WO2015151462A1 - 超解像観察装置及び超解像観察方法 - Google Patents

超解像観察装置及び超解像観察方法 Download PDF

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文宏 嶽
洋紀 矢澤
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Definitions

  • the present invention relates to a super-resolution observation apparatus and a super-resolution observation method.
  • a stimulated emission microscope has been proposed as a new unstained microscope that may satisfy these requirements (see Patent Document 1, etc.).
  • the stimulated emission microscope uses the energy level inherent to the observation object, it can sufficiently satisfy the above requirement (2), but there is still room for improvement in order to satisfy the above requirement (1). This is where the current challenges lie.
  • the present invention provides a super-resolution observation apparatus and a super-resolution observation method capable of super-resolution observation without staining a sample in order to solve the above-described problems.
  • An aspect of the super-resolution observation apparatus exemplifying the present invention includes an illumination optical system that condenses the first illumination light having the optical frequency ⁇ 1 and the second illumination light having the optical frequency ⁇ 2 in the region of the observation target surface. a modulator for modulating a characteristic of the first illumination light toward the region at the modulation frequency f m, from the light generated in the region in response to the first illumination light and the second illumination light, the modulation frequency f m An extraction unit that extracts a component of the optical frequency ⁇ 1 or ⁇ 2 whose characteristics change at a higher frequency.
  • An aspect of the super-resolution observation apparatus exemplifying the present invention includes an illumination optical system that condenses illumination light having an optical frequency ⁇ 1 in a region of an observation target surface, and a characteristic of the illumination light that travels toward the region. a modulation unit that modulates at m , and an extraction unit that extracts a component of the optical frequency ⁇ 1 whose characteristics change at a frequency higher than the modulation frequency f m from light generated in the region according to the illumination light. .
  • the first illumination light having the optical frequency ⁇ 1 and the second illumination light having the optical frequency ⁇ 2 are condensed on the region of the observation target surface and headed to the region. modulating a characteristic of the first illumination light at the modulation frequency f m, from the light generated in the region in response to the first illumination light and the second illumination light, the characteristic at frequencies higher than the modulation frequency f m The component of the changing optical frequency ⁇ 1 or ⁇ 2 is extracted.
  • One aspect of the super-resolution observation method of illustrating the present invention condenses the illumination light of the light frequency omega 1 in the area of the observation target surface, it modulates a characteristic of the illumination light directed toward the region at the modulation frequency f m , from the light generated by the region in response to the illumination light, and extracts a varying optical frequency omega 1 of the components of said characteristic at a frequency higher than the modulation frequency f m.
  • a super-resolution observation apparatus and a super-resolution observation method capable of super-resolution observation without staining a sample are realized.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of the super-resolution microscope of the present embodiment.
  • the super-resolution microscope includes a pulsed laser light source 11, a lens 12, a beam splitter 131, a mirror M1, optical parametric oscillators (OPOs) 141 and 143, and an acousto-optic modulator.
  • OPOs optical parametric oscillators
  • AOM Acousto-optic modulator
  • a photodetector 24 such as a photodiode, a lock-in amplifier 25, a signal generator 26, and a personal computer 27 are arranged.
  • the pulse laser light source 11 is a pulse laser light source such as a femtosecond pulse laser light source or a picosecond pulse laser light source.
  • Repetition frequency f r of the pulsed by the pulse laser light source 11 is, for example, 80 MHz
  • pulse laser light pulse width ⁇ T of the pulse laser light source 11 oscillates, for example several hundred fs (femtoseconds).
  • the pulsed laser light emitted from the pulsed laser light source 11 becomes a parallel light beam having a large diameter by the lens 12 and enters the beam splitter 131.
  • the pulse laser beam incident on the beam splitter 131 is divided into a pulse laser beam that passes through the beam splitter 131 and a pulse laser beam that reflects off the beam splitter 131, and the pulse laser beam that has passed through the beam splitter 131 is an optical parametric oscillator 141.
  • the pulse laser beam reflected by the beam splitter 131 is reflected by the mirror M 1 and enters the optical parametric oscillator 143.
  • the optical parametric oscillator 141 converts the optical frequency of the incident pulse laser light into ⁇ 1
  • the optical parametric oscillator 143 converts the optical frequency of the incident pulse laser light into ⁇ 2 .
  • the magnitude relationship between the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is assumed to be ⁇ 1 > ⁇ 2 .
  • Acousto-optic modulator 15 emerging optical path of the optical parametric oscillator 141, i.e. disposed alone optical path of the optical frequency omega 1 of the pulsed laser light, the intensity of the pulsed laser beam toward the time direction with a sine wave of a single frequency f m Modulate.
  • the modulation waveform (modulation frequency f m ) of the pulsed laser light by the acousto-optic modulator 15 is controlled by a control signal supplied from the signal generator 26.
  • the pulsed laser light having the optical frequency ⁇ 1 emitted from the optical parametric oscillator 141 reflects the mirror M 2 through the acousto-optic modulator 15 and reflects the dichroic mirror 134.
  • the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 emitted from the optical parametric oscillator 143 passes through the dichroic mirror 134 and integrates the optical path with the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 1 .
  • the pulsed laser beams having optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 in which the optical paths are integrated with each other are condensed by the objective lens 19 toward a minute region of the observation target surface P 0 of the sample 20 to form a light spot.
  • the light spot pulse laser light of the optical frequency omega 1 on the observation target surface P 0 is formed, with the light spot optical frequency omega 2 of the pulsed laser light is formed on the observation target plane P 0, shape, location , And the size is almost common.
  • a light spot pulse laser light of the optical frequency omega 1 on the observation target surface P 0 is formed, and a light spot optical frequency omega 2 of the pulsed laser light is formed on the observation target plane P 0 simply "light This is referred to as “Spot S”.
  • the relationship between the optical path length of the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 1 and the optical path length of the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 is such that the order of irradiating the observation target surface P 0 is as follows. It has been adjusted in advance.
  • Pulse laser beam with optical frequency ⁇ 1 Pulse laser beam with optical frequency ⁇ 2
  • the pulse laser beam with optical frequency ⁇ 1 irradiated earlier is a specific observation existing in the light spot S Moves the energy level of electrons of the target substance to the excitation level (light absorption), and the pulsed laser beam with the optical frequency ⁇ 2 that is irradiated next moves the electrons being excited to the ground level. (induced emission) is allowed to have functions to generate an induced emission light of the light frequency omega 2.
  • the pulse laser beam with the optical frequency ⁇ 1 that is irradiated first is referred to as “excitation light”, and the pulse laser beam with the optical frequency ⁇ 2 that is irradiated next is referred to as “guide light”.
  • the combination of the pulse shapes (pulse light intensity and pulse width) of the excitation light and the guide light and the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is an observation existing in the light spot S. It is adjusted in advance so that the above-described stimulated emission process (excitation and stimulated emission described above) occurs in the target substance.
  • Each of the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is preferably set within a wavelength range of about ultraviolet to near infrared in terms of wavelength, and the pulse width is set to a time width of picosecond to femtosecond. Is desirable.
  • the pulsed light intensity of each of the excitation light and stimulation light is saturated in the central region A 2 of the light spot S, and, near the light spot S region A 1 is adjusted in advance to an appropriate value so that the light absorption amount at 1 is not saturated.
  • the light absorption amount is saturated, it is only necessary to determine whether or not a high frequency component described later is detected.
  • Each pulse shape (pulse light intensity, pulse width) of the excitation light and the guide light can be adjusted by the shape of the pulse oscillated by the pulse laser light source 11 and the transmission reflectance of the beam splitter 131.
  • an ND filter (not shown) may be disposed in at least one optical path of the excitation light and the guide light, and the transmittance of the ND filter may be adjusted.
  • FIG. 2A shows a time-varying waveform of the excitation light incident on the observation target surface P 0
  • FIG. 2B shows a time-varying waveform of the guide light incident on the observation target surface P 0. is there.
  • the pulse repetition period Tr is common between the excitation light and the guide light, but the timing at which the pulse reaches the observation target plane P 0 between the excitation light and the guide light. Is slightly off.
  • FIG. 2 (c) is an enlarged display of the waveforms of three pulses of excitation light and guide light on the same coordinates.
  • the solid line indicates the excitation light pulse
  • the dotted line indicates the guide light pulse.
  • the difference ⁇ between the timing at which the excitation light pulse reaches the observation target surface P 0 and the timing at which the guide light pulse reaches the observation target surface P 0 is the difference between the excitation light and the induction light.
  • the degree is slightly larger than each pulse width ⁇ T of light, for example, several hundred fs (femtosecond).
  • the super-resolution microscope of the present embodiment In order to adjust the deviation ⁇ timing the excitation light and stimulation light reaches the observation object surface P 0, the super-resolution microscope of the present embodiment, among the alone optical path of the stimulating light alone optical path of the excitation light It is desirable that at least one of the optical paths is provided with an optical path length adjusting mechanism (not shown) configured by a movable mirror or the like.
  • the modulation of the excitation light by the acousto-optic modulator 15 is not visualized, but when visualized, the results are as shown in FIGS. 3A and 3B.
  • the modulation frequency f m of the excitation light by the acousto-optic modulator 15 is sufficiently lower than the pulse repetition frequency f r and satisfies at least the relationship of f m ⁇ f r / 2, for example, f m is about several MHz.
  • the sample 20 is, for example, a transparent living cell housed in a culture container together with a culture solution, and a specific substance (for example, a specific protein such as hemoglobin) in the living cell is an observation target substance. is there.
  • a specific substance for example, a specific protein such as hemoglobin
  • the observation target substance need not be fluorescently stained in advance.
  • the sample stage 28 is a transmission type stage that supports the sample 20, moves the sample 20 in the optical axis direction (Z direction), and moves the sample 20 in a direction perpendicular to the optical axis (XY direction).
  • Z direction optical axis direction
  • XY direction optical axis
  • the sample stage 28 moves the sample 20 toward the Z-direction, is adjusted the depth of the observation target plane P 0 inside the sample 20, the sample stage 28 moves the sample 20 toward the XY directions, observed with the light spot S
  • the target surface P 0 can be two-dimensionally scanned.
  • Light emitted from the light spot S on the observation target surface P 0 that is, excitation light emitted from the light spot S (excess excitation light), induced light emitted from the light spot (excess induced light), and stimulated emission generated at the light spot.
  • the objective lens 21 (numerical aperture, magnification, etc.) is the same as the specification of the objective lens 19, the positional relationship and orientation relationship between the objective lens 21 and the objective lens 19 is symmetrical with respect to the observation target plane P 0 is there.
  • the specification of the objective lens 21 and the specification of the objective lens 19 are common here, they may not be completely common.
  • the numerical aperture of the objective lens 21 may be larger than the numerical aperture of the objective lens 19.
  • the light incident on the objective lens 21 from the distal end side i.e., the excitation light emitted from the light spot S of the observation target plane P 0 (excess excitation light), stimulation light (excess induced emitted from the light spot S of the observation target plane P 0 Light), the stimulated emission light emitted from the light spot S on the observation target surface P 0 is emitted from the pupil side of the objective lens 21, and goes to the photodetector 24 through the wavelength selection filter 22 and the condenser lens 23 in this order.
  • the wavelength selection filter 22 is given wavelength selectivity that cuts one of the light of the optical frequency ⁇ 1 and the light of the optical frequency ⁇ 2 and passes the other.
  • the wavelength selection filter 22 passes light having the optical frequency ⁇ 1 and cuts light having the optical frequency ⁇ 2 .
  • the surplus excitation light (optical frequency ⁇ 1 ) emitted from the light spot S enters the photodetector 24, and the surplus induced light and stimulated emission light (optical frequency ⁇ 2 ) emitted from the light spot S are detected by the photodetector 24. It does not enter.
  • the photodetector 24 is a photoelectric conversion element such as a photodiode that converts the intensity of incident light into an electrical signal.
  • Lock-in amplifier 25 the electric signal output of the photodetector 24, to lock-in detecting a component that changes at a double frequency (2f m) of the modulation frequency f m of the excitation light as a signal.
  • the detection frequency and detection timing of the lock-in amplifier 25 are controlled by a control signal supplied from the signal generator 26.
  • the personal computer 27 takes in the signal detected by the lock-in amplifier 25. Further, the personal computer 27 detects that the light spot S is at each position on the observation target surface P 0 during the above-described scanning (specifically, the central area A 2 of the light spot S is at each position on the observation target surface P 0 .
  • the signal is captured and the signal distribution on the observation target plane P 0 is created as a super-resolution image, it is displayed on a monitor (not shown).
  • FIG. 4 (a) Shown in FIG. 4 (a), a time change waveform of the light irradiated to the peripheral area A 1 of the light spot S, FIGS. 4 (a) code omega 1, the waveform of the excitation light (irradiation excitation light) and a, FIGS. 4 (a) code omega 2 is a waveform of the stimulation light (radiation-induced light) (in FIG. 4, not illustrated fine pulse showed only the envelope of the pulse.) .
  • FIG. 4 (a ') show, the a time variation waveform of the light emitted from the peripheral region A 1 of the light spot S, FIG. 4 (a') code omega 1 did not contribute to the light absorbing excess the waveform of the excitation light, FIG. 4 (a ') code omega 2 is induced light and stimulated emission light (hereinafter, collectively referred to as "surplus induction-emission light”.) composite waveform.
  • FIG. 4B shows a time-varying waveform of light applied to the central area A 2 of the light spot S.
  • FIG. 4B shows a waveform ⁇ 1 of excitation light (irradiation excitation light).
  • FIG. 4 (b) code omega 2 is a waveform of the stimulation light (radiation-induced light).
  • FIG 4 (b ') show, the a time variation waveform of the light emitted from the central region A 2 of the light spot S, FIG. 4 (b') coding omega 1 did not contribute to the light absorbing excess the waveform of the excitation light, FIG. 4 (b ') coding omega 2 is induced light and stimulated emission light (hereinafter, collectively referred to as "surplus induction-emission light”.) composite waveform.
  • the super-resolution microscope of the present embodiment since the excitation light as described above is modulated at the modulation frequency f m, the intensity of the irradiation excitation light for the peripheral region A 1 (FIGS. 4 (a) code omega 1), the central the intensity of the irradiation excitation light for the region a 2 (FIG. 4 (b) code omega 1) are both time-varying at a modulation frequency f m.
  • the light absorption amount in the peripheral region A 1 (not shown)
  • the light absorption amount in the central region A 2 (not shown) is also basically changes with time at a frequency f m.
  • the light absorption amount in the peripheral region A 1 (not shown) whereas not saturated, the light absorption amount in the central region A 2 (not shown) is saturated.
  • the lock-in amplifier 25 has a high frequency component (frequency 2f m ) of excess excitation light (reference symbol ⁇ 1 in FIG. 4 (b ′)) emitted from the central region A 2 from the light generated at the light spot S. It is possible to extract only the components that change in
  • the super-resolution microscope of the present embodiment limits the signal acquisition source to only the central region A 2 smaller than the light spot S, that is, super-resolution observation of the density distribution of the observation target substance in the sample 20. Can do.
  • the detection frequency of the lock-in detection by the lock-in amplifier 25 may be the modulation frequency f m is greater than another value .
  • the detection frequency N ⁇ f m (where, N is the integer of 2 or more) may be. If the detection frequency is increased in this way, the super-resolution effect can be further enhanced. This is because the region of the light spot S that can be a source of high frequency components is limited only to a region with a particularly high light intensity, that is, an extremely narrow region. Therefore, the higher the detection frequency, the higher the super-resolution effect.
  • the optical frequency of the light to be incident on the detector 24 is the same as the optical frequency ⁇ 1 of the excitation light, but may be the same as the optical frequency ⁇ 2 of the guide light.
  • the wavelength selection filter 22 is given wavelength selectivity that cuts light having the optical frequency ⁇ 1 and allows light having the optical frequency ⁇ 2 to pass.
  • the lock-in amplifier 25 uses the high frequency of the surplus guided / emitted light (FIG. 4 (b ′) symbol ⁇ 2 ) instead of the high frequency component of the surplus pumping light (FIG. 4 (b ′) symbol ⁇ 1 ). Ingredients can be extracted. In this case, super-resolution observation is possible. The reason is as follows.
  • stimulated emission amount in the peripheral region A 1 with respect to (not shown) is not saturated, stimulated emission amount in the central region A 2 (not shown) is saturated.
  • the super-resolution microscope of the present embodiment may be configured such that the wavelength selection filter 22 can be switched between two wavelength selection filters.
  • One of the two wavelength selection filters is provided with wavelength selectivity that cuts light of the optical frequency ⁇ 2 and passes light of the optical frequency ⁇ 1 , and the other cuts light of the optical frequency ⁇ 1 , Wavelength selectivity that allows light of optical frequency ⁇ 2 to pass through is provided.
  • a time difference is provided between the timing at which the excitation light reaches the sample 20 and the timing at which the guide light reaches the sample 20, but the time difference may be zero. However, in that case, it is desirable to give a wavelength difference of 3600 cm ⁇ 1 or more in terms of energy between the excitation light and the guide light.
  • ESA excited-state absorption
  • pulsed laser light having an optical frequency ⁇ 1 is used as excitation light
  • pulsed laser light having an optical frequency ⁇ 2 is used as ESA light.
  • Each of the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 ′ is preferably set in a wavelength range of approximately ultraviolet to visible in terms of wavelength, and the optical frequency ⁇ 2 is approximately in the range of visible to near infrared in terms of wavelength. It is desirable to set the wavelength range.
  • the combination of the pulse shapes (pulse light intensity and pulse width) of the excitation light and the ESA light and the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is the ESA in the observation target substance existing in the light spot S.
  • the process is set to take place.
  • the energy level of an electron of a specific observation target substance is transferred to the excitation level (light absorption) with excitation light, and then the excited electron is moved to a higher level with ESA light. It is a process of transition.
  • the pulsed light intensity of the excitation light and the ESA light is saturated in the central region A 2 of the light spot S, and the light absorption amount in the peripheral region A 1 of the light spot S is saturated It is set to a reasonable value so that it does not.
  • FIG. 5 shows a time-varying waveform of each light in the present embodiment.
  • the phase of the time-varying waveform of surplus ESA light that has not contributed to the process is shifted by ⁇ . This is because, in the ESA process, the intensity of excess ESA light decreases as the intensity of excitation light increases.
  • the signal lock-in amplifier 25 of this embodiment detects the amount of light absorption in the peripheral region A 1 whereas not reflected, the light absorption amount in the central region A 2 is reflected.
  • the detection frequency of the lock-in detection by the lock-in amplifier 25 may be the modulation frequency f m is greater than another value.
  • the detection frequency N ⁇ f m (where, N is the integer of 2 or more) may be. If the detection frequency is increased in this way, the super-resolution effect can be further enhanced. This is because the region of the light spot S that can be a source of high frequency components is limited only to a region with a particularly high light intensity, that is, an extremely narrow region. Therefore, the higher the detection frequency, the higher the super-resolution effect.
  • the optical frequency of the light to be incident on the detector 24 is the same as the optical frequency ⁇ 1 of the excitation light, but may be the same as the optical frequency ⁇ 2 of the ESA light.
  • the wavelength selection filter 22 is given wavelength selectivity that cuts light having the optical frequency ⁇ 1 and allows light having the optical frequency ⁇ 2 to pass.
  • the super-resolution microscope of the present embodiment may be configured so that the wavelength selection filter 22 can be switched between two wavelength selection filters.
  • One of the two wavelength selection filters is provided with wavelength selectivity that cuts light of the optical frequency ⁇ 2 and passes light of the optical frequency ⁇ 1 , and the other cuts light of the optical frequency ⁇ 1 , Wavelength selectivity that allows light of optical frequency ⁇ 2 to pass through is provided.
  • GSD ground state depletion
  • FIG. 6 is a configuration diagram of the super-resolution microscope of the present embodiment.
  • the super-resolution microscope of the present embodiment is the same as the super-resolution microscope of the first embodiment except that the CW laser light sources 11-1 and 11-2 and the lens are used instead of the pulse laser light source 11 and the lens 12.
  • 12-1 and 12-2 are used (CW: Continuous Wave), and the optical parametric oscillators 141 and 143, the beam splitter 131, and the mirror M1 are omitted.
  • the CW laser light source 11-1 emits CW laser light having an optical frequency ⁇ 1 through a lens 12-1, and the CW laser light source 11-2 has CW laser light having an optical frequency ⁇ 2 through a lens 12-2. Is emitted.
  • the CW laser light having the optical frequency ⁇ 1 is used as the first excitation light
  • the CW laser light having the optical frequency ⁇ 2 is used as the second excitation light.
  • the combination of the intensity of the first excitation light and the second excitation light and the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is set so that the GSD process occurs in the observation target substance existing in the light spot S.
  • the magnitude relationship between the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is ⁇ 1 ⁇ 2 .
  • the value relationship between the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is set to a value relationship that causes excitation from the ground state to the excited state in the GSD process.
  • each of the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 is desirably set within a wavelength range of approximately ultraviolet to visible in terms of wavelength.
  • the energy level of electrons of a specific observation target substance is transferred (light absorption) to the first excitation level by the first excitation light, and the remaining electrons of the same observation target substance are transferred by the second excitation light. This is a process of shifting to the first excitation level.
  • the intensity of the first excitation light and second excitation light, the light absorption amount is saturated in the central region A 2 of the light spot S, and the light absorption amount in the peripheral region A 1 of the light spot S Is set to an appropriate value so as not to saturate.
  • FIG. 7 shows a time-varying waveform of each light in this embodiment.
  • FIG. 7 (a ') to high-frequency components above the frequency f m in each of the surplus first excitation light and the excess second excitation light emitted from the peripheral region A 1 does not occur against it, as shown in FIG. 7 (b '), high frequency components above the frequency f m is generated in each of the surplus first excitation light and the excess second excitation light emitted from the central region a 2.
  • the signal lock-in amplifier 25 of this embodiment detects the amount of light absorption in the peripheral region A 1 whereas not reflected, the light absorption amount in the central region A 2 is reflected.
  • the detection frequency of the lock-in detection by the lock-in amplifier 25 may be the modulation frequency f m is greater than another value.
  • the detection frequency N ⁇ f m (where, N is the integer of 2 or more) may be. If the detection frequency is increased in this way, the super-resolution effect can be further enhanced. This is because the region of the light spot S that can be a source of high frequency components is limited only to a region with a particularly high light intensity, that is, an extremely narrow region. Therefore, the higher the detection frequency, the higher the super-resolution effect.
  • the optical frequency of the light to be incident on the detector 24 is the same as the optical frequency ⁇ 1 of the first excitation light, but may be the same as the optical frequency ⁇ 2 of the second excitation light.
  • the wavelength selection filter 22 is given wavelength selectivity that cuts light having the optical frequency ⁇ 1 and allows light having the optical frequency ⁇ 2 to pass.
  • the super-resolution microscope of the present embodiment may be configured so that the wavelength selection filter 22 can be switched between two wavelength selection filters.
  • One of the two wavelength selection filters is provided with wavelength selectivity that cuts light of the optical frequency ⁇ 2 and passes light of the optical frequency ⁇ 1 , and the other cuts light of the optical frequency ⁇ 1 , Wavelength selectivity that allows light of optical frequency ⁇ 2 to pass through is provided.
  • CW laser light is used as each of the first excitation light and the second excitation light.
  • pulse laser light may be used.
  • the apparatus configuration in the case of using pulsed laser light is as described in the first embodiment (see FIG. 1).
  • a super-resolution microscope using a one-photon absorption process will be described as a fourth embodiment of the present invention. Here, only differences from the first embodiment will be described.
  • FIG. 8 is a configuration diagram of the super-resolution microscope of the present embodiment.
  • the super-resolution microscope according to the present embodiment is the same as the super-resolution microscope according to the first embodiment except that the CW laser light sources 11-1 and 11-2 and the lens are used instead of the pulse laser light source 11 and the lens 12.
  • 12-1 and 12-2 are used (CW: Continuous Wave), and the optical parametric oscillators 141 and 143, the beam splitter 131, and the mirror M1 are omitted.
  • the CW laser light source 11-1 emits CW laser light having an optical frequency ⁇ 1 through a lens 12-1, and the CW laser light source 11-2 has CW laser light having an optical frequency ⁇ 2 through a lens 12-2. Is emitted.
  • the CW laser light having the optical frequency ⁇ 1 since only the CW laser light having the optical frequency ⁇ 1 is used as the excitation light, the CW laser light having the optical frequency ⁇ 2 toward the observation target surface P 0 is turned off.
  • the CW laser light of the optical frequency omega 2 may be turned off CW laser light source 11-2.
  • the combination of the intensity of the excitation light and the optical frequency ⁇ 1 is set so that a one-photon absorption process occurs in the observation target substance existing in the light spot S.
  • the optical frequency ⁇ 1 is preferably set within a wavelength range of approximately ultraviolet to visible in terms of wavelength.
  • the one-photon absorption process is a process in which the energy level of electrons of a specific observation target substance is transferred to the excited level (one-photon absorption) with excitation light.
  • the sample 20 is a sample containing a fluorescent material (fluorescent sample)
  • spontaneous emission light (fluorescence) with an optical frequency ⁇ 2 is generated from the sample 20.
  • the wavelength selection filter 22 of the present embodiment is given wavelength selectivity that allows light of the optical frequency ⁇ 1 to pass therethrough and cuts light of the optical frequency ⁇ 2 . For this reason, in this embodiment, the fluorescence with the optical frequency ⁇ 2 does not enter the photodetector 24, whereas the excitation light with the optical frequency ⁇ 1 enters the photodetector 24.
  • the intensity of the excitation light in this embodiment is saturated in the central region A 2 of the light spot S, and, to an appropriate value so that the light absorption amount in the peripheral region A 1 of the light spot S is not saturated Is set.
  • FIG. 9 shows a time-varying waveform of each light in the present embodiment.
  • FIG. 9 (a ') as shown in, for high frequency components above the frequency f m is the excess excitation light and the fluorescence emitted from the peripheral region A 1 is not to occur, FIG. 9 (b' as shown in), high frequency components above the frequency f m is generated in excess excitation light and the fluorescence emitted from the central region a 2.
  • the signal lock-in amplifier 25 of this embodiment detects the amount of light absorption in the peripheral region A 1 whereas not reflected, the light absorption amount in the central region A 2 is reflected.
  • the detection frequency of the lock-in detection by the lock-in amplifier 25 may be the modulation frequency f m is greater than another value.
  • the detection frequency N ⁇ f m (where, N is the integer of 2 or more) may be. If the detection frequency is increased in this way, the super-resolution effect can be further enhanced. This is because the region of the light spot S that can be a source of high frequency components is limited only to a region with a particularly high light intensity, that is, an extremely narrow region. Therefore, the higher the detection frequency, the higher the super-resolution effect.
  • the elements for guiding light of the light frequency omega 2 in the sample 20 may be omitted.
  • the sample 20 is assumed to be a fluorescent sample. However, even if the sample 20 is a sample that does not contain a fluorescent material (non-fluorescent sample), excess excitation light is detected. Thus, it is possible to perform super-resolution observation of the sample 20.
  • a super-resolution microscope using a two-photon absorption process will be described as a fifth embodiment of the present invention. Here, only differences from the first embodiment will be described.
  • FIG. 10 is a configuration diagram of the super-resolution microscope of the present embodiment.
  • the super-resolution microscope of the present embodiment is the same as the super-resolution microscope of the first embodiment except that the pulsed laser light having the optical frequency ⁇ 2 toward the observation target surface P 0 is turned off.
  • the pulse laser beam having the frequency ⁇ 1 is used as the excitation light.
  • the beam splitter 131 may be removed from the optical path as shown in the upper left of FIG.
  • the combination of the intensity of the excitation light and the optical frequency ⁇ 1 is set so that the two-photon absorption process occurs in the observation target substance existing in the light spot S.
  • the optical frequency ⁇ 1 is preferably set within a wavelength range of approximately visible to near infrared in terms of wavelength.
  • the two-photon absorption process is a process in which the energy level of electrons of a specific observation target substance is shifted to a high excitation level (two-photon absorption) with excitation light.
  • the sample 20 is a sample containing a fluorescent material (fluorescent sample)
  • spontaneous emission light (fluorescence) with an optical frequency ⁇ 2 is generated from the sample 20.
  • the wavelength selection filter 22 of the present embodiment is given wavelength selectivity that allows light of the optical frequency ⁇ 1 to pass therethrough and cuts light of the optical frequency ⁇ 2 . For this reason, in this embodiment, the fluorescence with the optical frequency ⁇ 2 does not enter the photodetector 24, whereas the excitation light with the optical frequency ⁇ 1 enters the photodetector 24.
  • the intensity of the excitation light in this embodiment is saturated in the central region A 2 of the light spot S, and, to an appropriate value so that the light absorption amount in the peripheral region A 1 of the light spot S is not saturated Is set.
  • the detection frequency of the lock-in amplifier 25 of this embodiment is set to four times instead of two times the modulation frequency f m of the excitation light (4f m).
  • FIG. 11 shows a time-varying waveform of each light in the present embodiment.
  • I (t) (1 + cos2 ⁇ f m t) 2
  • FIG. 11 (a ') for high frequency components above the frequency 2f m in excess excitation light and the fluorescence emitted from the peripheral region A 1 is not to occur, FIG. 11 ( as shown in b '), a high frequency component exceeding the frequency 2f m is generated in each of the excess pumping light and fluorescence emitted from the central region a 2.
  • the signal lock-in amplifier 25 of this embodiment detects the amount of light absorption in the peripheral region A 1 whereas not reflected, the light absorption amount in the central region A 2 is reflected.
  • the present embodiment has been set to the detection frequency of the lock-in detection by the lock-in amplifier 25 to four times the modulation frequency f m (4f m), may be the modulation frequency 2f m is greater than another value.
  • the detection frequency 2N ⁇ f m (where, N is the integer of 2 or more) may be. If the detection frequency is increased in this way, the super-resolution effect can be further enhanced. This is because the region of the light spot S that can be a source of high frequency components is limited only to a region with a particularly high light intensity, that is, an extremely narrow region. Therefore, the higher the detection frequency, the higher the super-resolution effect.
  • the sample 20 is assumed to be a fluorescent sample. However, even if the sample 20 is a sample that does not contain a fluorescent material (non-fluorescent sample), excess excitation light is detected. Thus, it is possible to perform super-resolution observation of the sample 20.
  • the super-resolution microscopy although using the excitation light only light frequencies omega 1 in order to rise to two-photon absorption, a first pumping light of optical frequencies omega 1, the optical frequency omega 2 You may use both with 2nd excitation light.
  • the light intensity of the first excitation light is modulated at a modulation frequency f m, detecting the first pumping light or the second pumping light emitted from the sample 20 frequency 2N ⁇ f m (where, N is the integer of 2 or more ) To detect lock-in.
  • the element for guiding light of the light frequency omega 2 in the sample 20 (the beam splitter 131, a mirror M1, the light The parametric oscillator 143, the mirror M2, the dichroic mirror 134, etc.) may be omitted.
  • the improvement of the resolving power in the plane perpendicular to the optical axis has been described, but the resolving power in the direction of the optical axis is similarly improved.
  • the generation source of the high-frequency component described above is limited not only in the plane perpendicular to the optical axis but also in the vicinity of the condensing point where the light intensity is high in the optical axis direction. That is, in any of the above-described embodiments or modifications that detect high-frequency components due to saturation, the resolving power extends in both the direction perpendicular to the optical axis and the optical axis direction, in other words, in the three-dimensional direction of xyz. improves.
  • one laser light source and two optical parametric oscillators are used to generate two pulsed laser beams having different optical paths.
  • a combination of one laser light source and one parametric oscillator may be used.
  • the laser beam emitted from the laser light source is used as it is as one of the two pulsed laser beams. In this case, it is desirable to synchronize one repetition frequency of the two pulse laser beams and the other repetition frequency.
  • the saturation (saturation phenomenon) of the absorption by the light at the optical frequency ⁇ 1 has been described.
  • the saturation by the light at the optical frequency ⁇ 2 You may use the phenomenon.
  • any of the stimulated emission process, the ESA process, the GSD process, the one-photon absorption process, and the two-photon absorption process may be used as an optical process involving light absorption of the observation target substance.
  • other optical processes involving light absorption of the observation target substance may be caused.
  • the sample 20 is assumed to be a fluorescent sample.
  • the sample 20 may be a sample that does not include a fluorescent substance (non-fluorescent sample). Therefore, the present invention can be applied not only to bio-observation but also to other types of observation such as material observation.
  • only one type of optical process is generated as an optical process involving light absorption of the observation target substance.
  • two or more types of optical processes different from each other are generated.
  • One possible super-resolution microscope that is, a super-resolution microscope capable of mode switching between a plurality of modes having different optical processes may be configured.
  • the following functions (1) to (5) are mounted on the super-resolution microscope capable of mode switching.
  • the transmission type microscope has been described.
  • the present invention can also be applied to a reflection type microscope.
  • optical frequency omega 1 of the optical characteristic "strength" instead of the intensity of the optical frequency omega 1 of the light, optical frequency omega
  • Other characteristics of one light for example, any of phase, polarization, and optical frequency may be modulated.
  • optical frequency omega 1 of the light and the optical frequency omega 2 of the light both of the characteristics of the light may be modulated with different modulation frequencies.
  • the super-resolution observation apparatus (super-resolution microscope) of any of the above-described embodiments uses the first illumination light having the optical frequency ⁇ 1 and the second illumination light having the optical frequency ⁇ 2 on the observation target surface (P 0 ).
  • region (light spot S) to condenses the illumination optical system (objective lens 19), said region modulator modulating (light spot S) characteristic of the first illumination light directed to the modulation frequency f m (acousto a vessel 15), the light generated in the region in response to the first illumination light and the second illumination light (the light spot S), varying the optical frequency of said characteristic at a frequency higher than the modulation frequency f m omega 1 Or the extraction part (The lock-in amplifier 25, the signal generator 26, the wavelength selection filter 22) which extracts the component of (omega) 2 is provided.
  • the characteristic that is a modulation target of the modulation unit is any one of the intensity, phase, polarization, and optical frequency of the first illumination light.
  • the combination of the intensity of the first illumination light, the intensity of the second illumination light, the optical frequency ⁇ 1 , and the optical frequency ⁇ 2 is
  • the stimulated emission process occurs in the observation target substance in the region (light spot S), and the light absorption amount of the observation target substance by the stimulated emission process is saturated only in a part of the region.
  • the combination of the intensity of the first illumination light, the intensity of the second illumination light, the optical frequency ⁇ 1 , and the optical frequency ⁇ 2 is
  • the excited state absorption process occurs in the observation target substance in the region (light spot S), and the light absorption amount of the observation target substance due to the excited state absorption process is saturated only in a part of the region. Is set.
  • the combination of the intensity of the first illumination light, the intensity of the second illumination light, the optical frequency ⁇ 1 , and the optical frequency ⁇ 2 is
  • the ground level depletion process occurs in the observation target substance in the region (light spot S), and the light absorption amount of the observation target substance due to the ground level depletion process is saturated only in a part of the region. Is set as follows.
  • an extraction target of the extraction unit (lock-in amplifier 25, signal generator 26, wavelength selection filter 22). It is, for example, varying component of the characteristic frequency N ⁇ f m (where, N is the integer of 2 or more).
  • the irradiation of the second illumination light to the region (light spot) is omitted, and the intensity of the first illumination light and the optical frequency ⁇ .
  • the one-photon absorption process occurs in the observation target substance in the region (light spot), and the light absorption amount of the observation target substance by the one-photon absorption process is saturated only in a part of the region.
  • extraction object of the extraction unit lock-in amplifier 25, the signal generator 26, the wavelength selecting filter 22
  • the irradiation of the second illumination light to the region (light spot) is omitted, and the intensity of the first illumination light and the optical frequency ⁇ .
  • the two-photon absorption process occurs in the observation target substance in the region (light spot), and the light absorption amount of the observation target substance by the two-photon absorption process is saturated only in a part of the region.
  • extraction object of the extraction unit lock-in amplifier 25, the signal generator 26, the wavelength selecting filter 22
  • SYMBOLS 11 Pulse laser light source, 12 ... Lens, 131 ... Beam splitter, M1 ... Mirror, 141 ... Optical parametric oscillator, 143 ... Optical parametric oscillator, 15 ... Acoustooptic modulator, M2 ... Mirror, 134 ... Dichroic mirror, 19 ... Objective Lens, 20 ... Sample, 28 ... Sample stage, 21 ... Objective lens, 22 ... Wavelength selection filter, 23 ... Condensing lens, 24 ... Photo detector, 25 ... Lock-in amplifier, 26 ... Signal generator, 27 ... Personal computer

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Abstract

本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、光周波数ω１の第１照明光と光周波数ω２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光する照明光学系と、前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調する変調部と、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１又はω２の成分を抽出する抽出部とを備える。

Description

超解像観察装置及び超解像観察方法
　本発明は、超解像観察装置及び超解像観察方法に関する。
　近年、バイオサイエンス、特に分子生物学の分野や病理診断の分野では、試料を蛍光プローブなどで染色せず「そのままの状態で」顕微することのできる無染色顕微鏡の必要性が高まりつつある。この無染色顕微鏡が満たすべき要求は、主に以下の（１）、（２）である。
（１）高い光学分解能（例えば、平面分解能＜５０ｎｍ、奥行分解能＜１００ｎｍ）。
（２）試料内部における観察対象の識別能力。
　これらの要求を満たす可能性のある新しい無染色顕微鏡として、誘導放出顕微鏡が提案された（特許文献１等を参照。）。
国際公開第２０１１／０９９２６９号パンフレット
　誘導放出顕微鏡は、観察対象物に固有のエネルギー準位を利用するため、上記の要求（２）を十分に満たしうるものの、上記の要求（１）を満たすためには依然として改善の余地があり、ここに現状の課題が存する。
　そこで本発明は、上記の課題を解決すべく、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法を提供する。
　本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、光周波数ω１の第１照明光と光周波数ω２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光する照明光学系と、前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調する変調部と、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１又はω２の成分を抽出する抽出部とを備える。
　本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、光周波数ω１の照明光を観察対象面の領域に集光する照明光学系と、前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調する変調部と、前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分を抽出する抽出部とを備える。
　本発明を例示する超解像観察方法の一態様は、光周波数ω１の第１照明光と光周波数ω２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光し、前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調し、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１又はω２の成分を抽出する。
　本発明を例示する超解像観察方法の一態様は、光周波数ω１の照明光を観察対象面の領域に集光し、前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調し、前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分を抽出する。
　本発明によれば、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法が実現する。
本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 観察対象面Ｐ０へ入射する励起光及び誘導光の時間変化波形である（励起光の変調を可視化してないもの）。 観察対象面Ｐ０へ入射する励起光及び誘導光の時間変化波形（励起光の変調を可視化したもの）である。 光スポットＳの各領域へ入射する各光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第２実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する各光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第３実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 第３実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する各光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第４実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 第４実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する光と各領域から射出する各光とを比較する図である。 第５実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。 第５実施形態において光スポットＳの各領域へ入射する光と各領域から射出する各光とを比較する図である。
［第１実施形態］
　以下、本発明の第１実施形態として誘導放出過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。
　図１は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図１に示すとおり超解像顕微鏡には、パルスレーザ光源１１と、レンズ１２と、ビームスプリッタ１３１と、ミラーＭ１と、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）１４１、１４３と、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-optic modulator）１５と、ミラーＭ２と、ダイクロイックミラー１３４と、対物レンズ１９と、試料２０と、試料ステージ２８と、対物レンズ２１と、波長選択フィルタ２２と、集光レンズ２３と、フォトダイオードなどの光検出器２４と、ロックインアンプ２５と、信号発生器２６と、パーソナルコンピュータ２７とが配置される。
　パルスレーザ光源１１は、フェムト秒パルスレーザ光源、ピコ秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源である。パルスレーザ光源１１によるパルス発振の繰り返し周波数ｆｒは、例えば８０ＭＨｚであり、パルスレーザ光源１１が発振するパルスレーザ光のパルス幅ΔＴは、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）である。
　パルスレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光は、レンズ１２により径の太い平行光束となり、ビームスプリッタ１３１へ入射する。ビームスプリッタ１３１へ入射したパルスレーザ光は、ビームスプリッタ１３１を透過するパルスレーザ光と、ビームスプリッタ１３１を反射するパルスレーザ光とに分割され、ビームスプリッタ１３１を透過したパルスレーザ光は光パラメトリック発振器１４１へ入射する。
　ビームスプリッタ１３１を反射したパルスレーザ光は、ミラーＭ１を反射し、光パラメトリック発振器１４３へ入射する。
　光パラメトリック発振器１４１は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω１に変換し、光パラメトリック発振器１４３は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω２に変換する。ここでは、光周波数ω１、ω２の大小関係をω１＞ω２とする。
　音響光学変調器１５は、光パラメトリック発振器１４１の射出光路、つまり光周波数ω１のパルスレーザ光の単独光路に配置され、そのパルスレーザ光の強度を時間方向にかけて単一周波数ｆｍの正弦波で変調する。なお、音響光学変調器１５によるパルスレーザ光の変調波形（変調周波数ｆｍ）は、信号発生器２６から与えられる制御信号によって制御される。
　光パラメトリック発振器１４１から射出した光周波数ω１のパルスレーザ光は、音響光学変調器１５を介してミラーＭ２を反射し、ダイクロイックミラー１３４を反射する。
　光パラメトリック発振器１４３から射出した光周波数ω２のパルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１３４を透過し、光周波数ω１のパルスレーザ光と光路を統合させる。
　互いの光路を統合させた光周波数ω１、ω２のパルスレーザ光は、対物レンズ１９により、試料２０の観察対象面Ｐ０の微小領域に向かって集光され、光スポットを形成する。
　なお、観察対象面Ｐ０に光周波数ω１のパルスレーザ光が形成する光スポットと、観察対象面Ｐ０に光周波数ω２のパルスレーザ光が形成する光スポットとの間では、形状、位置、及びサイズがほぼ共通である。以下、観察対象面Ｐ０に光周波数ω１のパルスレーザ光が形成する光スポットと、観察対象面Ｐ０に光周波数ω２のパルスレーザ光が形成する光スポットとを区別せず単に「光スポットＳ」と称す。
　ここで、光周波数ω１のパルスレーザ光の光路長と、光周波数ω２のパルスレーザ光の光路長との関係は、観察対象面Ｐ０に照射される順序が以下の順序となるように予め調整されている。
　（１）光周波数ω１のパルスレーザ光
　（２）光周波数ω２のパルスレーザ光
　このうち、先に照射される光周波数ω１のパルスレーザ光には、光スポットＳに存在する特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起準位へと移行（光吸収）させる働きがあり、次に照射される光周波数ω２のパルスレーザ光には、励起中の電子を基底準位へ移行（誘導放出）させて光周波数ω２の誘導放出光を発生させる働きがある。
　そこで以下では、先に照射される光周波数ω１のパルスレーザ光を「励起光」と称し、次に照射される光周波数ω２のパルスレーザ光を「誘導光」と称す。
　なお、本実施形態の超解像顕微鏡において、励起光及び誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と光周波数ω１、ω２との組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にて上述した誘導放出過程（上述した励起及び誘導放出）が生起するように予め調整されている。光周波数ω１、ω２の各々は、波長換算でおよそ紫外域～近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましく、パルス幅は、ピコ秒～フェムト秒の時間幅に設定されることが望ましい。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡において、励起光及び誘導光の各々のパルス光強度は、光スポットＳの中央領域Ａ２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に予め調整されている。なお、光吸収量が飽和しているか否かを判別するためには、後述する高周波数成分が検出されるか否かを判別すればよい。
　なお、励起光及び誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）は、パルスレーザ光源１１が発振するパルスの形状と、ビームスプリッタ１３１の透過反射率とによって調整することが可能である。或いは、励起光及び誘導光の少なくとも一方の光路にＮＤフィルタ（不図示）を配置し、そのＮＤフィルタの透過率を調整してもよい。
　図２（ａ）に示すのは観察対象面Ｐ０に入射する励起光の時間変化波形であり、図２（ｂ）に示すのは観察対象面Ｐ０に入射する誘導光の時間変化波形である。
　図２（ａ）、（ｂ）に示すとおり励起光と誘導光の間でパルスの繰り返し周期Ｔｒは共通であるが、励起光と誘導光の間でパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングは若干ずれている。図２（ｃ）は、励起光及び誘導光の３パルス分の波形を同一座標上に拡大表示したものである。図２（ｃ）において実線で示すのが励起光のパルスであり、点線で示すのが誘導光のパルスである。図２（ｃ）に示すとおり励起光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、誘導光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングとの間のズレΔは、励起光及び誘導光の各々のパルス幅ΔＴより若干大きい程度、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）である。
　なお、励起光及び誘導光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングのズレΔを調整するために、本実施形態の超解像顕微鏡では、励起光の単独光路と誘導光の単独光路とのうち少なくとも一方の光路には、可動ミラーなどで構成された光路長調整機構（不図示）が設けられていることが望ましい。
　また、図２（ａ）、（ｂ）では、音響光学変調器１５による励起光の変調を可視化しなかったが、可視化すると図３（ａ）、（ｂ）のとおりである。図３に示すとおり、音響光学変調器１５による励起光の変調周波数ｆｍは、パルスの繰り返し周波数ｆｒと比較して十分に低く、少なくともｆｍ≦ｆｒ／２の関係を満たし、例えばｆｍは数ＭＨｚ程度である。なお、図３において符号Ｔｍで示すのは励起光の変調周期（＝変調周波数ｆｍの逆数）である。
　さて、図１に戻り、試料２０は、例えば、培養液と共に培養容器に収容された透明な生体細胞であり、この生体細胞中の特定物質（例えば、ヘモグロビンなどの特定タンパク質）が観察対象物質である。上述した誘導放出過程では、観察対象物質に固有のエネルギー準位の変位（光吸収）を利用するため、観察対象物質が予め蛍光染色されている必要は無い。
　試料ステージ２８は、試料２０を支持し、光軸方向（Ｚ方向）にかけて試料２０を移動させると共に、光軸と垂直な方向（ＸＹ方向）にかけて試料２０を移動させる透過型のステージである。試料ステージ２８がＺ方向にかけて試料２０を移動させると、試料２０の内部における観察対象面Ｐ０の深さが調整され、試料ステージ２８がＸＹ方向にかけて試料２０を移動させると、光スポットＳで観察対象面Ｐ０を二次元スキャンすることができる。
　観察対象面Ｐ０の光スポットＳから射出した光、すなわち、光スポットＳから射出した励起光（余剰励起光）、光スポットから射出した誘導光（余剰誘導光）、光スポットで発生した誘導放出光は、対物レンズ２１の先端側から対物レンズ２１に入射する。
　対物レンズ２１の仕様（開口数、倍率など）は、対物レンズ１９の仕様と同じであり、対物レンズ２１と対物レンズ１９との間の位置関係及び姿勢関係は、観察対象面Ｐ０に関して対称である。なお、ここでは対物レンズ２１の仕様と対物レンズ１９の仕様とを共通としたが、完全に共通でなくても構わない。例えば、対物レンズ２１の開口数は対物レンズ１９の開口数より大きくても良い。
　対物レンズ２１に先端側から入射した光、すなわち、観察対象面Ｐ０の光スポットＳから射出した励起光（余剰励起光）、観察対象面Ｐ０の光スポットＳから射出した誘導光（余剰誘導光）、観察対象面Ｐ０の光スポットＳから射出した誘導放出光は、対物レンズ２１の瞳側から射出し、波長選択フィルタ２２、集光レンズ２３を順に介して光検出器２４へ向かう。
　ここで、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光と光周波数ω２の光との一方をカットし、かつ、他方を通過させる波長選択性が付与されている。以下、波長選択フィルタ２２は、光周波数ω１の光を通過させ、かつ光周波数ω２の光をカットすると仮定する。
　よって、光スポットＳから射出した余剰励起光（光周波数ω１）は光検出器２４へ入射し、光スポットＳから射出した余剰誘導光及び誘導放出光（光周波数ω２）は光検出器２４へ入射しない。
　光検出器２４は、入射光の強度を電気信号に変換するフォトダイオードなどの光電変換素子である。
　ロックインアンプ２５は、光検出器２４の出力する電気信号から、励起光の変調周波数ｆｍの２倍周波数（２ｆｍ）で変化する成分を信号としてロックイン検出する。なお、ロックインアンプ２５の検出周波数及び検出タイミングは、信号発生器２６から与えられる制御信号によって制御される。
　パーソナルコンピュータ２７は、ロックインアンプ２５の検出した信号を取り込む。また、パーソナルコンピュータ２７は、前述したスキャン中、光スポットＳが観察対象面Ｐ０の各位置にあるとき（具体的には、光スポットＳの中央領域Ａ２が観察対象面Ｐ０の各位置にあるとき）に信号の取り込みを行い、観察対象面Ｐ０における信号の分布を超解像画像として作成すると、不図示のモニタへ表示する。
　以下、図４を参照して超解像顕微鏡の超解像効果を説明する。
　図４（ａ）に示すのは、光スポットＳの周辺領域Ａ１へ照射される光の時間変化波形であって、図４（ａ）符号ω１は、励起光（照射励起光）の波形であり、図４（ａ）符号ω２は、誘導光（照射誘導光）の波形である（なお、図４では、細かなパルスの図示を省略し、パルスの包絡線のみを示した。）。
　図４（ａ’）に示すのは、光スポットＳの周辺領域Ａ１から射出する光の時間変化波形であって、図４（ａ’）符号ω１は、光吸収に寄与しなかった余剰励起光の波形であり、図４（ａ’）符号ω２は、誘導光及び誘導放出光（以下、まとめて「余剰誘導・放出光」と称す。）の合成波形である。
　図４（ｂ）に示すのは、光スポットＳの中央領域Ａ２へ照射される光の時間変化波形であって、図４（ｂ）符号ω１は、励起光（照射励起光）の波形であり、図４（ｂ）符号ω２は、誘導光（照射誘導光）の波形である。
　図４（ｂ’）に示すのは、光スポットＳの中央領域Ａ２から射出する光の時間変化波形であって、図４（ｂ’）符号ω１は、光吸収に寄与しなかった余剰励起光の波形であり、図４（ｂ’）符号ω２は、誘導光及び誘導放出光（以下、まとめて「余剰誘導・放出光」と称す。）の合成波形である。
　さて、本実施形態の超解像顕微鏡では、上述したとおり励起光が変調周波数ｆｍで変調されるので、周辺領域Ａ１に対する照射励起光の強度（図４（ａ）符号ω１）、中央領域Ａ２に対する照射励起光の強度（図４（ｂ）符号ω１）は、共に変調周波数ｆｍで時間変化する。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡では、これらの照射励起光が変調周波数ｆｍで時間変化するので、周辺領域Ａ１における光吸収量（不図示）、中央領域Ａ２における光吸収量（不図示）も、基本的には周波数ｆｍで時間変化する。
　このため、本実施形態の超解像顕微鏡では、周辺領域Ａ１から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω１）、中央領域Ａ２から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω１）の各々には、周波数ｆｍの周波数成分が発生する。
　但し、本実施形態の超解像顕微鏡装置では、周辺領域Ａ１における光吸収量（不図示）は飽和しないのに対して、中央領域Ａ２における光吸収量（不図示）は飽和する。
　したがって、周辺領域Ａ１から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω１）には周波数ｆｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、中央領域Ａ２から射出する余剰励起光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω１）には周波数ｆｍを超える高い周波数成分（例えば周波数２ｆｍの成分）が発生する（図４（ｂ’）の点線矢印を参照。）。
　そこで、本実施形態のロックインアンプ２５は、光検出器２４の出力する電気信号（＝光周波数ω１の光強度信号）から、周波数２ｆｍで変化する信号のみをロックイン検出する。
　この信号（＝周波数２ｆｍで変化する光周波数ω１の光強度信号）には、周辺領域Ａ１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ２における光吸収量は反映される。
　したがって、本実施形態のロックインアンプ２５は、光スポットＳで発生した光から、中央領域Ａ２から射出した余剰励起光（図４（ｂ’）符号ω１）の高周波数成分（周波数２ｆｍで変化する成分）のみを抽出することができる。
　したがって、本実施形態の超解像顕微鏡は、光スポットＳより小さい中央領域Ａ２のみに信号の取得元を制限すること、つまり、試料２０における観察対象物質の密度分布を超解像観察することができる。
［第１実施形態の変形例］
　なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を励起光の変調周波数ｆｍの２倍（２ｆｍ）に設定したが、変調周波数ｆｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。
　また、本実施形態では、検出器２４に入射させるべき光の光周波数を、励起光の光周波数ω１と同じにしたが、誘導光の光周波数ω２と同じにしてもよい。その場合、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光をカットし、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
　この場合、ロックインアンプ２５は、余剰励起光（図４（ｂ’）符号ω１）の高周波数成分の代わりに、余剰誘導・放出光（図４（ｂ’）符号ω２）の高周波数成分を抽出することができる。この場合も超解像観察が可能である。その理由は、以下のとおりである。
　すなわち、周辺領域Ａ１から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω２）、中央領域Ａ２から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω２）の各々には、周波数ｆｍの周波数成分が発生する。
　但し、周辺領域Ａ１における光吸収量（不図示）は飽和しないのに対して、中央領域Ａ２における光吸収量（不図示）は飽和する。この場合、周辺領域Ａ１における誘導放出量（不図示）は飽和しないのに対して、中央領域Ａ２における誘導放出量（不図示）は飽和する。
　このため、周辺領域Ａ１から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ａ’）符号ω２）には周波数ｆｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、中央領域Ａ２から射出する余剰誘導・放出光の時間変化波形（図４（ｂ’）符号ω２）には周波数ｆｍを超える高い周波数成分（例えば周波数２ｆｍの成分）が発生する（図４（ｂ’）の点線矢印を参照。）。
　なお、本実施形態の超解像顕微鏡は、波長選択フィルタ２２を２つの波長選択フィルタの間で切り換えることが可能に構成されてもよい。２つの波長選択フィルタの一方には、光周波数ω２の光をカットし、光周波数ω１の光を通過させる波長選択性が付与され、他方には、光周波数ω１の光をカットし、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡では、励起光が試料２０に到達するタイミングと、誘導光が試料２０に到達するタイミングと間に時間差を設けたが、この時間差をゼロにしてもよい。但し、その場合は、励起光と誘導光との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ－１以上の波長差を付与することが望ましい。
［第２実施形態］
　以下、本発明の第２実施形態として励起状態吸収（ＥＳＡ：Excited-State Absorption）過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。
　先ず、本実施形態では、光周波数ω１のパルスレーザ光が励起光として使用され、光周波数ω２のパルスレーザ光がＥＳＡ光として使用される。光周波数ω１、ω２’の各々は、波長換算でおよそ紫外域～可視域の波長範囲内に設定されることが望ましく、光周波数ω２は、波長換算でおよそ可視域～近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましい。
　また、本実施形態では、励起光及びＥＳＡ光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と光周波数ω１、ω２との組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にてＥＳＡ過程が生起するように設定されている。
　ＥＳＡ過程は、先ず、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起光で励起準位へと移行（光吸収）させ、次に、励起中の電子をＥＳＡ光で更に高い準位へと移行させるという過程である。
　また、本実施形態では、励起光及びＥＳＡ光のパルス光強度は、光スポットＳの中央領域Ａ２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。
　図５に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。第１実施形態における時間変化波形（図４）との主な相違点は、図５（ａ’）、（ｂ’）に示すとおり、光スポットＳから射出する光周波数ω２の光（＝ＥＳＡ過程に寄与しなかった余剰ＥＳＡ光）の時間変化波形の位相がπだけずれている点である。なぜなら、ＥＳＡ過程では励起光の強度が高いほど余剰ＥＳＡ光の強度が減少するからである。
　しかし、本実施形態でも、図５（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ１から射出する余剰励起光及び余剰ＥＳＡ光の各々には周波数ｆｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、図５（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ２から射出する余剰励起光及び余剰ＥＳＡ光の各々には周波数ｆｍを超える高い周波数成分が発生する。
　したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ２における光吸収量は反映される。
　したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第２実施形態の変形例］
　なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆｍの２倍（２ｆｍ）に設定したが、変調周波数ｆｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。
　また、本実施形態では、検出器２４に入射させるべき光の光周波数を、励起光の光周波数ω１と同じにしたが、ＥＳＡ光の光周波数ω２と同じにしてもよい。その場合、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光をカットし、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡は、波長選択フィルタ２２を２つの波長選択フィルタの間で切り換えることが可能に構成されてもよい。２つの波長選択フィルタの一方には、光周波数ω２の光をカットし、光周波数ω１の光を通過させる波長選択性が付与され、他方には、光周波数ω１の光をカットし、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
［第３実施形態］
　以下、本発明の第３実施形態として基底準位枯渇（ＧＳＤ：Ground State Depletion）過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。
　図６は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図６に示すとおり、本実施形態の超解像顕微鏡は、第１実施形態の超解像顕微鏡において、パルスレーザ光源１１及びレンズ１２の代わりにＣＷレーザ光源１１－１、１１－２、及びレンズ１２－１、１２－２を使用し（ＣＷ：Continuous Wave）、光パラメトリック発振器１４１、１４３、ビームスプリッタ１３１、ミラーＭ１を省略したものである。ＣＷレーザ光源１１－１は、レンズ１２－１を介して光周波数ω１のＣＷレーザ光を出射し、ＣＷレーザ光源１１－２は、レンズ１２－２を介して光周波数ω２のＣＷレーザ光を出射する。
　本実施形態では、このうち光周波数ω１のＣＷレーザ光が第１励起光として使用され、光周波数ω２のＣＷレーザ光が第２励起光として使用される。
　また、本実施形態では、第１励起光及び第２励起光の強度と光周波数ω１、ω２との組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にてＧＳＤ過程が生起するように設定されている。但し、本実施形態では、光周波数ω１、ω２の大小関係は、ω１＜ω２である。　具体的に、光周波数ω１、ω２の値関係は、ＧＳＤ過程における基底状態から励起状態への励起が発生するような値関係に設定される。また、光周波数ω１、ω２の各々は、波長換算でおよそ紫外域～可視域の波長範囲内に設定されることが望ましい。
　ＧＳＤ過程は、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を第１励起光で第１励起準位へと移行（光吸収）させ、同種の残りの観察対象物質の電子を第２励起光により第１励起準位へと移行させるという過程である。
　また、本実施形態では、第１励起光及び第２励起光の強度は、光スポットＳの中央領域Ａ２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。
　図７に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。本実施形態でも、図７（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ１から射出する余剰第１励起光及び余剰第２励起光の各々には周波数ｆｍを超える高周波数成分が発生しないのに対して、図７（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ２から射出する余剰第１励起光及び余剰第２励起光の各々には周波数ｆｍを超える高周波数成分が発生する。
　したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ２における光吸収量は反映される。
　したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第３実施形態の変形例］
　なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆｍの２倍（２ｆｍ）に設定したが、変調周波数ｆｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。
　また、本実施形態では、検出器２４に入射させるべき光の光周波数を、第１励起光の光周波数ω１と同じにしたが、第２励起光の光周波数ω２と同じにしてもよい。その場合、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光をカットし、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡は、波長選択フィルタ２２を２つの波長選択フィルタの間で切り換えることが可能に構成されてもよい。２つの波長選択フィルタの一方には、光周波数ω２の光をカットし、光周波数ω１の光を通過させる波長選択性が付与され、他方には、光周波数ω１の光をカットし、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡では、第１励起光及び第２励起光の各々としてＣＷレーザ光を使用したが、パルスレーザ光を使用してもよい。パルスレーザ光を使用する場合の装置構成は、第１実施形態にて説明したとおりである（図１を参照。）。
［第４実施形態］
　以下、本発明の第４実施形態として１光子吸収過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。
　図８は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図８に示すとおり、本実施形態の超解像顕微鏡は、第１実施形態の超解像顕微鏡において、パルスレーザ光源１１及びレンズ１２の代わりにＣＷレーザ光源１１－１、１１－２、及びレンズ１２－１、１２－２を使用し（ＣＷ：Continuous Wave）、光パラメトリック発振器１４１、１４３、ビームスプリッタ１３１、ミラーＭ１を省略したものである。ＣＷレーザ光源１１－１は、レンズ１２－１を介して光周波数ω１のＣＷレーザ光を出射し、ＣＷレーザ光源１１－２は、レンズ１２－２を介して光周波数ω２のＣＷレーザ光を出射する。
　但し、本実施形態では、光周波数ω１のＣＷレーザ光のみが励起光として使用されるので、観察対象面Ｐ０に向かう光周波数ω２のＣＷレーザ光は、オフされる。この光周波数ω２のＣＷレーザ光をオフするには、ＣＷレーザ光源１１－２をオフすればよい。
　また、本実施形態では、励起光の強度及び光周波数ω１の組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にて１光子吸収過程が生起するように設定されている。光周波数ω１は、波長換算でおよそ紫外域～可視域の波長範囲内に設定されることが望ましい。
　１光子吸収過程は、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起光で励起準位へと移行（１光子吸収）させるという過程である。このとき、試料２０が蛍光物質を含んだ試料（蛍光試料）であるならば、試料２０から光周波数ω２の自然放出光（蛍光）が発生する。
　また、本実施形態の波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光を通過させ、光周波数ω２の光をカットする波長選択性が付与されている。このため、本実施形態では、光周波数ω２の蛍光は光検出器２４に入射しないのに対して、光周波数ω１の励起光は光検出器２４に入射する。
　また、本実施形態における励起光の強度は、光スポットＳの中央領域Ａ２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。
　図９に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。本実施形態でも、図９（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ１から射出する余剰励起光及び蛍光には周波数ｆｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、図９（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ２から射出する余剰励起光及び蛍光には周波数ｆｍを超える高い周波数成分が発生する。
　したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ２における光吸収量は反映される。
　したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第４実施形態の変形例］
　なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆｍの２倍（２ｆｍ）に設定したが、変調周波数ｆｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数をＮ×ｆｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡では、光周波数ω２の光を試料２０に照射しないので、光周波数ω２の光を試料２０に導くための要素（ＣＷレーザ光源１１－２、レンズ１２－２、ミラーＭ２、ダイクロイックミラー１３４など）を省略してもよい。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡では、試料２０を蛍光試料と仮定したが、仮に、試料２０が蛍光物質を含まない試料（非蛍光試料）であったとしても、余剰励起光を検出することにより、試料２０を超解像観察することが可能である。
［第５実施形態］
　以下、本発明の第５実施形態として２光子吸収過程を利用した超解像顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみを説明する。
　図１０は、本実施形態の超解像顕微鏡の構成図である。図１０に示すとおり、本実施形態の超解像顕微鏡は、第１実施形態の超解像顕微鏡において、観察対象面Ｐ０に向かう光周波数ω２のパルスレーザ光をオフしたものである。本実施形態では、周波数ω１のパルスレーザ光のみが励起光として使用される。なお、観察対象面Ｐ０に向かう光周波数ω２のＣＷレーザ光をオフするには、例えば図１０の左上に示すとおりビームスプリッタ１３１を光路から外せばよい。
　また、本実施形態では、励起光の強度及び光周波数ω１の組み合わせは、光スポットＳに存在する観察対象物質にて２光子吸収過程が生起するように設定されている。光周波数ω１は、波長換算でおよそ可視域～近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましい。
　２光子吸収過程は、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起光で高い励起準位へと移行（２光子吸収）させるという過程である。このとき、試料２０が蛍光物質を含んだ試料（蛍光試料）であるならば試料２０から光周波数ω２の自然放出光（蛍光）が発生する。
　また、本実施形態の波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光を通過させ、光周波数ω２の光をカットする波長選択性が付与されている。このため、本実施形態では、光周波数ω２の蛍光は光検出器２４に入射しないのに対して、光周波数ω１の励起光は光検出器２４に入射する。
　また、本実施形態における励起光の強度は、光スポットＳの中央領域Ａ２における光吸収量が飽和し、かつ、光スポットＳの周辺領域Ａ１における光吸収量が飽和しないよう適度な値に設定されている。
　また、本実施形態のロックインアンプ２５の検出周波数は、励起光の変調周波数ｆｍの２倍ではなく４倍（４ｆｍ）に設定される。
　図１１に示すのは、本実施形態における各光の時間変化波形である。本実施形態では、図１１（ａ’）に示すとおり、光スポットＳの周辺領域Ａ１から射出する蛍光の時間変化波形Ｉ（ｒ）はＩ（ｔ）＝（１＋ｃｏｓ２πｆｍｔ）２で表される。このため、本実施形態では、図１１（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ１から射出する余剰励起光及び蛍光の各々には、周波数２ｆｍの周波数成分が発生する。
　しかし、本実施形態では、図１１（ａ’）に示すとおり、周辺領域Ａ１から射出する余剰励起光及び蛍光には周波数２ｆｍを超える高い周波数成分が発生しないのに対して、図１１（ｂ’）に示すとおり、中央領域Ａ２から射出する余剰励起光及び蛍光の各々には周波数２ｆｍを超える高い周波数成分が発生する。
　したがって、本実施形態のロックインアンプ２５が検出する信号には、周辺領域Ａ１における光吸収量は反映されないのに対して、中央領域Ａ２における光吸収量は反映される。
　したがって、本実施形態でも、第１実施形態と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
［第５実施形態の変形例］
　なお、本実施形態では、ロックインアンプ２５によるロックイン検出の検出周波数を変調周波数ｆｍの４倍（４ｆｍ）に設定したが、変調周波数２ｆｍより大きい別の値としてもよい。例えば、検出周波数を２Ｎ×ｆｍ（但し、Ｎは２以上の整数）としてもよい。このように検出周波数を高めれば、超解像効果を更に高めることができる。なぜなら、光スポットＳのうち、高い周波数成分の発生元となり得る領域は、光強度の特に高い領域のみ、つまり極端に狭い領域のみに制限されるからである。よって、検出周波数が高いほど超解像効果も高まる。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡では、試料２０を蛍光試料と仮定したが、仮に、試料２０が蛍光物質を含まない試料（非蛍光試料）であったとしても、余剰励起光を検出することにより、試料２０を超解像観察することが可能である。
　また、本実施形態の超解像顕微鏡では、２光子吸収過程を生起させるために光周波数ω１の励起光のみを使用したが、光周波数ω１の第１励起光と、光周波数ω２の第２励起光との双方を使用してもよい。その場合は、第１励起光の光強度を変調周波数ｆｍで変調し、試料２０から射出した第１励起光又は第２励起光を検出周波数２Ｎ×ｆｍ（但し、Ｎは２以上の整数）でロックイン検出すればよい。
　なお、本実施形態の超解像顕微鏡において、光周波数ω２の光を試料２０に照射しない場合は、光周波数ω２の光を試料２０に導くための要素（ビームスプリッタ１３１、ミラーＭ１、光パラメトリック発振器１４３、ミラーＭ２、ダイクロイックミラー１３４など）を省略してもよい。
［実施形態及び変形例の補足］
　なお、上述した何れかの実施形態又は変形例では、光軸と垂直な面内における解像力の向上について説明したが、光軸方向における解像力についても同様に向上する。なぜなら、前述した高周波成分の発生元は、光軸と垂直な面内だけでなく光軸方向においても光強度の高い集光点近傍のみに制限されるからである。すなわち、飽和による高周波成分を検出する上述した何れかの実施形態又は変形例では、光軸と垂直な方向と光軸方向との双方に亘って、言い換えればｘｙｚの３次元方向に亘って解像力が向上する。
　なお、第１実施形態、第２実施形態、第５実施形態、及びその変形例では、光路の異なる２つのパルスレーザ光を生成するために、１台のレーザ光源と２台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用したが、１台のレーザ光源と１台のパラメトリック発振器との組み合わせを使用してもよい。但し、その場合は、２つのパルスレーザ光の一方としてレーザ光源から射出したレーザ光がそのまま使用される。また、その場合は、２つのパルスレーザ光の一方の繰り返し周波数と他方の繰り返し周波数とを同期させることが望ましい。
　なお、第１実施形態、第２実施形態、第５実施形態、及びその変形例では、光周波数ω１の光による吸収の飽和（飽和現象）について説明したが、光周波数ω２の光による飽和現象を利用しても良い。
　また、上述した何れかの実施形態又は何れかの変形例では、観察対象物質の光吸収を伴う光学過程として、誘導放出過程、ＥＳＡ過程、ＧＳＤ過程、１光子吸収過程、２光子吸収過程の何れかを生起させたが、観察対象物質の光吸収を伴う他の光学過程を生起させてもよい。
　また、上述した何れかの実施形態又は何れかの変形例では、試料２０を蛍光試料と仮定したが、試料２０は蛍光物質を含まない試料（非蛍光試料）であってもよい。したがって、バイオ観察のみでなく、例えば材料観察などの他種の観察にも本発明は適用可能である。
　また、上述した何れかの実施形態又は何れかの変形例では、観察対象物質の光吸収を伴う光学過程として１種類の光学過程しか生起させなかったが、互いに異なる２種類以上の光学過程を生起できるような１つの超解像顕微鏡、すなわち、光学過程の異なる複数のモードの間でモード切り換えが可能な超解像顕微鏡を構成してもよい。なお、モード切り換えが可能な超解像顕微鏡には、例えば以下の機能（１）～（５）が搭載される。
　（１）試料２０に照射される光の時間変化波形を調整する機能。
　（２）光周波数ω１及び光周波数ω２の各々を調整する機能。
　（３）試料２０に照射される光周波数ω１の光と、試料２０に照射される光周波数ω２の光との少なくとも一方をオン／オフする機能。
　（４）ロックインアンプ２５の検出周波数を調整する機能。
　（５）選択波長の異なる複数の波長選択フィルタの間で波長選択フィルタ２２を切り換える機能。
　また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、透過型の顕微鏡を説明したが、反射型の顕微鏡にも本発明は適用可能である。
　また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、光周波数ω１の光の特性の１種である「強度」を変調したが、光周波数ω１の光の強度の代わりに、光周波数ω１の光の他の特性、例えば、位相、偏光、光周波数の何れかを変調してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、光周波数ω１の光と光周波数ω２の光とのうち一方のみの特性を変調したが、光周波数ω１の光と光周波数ω２の光との双方の特性を、互いに異なる変調周波数で変調してもよい。
［実施形態の作用効果］
　上述した何れかの実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）は、光周波数ω１の第１照明光と光周波数ω２の第２照明光とを観察対象面（Ｐ０）の領域（光スポットＳ）に集光する照明光学系（対物レンズ１９）と、前記領域（光スポットＳ）に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調する変調部（音響光学変調器１５）と、前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域（光スポットＳ）で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１又はω２の成分を抽出する抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）とを備える。
　なお、前記変調部の変調対象である前記特性は、前記第１照明光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである。
　また、第１実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω１、前記光周波数ω２の組み合わせは、前記領域（光スポットＳ）内の観察対象物質で誘導放出過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記誘導放出過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される。
　また、第２実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω１、前記光周波数ω２の組み合わせは、前記領域（光スポットＳ）内の観察対象物質で励起状態吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記励起状態吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される。
　また、第３実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω１、前記光周波数ω２の組み合わせは、前記領域（光スポットＳ）内の観察対象物質で基底準位枯渇過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記基底準位枯渇過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される。
　また、第１実施形態～第３実施形態の何れかの超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）の抽出対象は、例えば周波数Ｎ×ｆｍで前記特性の変化する成分である（但し、Ｎは２以上の整数）。
　また、第４実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記領域（光スポット）に対する前記第２照明光の照射は省略され、前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω１の組み合わせは、前記領域（光スポット）内の観察対象物質で１光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記１光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、前記抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）の抽出対象は、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分である。
　また、第５実施形態の超解像観察装置（超解像顕微鏡）において、前記領域（光スポット）に対する前記第２照明光の照射は省略され、前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω１の組み合わせは、前記領域（光スポット）内の観察対象物質で２光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記２光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、前記抽出部（ロックインアンプ２５、信号発生器２６、波長選択フィルタ２２）の抽出対象は、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分である。
［その他］
　また、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。
　１１…パルスレーザ光源、１２…レンズ、１３１…ビームスプリッタ、Ｍ１…ミラー、１４１…光パラメトリック発振器、１４３…光パラメトリック発振器、１５…音響光学変調器、Ｍ２…ミラー、１３４…ダイクロイックミラー、１９…対物レンズ、２０…試料、２８…試料ステージ、２１…対物レンズ、２２…波長選択フィルタ、２３…集光レンズ、２４…光検出器、２５…ロックインアンプ、２６…信号発生器、２７…パーソナルコンピュータ

Claims (11)

  1. 　光周波数ω１の第１照明光と光周波数ω２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光する照明光学系と、
    　前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調する変調部と、
    　前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１又はω２の成分を抽出する抽出部と、
    　を備えることを特徴とする超解像観察装置。
  2. 　請求項１に記載の超解像観察装置において、
    　前記変調部の変調対象である前記特性は、
    　前記第１照明光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
    　前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω１、前記光周波数ω２の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で誘導放出過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記誘導放出過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  4. 　請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
    　前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω１、前記光周波数ω２の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で励起状態吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記励起状態吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  5. 　請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
    　前記第１照明光の強度、前記第２照明光の強度、前記光周波数ω１、前記光周波数ω２の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で基底準位枯渇過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記基底準位枯渇過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定される
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  6. 　請求項３～請求項５の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部の抽出対象は、
    　周波数Ｎ×ｆｍで前記特性の変化する成分である（但し、Ｎは２以上の整数）
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  7. 　請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
    　前記領域に対する前記第２照明光の照射は省略され、
    　前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω１の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で１光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記１光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、
    　前記抽出部の抽出対象は、
    　前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分である
    　ことを特徴とする超解像観察蔵置。
  8. 　請求項１又は請求項２に記載の超解像観察装置において、
    　前記領域に対する前記第２照明光の照射は省略され、
    　前記第１照明光の強度及び前記光周波数ω１の組み合わせは、前記領域内の観察対象物質で２光子吸収過程が生起し、かつ、前記領域の一部でのみ前記２光子吸収過程による前記観察対象物質の光吸収量が飽和するように設定され、
    　前記抽出部の抽出対象は、
    　前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分である
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  9. 　光周波数ω１の照明光を観察対象面の領域に集光する照明光学系と、
    　前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調する変調部と、
    　前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分を抽出する抽出部と
    　を備えることを特徴とする超解像観察装置。
  10. 　光周波数ω１の第１照明光と光周波数ω２の第２照明光とを観察対象面の領域に集光し、
    　前記領域に向かう前記第１照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調し、
    　前記第１照明光及び前記第２照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１又はω２の成分を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察方法。
  11. 　光周波数ω１の照明光を観察対象面の領域に集光し、
    　前記領域に向かう前記照明光の特性を変調周波数ｆｍで変調し、
    　前記照明光に応じて前記領域で発生する光から、前記変調周波数ｆｍより高い周波数で前記特性の変化する光周波数ω１の成分を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022518161A (ja) * 2019-01-25 2022-03-14 ホーホシューレ、フューア、アンゲバント、ビッセンシャフテン、ミュンヘン ２色共焦点共局在化顕微鏡法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10855046B2 (en) * 2017-10-16 2020-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Nonlinear optical imaging
JP2019086529A (ja) * 2017-11-01 2019-06-06 株式会社ニコン 顕微鏡、照明装置、及び観察方法
US10236027B1 (en) * 2018-02-12 2019-03-19 Microsoft Technology Licensing, Llc Data storage using light of spatially modulated phase and polarization
US20240102924A1 (en) * 2021-02-01 2024-03-28 Osaka University Optical microscope and imaging method

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010506155A (ja) * 2006-10-07 2010-02-25 ライカ マイクロシステムズ ツェーエムエス ゲーエムベーハー 試料の高分解能光学的走査方法及び装置
WO2011099269A1 (ja) * 2010-02-10 2011-08-18 国立大学法人大阪大学 顕微鏡及び観察方法
JP2013019908A (ja) * 2005-07-22 2013-01-31 Carl Zeiss Microscopy Gmbh 解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7485875B2 (en) 2005-07-22 2009-02-03 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Resolution-enhanced luminescence microscopy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013019908A (ja) * 2005-07-22 2013-01-31 Carl Zeiss Microscopy Gmbh 解像度を高めたルミネセンス顕微鏡検査
JP2010506155A (ja) * 2006-10-07 2010-02-25 ライカ マイクロシステムズ ツェーエムエス ゲーエムベーハー 試料の高分解能光学的走査方法及び装置
WO2011099269A1 (ja) * 2010-02-10 2011-08-18 国立大学法人大阪大学 顕微鏡及び観察方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATSUMASA FUJITA: "Recent Developments in Super Resolution Fluorescence Microscopy", BIOPHYSICS, vol. 50, no. 4, 20 July 2010 (2010-07-20), pages 174 - 179 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022518161A (ja) * 2019-01-25 2022-03-14 ホーホシューレ、フューア、アンゲバント、ビッセンシャフテン、ミュンヘン ２色共焦点共局在化顕微鏡法

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