ITTO20120929A1 - Sistema di microscopia ottica basato su transizioni ottiche saturabili reversibili (resolft), in modulazione di frequenza. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

"Sistema di microscopia ottica basato su transi-zioni ottiche saturabili reversibili (RESOLFT), in modulazione di frequenza"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda in generale le tecniche di microscopia ad alta risoluzione com-plessivamente denominate con 1'acronimo RESOLFT, (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions). Tramite tali tecniche, utilizzando ottiche standard per radiazione visibile in campo lontano è possibile ottenere una risoluzione molto al di sot-to del limite di diffrazione.

In particolare, la presente invenzione si rife-risce ad un sistema di microscopia ottica basato su transizioni ottiche saturabili reversibili (RE-SOLFT), in cui un campione da esaminare contiene una specie chimica presentante almeno due stati di-stinti nei quali detta specie chimica è alternativamente commutabile in modo reversibile, almeno una transizione fra detti almeno due stati essendo in-dotta otticamente, ed in cui detti almeno due stati comprendono uno stato on in grado di generare un segnale ottico da rilevare, ed uno stato off non in grado di generare detto segnale, detto sistema com-prendendo:

primi mezzi generatori per fornire un fascio di attivazione atto a provocare una transizione della specie chimica in detto stato on,

secondi mezzi generatori per fornire un fascio di disattivazione atto a provocare una transizione della specie chimica in detto stato off,

un sistema ottico atto a focalizzare il fascio di attivazione ed il fascio di disattivazione su rispettive aree, parzialmente sovrapposte, di detto campione, ed

un rilevatore atto a rilevare detto segnale ot-tico emesso dal campione e rendere disponibile un corrispondente segnale elettrico di rilevamento.

Con le tecniche convenzionali non è possibile distinguere particolari che sono separati fra loro di distanze minori della distanza determinata dalla legge di Abbe. Tale limite di diffrazione è dovuto alla natura ondulatoria della luce. Nei microscopi convenzionali il limite di diffrazione è determinato dalla lunghezza d'onda utilizzata e dall'apertura numerica del sistema ottico. Il con-cetto RESOLFT supera tale limite commutando tempo-raneamente le molecole in uno stato in cui esse non sono in grado di emettere un segnale (in particola-re, un segnale di fluorescenza) a seguito di illu-minazione.

Fra le tecniche RESOLFT più note si annoverano la microscopia STED (STimulated Emission Depletion) e la microscopia GSD (Ground State Depletion). Me-diante tali tecniche, vengono rilevate strutture che sono normalmente troppo vicine per essere di-stinguibili.

Tutte le tecniche nell'ambito del concetto RE-SOLFT operano su molecole che presentano almeno due stati distinti, che nel seguito verranno indicati "on" ed "off", nei quali le molecole sono in grado di alternativamente commutare in modo reversibile. Almeno una transizione in uno di questi stati è in-dotta otticamente. Nella maggioranza dei casi si utilizzano marcatori fluorescenti. Transizioni fra stati di tali molecole marcatrici sono provocate otticamente. Uno degli stati è luminoso (on), cioè è in grado di generare un segnale, mentre l'altro è oscuro (off), e non è in grado di fornire un segna-le. Una transizione fra essi può essere indotta dalla radiazione luminosa (ad es. on-off, da "lumi-noso" ad "oscuro").

Il campione viene illuminato in maniera non omogenea, con intensità di illuminazione molto bassa (nulla in condizioni ideali) in corrispondenza di un'area prestabilita. Solo in corrispondenza di quest'area le molecole non sono mai nello stato oscuro off (se on è lo stato preesistente) e riman-gono completamente in on. L'area in cui le molecole sono prevalentemente in on (e quindi in grado di fornire un segnale) può essere resa molto piccola (di dimensioni inferiori al convenzionale limite di diffrazione) aumentando l'intensità della radiazio-ne che provoca la transizione. Nel segnale rilevato (principalmente di fluorescenza) il contributo è dato solo dalle molecole nell'area ridotta attorno al minimo di intensità di illuminazione (intensità di illuminazione utilizzata per provocare la tran-sizione on-off). Effettuando una scansione sull'intero campione, cioè spostando il profilo di illuminazione lungo di esso, è possibile rico-struirne un'immagine ad alta risoluzione.

La transizione in senso inverso da off ad on può essere spontanea od anch'essa indotta da radia-zione luminosa di un'altra lunghezza d'onda. Le mo-lecole devono essere commutabili diverse volte per essere presenti nello stato on od off in momenti distinti durante la scansione del campione. Il me-todo funziona anche se stato luminoso e stato oscu-ro sono invertiti; si ottiene in questo caso un'immagine negativa, ed occorre applicare una deconvoluzione dell'immagine per ottenerne il positi-vo .

In particolare, nella microscopia STED un fa-scio di eccitazione è sovrapposto con un secondo fascio spazialmente sagomato in modo da avere un punto di intensità nulla al centro. Tale secondo fascio (generalmente denominato fascio STED), spet-tralmente spostato verso il rosso rispetto al fa-scio di eccitazione, diseccita le molecole di dye precedentemente eccitate al loro stato fondamentale mediante emissione stimolata, prima che tali mole-cole possano emettere un segnale di fluorescenza.

La risoluzione finale del microscopio dipende principalmente dalla sezione d'urto per il processo di emissione stimolata e dall'intensità del fascio STED disponibile. A causa della richiesta di laser ad alta potenza nella linea STED e della complessi-tà della configurazione dei filtri, un microscopio STED è inflessibile in termini di scelta della lun-ghezza d'onda STED. Tale fatto restringe anche la scelta dei dye compatibili che possono essere sottoposti ad imaging in super-risoluzione: nella par-te di emissione, lo spettro del dye deve avere una sovrapposizione significativa con la lunghezza d'onda STED, dal momento che tale sovrapposizione determina l'entità della sezione d'urto per l'emissione stimolata. A causa delle intensità mol-to elevate utilizzate in un microscopio STED, una sovrapposizione dello spettro di eccitazione del dye con la lunghezza d'onda del fascio STED genere-rebbe un intenso segnale indesiderato di fluore-scenza che renderebbe un imaging STED praticamente impossibile. A causa di tali restrizioni, un micro-scopio STED tipico può effettuare un imaging di un numero molto limitato di dye i cui spettri soddi-sfano tutti i requisiti sopra indicati. Di conse-guenza, nei microscopi STED commercialmente dispo-nibili è possibile un imaging solo per dye che rientrano in un campo spettrale molto ristretto.

Quindi, con dye non perfettamente compatibili con le lunghezze d'onda di una certa apparecchiatu-ra STED, il laser STED non provoca soltanto una di-sattivazione della fluorescenza come ci si attende, ma in qualche misura eccita il dye e produce per-tanto un fondo di fluorescenza anche in aree ove la fluorescenza dovrebbe essere quasi completamente disattivata. Convenzionalmente, il fondo prodotto dal fascio STED può essere (in alcune situazioni per configurazioni CW STED a onda continua) trascurato semplicemente aumentando l'intensità di ecci-tazione. Con questo accorgimento è possibile aumen-tare il rapporto segnale/rumore, e quindi effettua-re un imaging. Vi sono tuttavia dei limiti per l'aumento dell'intensità di eccitazione. Innanzi-tutto, a causa della maggior intensità di eccita-zione cresce enormemente il photobleaching dei fluorofori, rendendo impossibile un imaging di campioni opachi. Inoltre, dosi maggiori di radiazione luminosa applicate su campioni biologici interagi-scono con i tessuti e possono danneggiarli. Inol-tre, una maggior potenza di eccitazione deve essere compensata da una maggior potenza STED per ottenere la stessa risoluzione. Ciò è difficilmente possibi-le se non impossibile, dal momento che la sorgente laser non può fornire una potenza illimitata, e che il photobleaching limita comunque le dosi di radia-zione luminosa che possono essere applicate.

Problematiche analoghe affliggono più in gene-rale altre tecniche di microscopia basate su RE-SOLFT, quali ad esempio la microscopia GSD.

Uno scopo della presente invenzione è pertanto quello di superare gli inconvenienti sopra esposti, aumentando la flessibilità dei microscopi STED, e più in generale dei microscopi basati su RESOLFT. Tale scopo è raggiunto secondo l'invenzione da un sistema di microscopia ottica del tipo definito all'inizio, in cui

detti primi mezzi generatori sono configurati per modulare in frequenza detto fascio di attiva-zione, mezzi di filtraggio in modulazione essendo previsti per filtrare detto segnale elettrico di rilevamento in modo da separare una componente principale generata dall'interazione del fascio di attivazione con il campione, da una componente spu-ria generata dall'interazione del fascio di disat-tivazione con il campione.

Nel sistema secondo l'invenzione, un'immagine può essere registrata anche se nel segnale di fluo-rescenza vi è un contributo importante dovuto all'eccitazione da parte del fascio STED. Tale fat-to da solo permette già di risolvere uno dei pro-blemi sopra menzionati, ovvero la scelta ristretta delle molecole di dye compatibili con le lunghezze d'onda dell'apparecchiatura. Inoltre, poiché la lunghezza d'onda STED può essere fissata più vicino al picco di emissione del dye, si ottiene intrinse-camente una sezione d'urto maggiore per il processo STED. Come sopra menzionato, la risoluzione finale di un microscopio STED è governata dalla combinazione dell'intensità del fascio STED e dalla sezio-ne d'urto STED. Una sezione d'urto maggiore implica che a parità di intensità del fascio STED applicata si ottiene una risoluzione significativamente mag-giore. Alternativamente, a parità di risoluzione è possibile applicare una minor intensità del fascio STED. Per l'imaging di cellule viventi, con una intensità complessiva minore sul campione si riduce la potenziale tossicità dovuta all'interazione lu-ce-campione, il che è particolarmente importante per l'imaging in tempo reale o studi time-lapse.

Si osserva inoltre che la presente invenzione è applicabile sia ad apparecchiature utilizzanti la-ser ad onda continua (CW) che a quelle che fanno impiego di laser ad impulsi.

Benché i benefici qui indicati siano riferiti specificamente alla tecnica di microscopia STED, il tecnico del ramo è in grado di apprezzare che i be-nefici dell'invenzione sono ottenibili anche in al-tre tecniche di microscopia RESOLFT, le quali pos-sono essere affette da problematiche simili.

Forma inoltre oggetto dell'invenzione un metodo di microscopia ottica basato su transizioni ottiche saturabili reversibili (RESOLFT), in cui un campio-ne da esaminare contiene una specie chimica presen-tante almeno due stati distinti nei quali detta specie chimica è alternativamente commutabile in modo reversibile, almeno una transizione fra detti almeno due stati essendo indotta otticamente, ed in cui detti almeno due stati comprendono uno stato on in grado di generare un segnale ottico da rilevare, ed uno stato off non in grado di generare detto se-gnale, detto metodo comprendendo le fasi seguenti:

fornire un fascio di attivazione atto a provo-care una transizione della specie chimica in detto stato on,

fornire un fascio di disattivazione atto a pro-vocare una transizione della specie chimica in det-to stato off,

focalizzare il fascio di attivazione ed il fa-scio di disattivazione su rispettive aree, parzial-mente sovrapposte, di detto campione, e

rilevare detto segnale ottico emesso dal cam-pione e rendere disponibile un corrispondente se-gnale elettrico di rilevamento,

in cui detto fascio di attivazione è modulato in frequenza, detto segnale elettrico di rilevamen-to essendo sottoposto ad un filtraggio in modula-zione in modo da separare una componente principale generata dall'interazione del fascio di attivazione con il campione, da una componente spuria generata dall'interazione del fascio di disattivazione con il campione.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del siste-ma secondo l'invenzione diverranno più chiari con la seguente descrizione dettagliata di una forma di realizzazione del trovato, fatta con riferimento ai disegni allegati, forniti a titolo puramente illu-strativo e non limitativo, in cui:

- la figura 1 è una rappresentazione schematica di un microscopio STED secondo l'invenzione;

- le figure 2a-2c sono rappresentazioni schema-tiche di alcuni possibili esempi di realizzazione di rilevatori utilizzabili nel microscopio di figu-ra 1;

- le figure 3a e 3b sono grafici che illustrano rispettivamente spettri di eccitazione ed emissione di sferette fluorescenti, e curve di deplezione di fluorescenza per un microscopio STED convenzionale ed un microscopio STED secondo l'invenzione, in funzione della potenza del laser STED; e

- la figura 4 riporta immagini di sfere di Red Fluorescent con diametro di 40nm (Invitrogen, USA) prese con microscopi confocali, microscopi STED tradizionali e microscopi STED secondo 1'invenzione.

La figura 1 mostra un esempio di realizzazione di un microscopio ottico basato su transizioni ot-tiche saturabili reversibili (RESOLFT), in partico-lare transizioni di fluorescenza, secondo l'invenzione. Mediante tale microscopio è possibile osservare un campione S, il quale contiene una spe-cie chimica, in particolare una molecola di dye fluorescente, presentante almeno due stati distinti nei quali tale specie chimica è alternativamente commutabile in modo reversibile, almeno una transi-zione fra detti almeno due stati essendo indotta otticamente, ed in cui detti almeno due stati com-prendono uno stato on in grado di generare un se-gnale ottico da rilevare, ed uno stato off non in grado di generare il segnale. Nel caso della micro-scopia STED, una molecola di dye fluorescente è portata dal suo stato elettronico fondamentale ad uno stato eccitato di singoletto, in cui emette fo-toni di fluorescenza. Questa è la modalità di fun-zionamento standard nella microscopia di fluore-scenza, e rappresenta lo stato on. Nello stato off il dye è mantenuto in modo permanente nel suo stato elettronico fondamentale mediante emissione stimo-lata. Il dye è in grado di emettere in fluorescenza nello stato on e non nello stato off.

Una prima sorgente luminosa 1 in particolare una sorgente laser, fornisce un fascio di attiva-zione AB avente una lunghezza d'onda nell'intervallo dello spettro visibile, ad esempio 532 nm. La sorgente 1 può essere ad onda continua oppure ad impulsi. Il fascio di attivazione AB è atto a provocare una transizione della specie chi-mica nello stato on in cui la specie chimica è in grado di emettere un segnale da rilevare. Nel caso della microscopia STED, il fascio di attivazione consiste in un fascio di eccitazione atto ad ecci-tare la molecola di dye dal suo stato fondamentale allo stato eccitato (per assorbimento), in cui il dye è in grado di emettere un segnale di fluore-scenza (per emissione spontanea).

Un modulatore 2 è previsto dopo la sorgente lu-minosa 1 per modulare il fascio di attivazione AB con una frequenza fa, preferibilmente di qualche decina di KHz. Tale modulatore può essere costitui-to ad esempio da un modulatore acusto-ottico (AOM), un modulatore elettro-ottico (EOM) od un filtro acusto-ottico sintonizzabile (AOTF). In una forma di realizzazione alternativa, non illustrata, la sor-gente luminosa è in grado da sola di generare un fascio di attivazione modulato, per cui il modula-tore separato può essere omesso. Nell'esempio illustrato, il modulatore 2 si avvale per il suo fun-zionamento di un segnale modulante MS generato da un generatore di frequenza 3.

Un sistema ottico 4, di tipo convenzionale per le tecniche RESOLFT, è atto a focalizzare il fascio di attivazione AB su un'area prestabilita del cam-pione S, essendo inoltre equipaggiato per effet-tuarne un scansione, e quindi spostare l'area di focalizzazione lungo la superficie del campione. Tale sistema ottico 4 può comprendere convenzional-mente specchi, specchi galvanometrici, lenti di scansione, tube lens, lamine a quarto d'onda, lenti di obiettivo, e così via.

Una seconda sorgente luminosa 5, in particolare una sorgente laser, fornisce un fascio di disatti-vazione DB avente una lunghezza d'onda diversa dal-la lunghezza d'onda del fascio di attivazione, ad esempio 642 nm. La sorgente 5 può essere ad onda continua oppure ad impulsi. Il fascio di disattiva-zione DB è atto a provocare una transizione della specie chimica nello stato off in cui la specie chimica non è in grado di emettere il segnale che si vuole rilevare. Nel caso della microscopia STED, il fascio di disattivazione consiste in un fascio di deplezione atto a diseccitare la molecola di dye dallo stato eccitato allo stato fondamentale (per emissione stimolata), prima che il dye emetta il segnale di fluorescenza. In una forma di realizza-zione alternativa, non illustrata, è possibile pre-vedere che fascio di attivazione e fascio di disat-tivazione siano generati da una medesima sorgente in grado di generare differenti lunghezze d'onda.

Nell'esempio illustrato il fascio di disattiva-zione DB non è modulato. Sebbene sia preferibile la configurazione in cui è modulato il solo fascio di attivazione, è possibile concepire che anche il fa-scio di disattivazione possa essere modulato, me-diante un modulatore analogo a quello associato al fascio di attivazione, oppure prevedendo che la sorgente stessa sia predisposta per generare un fa-scio modulato. Nel caso in cui entrambi i fasci siano modulati, è essenziale che la frequenza di modulazione del fascio di disattivazione sia molto maggiore della frequenza di modulazione del fascio di attivazione, in particolare maggiore di almeno due ordini di grandezza.

Nell'esempio illustrato, dopo la sorgente 5 so-no disposti una piastra di ritardo di fase PP, ed il sistema ottico 4.

Il sistema ottico 4 è atto a focalizzare anche il fascio di disattivazione DB su un'area prestabi-lita del campione S, parzialmente sovrapposta all'area di focalizzazione del fascio di attivazio-ne AB, e che può essere spostata insieme ad essa lungo la superficie del campione.

Tipicamente, il fascio di disattivazione DB produce sul campione uno spot a forma di ciambella, il quale è sovrapposto ad una porzione periferica di un spot centrale prodotto dal fascio di attiva-zione. Il campione S emette quindi un segnale otti-co OS determinato dalla sovrapposizione degli ef-fetti di fascio di attivazione e fascio di disatti-vazione. Tipicamente, si tratta di un segnale di fluorescenza. Come è stato detto in precedenza, il segnale ottico emesso comprende una componente principale generata dall'interazione del fascio di attivazione AB con il campione S, e può comprendere una componente spuria, più o meno intensa, generata dall'interazione del fascio di disattivazione DB con il campione S.

Attraverso il sistema ottico 4 il segnale di fluorescenza OS è trasmesso ad un rilevatore 6 atto a rilevare tale segnale ottico ed a rendere dispo-nibile un corrispondente segnale elettrico di rile-vamento. Il rilevatore 6 può comprendere ad esempio un semplice fotomoltiplicatore (fig. 2a), oppure un fotomoltiplicatore seguito da un amplificatore in corrente (fig. 2b), oppure un fotodiodo a valanga seguito da un filtro passabasso (fig. 2c).

Un dispositivo di filtraggio in modulazione 7 è previsto a valle del rilevatore 6 per filtrare il segnale elettrico di rilevamento in modo da separa-re la componente principale del segnale ottico, ge-nerata dall'interazione del fascio di attivazione con il campione, dalla componente spuria generata dall'interazione del fascio di disattivazione con il campione. In particolare, il dispositivo di fil-traggio in modulazione 7 è costituito da un ampli-ficatore lock-in settato alla frequenza fadi modu-lazione del fascio di attivazione. Nel caso in cui entrambi i fasci siano modulati, il dispositivo di filtraggio in modulazione può essere settato in ma-niera corrispondente, per avere ulteriori possibi-lità di analisi del segnale. Vantaggiosamente, il segnale di riferimento utilizzato dall'amplificatore 7 può essere costituito dallo stesso segnale modulante MS prodotto dal generatore di frequenza 3. In alternativa all'amplificatore lock-in, la funzione di filtraggio in modulazione può essere svolta da un filtro passa banda elettronico

Il segnale estratto ES prodotto dall'amplificatore 7 può essere infine ricevuto da un elaboratore 8 per le analisi desiderate.

Per dimostrare sperimentalmente la bontà della presente invenzione, è stata utilizzata una moleco-la di dye notoriamente non adatta per una specifica strumentazione STED, dal momento che lo spettro di eccitazione si sovrappone in maniera significativa con la lunghezza d'onda del fascio STED, il che provoca una significativa generazione di fluore-scenza nelle regioni investite dal fascio STED. In particolare, sono stati effettuati esperimenti con sferette Red Fluorescent (Invitrogen, USA) aventi un diametro di 40 nm, con un'apparecchiatura STED personalizzata (rappresentata in fig. 1). In figura 3a sono rappresentati gli spettri di eccitazione e di emissione di Red Fluorescent. La linea laser di eccitazione a 532 nm dell'apparecchiatura era modu-lata a 20 KHz per mezzo di un modulatore acustoottico, e l'intensità di deplezione era data da un laser ad onda continua a 642 nm. L'emissione di fluorescenza era raccolta da un fotomoltiplicatore seguito da un amplificatore in corrente, ed il se-gnale acquisito era trasmesso ad un amplificatore lock-in settato all'armonica fondamentale di modu-lazione del laser di eccitazione.

Con la modulazione del fascio di eccitazione ed il rilevamento della fluorescenza dipendente dalla frequenza, è stato possibile separare facilmente in tempo reale la fluorescenza proveniente dal fascio di eccitazione da quella generata dal fascio STED, e quindi ottenere una miglior risoluzione rispetto ad un sistema STED senza filtraggio in modulazione. In figura 4 sono riportate immagini delle sferette Red Fluorescent prese con un microscopio confocale (immagini a sinistra), con un microscopio STED convenzionale (immagini centrali), e con il microsco-pio STED modulato nella configurazione sperimentale sopra indicata (immagini a destra). Le immagini ot-tenute con microscopi STED sono state prese utiliz-zando fasci STED di differente potenza (la potenza crescendo dalle immagini in alto verso le immagini in basso).

In figura 3b sono riportate la fluorescenza normalizzata rispetto alla fluorescenza in assenza di fascio di disattivazione, misurata senza fil-traggio lock-in (scala a sinistra), e con filtrag-gio lock-in (scala a destra), in funzione della po-tenza del fascio STED espressa in mW. Tale figura mostra che il filtraggio in modulazione è efficace anche in situazioni in cui la fluorescenza del fa-scio STED è maggiore della fluorescenza del fascio di eccitazione; ciò dimostra il potenziale dell'invenzione.

Come si potrà osservare, la presente invenzione può anche essere facilmente applicata a microscopi preesistenti senza provocare alterazioni nel per-corso dei fasci. È infatti sufficiente che il se-gnale proveniente dal fotorilevatore sia filtrato con il dispositivo lock-in, e che l'intensità del fascio di attivazione sia modulata ad una frequenza di alcune decine di kHz, o più in generale che tale frequenza abbia un periodo di modulazione più lungo del tempo di vita della fluorescenza del marcatore fluorescente. Tale frequenza può essere generata da un generatore di frequenza standard od in alcuni casi anche dallo stesso amplificatore lock-in. Nel caso in cui la sorgente laser non possa essere mo-dulata, è sufficiente inserire un modulatore con-venzionale nel percorso del fascio. L'allineamento del microscopio non ne soffre in maniera rilevabi-le.

D'altro canto, il sistema diventa più flessibi-le in termini di scelta della molecola di dye da investigare. Ciò è un fattore importante anche per l'implementazione di imaging a due colori, dove due differenti molecole di dye con differenti spettri possono essere osservate ad alta risoluzione. La maggior flessibilità nella scelta del dye rende più semplice ed economica 1'implementazione finale del sistema .

Claims (6)

1. RIVENDICAZIONI 1. Sistema di microscopia ottica basato su transi-zioni ottiche saturabili reversibili (RESOLFT), in cui un campione (S) da esaminare contiene una spe-cie chimica presentante almeno due stati distinti nei quali detta specie chimica è alternativamente commutabile in modo reversibile, almeno una transi-zione fra detti almeno due stati essendo indotta otticamente, ed in cui detti almeno due stati com-prendono uno stato on in grado di generare un se-gnale ottico (OS) da rilevare, ed uno stato off non in grado di generare detto segnale, detto sistema comprendendo: primi mezzi generatori (1, 2) per fornire un fascio di attivazione (AB) atto a provocare una transizione della specie chimica in detto stato on, secondi mezzi generatori (5) per fornire un fascio di disattivazione (DB) atto a provocare una transizione della specie chimica in detto stato off, un sistema ottico (4) atto a focalizzare il fa-scio di attivazione ed il fascio di disattivazione su rispettive aree, parzialmente sovrapposte, di detto campione, ed un rilevatore (6) atto a rilevare detto segnale ottico emesso dal campione e rendere disponibile un corrispondente segnale elettrico di rilevamento (DS), caratterizzato dal fatto che detti primi mezzi generatori sono configurati per modulare in frequenza detto fascio di attiva-zione, mezzi di filtraggio in modulazione (7) es-sendo previsti per filtrare detto segnale elettrico di rilevamento in modo da separare una componente principale generata dall'interazione del fascio di attivazione con il campione, da una componente spu-ria generata dall'interazione del fascio di disat-tivazione con il campione.
2. 2. Sistema secondo la rivendicazione 1, in cui detti mezzi di filtraggio in modulazione comprendo-no un amplificatore lock-in.
3. 3. Sistema secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detti primi mezzi generatori comprendono un modulatore per modulare in frequenza detto fascio di at-tivazione.
4. 4. Sistema secondo una delle rivendicazioni prece-denti, costituito da un sistema di microscopia ot-tica a deplezione mediante emissione stimolata (STED), in cui detto fascio di attivazione è costi-tuito da un fascio di eccitazione, detto fascio di disattivazione è costituito da un fascio di deple-zione, e detto segnale ottico è un segnale di fluorescenza
5. 5. Metodo di microscopia ottica basato su transi-zioni ottiche saturabili reversibili (RESOLFT), in cui un campione (S) da esaminare contiene una spe-cie chimica presentante almeno due stati distinti nei quali detta specie chimica è alternativamente commutabile in modo reversibile, almeno una transi-zione fra detti almeno due stati essendo indotta otticamente, ed in cui detti almeno due stati com-prendono uno stato on in grado di generare un se-gnale ottico (OS) da rilevare, ed uno stato off non in grado di generare detto segnale, detto metodo comprendendo le fasi seguenti: fornire un fascio di attivazione (AB) atto a provocare una transizione della specie chimica in detto stato on, fornire un fascio di disattivazione (DB) atto a provocare una transizione della specie chimica in detto stato off, focalizzare il fascio di attivazione ed il fa-scio di disattivazione su rispettive aree, parzial-mente sovrapposte, di detto campione, e rilevare detto segnale ottico emesso dal cam-pione e rendere disponibile un corrispondente se-gnale elettrico di rilevamento (DS), caratterizzato dal fatto che detto fascio di attivazione è modulato in fre-quenza, detto segnale elettrico di rilevamento es-sendo sottoposto ad un filtraggio in modulazione in modo da separare una componente principale generata dall'interazione del fascio di attivazione con il campione, da una componente spuria generata dall'interazione del fascio di disattivazione con il campione.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, consistente in un metodo di microscopia ottica a deplezione me-diante emissione stimolata (STED), in cui detto fa-scio di attivazione è costituito da un fascio di eccitazione, detto fascio di disattivazione è co-stituito da un fascio di deplezione, e detto segna-le ottico è un segnale di fluorescenza.