射を照射するための手段と、該ルミネセンスを発する試料（１０）の画像を取得するための手段とを備えており、その際、該励起用放射を照射するための手段が、該試料（１０）の第１の試料部分ボリューム内に第１のレーザ放射エリア（５）を照射するための手段と、該試料（１０）の第２の試料部分ボリューム内に第２のレーザ放射エリア（４）を照射するための手段とを有しており、その際、
   第１および第２の試料部分ボリュームが、部分的に、ただし完全にではなく重なり合っており、該第１のレーザ放射エリアを照射するための手段が、該第１のレーザ放射エリア（５）を第１の周波数で変調する変調器（６）を有しており、
   該画像を取得するための手段が、該第１の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射を変調フィルタリング検出し、これにより該第２の試料部分ボリュームからのルミネセンス放射が該フィルタリングによって抑制される、
   解像度を高めたルミネセンス顕微鏡。
9. 前記第２のレーザ放射エリア（４）を照射するための手段が、前記第２の試料部分ボリュームをルミネセンス飽和にもって行くことを特徴とする請求項８に記載の装置。
10. 前記第２のレーザ放射エリア（４）の強度が、前記第１のレーザ放射エリア（５）の強度より少なくとも５０倍、好ましくは１００倍大きい、請求項８または９に記載の装置。
11. 前記第１のレーザ放射エリア（５）のためのレーザ放射を回折によって制限して前記試料（１０）上に合焦させる光学系（９）を特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の装置。
12. 前記第２のレーザ放射エリア（４）を前記第１の周波数と異なる第２の周波数で変調する変調器（６）が設けられる、請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の装置。
13. 前記画像を取得するための手段が、前記第１の周波数および検出器（１２）の信号が供給されるロック・イン増幅器（１３）を有する、請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の装置。
14. 前記第１の周波数が１〜１００ＭＨｚである、請求項８乃至１３のいずれか１項に記載の装置。

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