JP5953753B2 - 非線形顕微鏡及び非線形観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、非線形顕微鏡及び非線形観察方法に関する。

共焦点顕微鏡は、光源から射出した照明光を被検物に向けて集光する照射光学系と、被検物から射出した光を、照射光の集光点と共役な位置に配置された共焦点絞り（ピンホール部材）を介して検出する検出光学系とを備える（特許文献１などを参照）。

この構成では、照明光の集光点とは異なる高さの層から射出した光の大部分はピンホール部材で阻止されるので、照射光学系の焦点を所望の高さの層に合わせ、照明光のスポットで被検物上を二次元走査しながら検出を繰り返せば、その層の画像（断面画像）を取得することができる。

さらに、被検物に対する集光点の高さを変化させながら断面画像の取得を繰り返し、各高さ位置で取得した断面画像を合成すれば、被検物の三次元画像を取得することもできる。なお、通常の共焦点顕微鏡において信号光として検出されるのは、照射光の強度に対して線形な強度で被検物から発せられる蛍光である。

それに対し、近年になると、コヒーレントな非線形光学過程を利用した非線形顕微鏡の開発が盛んに行われるようになった（例えば、特許文献２を参照。）。非線形顕微鏡において信号光として検出されるのは、照明光の強度に対して非線形な強度で被検物から発せられる光である。

この非線形顕微鏡は、照明光として比較的長い波長の光（近赤外線）を用いることができるので、被検物の深部観察が可能である。また、非線形光学過程は対物レンズの焦点近傍の微小領域でしか生起しないので、非線形顕微鏡の分解能は、線形顕微鏡の分解能と比して格段に高い。

特開２００７−２７９０８５号公報 特開２００９−４７４３５号公報

しかしながら、非線形顕微鏡の性能は経験的に知られているものの、それを定量的に表わした例はほとんどない。

そこで本発明は、性能の評価機能を備えた非線形顕微鏡及び非線形観察方法を提供することを目的とする。

本発明を例示する非線形顕微鏡は、光源から供給される照明光を被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明光学系と、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな信号光を検出する検出光学系とを備える非線形顕微鏡において、前記非線形光学過程のタイプ、前記非線形光学過程の使用波長、前記非線形光学過程の照明タイプ、前記照明光学系の対物レンズのＮＡ、前記検出光学系の対物レンズのＮＡのいずれかの設定が変更可能であって、変更された設定において算出された前記非線形顕微鏡のコヒーレント伝達関数の伝達域の形状を示す画像の情報を表示装置に出力する算出手段をさらに備える。

本発明を例示する非線形観察方法は、光源から供給される照明光を被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明手順と、前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな信号光を検出する検出手順とを含む非線形観察方法において、前記非線形光学過程のタイプ、前記非線形光学過程の使用波長、前記非線形光学過程の照明タイプ、前記照明光学系の対物レンズのＮＡ、前記検出光学系の対物レンズのＮＡのいずれかの設定が変更可能であって、変更された設定において算出された前記非線形顕微鏡のコヒーレント伝達関数の伝達域の形状を示す画像の情報を表示装置に出力する算出手順をさらに含む。

本発明によれば、性能の評価機能を備えた非線形顕微鏡及び非線形観察方法が実現する。

本実施形態の非線形顕微鏡の構成図である。 タイプの異なる複数の非線形光学過程の各々をdouble-sided Feynman diagramで表したものである。 ＳＲＬ、ＳＲＧにおける信号検出方法を説明する図である。 典型的な３次元瞳関数を説明する図である。 二値化ＣＴＦを非線形光学過程のタイプ毎に示す図である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として非線形顕微鏡を説明する。

図１は、本実施形態の非線形顕微鏡の構成図である。図１の上部は、非線形顕微鏡の光源側の構成を示す図であり、図１の下部は、非線形顕微鏡の試料側の構成を示す図である。

図１の上部に示すとおり本実施形態の非線形顕微鏡には、レーザ光源１１と、レンズ１２１と、ビームスプリッタ１２２と、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）１２５−１、１２５−２と、電気光学変調器（ＥＯＭ）１２６−１、１２６−２と、全反射ミラー１２３、１２７Ａ、１２７Ｂ、１２７Ｃと、光路長差調整機構１２８と、ビームスプリッタ１２９とが備えられる。

図１の下部に示すとおり本実施形態の非線形顕微鏡には、ダイクロイックミラー１４と、光スキャナ１５と、リレー光学系（レンズ１６Ａ、１６Ｂ）と、対物レンズ切り替え機構１９と、透過型のステージ１００と、対物レンズ切り替え機構２０と、全反射ミラー２１と、フィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒと、集光レンズ２５ｔ、２５ｒと、ピンホールマスク２６ｔ、２６ｒと、光検出器２７ｔ、２７ｒと、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒと、制御部２８と、演算部２９とが備えられる。

なお、ステージ１００は、透過型のステージであって、透明な容器である培養容器１０を支持している。培養容器１０の内部には、生体細胞を含んだ透明な培養液が収容されている。この生体細胞に含まれる分子（タンパク質、脂質など）が、非線形顕微鏡の観察対象物となる。

レーザ光源１１は、パルスレーザ光を発振するパルスレーザ光源であって、レーザ光源が発振するパルスレーザ光のパルス形状は、適切な形状に設定されている。この設定により、後述する光スポットの中心部分（高密度スポット）のエネルギー密度は、観察対象物に非線形光学過程を生起させるのに適したエネルギー密度となる。このレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光は、レンズ１２１へ入射する。

レンズ１２１へ入射したパルスレーザ光は、径の太い平行光束となり、ビームスプリッタ１２２へ入射し、ビームスプリッタ１２２を透過するパルスレーザ光Ｌと、ビームスプリッタ１２２を反射するパルスレーザ光Ｌとに分岐される（なお、図１では、互いに同じ光周波数を有した光に対して互いに同じ符号を付している。）。

ビームスプリッタ１２２を透過したパルスレーザ光Ｌは、ＯＰＯ１２５−１、ＥＯＭ１２６−１、全反射ミラー１２７Ａ、光路長差調整機構１２８、全反射ミラー１２７Ｂを順に介してビームスプリッタ１２９へ入射する。また、ビームスプリッタ１２２を反射したパルスレーザ光Ｌは、全反射ミラー１２３、ＯＰＯ１２５−２、ＥＯＭ１２６−２、全反射ミラー１２７Ｃを順に介してビームスプリッタ１２９へ入射する。

以下、ＯＰＯ１２５−１を経由するパルスレーザ光Ｌを「パルスレーザ光Ｌ１」とし、ＯＰＯ１２５−２を経由するパルスレーザ光Ｌを「パルスレーザ光Ｌ２」とする。

パルスレーザ光Ｌ１の単独光路へ配置されたＯＰＯ１２５−１は、入射したパルスレーザ光Ｌ１の光周波数を変換することにより、パルスレーザ光Ｌ１の光周波数を所定の周波数ω_１に設定する。なお、ＯＰＯ１２５−１の出力周波数ω_１は、制御部２８によって適宜に切り替えられる。

パルスレーザ光Ｌ２の単独光路へ配置されたＯＰＯ１２５−２は、入射したパルスレーザ光Ｌ２の光周波数を変換することにより、パルスレーザ光Ｌ２の光周波数をω_１とは異なる周波数ω_２に設定する。なお、ＯＰＯ１２５−２の出力周波数ω_２は、制御部２８によって適宜に切り替えられる（以下、ω_１＞ω_２とする。）。

パルスレーザ光Ｌ１の単独光路へ配置されたＥＯＭ１２６−１は、入射したパルスレーザ光Ｌ１の強度を時間方向にかけて所定の周波数でパルス変調する。このＥＯＭ１２６−１の変調周波数は、パルスレーザ光Ｌ１の繰り返し周波数よりも低い値に設定される。なお、ＥＯＭ１２６−１の変調機能は、制御部２８によって適当なタイミングでオン／オフされ、ＥＯＭ１２６−１の変調機能がオフされた状態では、パルスレーザ光Ｌ１は無変調状態となる。また、ＥＯＭ１２６−１の出力強度をゼロに設定すれば、パルスレーザ光Ｌ１をオフすることができる。

パルスレーザ光Ｌ２の単独光路へ配置されたＥＯＭ１２６−２は、入射したパルスレーザ光Ｌ２の強度を時間方向にかけて所定の周波数で変調する。このＥＯＭ１２６−２の変調周波数は、パルスレーザ光Ｌ２の繰り返し周波数よりも低い値に設定される。なお、ＥＯＭ１２６−２の変調機能は、制御部２８によって適当なタイミングでオン／オフされ、ＥＯＭ１２６−２の変調機能がオフされた状態では、パルスレーザ光Ｌ２は無変調状態となる。また、ＥＯＭ１２６−２の出力強度をゼロに設定すれば、パルスレーザ光Ｌ２をオフすることができる。

光路長差調整機構１２８は、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の光路長差を調整するための機構である。両者の光路長差は、パルスレーザ光Ｌ１の何れかのパルスがビームスプリッタ１２９へ入射するタイミングと、パルスレーザ光Ｌ２の何れかのパルスがビームスプリッタ１２９へ入射するタイミングとが合致するように予め調整されている。

ビームスプリッタ１２９へ入射したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、互いの光路を統合し、ダイクロイックミラー１４へ向かう。これらのパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は、ダイクロイックミラー１４を透過し、光スキャナ１５、レンズ１６Ａ、１６Ｂを順に介して対物レンズ切り替え機構１９の有効対物レンズへ入射する。

対物レンズ切り替え機構１９は、ＮＡの異なる複数の対物レンズを備えており、それらの対物レンズのうち１つを選択的に光路へ設定する。ここでは、対物レンズ切り替え機構１９が光路へ設定している対物レンズを「有効対物レンズ」と称している。対物レンズ切り替え機構１９の切り替え位置は、制御部２８によって制御される。

対物レンズ切り替え機構１９の有効対物レンズへ入射したパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２は集光し、培養容器１０の観察対象面１０Ａ上に光スポットを形成する。その光スポットの中心部分（高密度スポット）では、非線形光学過程が生起し、信号光が発生する。

培養容器１０で発生した信号光のうち、対物レンズ切り替え機構２０の有効対物レンズの側へ射出したもの（透過信号光）は、対物レンズ切り替え機構２０の有効対物レンズへ入射する。

対物レンズ切り替え機構２０は、ＮＡの異なる複数の対物レンズを備えており、それらの対物レンズのうち１つを選択的に光路へ設定する。ここでは、対物レンズ切り替え機構２０が光路へ設定している対物レンズを「有効対物レンズ」と称している。対物レンズ切り替え機構２０の切り替え位置は、制御部２８によって制御される。

対物レンズ切り替え機構２０の有効対物レンズへ入射した信号光は、全反射ミラー２１を介してフィルタ切り替え機構２２ｔの有効フィルタへ入射する。

なお、フィルタ切り替え機構２２ｔは、パスバンドの異なる複数のフィルタを備えており、それらのフィルタのうち１つを選択的に光路へ設定する。ここでは、フィルタ切り替え機構２２ｔが光路へ設定しているフィルタを「有効フィルタ」と称している。フィルタ切り替え機構２２ｔの切り替え位置は、制御部２８によって制御される。

フィルタ切り替え機構２２ｔの有効フィルタを通過した透過信号光Ｌｒは、集光レンズ２５ｔにより集光され、ピンホールマスク２６ｔのピンホール近傍に向かう。ピンホールマスク２６ｔを通過した透過信号光Ｌｔは、光検出器２７ｔへ入射し、電気信号へと変換される。この電気信号は、ロックインアンプ２３ｔを介して制御部２８へと入力される。

ロックインアンプ２３ｔは、制御部２８によってＥＯＭ１２６−１又はＥＯＭ１２６−２と同期制御され、光検出器２７ｔから出力される電気信号のうち、ＥＯＭ１２６−１又はＥＯＭ１２６−２の変調周波数と同じ周波数で変化する成分を抽出する。なお、ロックインアンプ２３ｔのロックイン機能は、制御部２８によって適当なタイミングでオン／オフされる。

培養容器１０で発生した信号光のうち、対物レンズ切り替え機構１９の有効対物レンズの側へ射出したもの（反射信号光）は、対物レンズ切り替え機構１９の有効対物レンズへ入射する。

対物レンズ切り替え機構１９の有効対物レンズへ入射した反射信号光は、レンズ１６Ｂ、１６Ａ、光スキャナ１５を順に介してダイクロイックミラー１４へ入射する。この反射信号光は、フィルタ切り替え機構２２ｒの有効フィルタへ入射する。

フィルタ切り替え機構２２ｒは、パスバンドの異なる複数のフィルタを備えており、それらのフィルタのうち１つを選択的に光路へ設定する。ここでは、フィルタ切り替え機構２２ｒが光路へ設定しているフィルタを「有効フィルタ」と称している。フィルタ切り替え機構２２ｒの切り替え位置は、制御部２８によって制御される。

フィルタ切り替え機構２２ｒの有効フィルタを通過した反射信号光Ｌｒは、集光レンズ２５ｒにより集光され、ピンホールマスク２６ｒのピンホール近傍に向かう。ピンホールマスク２６ｒを通過した反射信号光Ｌｒは、光検出器２７ｒへ入射し、電気信号へと変換される。この電気信号は、ロックインアンプ２３ｒを介して制御部２８へと入力される。

ロックインアンプ２３ｒは、制御部２８によってＥＯＭ１２６−１又はＥＯＭ１２６−２と同期制御され、光検出器２７ｒから出力される電気信号のうち、ＥＯＭ１２６−１又はＥＯＭ１２６−２の変調周波数と同じ周波数で変化する成分を抽出する。なお、ロックインアンプ２３ｒのロックイン機能は、制御部２８によって適当なタイミングでオン／オフされる。

光スキャナ１５は、１対のガルバノメータミラーなどを配置した光スキャナであって、光スキャナ１５が駆動されると前述した光スポットは観察対象面１０Ａ上を移動する。

制御部２８は、光スキャナ１５を駆動して光スポットで観察対象面１０Ａ上を二次元走査すると共に、光スポットが各走査位置にあるときに光検出器２７ｒを駆動することにより、反射信号光の強度の観察対象面１０Ａ上の分布（反射観察画像）を取得することができる。さらに、制御部２８は、培養容器１０を光軸方向にシフトさせながら反射観察画像の取得を繰り返すことにより、３次元の反射観察画像を取得する。この反射観察画像は、演算部２９を介して不図示のモニタに表示される。

演算部２９は、反射観察画像の表示に先立ち、その反射観察画像に関する分解能を算出する処理（分解能算出処理）と、反射観察画像を先鋭化する処理（先鋭化処理）とを実行する（詳細は後述）。

また、制御部２８は、ステージ１００を光軸と垂直な方向（ｘｙ方向）に移動させることにより光スポットで観察対象面１０A上を二次元走査すると共に、光スポットが各走査位置にあるときに光検出器２７ｔを駆動することにより、透過信号光の強度の観察対象面１０Ａ上の分布（透過観察画像）を取得することができる。さらに、制御部２８は、培養容器１０を光軸方向にシフトさせながら透過観察画像の取得を繰り返すことにより、３次元の透過観察画像を取得する。この透過観察画像は、演算部２９を介して不図示のモニタに表示される。

演算部２９は、透過観察画像の表示に先立ち、透過観察画像に関する分解能を算出する処理（分解能算出処理）と、透過観察画像を先鋭化する処理（先鋭化処理）とを実行する（詳細は後述）。

なお、制御部２８は、ユーザからの指示に応じて、駆動対象となる光検出器を光検出器２７ｒ、２７ｔの間で切り替えると共に、駆動対象となる機構を光スキャナ１５とステージ１００との間で切り替えることにより、非線形顕微鏡が取得する観察画像を、透過観察画像と反射観察画像との間で切り替える。このように、非線形顕微鏡が取得する観察画像を透過観察画像と反射観察画像との間で切り替えることは、非線形顕微鏡の照明タイプを透過型と反射型との間で切り替えることに相当する。

また、制御部２８は、ユーザからの指示に応じて、パルスレーザ光Ｌ１の光周波数ω_１とパルスレーザ光Ｌ２の光周波数ω_２との組み合わせを切り替えることにより、非線形光学過程の使用波長を切り替える。

また、制御部２８は、ユーザからの指示に応じて、パルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２のオン／オフ状態と、ＥＯＭ１２６−１、１２６−２の変調機能のオン／オフ状態と、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒのロックイン機能のオン／オフ状態と、フィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの設定位置との組み合わせを切り替えることにより、観察に利用される非線形光学過程のタイプを切り替える。切り替え可能な非線形光学過程のタイプは、例えば、以下のタイプ（Ａ）〜（Ｈ）である。

（Ａ）第２高調波（ＳＨＧ）：光周波数ω_１の照明光を照射し、光周波数ωｓ＝２ω_１の信号光を検出する非線形光学過程。このＳＨＧをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ａ）である。よって、このＳＨＧを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１をオンし、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２をオフし、ＥＯＭ１２６−１、１２６−２の双方の変調機能をオフし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオフし、パスバンドがωｓ＝２ω_１であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

（Ｂ）和周波（ＳＦＧ）：周波数ω_１、ω_２の照明光を照射し、周波数ωｓ＝（ω_１＋ω_２）の信号光を検出する非線形光学過程。このＳＦＧをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ｂ）である。よって、このＳＦＧを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１と、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２との双方をオンし、ＥＯＭ１２６−１、１２６−２の双方の変調機能をオフし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオフし、パスバンドがωｓ＝（ω_１＋ω_２）であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

（Ｃ）差周波（ＤＦＧ）：周波数ω_１、ω_２の照明光を照射し、周波数ωｓ＝（ω_１−ω_２）の信号光を検出する非線形光学過程（但し、ω_１＞ω_２）。このＤＦＧをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ｃ）である。よって、このＤＦＧを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１と、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２との双方をオンし、ＥＯＭ１２６−１、１２６−２の双方の変調機能をオフし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオフし、パスバンドがωｓ＝（ω_１−ω_２）であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

（Ｄ）第３高調波（ＴＨＧ）：周波数ω_１の照明光を照射し、周波数ωｓ＝３ω_１の信号光を検出する非線形光学過程。このＴＨＧをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ｄ）である。よって、このＴＨＧを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１をオンし、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２をオフし、ＥＯＭ１２６−１、１２６−２の双方の変調機能をオフし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオフし、パスバンドがωｓ＝３ω_１であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

（Ｅ）コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）：周波数ω_１、ω_２の照明光を照射し、周波数ωｓ＝（２ω_１−ω_２）の信号光を検出する非線形光学過程（ω_１＞ω_２）。このＣＡＲＳをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ｅ）である。よって、このＣＡＲＳを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１と、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２との双方をオンし、ＥＯＭ１２６−１、１２６−２の双方の変調機能をオフし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオフし、パスバンドがωｓ＝（２ω_１−ω_２）であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

（Ｆ）コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）：周波数ω_１、ω_２の照明光を照射し、周波数ωｓ＝（２ω_２−ω_１）の信号光を検出する非線形光学過程（但し、ω_１＞ω_２、２ω_２＞ω_１）。このＣＳＲＳをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ｆ）である。よって、このＣＳＲＳを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１と、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２との双方をオンし、ＥＯＭ１２６−１、１２６−２の双方の変調機能をオフし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオフし、パスバンドがωｓ＝（２ω_２−ω_１）であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

（Ｇ）三次の誘導ラマンロス（ＳＲＬ）：周波数ω_１、ω_２の照明光を照射し、周波数ωｓ＝ω_１の信号光を検出する非線形光学過程（但し、ω_１＞ω_２）。このＳＲＬをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ｇ）である。よって、このＳＲＬを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１と、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２との双方をオンし、ＥＯＭ１２６−１の変調機能をオフし、ＥＯＭ１２６−２の変調機能をオンし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオンし、パスバンドがωｓ＝ω_１であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

すなわち、ＳＲＬでは、信号光の光周波数ωｓが一方のパルスレーザ光Ｌ１の光周波数ω_１と等しいので、両者を分離するために、図３（Ａ）に示すとおり他方のパルスレーザ光Ｌ２を時間変調すると共に、光周波数がω_１である信号光を、変調周波数と同じ周波数でロックイン検出（復調）する。

（Ｈ）三次の誘導ラマンゲイン（ＳＲＧ）：周波数ω_１、ω_２の照明光を照射し、周波数ωｓ＝ω_２の信号光（ラマンゲイン）を検出する非線形光学過程（但し、ω_１＞ω_２）。このＳＲＧをdouble-sided Feynman diagramで表したのが図２（Ｈ）である。よって、このＳＲＧを利用するためには、光周波数がω_１であるパルスレーザ光Ｌ１と、光周波数がω_２であるパルスレーザ光Ｌ２との双方をオンし、ＥＯＭ１２６−１の変調機能をオンし、ＥＯＭ１２６−２の変調機能をオフし、ロックインアンプ２３ｔ、２３ｒの双方のロックイン機能をオンし、パスバンドがωｓ＝ω_２であるフィルタをフィルタ切り替え機構２２ｔ、２２ｒの有効フィルタに設定すればよい。

すなわち、ＳＲＧでは、信号光の光周波数ωｓが一方のパルスレーザ光Ｌ２の光周波数ω_２と等しいので、両者を分離するために、図３（Ｂ）に示すとおり他方のパルスレーザ光Ｌ１を時間変調すると共に、光周波数がω_２である信号光を、変調周波数と同じ周波数でロックイン検出（復調）する。

＜double-sided Feynman diagram＞
ここで、double-sided Feynman diagram（図２）を簡単に説明する。

double-sided Feynman diagram（図２）における１対の平行な線分は、非線形光学過程を生起させる分子の状態(分極状態)を表現している。分極状態とは、２つの状態が量子力学的に重なり合った状態で、１対の平行な線分は一方の状態と他方の状態とを表している。線分に向かう矢印は、分子が吸収する光を表しており、線分から離れる矢印は、分子から放出される光を表している。励起光の吸収や放出を表す矢印が線分に交わるたびに状態が遷移していき、分極状態が変化していく。左上の波線の矢印は、最終的に発する信号光を表しており、信号光を発した結果、分子の状態は分極状態からある終状態(定常状態)へと移行する。矢印に添えられた記号ωは、その励起光の周波数を意味する。

＜演算部２９が予め記憶する演算式＞
ここで、演算部２９が予め記憶する演算式を説明する。

演算部２９が予め記憶する演算式は、非線形顕微鏡のコヒーレント伝達関数（ＣＴＦ）を算出するための下記の演算式である。

なお、演算式中の各演算記号は、以下のとおり定義される。

また、演算式中のＰｓ（ｆ’）は、信号光の３次元瞳関数（信号光を導光する有効対物レンズの３次元瞳関数）である。また、ｆ’は空間周波数であって、ｚ方向（光軸方向）の空間周波数ｆｚ’と、ｘ方向の空間周波数ｆｘ’と、ｙ方向の空間周波数ｆｙ’とからなる。

また、演算式中のＰ_Ｒ１（ｆ’）、Ｐ_Ｒ２（ｆ’）、…は、double-sided Feynman diagramにおいて右上向き実線矢印で表される光周波数を有した光の３次元瞳関数（光を導光する有効対物レンズの３次元瞳関数）である（順不同）。

また、演算式中のＰ_Ｌ１（ｆ’）、Ｐ_Ｌ２（ｆ’）、…は、double-sided Feynman diagramの左上向き実線矢印で表される光周波数を有した光の３次元瞳関数（光を導光する有効対物レンズの３次元瞳関数）である（順不同）。

したがって、この演算式は、非線形光学過程のタイプがＳＨＧ（図２（Ａ））である場合には、以下の演算式（Ａ）となり、非線形光学過程のタイプがＳＦＧ（図２（Ｂ））である場合には、以下の演算式（Ｂ）となり、非線形光学過程のタイプがＤＦＧ（図２（Ｃ））である場合には、以下の演算式（Ｃ）となり、非線形光学過程のタイプがＴＨＧ（図２（Ｄ））である場合には、以下の演算式（Ｄ）となり、非線形光学過程のタイプがＣＡＲＳ（図３（Ｅ））である場合には、以下の演算式（Ｅ）となり、非線形光学過程のタイプがＣＳＲＳ（図３（Ｆ））である場合には、以下の演算式（Ｆ）となり、非線形光学過程のタイプがＳＲＬ（図３（Ｇ））である場合には、以下の演算式（Ｇ）となり、非線形光学過程のタイプがＳＲＧ（図３（Ｈ））である場合には、以下の演算式（Ｈ）となる。なお、これらの演算式（Ａ）〜（Ｈ）における添え字ｎは、double-sided Feynman diagramにおける添え字ｎに対応している。

また、或る光の３次元瞳関数Ｐ（ｆ’）は、その光を導光する有効対物レンズのＮＡと、その光の波長λと、その光の媒質の屈折率ｎ（ｎは、λに依存するので、以下、「ｎ（λ）」と表す。）とによって決まり、典型的には、値が１となる範囲と値が０となる範囲とを有した関数であって、値が１となる範囲を図示すると、図４に示すような部分球殻状となる。この部分球殻の曲率半径は、ｎ（λ）／λに一致し、部分球殻の縁から原点に向かう線分とｆｚ’軸との成す角度をθとおくと、ｓｉｎθはＮＡ／ｎ（λ）に一致する。

因みに、図４に示したのは、照明タイプが透過型である場合の信号光の３次元瞳関数Ｐｓ（ｆ’）の例である。照明タイプが反射型の場合、信号光の３次元瞳関数Ｐｓ（ｆ’）は、図４の関数をｆｘ’−ｆｙ’平面に関して反転させたものとなる。

＜演算部２９による分解能算出処理＞
次に、演算部２９による分解能算出処理を説明する。

分解能算出処理は、制御部２８からの指示に応じて実行される。制御部２８は、非線形顕微鏡の設定内容（非線形光学過程のタイプと、非線形光学過程の使用波長と、有効対物レンズのＮＡと、照明タイプとの組み合わせ）が変更されたか否かを判別し、変更された場合に分解能算出処理の実行指示を演算部２９へ与える。なお、演算部２９には、実行指示と共に、非線形顕微鏡の設定内容（非線形光学過程のタイプと、非線形光学過程の使用波長と、有効対物レンズのＮＡと、照明タイプとの組み合わせ）の情報が与えられる。

実行指示が与えられると、演算部２９は、演算式（Ａ）〜（Ｈ）の中の１つを非線形光学過程のタイプに応じて選択する。

次に、演算部２９は、選択した演算式に必要な３次元瞳関数、すなわち、Ｐ_１（ｆ’）、Ｐ_２（ｆ’）の少なくとも１つと、Ｐｓ（ｆ’）とを作成する。なお、その作成は、使用波長及びＮＡ及び照明タイプに基づき行われる。

次に、演算部２９は、作成した３次元瞳関数をその演算式へ当てはめることにより、非線形顕微鏡のＣＴＦ（ｆ’）を算出する。

次に、演算部２９は、算出したＣＴＦ（ｆ’）のｆｘ’−ｆｚ’平面における分布を二値化処理することにより、二値化ＣＴＦを取得する。この二値化ＣＴＦは、観察対象面から光検出器の側へと伝達可能な構造のｆｚ’方向の空間周波数域（伝達域）を示す。

次に、演算部２９は、取得した二値化ＣＴＦを、非線形顕微鏡の分解能として不図示のモニタへ表示する。

図５（Ａ）は、非線形光学過程のタイプがＳＨＧであったときの二値化ＣＴＦであり、図５（Ｂ）は、非線形光学過程のタイプがＤＦＧであったときの二値化ＣＴＦであり、図５（Ｃ）は、非線形光学過程のタイプがＴＨＧであったときの二値化ＣＴＦであり、図５（Ｄ）は、非線形光学過程のタイプがＣＡＲＳ又はＣＳＲＳであったときの二値化ＣＴＦであり、図５（Ｅ）は、非線形光学過程のタイプがＳＲＧ又はＳＲＬであったときの二値化ＣＴＦである。

図５（Ａ）〜（Ｅ）の各々の横軸は、ｆｚ’軸であり、縦軸は、ｆｘ’ｆｙ’方向である。これらの図５（Ａ）〜（Ｅ）において明るい領域が伝達域であり、暗い領域が非伝達域である。ｆz’方向の伝達域の幅が広いほどｚ方向の観察分解能は高いとみなすことができ、ｆｘ’方向の伝達域の幅が広いほどｘｙ方向の観察分解能は高いとみなすことができる（対物レンズは回転対称な形状をしているのでｘ方向の特性はそのままｙ方向の特性にも当てはまるので。）。

また、図５（Ａ）〜（Ｅ）の各々は、次の条件下で取得されたものである。

（１）照明タイプは透過型である。

（２）観察対象面の両側の有効対物レンズのＮＡは共に０．９である。

（３）有効対物レンズの媒質は共に空気（ドライタイプ）である。

（４）ＣＡＲＳとＣＳＲＳとＳＲＧとＳＲＬで使用される２種類のパルスレーザ光Ｌ１、Ｌ２の光周波数の差はきわめて小さい(パルスレーザ光Ｌ２の波長をλとした)。

（５）ＤＦＧで使用されるパルスレーザ光Ｌ２の波長はＤＦＧで使用されるパルスレーザ光Ｌ１の波長の約２倍である(パルスレーザ光Ｌ２の波長をλとした)。

ここで、図５（Ａ）〜（Ｅ）に示すとおり、非線形光学過程のタイプが異なると、他の条件が仮に同じであったとしても、伝達域の形状（つまり分解能）は異なる。例えば、非線形光学過程のタイプがＴＨＧである場合は、原点における二値化ＣＴＦが０であるため、ＴＨＧでは観察対象面の構造のＤＣ成分を分解できないが、他のタイプである場合は、原点における二値化ＣＴＦが１であるため、他のタイプでは観察対象面の構造のＤＣ成分を分解できることがわかる。

また、図５（Ａ）〜（Ｅ）には非線形光学過程のタイプの相違しか表さなかったが、非線形光学過程の使用波長と、有効対物レンズのＮＡと、照明タイプとの組み合わせが異なれば、非線形光学過程のタイプが仮に同じであったとしても、伝達域の形状（つまり分解能）は異なる。

したがって、ユーザは、非線形顕微鏡の設定内容に応じて変化する分解能を、モニタ上で適宜に確認することができる。

なお、演算部２９は、二値化ＣＴＦと共に、信号光の明るさの目安をモニタへ表示してもよい。信号光の明るさの目安は、非線形光学過程の感受率χ（３）によって決まるものであり、非線形光学過程のタイプと、非線形光学過程の使用波長と、有効対物レンズのＮＡと、照明タイプと、観察対象物のタイプとの組み合わせに基づき算出することができる。なお、観察対象物のタイプは、制御部２８がユーザに入力させればよい。

＜演算部２９による先鋭化処理＞
次に、演算部２９による先鋭化処理を説明する。

先鋭化処理は、制御部２８からの指示に応じて実行される。制御部２８は、３次元の観察画像（３次元の反射観察画像又は３次元の透過観察画像）を取得する度に、先鋭化処理の実行指示を演算部２９へ与える。なお、演算部２９には、その実行指示と共に、分解能算出処理で算出したＣＴＦ（ｆ’）の情報が与えられる。

実行指示が与えられると、演算部２９は、３次元の観察画像Ｉ（ｘ、ｙ、ｚ）をフーリエ変換することにより、フーリエスペクトルＦ（ ｆ’）を取得する（なお、前述したとおり、ｆ’は、ｆｘ’、ｆｙ’、ｆｚ’からなる。）。

また、演算部２９は、ＣＴＦ（ｆ’）の自己相関関数Ｒ（ｆ’）を算出する。自己相関関数Ｒ（ｆ’）のカットオフ周波数の絶対値は、ＣＴＦ（ｆ’）のカットオフ周波数の絶対値よりも大きい。ここでは、自己相関関数Ｒ（ｆ’）のカットオフ周波数を−ｆａ’〜ｆａ’と表す。

次に、演算部２９は、フーリエスペクトルＦ（ｆ’）のカットオフ周波数を、自己相関関数Ｒ（ｆ’）のカットオフ周波数に一致させるために、フーリエスペクトルＦ（ｆ’）のうち、カットオフ周波数−ｆａ’〜ｆａ’から外れた範囲の値をゼロに置換する。以下、置換後のフーリエスペクトルＦ（ｆ’）を、「フーリエスペクトルＧ（ｆ’）」と称す。

次に、演算部２９は、フーリエスペクトルＧ（ｆ’）の周波数操作を行い、フーリエスペクトルＧ（ｆ’）の立ち上がり（カットオフ周波数の近傍）を緩やかにする。以下、周波数操作後のフーリエスペクトルＧ（ｆ’）を、「フーリエスペクトルＨ（ｆ’）」と称す。

次に、演算部２９は、フーリエスペクトルＨ（ｆ’）を自己相関関数Ｒ（ｆ’）で除算し、除算後のフーリエスペクトルＨ（ｆ’）を逆フーリエ変換することにより、先鋭化後の観察画像Ｉ （ｘ、ｙ、ｚ）を取得する。

次に、演算部２９は、先鋭化後の観察画像Ｉ （ｘ、ｙ、ｚ）を、不図示のモニタへ表示する。

したがって、ユーザは、非線形顕微鏡が取得した観察画像を、鮮明な画像として観察することができる。

＜実施形態の効果＞
以上、本実施形態の非線形顕微鏡は、光源（レーザ光源１１）から供給される照明光を被観察物（培養容器１０）上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明光学系（レンズ１２１、ビームスプリッタ１２２、全反射ミラー１２７Ａ、光路長差調整機構１２８、全反射ミラー１２７Ｂ、１２３、１２７Ｃ、ビームスプリッタ１２９、ダイクロイックミラー１４、レンズ１６Ａ、１６Ｂ、対物レンズ切り替え機構１９の有効対物レンズなど）と、集光点における非線形光学過程で発生したコヒーレントな信号光を検出する検出光学系（対物レンズ切り替え機構２０の有効対物レンズ２０、全反射ミラー２１、集光レンズ２５ｔ、２５ｒ、光検出器２７ｔ、２７ｒなど）とを備える非線形顕微鏡において、非線形顕微鏡のコヒーレント伝達関数を算出する算出手段（演算部２９）とを備える。

したがって、本実施形態の非線形顕微鏡は、非線形顕微鏡の性能を定量的に評価することができる。

また、算出手段（演算部２９）は、コヒーレント伝達関数を算出するための演算式（式（Ａ）〜（Ｈ））を予め記憶しているので、非線形顕微鏡の性能評価を高速に行うことができる。

また、算出手段（演算部２９）は、コヒーレント伝達関数の算出に、非線形光学過程のタイプ、非線形光学過程の使用波長、照明タイプ、照明光学系の対物レンズのＮＡ、検出光学系の対物レンズのＮＡ、のうち少なくとも１つを加味するので、非線形顕微鏡の性能評価を高精度に行うことができる。

また、算出手段（演算部２９）は、非線形光学過程のタイプ、前記非線形光学過程の使用波長、前記照明光学系の照明タイプ、 前記照明光学系の対物レンズのＮＡ、前記検出光学系の対物レンズのＮＡ、のうち少なくとも１つが変更される度に算出を行うので、非線形顕微鏡の設定内容の変化に対処することができる。

また、本実施形態の非線形顕微鏡では、算出手段が算出したコヒーレント伝達関数に関する情報をユーザへ提示する提示手段（モニタ）を更に備えるので、ユーザは、非線形顕微鏡の性能を目で認識することができる。

また、提示手段（モニタ）は、算出手段（演算部２９）が算出したコヒーレント伝達関数の二値化画像（二値化ＣＴＦ）をユーザへ提示するので、ユーザは、非線形顕微鏡の性能を直感的に認識することができる。

また、本実施形態の非線形顕微鏡は、被観察物の被観察面を集光点で走査しながら信号光の検出を繰り返すことにより、被観察面の画像を取得する制御手段（ステージ１００、光スキャナ１５）を更に備えているので、被観察物の画像（透過観察画像又は反射観察画像）を高い分解能で取得することができる。

また、本実施形態の非線形顕微鏡は、被観察面の画像をコヒーレント伝達関数に基づき先鋭化する先鋭化手段（演算部２９）を更に備えるので、コヒーレント伝達関数を有効に利用することができる。

また、本実施形態の非線形顕微鏡では、非線形光学過程のタイプは、第２高調波（ＳＨＧ）、和周波（ＳＦＧ）、差周波（ＤＦＧ）、第３高調波（ＴＨＧ）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）、三次の誘導ラマンロス（ＳＲＬ）、三次の誘導ラマンゲイン（ＳＲＧ）のうち少なくとも２つの間で切り替えが可能であるので、タイプの異なる複数の非線形光学過程により同一の被観察面を観察することができる。

［第１実施形態の補足］
なお、第１実施形態の演算部２９は、ｆｘ’−ｆｚ’平面における二値化ＣＴＦをモニタへ表示したが、他の平面における二値化ＣＴＦをモニタへ表示してもよいことは言うまでもない。或いは、複数の平面における二値化ＣＴＦをモニタへ表示してもよい。

また、第１実施形態の演算部２９は、二値化ＣＴＦをモニタへ表示したが、二値化前のＣＴＦをモニタへ表示してもよい。また、その場合、ＣＴＦ値の分布を階調の分布や色相の分布などで表現してもよい。

また、第１実施形態の非線形顕微鏡は、共焦点ピンホール（ピンホールマスク２６ｔ、２６ｒ）を備えているが、省略することも可能である。但し、その場合の先鋭化処理では、ＣＴＦ（ｆ’）を使用する代わりに、以下の関数Ｈ（ｆ’）を使用することが望ましい。

この関数Ｈ（ｆ’）は、ＣＴＦ（ｆ’）を算出するための演算式においてＰｓ（ｆ’）をデルタ関数δ（ｆ’）に置き換えた演算式によって算出される関数のことである。

また、第１実施形態の演算部２９の一部又は全部の機能は、非線形顕微鏡にハードウエアとして搭載されてもよいし、非線形顕微鏡のソフトウエアとして搭載されてもよい。また、ソフトウエアとして実現する場合、そのソフトウエアは、インターネットや記憶媒体を介して非線形顕微鏡のコンピュータへインストールされたものであってもよい。

また、第１実施形態で説明したコヒーレント伝達関数（ＣＴＦ）は、以下のとおり定義される。

なお、この式における演算記号Fは、フーリエ変換を意味する。

また、第１実施形態では、非線形顕微鏡の照明タイプを反射型に設定する場合には非線形顕微鏡をレーザスキャン型として動作させたが、ステージスキャン型として動作させてもよい。その場合には、光スキャナ１５は不要である。

１１…レーザ光源、１２２、１２９…ビームスプリッタ、１２５−１、１２５−２…光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）、１２６−１、１２６−２…電気光学変調器（ＥＯＭ）、１４…ダイクロイックミラー、１５…光スキャナ、１６Ａ…レンズ、１６Ｂ…レンズ１６、１９、２０…対物レンズ切り替え機構、１００…ステージ、２２ｔ、２２ｒ…フィルタ切り替え機構、２５ｔ、２５ｔ…集光レンズ、２６ｒ、２６ｔ…ピンホールマスク、２７ｒ、２７ｔ…光検出器、２３ｔ、２３ｒ…ロックインアンプ、２８…制御部、２９…演算部

Claims (7)

1. 光源から供給される照明光を被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明光学系と、
   前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな信号光を検出する検出光学系と
   を備える非線形顕微鏡において、
   前記非線形光学過程のタイプ、前記非線形光学過程の使用波長、前記非線形光学過程の照明タイプ、前記照明光学系の対物レンズのＮＡ、前記検出光学系の対物レンズのＮＡのいずれかの設定が変更可能であって、
   変更された設定において算出された前記非線形顕微鏡のコヒーレント伝達関数の伝達域の形状を示す画像の情報を表示装置に出力する算出手段をさらに備える
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
2. 請求項１に記載の非線形顕微鏡において、
   前記算出手段は、
   前記コヒーレント伝達関数を算出するための演算式を予め記憶している
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
3. 請求項１または請求項２に記載の非線形顕微鏡において、
   前記被観察物の被観察面を前記集光点で走査しながら前記信号光の検出を繰り返すことにより、前記被観察面の画像を取得する制御手段を更に備えた
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
4. 請求項３に記載の非線形顕微鏡において、
   前記被観察面の画像を前記コヒーレント伝達関数に基づき先鋭化する先鋭化手段を更に備えた
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
5. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の非線形顕微鏡において、
   前記非線形光学過程のタイプは、
   第２高調波（ＳＨＧ）、和周波（ＳＦＧ）、差周波（ＤＦＧ）、第３高調波（ＴＨＧ）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）、三次の誘導ラマンロス（ＳＲＬ）、三次の誘導ラマンゲイン（ＳＲＧ）のうち少なくとも２つの間で切り替えが可能である
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
6. 請求項１〜請求項５の何れか一項に記載の非線形顕微鏡において、
   前記非線形光学過程の照明タイプは、透過型と反射型との間で切り替えが可能である
   ことを特徴とする非線形顕微鏡。
7. 光源から供給される照明光を被観察物上に集光し、その集光点にてコヒーレントな非線形光学過程を生起させる照明手順と、
   前記集光点における前記非線形光学過程で発生したコヒーレントな信号光を検出する検出手順と
   を含む非線形観察方法において、
   前記非線形光学過程のタイプ、前記非線形光学過程の使用波長、前記非線形光学過程の照明タイプ、前記照明光学系の対物レンズのＮＡ、前記検出光学系の対物レンズのＮＡのいずれかの設定が変更可能であって、
   変更された設定において算出された前記非線形顕微鏡のコヒーレント伝達関数の伝達域の形状を示す画像の情報を表示装置に出力する算出手順をさらに含む
   ことを特徴とする非線形観察方法。
   

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