WO2011099269A1 - 顕微鏡及び観察方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態では反射光、散乱光、又は透過光の飽和を利用して、空間分解能を向上している。すなわち、反射光、透過光、又は散乱光の飽和成分について観察することにより、空間分解能を向上している。本発明の実施の形態1にかかるレーザ顕微鏡は共焦点顕微鏡であり、レーザ走査方式の顕微鏡である。このレーザ顕微鏡について図1を用いて説明する。図1は本発明にかかるレーザ顕微鏡の構成を模式的に示す図である。10は光源、11は変調器、12はビームスプリッタ、13はスキャナ、14はレンズ、15はレンズ、16は対物レンズ、19はフィルタ、20はレンズ、21はピンホール、22は検出器、23はロックインアンプ、24は処理装置である。図1に示すレーザ顕微鏡では、反射光(あるいは散乱光)を検出する。
図7Aでは、スポット中心(x=a)での振幅スペクトルを示し、図7Bはスポット端部(x=b)での振幅スペクトルを示し、図7Cはその間における振幅スペクトルを示している。従って、例えば、周波数2fmの信号成分によって観察を行うことで、分解能を向上することができる。もちろん、n次の成分に着目して、観察を行っても良い。変調周波数のn倍の周波数で復調することで、高空間分解能での観察が可能になる。
また、照明光と同じ波長の反射光を検出しているため、高次の非線形効果を観察する場合でも、レーザ光と同じ波長の光を検出すればよい。すなわち、基本波の検出で、非線形効果に基づく観察が可能になる。レーザ光の波長を短くした場合でも、通常の光学系での検出を行うことが可能となる。例えば、紫外域の光を光学系内を伝搬させる必要がなくなるので、通常仕様のレンズ、ミラー等を用いることができる。すなわち、非線形光学損失を計測しているため、短波長用の光学部品や計測器を準備しなくても、容易に高次の非線形応答を確認することができる。よって、可視域用の光学系を用いながらも、高い分解能を実現することができる。非線形の応答を分離検出することにより、回折限界を越えた空間分解能で試料の形状を3次元観察することができる。
本実施の形態では、非線形光学効果によって発生する信号光の飽和成分に基づいて観察する。例えば、非線形光学効果によって試料で発生する散乱光等を検出する。この場合、レーザ波長と異なる波長の散乱光とを検出する。例えば、ハイパーレイリー散乱、高調波発生、ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)、四光波混合、誘導放出、差周波発生、和周波発生、パラメトリック蛍光、又は誘導ラマン散乱(SRS)等の各種光を検出するようにしてもよい。散乱光には、非線形光学効果によって発生する散乱光も含まれる。非線形光学効果や他の光学効果の発生により、光強度の損失、すなわち、高調波損失が発生する。ここで、高調波損失とは、信号光における高調波損失で、レーザ光(基本波)における高調波損失とは異なる概念である。この高調波損失は、非線形な光学損失(以下、非線形光学損失と称する)となる。
入射するレーザ光と異なる波長の散乱光等を検出する場合、レーザ波長の光が検出器22に入射しないようにする。すなわち、波長の差を用いて、レーザ波長の光と、レーザ高調波を分離する。この場合、例えば、バンドパスフィルタ等の光学フィルタや、ダイクロイックミラーを用いる。すなわち、レーザ波長と異なる波長の散乱光等(ラマン散乱、ハイパーレイリー散乱、誘導ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、高調波発生、パラメトリック蛍光、四光波混合、誘導放出、和周波発生、差周波発生等)を検出する場合、波長差を利用して、レーザ光(基本波)と信号光を分離するようにする。例えば、バンドパスフィルタ等の光学フィルタや、ダイクロイックミラーを用いる。検出器と試料の間に、レーザ光を遮光する光学素子を配置する。なお、散乱光を検出する場合、光源10を対物レンズ16の反対側に配置しても良い。すなわち光源10と反対側に、試料17を透過した散乱光を検出するようにしてもよい。
まず、実施の形態1で示した1光子反応、すなわち線形の応答における、レーザ光強度と散乱光強度の関係を図9Aに示す。図9Aでは、横軸がレーザ光強度Iex、縦軸が散乱光強度Iscatとなっている。なお、図9Aに示す散乱光は、レーザ波長と同じ波長の散乱光である。例えば、レイリー散乱やミー散乱は、1光子反応によって出射される。すなわち、線形光学効果による散乱光である。飽和がない場合、レーザ光と散乱光は、リニアに変化する。そして、レーザ光強度が高くなると、散乱光の飽和が発生する。この場合、散乱光は、変調するレーザ光強度の1乗に応じた1乗応答となる。
一方、非線形光学効果である2光子反応における、レーザ光と信号光の関係は図9Bに示すようになる。図9Bでは、信号光を第2高調波発生(SHG)とした場合を示している。図9Bでは、横軸がレーザ光強度Iex、縦軸が第2高調波強度ISHGとなっている。第2高調波発生は、2光子の反応による応答である。すなわち、第2高調波発生(SHG)は、変調するレーザ光強度の2乗に応じた2乗応答となる。飽和がない場合、強度変調したレーザ光(変調光)の2乗と第2高調波(光高調波)は、リニアに変化する。そして、レーザ光強度が高くなると、SHGの飽和が発生する。例えば、SHGの飽和が生じない線形領域において、レーザ光強度Iexが(1+cos(ωmt))に比例する場合、SHG強度ISHGは(1+cos(ωmt))2に比例する。これを展開すると、以下のようになる。
ISHG=1+2cos(ωmt)+cos2(ωmt) ・・・(1)
ISHG=1+2cos(ωmt)+(1+cos(2ωmt))/2・・・(2)
次に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度ICARSについて、図9Cを用いて説明する。コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる場合、ポンプ光とストークス光を照射する。すなわち、2つのレーザ光源を用いて、同時に2つのレーザ光を試料の同じ位置に照射する。ポンプ光はストークス光と異なる波長になっている。ここで、ポンプ光強度をIpとし、ストークス光強度をIsとする。この場合、CARS光の飽和が生じない線形領域では、CARS光強度ICARSは、Ip2Isに比例する。
あるいは、ポンプ光強度Ip及び、ストークス光強度Isを異なる周波数で強度変調しても良い。異なる周波数で強度変調した場合、2つの周波数の差又は和の周波数の整数倍で復調する。例えば、ポンプ光の変調周波数をfm_pとし、ストークス光の変調周波数をfm_sとした場合、その差の整数倍の周波数n(2fm_p―fm_s)又はその和の整数倍の周波数n(2fm_p+fm_s)で復調する。
誘導ラマン散乱光強度ISRSについて、図9Dを用いて説明する。誘導ラマン散乱光を発生させる場合、ポンプ光とストークス光を照射する。すなわち、2つのレーザ光源を用いて、同時に2つのレーザ光を試料の同じ位置に照射する。ポンプ光はストークス光と異なる波長になっている。ここで、ポンプ光強度をIpとし、ストークス光強度をIsとする。この場合、信号光の飽和が生じない線形領域では、誘導ラマン散乱光強度ISRSは、IpIsに比例する。従って、ポンプ光強度Iとストークス光強度Isのいずれか一方を強度変調する場合、強度変調するレーザ光の1乗応答となる。よって、図9Aで説明した散乱光と同様に、2次以上の成分を用いて観察する。また、ポンプ光強度Iとストークス光強度Isの両方を同じ変調周波数で強度変調する場合、2乗応答となる。よって、3次以上の変調高調波を用いて観察する。同じ変調周波数で、ポンプ光強度I及び、ストークス光強度Isの両方を強度変調する場合、同位相にそろえることが好ましい。すなわち、2つの光が最大強度で試料に照射されるタイミングを一致させることが好ましい。
あるいは、ポンプ光強度Ip及び、ストークス光強度Isを異なる変調周波数で強度変調しても良い。異なる変調周波数で強度変調した場合、2つの周波数の差又は和の周波数の整数倍で復調する。例えば、ポンプ光の変調周波数をfm_pとし、ストークス光の変調周波数をfm_sとした場合、その差n(fm_p―fm_s)又はその和n(fm_p+fm_s)で変調する。なお、ポンプ光強度I及び、ストークス光強度Isの両方で変調する場合、同位相にそろえることが好ましい。このように、2つのレーザ光入射させる場合、1つ目の変調周波数の整数倍と、2つ目の変調周波数の整数倍の和、又は差の周波数で復調する。
さらには、特許文献1で示した蛍光についても、2光子蛍光を検出する場合は、3次の変調周波数で復調し、3光子蛍光を検出する場合は、4次の変調周波数で復調する。
次に、レーザ光強度の最大値がbとなるようにした場合に付いて説明する。この場合、入射光強度の変調レンジが0~bとなっている。3次成分の点像分布関数は、図13のbに示すようになる。レーザ光スポットの中心位置では、入射光強度が最大bとなる。図12に示すように、レーザ光強度bよりも少し小さい入射光強度が3次成分の逆ピークに対応している。よって、レーザ光スポットの中心位置から少し離れると、3次成分の飽和が発生しない。すなわち、スポットから少し離れた位置では、3次成分の飽和が小さくなる。よって、スポット中心の近傍で点像分布関数が極小値を取る。そして、極小値は、図13bに示すようにリング状となる。
どの程度、高次の応答まで確認することができるかは、基本波の強度測定の信号対雑音比で決定される。非線形光学損失の計測では、レーザ光そのものが信号光であるため、非常に多くの光子を信号として利用することができる。このため、検出器のダイナミックレンジ一杯を利用して計測でき、信号対雑音比を非常に高くすることができる。また、非線形光学損失の測定にロックイン検出を利用することも有効である。一般的なフォトダイオードでは、100dB程度の検出ダイナミックレンジを有するため、高次の非線形応答も容易に計測することができる。
実際の測定結果を図14~図17に示す。図14は、金薄膜表面の非線形な反射特性を示す図である。図14の測定では、レーザ波長を780nmとした。図15は、LBO結晶表面の非線形な反射特性を示す図である。図15の測定では、レーザ波長を780nmとした。図16は、金微粒子からの非線形な散乱特性を示す図である。図16の測定では、レーザ波長を520nmとし、直径50nmの金微粒子を用いた。図17は、L-AlanineからのCARS光の飽和特性を示す図である。図17の測定では、ストークス光波長を820nm、ポンプ光を785nmとした。また、ストークス光強度を3100kW/cm2で一定とし、ポンプ光を変調した。
上記の説明では、変調器を用いてレーザ光強度を変化させたが、これ以外の方法によってレーザ光強度を変化させても良い。たとえば、特表2006/061947号に示したように、NDフィルタなどのフィルタを用いてレーザ光を減衰させる。フィルタを用いることで、レーザ光強度を段階的に変化させることができる。そして、レーザ光強度が最大となるときに、信号光の飽和が発生するようにする。これにより、同様の効果を得ることができる。例えば、信号光が非線形領域となる第1の強度と、第1の強度と異なる第2の強度の少なくとも2つの強度とで試料に照射されるようレーザ光の強度を変化させる。そして、第1の強度での信号光の強度及び前記第2の強度での信号光の強度に基づいて信号光の飽和成分を算出する。
11 変調器
12 ダイクロイックミラー
13 スキャナ
14 レンズ
15 レンズ
16 対物レンズ
17 試料
19 ダイクロイックフィルタ
20 レンズ
21 ピンホール
22 検出器
23 ロックインアンプ
24 処理装置
31 変調器
32 ビームスプリッタ
33 レンズ
34 試料
35 対物レンズ
36 ダイクロイックミラー
37 ミラー
38 検出器
39 検出器
30 ロックインアンプ
41 検出器
42 検出器
Claims (14)
- 光を出射する少なくとも一つの光源と、
前記光源からの光を集光して試料に照射するレンズと、
前記光を前記試料に照射した際に、前記試料での多光子遷移過程により発生する信号光を検出する、少なくとも一つの検出器と、を備え、
前記光の強度が最大の時に、前記信号光の非線形光学効果により発生する飽和又は非線形な増加が生じることによって光の強度と前記信号光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう前記光の強度を変化させて試料に照射し、
前記光の強度に応じた前記信号光を前記検出器で検出し、前記信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行う顕微鏡。 - 前記光源からの光と同じ波長の反射光、透過光、及び散乱光の少なくとも一つを前記信号光として、前記検出器が検出し、
高次の非線形光学効果を含む他の光学効果により光高調波が発生することで、前記信号光が飽和することを特徴とする請求項1に記載の顕微鏡。 - 多光子遷移によって発生した散乱光を前記信号光として前記検出器が検出し、
前記非線形光学効果を含む他の光学効果により光高調波が発生することで、前記信号光が飽和することを特徴とする請求項1に記載の顕微鏡。 - 前記検出器がハイパーレイリー散乱、ラマン散乱、誘導ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、四光波混合、誘導放出、高調波発生、差周波発生、及び和周波発生のうちの少なくとも一つを検出し、
前記検出器で検出される信号光が、前記光源からの光との波長差を利用して、前記光から分離されていることを特徴とする請求項3に記載の顕微鏡。 - 前記光の強度が時間に応じて変化するよう強度変調する変調器をさらに備え、
前記光がピークとなる時間において信号光が前記非線形領域となる強度で試料に照射され、
前記変調器で強度変調しながら、前記光と前記試料の相対位置を変化させるよう走査し、前記試料から出射した信号光を前記検出器で検出し、
前記検出器で検出された信号光から、前記変調器での変調周波数に対する高調波成分を取り出して観察を行う請求項1乃至4のいずれか1項に記載の顕微鏡。 - 前記試料からの信号光が、前記変調器で強度変調された光のn光子反応(nは1以上の自然数)によって生成され、
前記変調器での変調周波数に対する(n+1)次以上の高調波成分を取り出して、観察を行うことを特徴とする請求項5に記載の顕微鏡。 - 前記試料に波長の異なる2つの光が照射され、
前記2つの光が同じ変調周波数、かつ同じ位相で強度変調され、
前記試料からの信号光が、強度変調された2つの光のm光子反応(mは2以上の自然数)によって生成され、
前記変調周波数に対する(m+1)次以上の高調波成分を取り出して、観察を行うことを特徴とする請求項1乃至6のいずれか1項に記載の顕微鏡。 - 前記試料に波長の異なる2つの光が照射され、
前記2つの光が異なる変調周波数で変調され、
前記2つの光の変調周波数の和、又は差に応じた周波数で復調していることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか1項に記載の顕微鏡。 - 前記光の強度が時間に応じて変化するよう強度変調され、
前記光源がパルス光源であり、
前記パルス光源の繰り返し周波数が、強度変調の変調周波数よりも高くなっている請求項1乃至8のいずれか1項に記載の顕微鏡。 - 前記信号光が前記非線形領域となる第1の強度と、前記第1の強度と異なる第2の強度の少なくとも2つの強度とで前記試料に照射されるよう前記光の強度を変化させ、
前記第1の強度での信号光の強度及び前記第2の強度での信号光の強度に基づいて信号光の飽和成分又は非線形な増加成分を算出する請求項1乃至4のいずれか1項に記載の顕微鏡。 - 波長差に応じて分離された前記信号光を複数の前記検出器で検出することを特徴とする請求項1乃至10のいずれか1項に記載の顕微鏡。
- 光を試料に照射し、前記試料を観察する観察方法であって、
前記光を集光して、前記試料に照射することで、前記試料での多光子遷移過程による信号光を発生させ、
前記光の強度が最大の時に、前記試料からの前記信号光が、非線形光学効果により発生する前記信号光の飽和又は非線形な増加によって光の強度と信号光の強度との関係が非線形になる非線形領域となるよう、前記光の強度を変化させて、
前記試料からの信号光を検出し、
前記検出された信号光の飽和成分又は非線形な増加成分に基づいて観察を行う観察方法。 - 前記試料の近傍に金属探針を配置した状態、又は前記試料に金属粒子を添加した状態で、前記光を試料に照射することを特徴とする請求項12に記載の観察方法。
- 前記試料の近傍に配置された金属探針を走査しながら、前記光を試料に照射して、前記信号光を検出することを特徴とする請求項13に記載の観察方法。
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