WO2017094184A1

WO2017094184A1 - 走査型顕微鏡および顕微鏡画像取得方法

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Publication number: WO2017094184A1
Application number: PCT/JP2015/084143
Authority: WO
Inventors: 厚志土井
Original assignee: オリンパス株式会社
Priority date: 2015-12-04
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2017-06-08

Abstract

カメラを用いることなくＳＩＭを適用して高周波成分を強調した画像を取得することを目的として、走査型顕微鏡（１）は、照明部（２）と、検出部（３）とを備え、照明部（２）が、複数の照明光を発生する光発生部（４）と、該光発生部（４）から発せられた複数の照明光の空間的重なりが試料（Ｓ）の位置によって周期的に変化するように走査する走査部（５）と、該走査部（５）により走査された照明光を試料（Ｓ）に集光する対物レンズ（６）とを備え、検出部（３）が、照明光の照射によって、試料（Ｓ）内の照明光の空間的重なり位置で発生した信号光を試料（Ｓ）の位置毎に検出する受光部（７）と、該受光部（７）により検出した信号を再構成して試料（Ｓ）の画像を生成する処理部（８）とを備える。

Description

走査型顕微鏡および顕微鏡画像取得方法

　本発明は、走査型顕微鏡および顕微鏡画像取得方法に関するものである。

　光源からの励起光を試料に照射して試料内の蛍光物質から蛍光を発生させ、発生させられた蛍光を励起光と分離して検出することにより蛍光像を観察する蛍光顕微鏡が知られている。蛍光顕微鏡には、レーザ光を走査しながら試料に照射するレーザ光走査型の顕微鏡や多光子吸収過程を利用した多光子励起顕微鏡がある。

　多光子励起顕微鏡として、特に２光子励起過程を利用した２光子励起顕微鏡が普及している。２光子励起顕微鏡を用いた場合、近赤外パルスレーザを試料内に集光すると、その集光点のみで非線形光学過程である２光子吸収過程が生じて蛍光が発生する。この場合、用いるレーザの波長が近赤外領域であるため、可視域の波長と比べて試料内の散乱の影響を受けにくく、また、レーザの集光点のみから蛍光が発生するため、可視域のレーザと比べて深部での観察に適しているという特徴がある。

　一般的に、２光子励起顕微鏡による深部観察では、蛍光は可視光であることが多く試料内で散乱を強く受けるため、カメラやピンホールなどを利用して結像による空間情報を取得することが難しい。加えて、深部で発生して対物レンズに取り込まれる微量な蛍光信号をＳ／Ｎ良く検出する必要があるため、光検出器としては感度の高い光電子増倍管（ＰＭＴ）を利用ことが多い。即ち、蛍光検出のための光学系は空間分解を行う機能は有しておらず蛍光の総和強度信号を取得するのみであり、画像の空間分解能は励起レーザの対物レンズからの集光点におけるＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ　Ｓｐｒｅａｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のみによって決定される。このため、空間分解能を向上させるためには、励起レーザのＰＳＦに何らかの効果を持たせる必要がある。

　ＰＳＦを小さくして空間分解能を向上させる手段として、非線形光学過程を利用する方法がある。しかし、２光子励起顕微鏡では、２光子吸収過程が非線形光学過程であり、また、深部観察時には散乱の影響を受けるため、励起レーザは大きなパワーを必要とする。このため、更に非線形光学過程を利用して空間分解能を向上させることは、レーザパワーの観点から現実的ではない。

　一方、顕微鏡の分解能を向上させる手法として、非線形光学過程を用いずに、構造化照明を利用することで対物レンズの開口数を超える高い空間周波数成分を取得して分解能を向上させるＳＩＭ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ　Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。

Ｍ．Ｇ．Ｌ．Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ａｇａｒｄ　ａｎｄ　Ｊ．Ｗ．Ｓｅｄａｔ，"Ｄｏｕｂｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌａｔｅｒａｌ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｉｄｅ－ｆｉｅｌｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ，"　Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ３９１９，１４１（２０００）

　ＳＩＭは、構造化照明によって縞パターンを試料の観察範囲全体に照射し、また、その画像取得には検出器としてカメラを用いる。一方、２光子励起顕微鏡では、上述の通り、深部で発生して対物レンズに取り込まれる微量な蛍光信号をＳ／Ｎよく検出する必要があり、また、蛍光は可視光であることが多く試料内で散乱を強く受けて像を結ぶことが難しいため、カメラは検出器として不適切である。よって、ＳＩＭを２光子励起顕微鏡に適用することは困難である。

　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、カメラを用いることなくＳＩＭを適用して高周波成分を強調した画像を取得することができる走査型顕微鏡および顕微鏡画像取得方法を提供することを目的としている。

　本発明の一態様は、照明部と、検出部とを備え、前記照明部が、複数の照明光を発生する光発生部と、該光発生部から発せられた前記複数の照明光の空間的重なりが試料の位置によって周期的に変化するように走査する走査部と、該走査部により走査された前記照明光を試料に集光する対物レンズとを備え、前記検出部が、前記照明光の照射によって、前記試料内の前記照明光の空間的重なり位置で発生した信号光を前記試料の位置毎に検出する受光部と、該受光部により検出した信号を再構成して試料の画像を生成する処理部とを備える走査型顕微鏡である。

　本態様によれば、照明部の光発生部において発生した複数の照明光が走査部により走査され、対物レンズにより試料に集光されると、複数の照明光の空間的重なりが試料の位置によって周期的に変化するように走査され、各空間的重なり位置において信号光が発生する。発生した信号光が受光部により試料の位置毎に検出され、処理部において再構成されることにより試料の画像が取得される。すなわち、本態様によれば、照明光を走査させながら照明光の空間的重なりを周期的に変化させるので、カメラを用いない走査型顕微鏡においても、ＳＩＭを適用して高周波成分を強調した画像を取得することができる。

　上記態様においては、前記光発生部が、時間周波数の異なる複数の照明光を発生し、前記受光部が、前記空間的重なり位置で発生した信号光のみを選択する時間周波数選択部を備えていてもよい。
　このようにすることで、複数の照明光の空間的重なり位置からの信号のみを容易に検出することができる。

　また、上記態様においては、前記光発生部が、前記対物レンズの瞳位置において異なる空間分布を有する第１照明光および第２照明光を発生してもよい。
　このようにすることで、対物レンズの瞳位置における第１照明光の空間分布と第２照明光の空間分布とを調節することで、試料における空間的重なりにおける照明光の空間分布を任意の形状に設定することができる。

　また、上記態様においては、前記第１照明光が、前記対物レンズの瞳位置において瞳全域に空間分布し、前記第２照明光が、前記対物レンズの瞳位置において瞳周辺に空間分布してもよい。
　このようにすることで、空間的重なりにおける照明光の空間分布を対物レンズの開口数の範囲内で周期の短い縞パターンとすることができる。

　また、上記態様においては、前記走査部が、前記対物レンズの瞳周辺の位置に応じた空間周波数の周期で周期的に変化するように走査してもよい。
　このようにすることで、空間周波数に対応する構造化照明を試料全体にわたって行うことができる。

　また、上記態様においては、前記時間周波数選択部が、ロックインアンプを備えていてもよい。
　このようにすることで、空間的重なりからの信号光のみを簡易に検出することができる。

　また、上記態様においては、前記光発生部が、光源と、該光源からの光を分岐する分岐部と、該分岐部により分岐された光をそれぞれ異なる時間周波数の照明光に変調する音響光学素子または電気光学素子とを備えていてもよい。
　このようにすることで、空間的重なり位置における照明光の時間周波数を簡易に設定することができる。

　また、上記態様においては、前記照明光が、試料内の蛍光物質を励起して蛍光を誘起する励起光であり、前記信号光が蛍光であってもよい。
　このようにすることで、蛍光を発生する試料に対して高周波成分を強調した画像を取得することができる。

　また、上記態様においては、前記照明光が、多光子吸収効果によって蛍光を誘起してもよい。
　このようにすることで、多光子励起型の走査型顕微鏡においても高周波成分を強調した画像を取得することができる。

　また、上記態様においては、前記処理部は、デコンボリューションを利用して前記信号を再構成してもよい。
　このようにすることで、ＰＳＦが不自然な形になった場合にもそれを補正して観察を行うことができる。

　また、本発明の他の態様は、複数の照明光を、それらの空間的重なりが試料の位置によって周期的に変化するように走査する走査ステップと、該走査ステップにおいて走査された前記照明光を前記試料に集光する照射ステップと、該照射ステップによる前記照明光の照射によって、前記試料内の前記照明光の空間的重なり位置で発生した信号光を前記試料の位置毎に検出する検出ステップと、該検出ステップにより検出された信号を再構成して試料の画像を生成する画像生成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法である。

　本発明によれば、カメラを用いることなくＳＩＭを適用して高周波成分を強調した画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る走査型顕微鏡を示す模式的な全体構成図である。図１の走査型顕微鏡のレーザ分布調整部の一例を示す模式図である。図１の走査型顕微鏡において、第１レーザ光の対物レンズの瞳における強度分布を示す図である。図１の走査型顕微鏡において、第２レーザ光の対物レンズの瞳における強度分布を示す図である。図３Ａの第１レーザ光の試料Ｓにおける集光位置での電場分布を示す図である。図３Ｂの第２レーザ光の試料Ｓにおける集光位置での電場分布を示す図である。図４Ａの電場分布を２乗して得られた試料Ｓにおける集光位置での第１レーザ光強度分布を示す図である。図４Ｂの電場分布を２乗して得られた試料Ｓにおける集光位置での第２レーザ光強度分布を示す図である。図１の走査型顕微鏡において、第１レーザ光と第２レーザ光の一の重なり位置におけるレーザ光の分布を示す図である。図６Ａから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｂから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｃから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｄから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｅから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｆから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｇから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｈから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｉから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｊから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ｋから第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を微小変化させたときのレーザ光の分布を示す図である。図６Ａから図６Ｌを繰り返し行った場合のトータルのレーザ光の分布を示す図である。周波数再配置前の周波数分布を示す図である。周波数再配置後の周波数分布を示す図である。像回転素子により周波数シフト方向を１２０°および２４０°ずらして足し合わせた周波数分布を示す図である。図２のレーザ分布調整部の変形例を示す図である。図９に用いられるマスクの一例を示す正面図である。図１の走査型顕微鏡の変形例を示す模式的な全体構成図である

　本発明の一実施形態に係る走査型顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る走査型顕微鏡１は、図１に示されるように、多光子励起型の走査型顕微鏡１であって、照明部２と、検出部３とを備えている。
　また、本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、走査ステップと、照射ステップと、検出ステップと、画像生成ステップとを含んでいる。

　照明部２は、光発生部４と、走査部５と、対物レンズ６とを備え、検出部３は、受光部７と、処理部８とを備えている。
　光発生部４は、極短パルスレーザ光（以下、単にレーザ光（励起光）という。）を発生するレーザ光源（光源）９と、該レーザ光源９から発せられたレーザ光を２つの光路（第１光路Ｌ１および第２光路Ｌ２）を進行する第１レーザ光（第１照明光）と第２レーザ光（第２照明光）とに分岐するビームスプリッタ（分岐部）１０と、各光路Ｌ１，Ｌ２に分岐されたレーザ光の時間周波数を変調する光変調器１１，１２と、各光路Ｌ１，Ｌ２のレーザ光の光束径を調節するビーム径調整光学系１３，１４と、第１光路Ｌ１に設けられた光路長調整光学系１５と、第２光路Ｌ２に設けられたレーザ分布調整部１６とを備えている。

　レーザ光源９は、例えば、チタンサファイアレーザなど主にフェムト秒のパルスレーザ光源である。
　光変調器１１，１２は、例えば、音響光学素子または電気光学素子により構成され、第１光路Ｌ１の第１レーザ光の時間周波数をω１にシフトさせ、第２光路Ｌ２の第２レーザ光の時間周波数をω２にシフトさせるようになっている。

　第１光路Ｌ１に配置されたビーム径調整光学系１３は、ビームエキスパンダの役割を果たし、第１レーザ光が対物レンズ６の瞳を満たすように光束径を調整するようになっている。
　第２光路Ｌ２に配置されたビーム径調整光学系１４は、レーザ分布調整部１６の構成に依存して、第２レーザ光の光束径を調節するようになっている。

　光路長調整光学系１５は、第１レーザ光の光軸に対して４５°の角度をなして配置された第１のミラー１５ａと、該第１のミラー１５ａによって９０°偏向されたレーザ光を１８０°折り返す第２のミラー１５ｂと、該第２のミラー１５ｂによって折り返されたレーザ光を９０°偏向する第３のミラー１５ｃとを備えている。光路長調整光学系１５は、固定された第１のミラー１５ａおよび第３のミラー１５ｃに対して第２のミラー１５ｂを近接離間する方向（矢印Ａの方向）に移動させることにより、折り返し光路長を調節して第１光路Ｌ１の光路長を第２光路Ｌ２の光路長に対して調節するようになっている。

　レーザ分布調整部１６は、例えば、図２に示されるように、入射されたレーザ光を２つの光路に分岐するビームスプリッタ１７と、一方の光路の光路長を他方の光路の光路長に対して調節する光路長調整光学系１８と、２つの光路を通過してきたレーザ光を、微小間隙をあけて並行させるように偏向する三角プリズム１９と、像回転素子２０とを備えている。

　光路長調整光学系１８は、上述した光路長調整光学系１５と略同一構造を有し、固定されたミラー１８ａおよび三角プリズム１９に対して、Ｌ字状のミラー１８ｂを矢印Ｂの方向に移動させることにより光路長を調節することができるようになっている。三角プリズム１９は、像回転素子２０へのレーザ光の射出方向（矢印Ｃの方向）に並進移動可能に設けられており、移動により、像回転素子２０への並行するレーザ光の間隔を調節することができるようになっている。

　像回転素子２０は、例えば、ダブプリズム等で構成されている。像回転素子２０は、入射された２つの並行な光を、それらの中間地点を回転中心として回転することができるように設定されている。そして、この構成の場合に、ビーム径調整光学系１４は、第２レーザ光の光束径が対物レンズ６の瞳に対して十分に小さくなるように調節するようになっている。

　走査部５は、ビームスプリッタ１０により分岐された２つの光路にそれぞれ設けられた２個一対のガルバノミラーを対向させてなる２軸のガルバノスキャナ５ａ，５ｂである。第１光路Ｌ１のガルバノスキャナ５ａは、光路長調整光学系１５により光路長を調節された後の第１レーザ光を２次元的に走査するようになっている。また、第２光路Ｌ２のガルバノスキャナ５ｂは、レーザ分布調整部１６により分布が調整された第２レーザ光を２次元的に走査するようになっている。

　また、第１光路Ｌ１および第２光路Ｌ２には瞳投影レンズ２１が設けられ、各瞳投影レンズ２１を通過した第１レーザ光および第２レーザ光がビームスプリッタ２２により合波され、結像レンズ２３によってコリメートされて、対物レンズ６に入射されるようになっている。
　図１では、レーザ分布調整部１６を経た第２レーザ光は実際には２本の光束となっているが、説明を簡略化するために一本の線で示している。図中、符号２４は光路を形成するためのミラーである。

　ここで、対物レンズ６の瞳における第１レーザ光および第２レーザ光の強度分布を図３Ａおよび図３Ｂに示す。第１レーザ光は瞳を全て満たしており、図３Ａでは説明を簡略化するためにその強度が瞳中で一定であるように示している。また、第２レーザ光は、図３Ｂに示されるように、瞳の周辺に小さな光束径で入射されるようになっている。

　この条件において、対物レンズ６から射出され、試料Ｓにおける集光位置での各々のレーザ光の電場分布を図４Ａおよび図４Ｂに示す。第１レーザ光は小さなスポットに集光される一方、第２レーザ光は縞状の電場分布となる。

　これは次のように説明できる。対物レンズ６の瞳分布は集光される光の空間周波数分布に対応しており、瞳の中心から周辺にいくに従って高い周波数となる。第１レーザ光は低周波から高周波まで含んでいるため、集光点では各周波数の電場が足し合わされてスポット状となる。一方、第２レーザ光は瞳の周辺にしか入射していない。そのことは、すなわち、第２レーザ光が高周波成分のみを有することを示している。したがって、略単一周波数の電場分布となって、集光点で縞状の分布となる。

　検出部３は、主検出部２５と補助検出部２６とを備えている。
　主検出部２５は、試料Ｓにおけるレーザ光の集光位置において多光子吸収効果により発生した蛍光の内、対物レンズ６によって集光された蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー２５ａと、該ダイクロイックミラー２５ａによって分岐された蛍光を集光する集光レンズ２５ｂと、該集光レンズ２５ｂにより集光された蛍光を検出する光検出器２５ｃと、該光検出器２５ｃにより検出された蛍光の内、特定の時間周波数の蛍光の強度信号のみを抽出するロックインアンプ（時間周波数選択部）２５ｄとを備えている。光検出器２５ｃとロックインアンプ２５ｄとにより受光部７が構成されている。また、処理部８は、該ロックインアンプ２５ｄにより抽出された蛍光の強度信号に基づいて画像を生成するようになっている。
　光検出器２５ｃは、ＰＭＴ（光電子増倍管）が好ましいが、感度よく蛍光を検出できるものであれば、任意の検出器を採用できる。

　補助検出部２６は、第１レーザ光と第２レーザ光とがビームスプリッタ２２で合波された際、ビームスプリッタ２２から対物レンズ６の方向とは別の方向に出射された成分を略平行光にするコリメータレンズ２６ａと、略平行光にされた光を集光する集光レンズ２６ｂと、該集光レンズ２６ａ、２６ｂで集光された光を検出する光検出器２６ｃとを備えている。
　光検出器２６ｃはレーザ光の強度が検出できればよく、フォトダイオードなどが利用できる。また、コリメータレンズ２６ａと集光レンズ２６ｂは、第１レーザ光と第２レーザ光とが合波された強度が光検出器２６ｃで検出できれば、なくてもよい。

　ここで、ロックインアンプ２５ｄにより抽出する特定の周波数について説明する。
　試料Ｓにおける集光位置での第１レーザ光と第２レーザ光の空間的重なりに着目すると、第１レーザ光および第２レーザ光は、それぞれ光変調器１１，１２によって、ω１とω２に時間周波数が変調されている。異なる周波数の波が重ね合わされたとき、その差の周波数成分がうなりとして検出される。すなわち、｜ω１－ω２｜の時間周波数成分が第１レーザ光と第２レーザ光との重なり位置で発生する。

　ここで、多光子励起顕微鏡では、レーザ光は極短パルスレーザ光であるため、第１レーザ光と第２レーザ光との重なりによって、うなりが生じるためには、第１レーザ光と第２レーザ光のパルスが同じタイミングで集光位置に到達する必要がある。そこで、第１レーザ光と第２レーザ光の光路長が等しくなるように光路長調整光学系１５を調整しておく必要がある。

　図１において、試料Ｓが蛍光物質を含んでいる場合、集光位置では｜ω１－ω２｜の時間周波数を有する蛍光が発生することとなる。
　ここで、光路長調整光学系１５によって第１レーザ光と第２レーザ光の光路長が等しくなるように設定されている場合、補助検出部２６の光検出器２６ｃで検出される信号にも｜ω１－ω２｜のうなり成分が存在する。これをロックインアンプ２５ｄのリファレンス信号として用いるようになっている。これにより、ロックインアンプ２５ｄを利用して、蛍光信号の中からうなりの周波数に相当する成分のみを抽出することができるようになる。

　うなりの周波数についてより詳細に説明する。第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置におけるレーザ光強度をＩｅｘとおくと、Ｉｅｘは数１で表すことができる。

　ここで、Ｅ１、Ｅ２は、それぞれ、第１レーザ光と第２レーザ光の電場振幅である。この式において、ｃｏｓ（ω１－ω２）ｔおよびｓｉｎ（ω１－ω２）ｔがうなりの時間振動を表している。
　この場合、多光子励起顕微鏡における蛍光強度Ｉｆｌ＿２ＰはＩｅｘの２乗に比例するため数２で表される。

　この式からも分かるように、多光子励起の場合には、うなりの周波数と等しい周波数（１ｆ）の成分と、うなりの周波数の２倍の周波数（２ｆ）の成分が発生する。例えば、２ｆの周波数によりロックインアンプ２５ｄで復調する場合には、ロックインアンプ２５ｄにリファレンス信号として入力された光検出器２６ｃで得たうなり信号の周波数の２倍の周波数で光検出器２５ｃからの入力信号を検出すればよい。そうすると、Ｅ１とＥ２の内積の２乗に比例する信号が検出される。

　Ｅ１、Ｅ２は対物レンズ６からの集光位置における図４Ａおよび図４Ｂの分布電場となる。時間周波数２ｆで復調する場合は、図４Ａの第１レーザ光の電場分布と図４Ｂの第２レーザ光の電場分布の積の２乗に比例する成分が検出される。図５Ａおよび図５Ｂに示されるように、図４Ａおよび図４Ｂの各々の画像を２乗したものを示す。時間周波数２ｆで復調する場合は、図５Ａの第１レーザ光と図５Ｂの第２レーザ光の画像の積の分布が検出されることになる。

　次に、図１のガルバノスキャナ５ａで第１レーザ光を微小に走査させる場合（走査ステップおよび照射ステップ）について説明する。
　対物レンズ６からの集光位置において、第２レーザ光は固定されたまま、第１レーザ光のみが移動することとなる。すなわち、第１レーザ光と第２レーザ光の空間的重なり位置が変化する。このようにして、第１レーザ光と第２レーザ光の重なり位置を変えながら、時間周波数２ｆで復調した場合の信号の分布を図６Ａから図６Ｌに示す。

　図６Ａから図６Ｌでは、図５Ｂの第２レーザ光の縞パターンの分布を図５Ａの第１レーザ光のスポットで読み取ったような分布が得られている。
　図６Ａから図６Ｌの分布は、試料Ｓの分布ではなく、復調後のレーザ光の分布である。すなわち、時間周波数２ｆで復調して信号取得する場合、レーザ光のＰＳＦが図６Ａから図６Ｌのような空間分布となることを意味する。

　勿論、実際に照射されているレーザ光の電場分布は図４Ａの第１レーザ光と、図４Ｂの第２レーザ光の分布のようになり、光検出器２５ｃで検出される蛍光はそれらレーザ光によって発生した蛍光のうち対物レンズ６で集光されたもの全てになるが、ロックインアンプ２５ｄによって時間周波数２ｆで復調した場合には、図６Ａから図６ＬのＰＳＦのレーザ光で励起された蛍光信号のみが検出されることになる（検出ステップ）。

　図６Ａから図６Ｌによれば、第１レーザ光と第２レーザ光の相対位置の変化によってＰＳＦの形状が変化する様子がわかる。これらＰＳＦで試料Ｓを励起して画像を作成することを考える（画像生成ステップ）。このとき、１つのＰＳＦで全ピクセルを励起するのではなく、各ピクセルをＰＳＦを入れ替えながら励起するようにする。すなわち、画像の１列目に相当するピクセルは図６ＡのＰＳＦ１で励起し、２列目は図６ＢのＰＳＦ２で、３列目は図６ＣのＰＳＦ３で、というように、ＰＳＦを入れ替えながら励起を行う。このようにすると、トータルのレーザ光の分布は、図７のようになる。即ち、縞パターンの励起分布となる。

　これは、カメラを使用する場合のＳＩＭで用いられる縞パターンを細かいＰＳＦに分割して走査型顕微鏡１で観察していると理解することができる。より詳細には、図５Ｂの第２レーザ光の縞パターンの分布を試料Ｓに照射し、それを図５Ａの第１レーザ光のスポットで走査して読み取っていると理解することもできる。

　ここで、図５Ｂの第２レーザ光の分布は、図５Ａの第１レーザ光のスポットよりも広いとはいえ、試料Ｓ全体を覆うにはサイズが小さい。そこで、縞パターンの位相が２π分だけ進むにつれて第２レーザ光を空間的に走査させる。

　すなわち、第２レーザ光を試料Ｓに照射し、同時に最初に図５Ｂの第２レーザ光の中央よりも１つ左の暗環上に第１レーザ光を照射しているとする。この場合の時間周波数２ｆで復調した実質のＰＳＦは図６ＡのＰＳＦ１に相当する。

　第２レーザ光の位置はそのままで、第１レーザ光を右に走査していくと、復調後の実質のＰＳＦは図６ＢのＰＳＦ２、図６ＣのＰＳＦ３と変化していく。そして、第１レーザ光の位置が第２レーザ光の中央から１つ右の暗環位置に来る際に、第２レーザ光自体を縞の位相２π分だけ右に移動させる。

　そうすると、第１レーザ光は再び第２レーザ光の中央から１つ左の暗環上に位置することとなる。これは、図６Ａから図６ＬのＰＳＦで、ＰＳＦ１からＰＳＦ１２までＰＳＦが変化した後、またＰＳＦ１に戻ることを意味する。よって、第２レーザ光の電場分布の広さに関わらず、第１レーザ光と第２レーザ光を双方とも走査することで、どんなに大きな試料に対しても縞パターンで励起することができることになる。なお、第２レーザ光の移動は、図１のガルバノスキャナ５ｂで行う。

　このようにすることで、走査型顕微鏡１でありながら、カメラを用いた場合のＳＩＭと同様の構造化照明を行うことができるようになる。なお、本実施形態で重要となるのは図６Ａから図６Ｌのように、空間位置によってＰＳＦの形状が異なることである。この要素が必須であることは、縞状のパターンを空間分解することを考えると、自明である。したがって、例えば、同じ形状のＰＳＦでピクセル毎に強度を変化させて縞状の強度分布になるようにした場合には、効果は期待できない。

　このようにして、縞パターンで励起された画像が取得できれば、後の処理は非特許文献１と同様に画像処理を行うことで、画像の再構成を行うことができる。この場合、縞の位相を変化させて画像取得を行うことが必要であるが、それは図５Ａの第１レーザ光と図５Ｂの第２レーザ光との重ね合わせ位置を変えるだけでよく、また、縞の角度を変化させる場合は、図２の像回転素子２０を回転させるとともに、第１レーザ光と第２レーザ光との重ね合わせ位置と走査方向を変化させるだけでよい。

　本実施形態によれば、空間周波数の高周波成分を強調することができる。空間周波数分布に関して、図８をもとに説明する。図８Ａは画像における観察可能な空間周波数の範囲を示したものである。灰色で示した範囲が、図５Ａの第１レーザ光のＰＳＦの空間周波数分布（すなわち、図５ＡのＰＳＦで観察可能な範囲）であり、この範囲の広さに比例して空間分解能を向上させることができる。

　通常の２光子励起顕微鏡観察では、ＤＣ成分が最も強度が強く、高周波にいくにしたがってその強度が弱くなるのに対して、縞パターンで励起することにより、その周波数に応じて観察可能な周波数成分のシフトが生じる。対物レンズ６の開口数の範囲内で最も高い周波数の縞パターンで励起すると、図８Ａの灰色の範囲の最も外側の±ｋ_Ｘ１にＤＣ成分がくるように周波数シフトが生じる。すわなち、図８Ａでは、周波数シフトが生じる前の周波数成分（（ｋｘ，ｋｙ）＝（０，０）にＤＣが相当）と、（ｋｘ，ｋｙ）＝（ｋ_ｘ１，０）にＤＣが相当する成分、それに（ｋｘ，ｋｙ）＝（－ｋ_ｘ１，０）にＤＣが相当する成分の３つの周波数成分が重畳する形となっている。

　ここで、縞パターンの位相を変化させて複数枚の画像を取得し、更に周波数空間上で演算を行うことで、周波数成分を分離して再配置することができる。再配置後の周波数成分を図８Ｂに示す。図８Ａに対して、図８Ｂではｋｘ方向において周波数成分がシフトした形となっている。すなわち、（ｋｘ，ｋｙ）＝（ｋ_ｘ１，０）にＤＣが相当した成分が－ｋ_ｘ１だけ周波数シフトされ、また、（ｋｘ，ｋｙ）＝（－ｋ_ｘ１，０）にＤＣが相当した成分がｋ_ｘ１だけ周波数シフトされている。周波数再配置後の図８Ｂを見ると、ｋｘ＝０およびｋｘ＝±ｋ_ｘ１の位置で強度が強くなる。よって、図８Ｂではｋｘ＝０から高周波にいくにしたがって常に強度が弱くなるわけではなく、ｋｘ＝±ｋ_ｘ１において強度が強くなり、高周波を強調できていることになる。

　例えば、多光子顕微鏡観察では、上述のように試料Ｓの深部での観察が可能になるが、対物レンズ６で取得される蛍光の強度が弱い場合には、蛍光信号と相対的にノイズが多くなる。その場合、信号として強度の弱い高周波成分からノイズに紛れてしまう（すなわち、細かい構造の識別ができなくなる）。しかし、本実施形態のように高周波成分が強調されている場合は、高周波成分であってもノイズに紛れ難くなり、細かい構造の識別が可能となる。そして、像回転素子２０により、第２レーザ光を回転させて第１レーザ光と第２レーザ光との重ね合わせ位置と走査方向を変化させることにより、図８Ｃに示されるように、高周波を強調できる領域を２次元的に広げることができる。

　このように、本実施形態によれば、多光子励起顕微鏡のような走査型顕微鏡１においても、空間位置毎に異なるＰＳＦで励起して構造化照明の効果を持たせることで、高周波成分を強調して、試料Ｓの細かい構造の識別性を向上することができるという利点がある。

　なお、本実施形態においては、レーザ分布調整部１６において図２の構成を用いるとしたが、これに代えて図９のような構成を採用してもよい。図９では図１０のようなマスク３０（黒色部が遮蔽部）を光路上に配置して、対物レンズ６の瞳の両端のみに第２レーザ光が入射するようにしている。この場合、図１のビーム径調整光学系１４は第２レーザ光がマスク３０全域を覆うように光束径を調整する。このようにして、第２レーザ光が対物レンズ６の瞳の両端のみを照射するようにすれば、上述と同様の効果を得ることができる。また、縞パターンの角度を変える際には、像回転素子２０を回転させる代わりに、マスク３０自体を回転させればよい。

　また、本実施形態においては、第１レーザ光および第２レーザ光をそれぞれ独立に走査するガルバノスキャナ５ａ，５ｂを備えることとしたが、これに代えて、図１１に示されるように、第１レーザ光と第２レーザ光の合波位置を異ならせ、第２レーザ光が、ガルバノスキャナ４１の前でビームスプリッタ２２により第１レーザ光に合波されてもよい。
　この場合には、第２レーザ光はガルバノスキャナ５ａ，５ｂの双方を通過するようになっている。図中、符号４１はリレーレンズであり、ガルバノスキャナ５ａ，５ｂが光学的に共役になるように配置されている。

　このようにすることで、第２レーザ光は第１レーザ光に対して相対的に走査されることになる。図１の走査型顕微鏡１では２つのガルバノスキャナ５ａ，５ｂの試料Ｓ上での走査の絶対位置が把握されている必要があるが、図１１の走査型顕微鏡４０ではガルバノスキャナ５ｂはガルバノスキャナ５ａに対する相対的走査量が把握できていればよく、装置構成や光走査を簡易にすることができるという利点がある。

　また、上記では復調の周波数として２ｆについて述べたが、１ｆの周波数でも構造化照明の効果を持たせることは可能である。また、対物レンズ６の瞳位置におけるレーザ光の空間分布に関しても上記に限ることはなく、ピクセル毎に異なるＰＳＦ形状となるようにすれば構造化照明の効果を持たせることはできる。

　また、図８Ａから図８Ｃのように周波数空間で画像処理を行う際に、各周波数成分の強度を調整してもよい。例えば、簡単には上述の再配置された３つの成分の強度比を演算によって操作することで、画像処理において高周波強調を行うこともできる。また、周波数空間における分布が複雑な場合には、実空間におけるＰＳＦ形状がマイナス成分を持つなど複雑な形状になるが、そのような場合にはデコンボリューションを併用することで自然な形状のＰＳＦで画像取得した画像を作成することができる。

　また、多光子励起の走査型顕微鏡１，４０について述べたが、本実施形態は、他の走査型顕微鏡にも適用可能であり、１光子顕微鏡や２光子以外の多光子顕微鏡についても利用できる。また、深部観察では無い場合や透明な試料Ｓで蛍光の散乱が比較的小さい場合には、検出時にもＰＳＦ形状が乱れず蛍光信号も強いため、実施形態に係る走査型顕微鏡１とカメラやピンホールとを組み合わせることにしてもよい。また、顕微鏡の形態としては反射型を前提に説明をしたが、透過型でも構成は可能であり、ガルバノスキャンに代えてステージスキャンとするなど本案の原理を適用できれば構成は如何様にも変更可能である。

　また、これまでは信号光が蛍光の場合について述べたが、本実施形態においては、走査型顕微鏡であれば蛍光観察以外についても適用可能である。例えば、ラマン顕微鏡に適用する場合には、信号光が試料Ｓを透過または反射したレーザ光となる。本実施形態で蛍光信号に行った方法と同様に取得した信号を処理することにより、高周波成分を強調した画像を取得することができる。

　１，４０　走査型顕微鏡
　２　照明部
　３　検出部
　４　光発生部
　５　走査部
　６　対物レンズ
　７　受光部
　８　処理部
　９　レーザ光源（光源）
　１０　ビームスプリッタ（分岐部）
　１１，１２　光変調器（音響光学素子、電気光学素子）
　２５ｄ　ロックインアンプ（時間周波数選択部）
　Ｓ　試料

Claims

　照明部と、検出部とを備え、
　前記照明部が、複数の照明光を発生する光発生部と、該光発生部から発せられた前記複数の照明光の空間的重なりが試料の位置によって周期的に変化するように走査する走査部と、該走査部により走査された前記照明光を試料に集光する対物レンズとを備え、
　前記検出部が、前記照明光の照射によって、前記試料内の前記照明光の空間的重なり位置で発生した信号光を前記試料の位置毎に検出する受光部と、該受光部により検出した信号を再構成して試料の画像を生成する処理部とを備える走査型顕微鏡。
　前記光発生部が、時間周波数の異なる複数の照明光を発生し、
　前記受光部が、前記空間的重なり位置で発生した信号光のみを選択する時間周波数選択部を備える請求項１に記載の走査型顕微鏡。
　前記光発生部が、前記対物レンズの瞳位置において異なる空間分布を有する第１照明光および第２照明光を発生する請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡。
　前記第１照明光が、前記対物レンズの瞳位置において瞳全域に空間分布し、
　前記第２照明光が、前記対物レンズの瞳位置において瞳周辺に空間分布する請求項３に記載の走査型顕微鏡。
　前記走査部が、前記対物レンズの瞳周辺の位置に応じた空間周波数の周期で周期的に変化するように走査する請求項１から請求項４のいずれかに記載の走査型顕微鏡。
　前記時間周波数選択部が、ロックインアンプを備える請求項２に記載の走査型顕微鏡。
　前記光発生部が、光源と、該光源からの光を分岐する分岐部と、該分岐部により分岐された光をそれぞれ異なる時間周波数の照明光に変調する音響光学素子または電気光学素子とを備える請求項２に記載の走査型顕微鏡。
　前記照明光が、試料内の蛍光物質を励起して蛍光を誘起する励起光であり、
　前記信号光が蛍光である請求項１から請求項７のいずれかに記載の走査型顕微鏡。
　前記照明光が、多光子吸収効果によって蛍光を誘起する請求項８に記載の走査型顕微鏡。
　前記処理部は、デコンボリューションを利用して前記信号を再構成する請求項１から請求項９のいずれかに記載の走査型顕微鏡。
　複数の照明光を、それらの空間的重なりが試料の位置によって周期的に変化するように走査する走査ステップと、
　該走査ステップにおいて走査された前記照明光を前記試料に集光する照射ステップと、
　該照射ステップによる前記照明光の照射によって、前記試料内の前記照明光の空間的重なり位置で発生した信号光を前記試料の位置毎に検出する検出ステップと、
　該検出ステップにより検出された信号を再構成して試料の画像を生成する画像生成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法。