JPWO2018084268A1 - 蛍光観察装置 - Google Patents

Abstract

活性化光によって不活性化状態から活性化状態に移行し、活性化状態においてポンプ光によって励起されるネガ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察装置であって、活性化光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第２の強度変調部と、ポンプ光、並びに、強度変調されたプローブ光および活性化光を照射した観察対象物からの蛍光を受光する受光部と、受光部からの受光信号のうち周波数ｆ１±ｆ３の成分を検出する検出部とを備える。

Description

本発明は、蛍光観察装置に関する。

蛍光物質を２光子で励起し、誘導放出を誘起するレーザビームを照射して、減衰した蛍光を取得して画像を構築する顕微鏡が知られている。（例えば、非特許文献１を参照）。
Lu Wei et. al., Biomedical Optics Express 1465-1475, vol. 3, No.6, 1 June 2012

本発明の第１の態様である蛍光観察装置は、活性化光によって不活性化状態から活性化状態に移行し、活性化状態においてポンプ光によって励起されるネガ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察装置であって、活性化光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第２の強度変調部と、ポンプ光、並びに、強度変調されたプローブ光および活性化光を照射した観察対象物からの蛍光を受光する受光部と、受光部で検出される受光信号のうち周波数ｆ１±ｆ３の成分を検出する検出部とを備える。

本発明の第２の態様である蛍光観察装置は、活性化状態においてポンプ光によって励起され、不活性化光によって活性化状態から不活性化状態に移行するポジ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察装置であって、ポンプ光を周波数ｆ２で強度変調する第１の強度変調部と、観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を周波数ｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第２の強度変調部と、強度変調されたポンプ光およびプローブ光、並びに、不活性化光を照射した観察対象物からの蛍光を受光する受光部と、受光部で検出される受光信号のうち周波数２ｆ２±ｆ３の成分を検出する検出部とを備える。

本発明の第３の態様である蛍光観察方法は、活性化光によって不活性化状態から活性化状態に移行し、活性化状態においてポンプ光によって励起されるネガ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察方法であって、活性化光を周波数ｆ１で強度変調し、観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ３で強度変調し、ポンプ光、並びに、強度変調されたプローブ光および活性化光を照射した観察対象物からの蛍光を受光部で受光し、受光部で検出される受光信号のうち周波数ｆ１±ｆ３の成分を検出する。

本発明の第４の態様である蛍光観察方法は、活性化状態においてポンプ光によって励起され、不活性化光によって活性化状態から不活性化状態に移行するポジ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察方法であって、ポンプ光を周波数ｆ２で強度変調し、観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を周波数ｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調し、強度変調されたポンプ光およびプローブ光、並びに、不活性化光を照射した観察対象物からの蛍光を受光部で受光し、受光部で検出される受光信号のうち周波数２ｆ２±ｆ３の成分を検出する。

上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションも発明となりうる。

本実施形態に係る顕微鏡装置１０の構成を示す図である。 状態遷移図である。 各波長の関係を示す概念図である。 分解能向上を説明する図である。 信号発生領域のシミュレーション結果を示す。 走査部１５０のスキャン速度と検出の速度を説明する概念図である。 他の走査部１５１の例を示す。 さらに他の走査部１５６の例を示す。 他の顕微鏡装置１２の構成を示す図である。 顕微鏡装置１２で用いられるＧＵＩ画面３００の一例である。 顕微鏡装置１２の動作（Ｓ１０）の一例を示すフローチャートである。 共焦点観察に基づいて減衰蛍光観察の範囲を選択する動作（Ｓ３０）のフローチャートである。 顕微鏡装置１２において、共焦点観察をするか減衰蛍光観察をするかを自動選択する動作（Ｓ２０）のフローチャートである。 当該動作で用いられるＧＵＩ画面３５０を示す。 さらに他の顕微鏡装置１４の構成を示す図である。 さらに他の顕微鏡装置１８の構成を示す図である。 状態遷移図である。 分解能向上を説明する図である。 さらに他の顕微鏡装置２０の構成を示す図である。 さらに他の顕微鏡装置２２の構成を示す図である。 さらに他の顕微鏡装置２４の構成を示す図である。

以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

本実施形態で用いられるレーザ光には、ポンプ光、プローブ光およびスイッチング光が含まれる。ポンプ光は蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。プローブ光は蛍光物質において誘導放出を誘起することで、蛍光を減衰させる。スイッチング光は蛍光物質を不活性化状態から活性化状態に、あるいは活性状態から不活性状態に移行させる。ネガ型スイッチング蛍光物質は、スイッチング光により不活性化状態から活性化状態に移行する。この場合、スイッチング光を特に活性化光ともいう。ポジ型スイッチング蛍光物質は、スイッチング光により活性化状態から不活性化状態に移行する。この場合、スイッチング光を特に不活性化光ともいう。また、スイッチング光、ポンプ光、プローブ光を強度変調する場合の周波数をそれぞれｆ１、ｆ２、ｆ３という。

図１は、本実施形態に係る蛍光観察装置の一例として顕微鏡装置１０の構成を示す図である。顕微鏡装置１０は、ネガ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物に、ポンプ光、プローブ光および活性化光を観察対象物に照射することで、観察対象物の蛍光物質より生じる誘導放出により減衰した蛍光信号（以下、減衰蛍光、減衰蛍光信号などと記載する）を発生させる。減衰蛍光信号は、プローブ光および活性化光を強度変調させることにより検出することができる。具体的な方法としてはロックイン検出等があげられる。ロックイン検出により得られる減衰蛍光信号は、ポンプ光、プローブ光および活性化光の多重積の結果として得られるために、信号発生領域が制限される。これにより、空間分解能を向上させることができる。なお、以下、減衰蛍光を蛍光と総称して記載する場合もある。また、以下、光スイッチング可能な蛍光物質から生じる減衰蛍光を取得する顕微鏡を減衰蛍光顕微鏡と記載する。図１では説明のためにｘｙｚ軸を示す。

顕微鏡装置１０は、ポンプ光、プローブ光および活性化光を出力する光源１００と、ポンプ光、プローブ光および活性化光で観察対象物１８４を照明する照明光学系１４０と、観察対象物１８４から発せられた光を観察する観察光学系１６０と、観察光学系１６０を介して光を検出する検出部１３６を備える。顕微鏡装置１０はさらに、標本１８６を支持するステージ１８０を備える。顕微鏡装置１０はさらに、顕微鏡装置１０全体を制御する制御部１３０と、当該制御部１３０との間で信号を送受信する入力部２２０、表示部２２４および記憶部２２６を備える。

標本１８６は、観察対象物１８４と、観察対象物１８４を載置するスライドガラス１８２とを有する。観察対象物１８４は例えば生物細胞である。観察対象物１８４にはネガ型スイッチング蛍光物質が導入されている。ネガ型スイッチング蛍光物質として、例えば、Ｄｒｏｎｐａが挙げられる。

光源１００は、ポンプ光用のレーザ光源１０２、プローブ光用のレーザ光源１０４、および、活性化光用のレーザ光源５００を有する。レーザ光源１０２、１０４、５００は例えばいずれも連続発振方式であって、かつ、互いに異なる波長のレーザ光を出力する。ポンプ光は蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。プローブ光は蛍光物質において誘導放出を誘起することで、蛍光を減衰させる。活性化光は蛍光物質を不活性化状態から活性化状態に移行させる。ポンプ光の波長はプローブ光の波長より短く、例えば、ポンプ光は４８８ｎｍ、プローブ光は６００ｎｍである。活性化光の波長はさらに短く、例えば４０５ｎｍである。これらポンプ光およびプローブ光の波長は蛍光物質の吸収帯(吸収スペクトル)および蛍光帯(蛍光スペクトル)に合せて適宜設定され、活性化光の波長も蛍光物質の活性化に合わせて適宜設定される。これらポンプ光、プローブ光および活性化光の波長は自動的に設定されてもよいし、入力部２２０でユーザからの入力を受け付けてもよい。

照明光学系１４０は、音響光学素子５１４、５２４（以下、ＡＯＭともいう）、ミラー４６０、４５８、ダイクロイックミラー４５４と、走査部１５０、レンズペア１７３、ダイクロイックミラー１６２および対物レンズ１６４とを有する。観察光学系１６０は、対物レンズ１６４と、ダイクロイックミラー１６２と、光学フィルタ１６６と、レンズペア１７２とを有する。

活性化光が入射するＡＯＭ５１４に印加するドライバ５１２の電圧を制御することで、活性化光の１次回折光の発生を制御する。常に１次回折光を生じさせる状態（ＯＮ状態、すなわち強度が最大の状態）とすることもできるし、常に生じさせない状態（ＯＦＦ状態、すなわち強度が最小の状態）とすることもできるし、光強度を変調することもできる。例えば、ドライバ５１２から一定の電圧値を付与した場合には、電圧値に応じて光強度は一定値となる。例えば、ドライバ５１２から付与される電圧値が時間的にゼロであれば、光強度もゼロになる。例えばドライバ５１２の電圧波形が正弦波の場合に光の強度を正弦波に変調する。本実施形態では、発振器１３２からの発振に基づいて、ＡＯＭ５１４により活性化光を、例えば数ＭＨｚの周波数ｆ１で強度変調する。ＡＯＭ５１４の利点は、数ＭＨｚという比較的高い周波数で強度変調できることである。なお、これらＡＯＭ５１４とドライバ５１２とにより第１強度変調部５１０が構成される。なお、このｆ１で決まる時間周期に対して、蛍光物質のスイッチング時間（不活性状態から活性状態への遷移に要する時間）が短いことが望ましい。

プローブ光が入射するＡＯＭ５２４および当該ＡＯＭ５２４へ電圧を印加するドライバ５２２の構成も上記ＡＯＭ５１４およびドライバ５１２と同様の構成である、これにより、発振器１３２からの発振に基づいて、ＡＯＭ５２４によりプローブ光を、例えば数十ＭＨｚの周波数ｆ３で強度変調する。ただし、周波数ｆ３は上記周波数ｆ１とは異ならせる。なお、これらＡＯＭ５２４とドライバ５２２とにより第２強度変調部５２０が構成される。

ミラー４６０は強度変調された活性化光を反射して、ダイクロイックミラー４５６は活性化光とポンプ光とを合波してミラー４５８に導く。ミラー４５８は活性化光およびポンプ光を反射し、ダイクロイックミラー４５４は強度変調されたプローブ光を、活性化光およびポンプ光と同軸に合波して走査部１５０に導く。

走査部１５０は対物レンズ１６４の瞳面とほぼ共役な位置に配される。このために、走査部１５０とダイクロイックミラー１６２の間にはレンズペア１７３が設置されていることが望ましい。走査部１５０の一例はガルバノスキャナであり、互いに直交する方向に回転可能な一対のガルバノミラーを有する。それらガルバノミラーの角度を変化させることで観察対象物１８４におけるレーザ光のスポット位置をｘｙ方向でスキャンする。走査部１５０の他の例はレゾナントスキャナ（共振型スキャナ）である。レゾナントスキャナは、共振により動作する共振ミラー（レゾナントミラー）を有する。レゾナントスキャナは、例えば、主走査用のレゾナントミラーと、副走査用のガルバノミラーを備える。レゾナントスキャナを用いることで、より高速なスキャンをすることができる。

走査部１５０から出力されたレーザ光はダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に導かれる。対物レンズ１６４はレーザ光を観察対象物１８４に集光する。

観察対象物１８４の蛍光物質から生じた蛍光はダイクロイックミラー１６２で反射し、光学フィルタ１６６によりポンプ光、プローブ光および活性化光が除去される。蛍光はレンズペア１７２により対物レンズ瞳面とほぼ共役な位置に設置された受光部１７４に入射する。なお、ダイクロイックミラー１６２は、レンズペア１７３と走査部１５０の間に設置されても良いし、走査部１５０よりも光源側に設置されても良い。

検出部１３６は、受光部１７４およびロックインアンプ１３４を備える。受光部１７４は対物レンズ１６４の瞳面とほぼ共役な位置に配される。受光部１７４の一例は、光電子増倍管である。受光部１７４は光電変換によって、受光した蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。受光部１７４の出力はロックインアンプ１３４に入力されてロックイン検出される。ロックイン検出については後述する。

入力部２２０、表示部２２４、記憶部２２６および制御部１３０は例えばＰＣ等であってもよい。入力部２２０は、ユーザから制御部１３０への入力を受け付けるものであって、例えば、キーボード、タッチパネル、マウス等である。表示部２２４は、例えば、ＧＵＩ、検出結果、観察画像を表示するディスプレイである。記憶部２２６は、顕微鏡装置１０を制御するプログラム、パラメータ等、および、検出結果、観察画像等が記憶される。

制御部１３０は、周波数制御部２２９、スキャナ制御部２２８および画像生成部２２２を有する。周波数制御部２２９はユーザからの入力により、または、蛍光物質に基づいて自動で、発振器１３２に発生させる発振周波数を制御する。スキャナ制御部２２８は、走査部１５０を制御する。画像生成部２２２は検出部１３６の検出結果に基づいて画像を生成し、表示部２２４に表示する。

図２から図６を用いて顕微鏡装置１０の減衰蛍光による観察の原理を説明する。図２は状態遷移図である。図３は、各波長の関係を示す概念図である。図４は分解能向上を説明する図である。図５に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。

ネガ型スイッチング蛍光物質は図３に示すように状態遷移する。まず、発光できない不活性化状態からは活性化光の励起により発光できる活性化状態に遷移する。活性化状態においてはポンプ光で励起され、プローブ光で誘導放出されて減衰した蛍光が出射される。ここで、信号として、時間的に以下の過程を経て生じる蛍光信号を検出する。
（Ｓｔｅｐ１）活性化光によるスイッチング （不活性化状態から活性化状態へ ）(1)
（Ｓｔｅｐ２）ポンプ光による励起(2)
（Ｓｔｅｐ３）プローブ光による誘導放出(3)

この過程を経て生じる蛍光信号は、活性化光、ポンプ光、プローブ光の積の結果として得られるため、信号発生領域が制限される。このメカニズムは後述する。発生する蛍光信号をＰＳＮ−ＲＦ（Ｐｈｏｔｏ−Ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ｐｒｏｂｅ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ） Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）信号と定義する。

図３において破線は特定の蛍光物質の吸収帯を示し、実線は当該蛍光物質の蛍光帯を示す。ポンプ光の波長は吸収帯に含まれるように設定され、プローブ光は蛍光帯の強度のピークよりも長い波長に設定されることが好ましい。これにより、蛍光帯の強度のピークを含む波長領域を蛍光検出領域とすることができる。

活性化光強度を周波数ｆ１で、プローブ光強度を周波数ｆ３で強度変調する。活性化光、ポンプ光、プローブ光の時間波形をＩ_Ａｃｔ、 Ｉ_Ｐｕｍｐ、 Ｉ_{Ｐｒｏｂｅ}とすると、
ここで、 Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３はそれぞれ活性化光、ポンプ光、プローブ光の光強度である。ＰＳＮ−ＲＦ信号は、
従って、受光部１７４で検出された蛍光信号をｆ１＋ｆ３またはｆ１−ｆ３を復調周波数としてロックインアンプ１３４で復調することで、分解能の向上したＰＳＮ−ＲＦ信号を取得することができる。復調周波数は、強度変調した２以上の周波数の和または差のいずれであってもよい。この場合、単に「±」と表記する。より具体的には、発振器１３２から上記復調周波数がロックインアンプ１３４に入力される。ロックインアンプ１３４は復調周波数に同期する信号を抽出する。走査部１５０で観察対象物１８４における光スポットを走査しつつ、ロックインアンプ１３４でピクセルごとにロックイン検出を実施し、当該ピクセルの位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。画像生成部２２２は、記憶部２２６から位置情報に対応付けられた検出結果を読み出して、減衰蛍光の観察画像を生成し、表示部２２４に表示する。

図４は分解能向上の原理について示す図である。活性化光、ポンプ光、プローブ光の光スポットの強度分布をそれぞれ Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３とする。図中の各スポットの縦軸は強度を表し、横軸は空間座標を表す。
（Ｓｔｅｐ１）活性化光により光スイッチングが発生する発生分布をＡ_１とすると、それは活性化光の強度分布に等しいので、
（Ｓｔｅｐ２）
ポンプ光により励起が発生する発生分布をＡ_２とする。この信号発生分布は、 Ｓｔｅｐ１の発生分布Ａ_１と、ポンプ光スポットの強度分布 Ｓ_２の積に等しいので、
（Ｓｔｅｐ３）
プローブ光により誘導放出が発生する発生分布をＡ_３とする。この信号発生分布は、 Ｓｔｅｐ２の発生分布Ａ_２と、プローブ光スポットの強度分布Ｓ_３の積に等しいので、
この発生分布Ａ_３はＰＳＮ−ＲＦ信号の発生分布と等価である。このように、３つの光の積で生じる蛍光信号を検出することで、図４に示すように、光スポットの中心からの蛍光発生の寄与を大きくかつ周辺からの蛍光発生の寄与を小さくすることができるので、観察対象物１８４からの信号発生領域を回折限界以下に制限でき、結果として分解能を向上させることができる。

図５に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。比較のために、通常の共焦点顕微鏡 （ＣＭ）と、減衰蛍光 （ＲＦ）顕微鏡の信号発生領域も示す。信号が活性化光、ポンプ光、プローブ光の積で生じる効果によって、 ＰＳＮ−ＲＦではＸ方向、Ｚ方向ともに、信号発生領域がシャープになることがわかる。

図６は、走査部１５０のスキャン速度と検出の速度を説明する概念図である。ガルバノスキャナにおいて主走査（図中ｘ方向）のスキャンに要する時間はレゾナントスキャナと比較して長いので、図６の（ａ）に示すように差周波の復調で検出するのにかかる時間の間にビームの位置はほぼ変わらないと考えてよい。しかしながら、レゾナントスキャナにおいて主走査（図中ｘ方向）のスキャンに要する時間はガルバノスキャナと比較して短いので、差周波の復調で検出するのにかかる時間の間に、図６の（ｂ）に示すようにビームの位置は変わってしまい正確な画像取得が困難になるというおそれがある。しかしながら和周波で復調した場合、復調の周波数が高いので検出にかかる時間も短くなり、レゾナントスキャナを用いても所定位置における信号検出に必要な所定時間の間にビームの位置はほぼ変わらないと考えてよい。したがって、レゾナントスキャナを用いて高速で検出しつつ、正確な画像取得をすることができる。

図７は、他の走査部１５１の例を示す。走査部１５１は、レゾナントスキャナ１５２、ガルバノスキャナ１５３および一対のミラー１５４、１５５を有する。一対のミラー１５４、１５５はそれぞれ図中矢印の方向に移動可能に設けられており、これらの位置に基づいて、レゾナントスキャナ１５２、ガルバノスキャナ１５３のいずれを用いるかが選択される。

図７は、レゾナントスキャナ１５２が選択された状態が示されている。この場合、ダイクロイックミラー４５４から出射される光の光路上にミラー１５４が配され、レゾナントスキャナ１５２から出射される光の光路上にミラー１５５が配されている。これにより、ミラー１５４で反射された光はレゾナントスキャナ１５２に入射する。レゾナントスキャナ１５２で所定の方向に偏向された光はミラー１５５で反射されて、ダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に入射する。

一方、ガルバノスキャナ１５３が選択される場合には、ダイクロイックミラー４５４から出射される光の光路上からミラー１５４が退避するとともに、ガルバノスキャナ１５３とダイクロイックミラー１６２との間からミラー１５５が退避する。これにより、ガルバノスキャナ１５３に光が入射し、ガルバノスキャナ１５３で偏向された光がダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に入射する。

走査部１５１によれば、用途に応じてレゾナントスキャナ１５２とガルバノスキャナ１５３を使い分けることができる。なお、一対のミラー１５４、１５５の位置を移動させる手段は、例えばリニアモーターが挙げられるが、これに限られずそれぞれが対応するターレット上に配され、当該ターレットの回転によりミラー１５４、１５５が移動してもよい。一対のミラー１５４、１５５に代えて、一対のダイクロイックミラーを配することにより、当該一対のダイクロイックミラーを反射する波長の光に対してはレゾナントスキャナ１５２を用い、当該一対のダイクロイックミラーを透過する波長の光に対してガルバノスキャナ１５３を用いることができる。なお、レゾナントスキャナ１５２とガルバノスキャナ１５３の位置は図７と逆でもよい。

図８は、さらに他の走査部１５６の例を示す。図８において図７と同じ構成については同じ番号を付して説明を省略する。

走査部１５６は、走査部１５１の一対のミラー１５４、１５５に代えて、それらが一体化したミラー１５７を有する。当該ミラー１５７は紙面に垂直な方向に移動可能に設けられる。ここで図８の状態は図７の状態に対応しており、ミラー１５７によって光が反射されることにより、レゾナントスキャナ１５２が用いられる状態が示されている。一方、図８の状態からミラー１５７が紙面に垂直な方向に移動して、ダイクロイックミラー４５４とガルバノスキャナ１５３との間の光路、および、ガルバノスキャナ１５３とダイクロイックミラー１６２との間の光路から同時に退避することで、ガルバノスキャナ１５３が用いられる状態となる。

図９は他の顕微鏡装置１２の構成を示す図である。顕微鏡装置１２は顕微鏡装置１０と同様に減衰蛍光顕微鏡として用いることができるとともに、共焦点顕微鏡としても用いることができる。顕微鏡装置１２において顕微鏡装置１０と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。

顕微鏡装置１２は、ポンプ光を変調する第３強度変調部５４０を有する。第３強度変調部５４０は、ポンプ光の光路上に配されたＡＯＭ５４４と、ＡＯＭ５４４を発振器１３２からの発振に基づいて駆動するドライバ５４２を有する。

さらに、顕微鏡装置１２において、蛍光を反射して、ポンプ光およびプローブ光を透過するダイクロイックミラー４０２はダイクロイックミラー４５４と走査部１５０との間の光路上に配される。さらに、ダイクロイックミラー４０２で反射された光が入射する、光学フィルタ４０４、レンズ４０６、受光部４１０を有する。光学フィルタ４０４および受光部４１０は、顕微鏡装置１０の光学フィルタ１６６および受光部１７４と同様の構成であってよい。顕微鏡装置１２はさらにピンホール４０８を有する。ピンホール４０８は、観察対象物１８４と共役の位置に配される。レンズ４０６はピンホール４０８に光を集光する。また、受光部４１０はピンホール４０８に近接して設置される。あるいは、不図示のレンズにより、ピンホールと略共役位置に設置されても良い。

顕微鏡装置１２はさらに、レーザ光源１０２、１０４、５００の光の波長を制御する波長制御部２３０を有する。

上記構成により、観察対象物１８４からの蛍光は走査部１５０を通り、ダイクロイックミラー４０２で反射されて、光学フィルタ４０４、レンズ４０６およびピンホール４０８を介して受光部４１０で受光される。これら、これにより、走査部１５０により観察対象物１８４の観察位置が変わっても、走査部１５０でデスキャンされて、ピンホール４０８でのスポット位置は不変である。ピンホール４０８は穴の大きさが可変となっており、詳細は後述する。

図１０は顕微鏡装置１２で用いられるＧＵＩ画面３００の一例である。ＧＵＩ画面３００は表示部２２４に表示され、入力部２２０を用いてユーザからの入力を受け付ける。

チェックボックス３０２は共焦点観察の画像を取得するか否かの入力欄である。チェックボックス３０４は共焦点観察においてポンプ光を変調することを指定する入力欄であり、チェックボックス３０６は変調しないことを指定する入力欄である。

入力欄３０８はポンプ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。入力欄３１０はピンホールの大きさを指定する入力欄である。入力欄３１０の「ＯＰＥＮ」は穴の大きさが最大であることを示す。さらに、「１」をエアリーサイズとしたときの大きさの目盛りとともに、指定された穴の大きさが縦の太線で示されている。ここで、エアリーサイズとは、波長と開口数で決まる回折限界の光スポットの大きさで、ピンホール径を規格化した値である。

さらに、チェックボックス３１２は、共焦点観察のタイムラプス画像を取得するか否かの入力欄である。入力欄３１４はタイムラプスの時間間隔の入力欄である。

チェックボックス３１６は減衰蛍光観察の画像を取得するか否かの入力欄である。入力欄３１８は活性化光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。入力欄３２０はプローブ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。

入力欄３２２は減衰蛍光観察におけるピンホール４０８の穴の大きさの入力欄であって、入力欄３１０と同様の構成である。また、チェックボックス３２４および入力欄３２６は減衰蛍光観察におけるタイムラプスに関する入力欄であり、チェックボックス３１２、入力欄３１４と同様の構成である。

ＧＵＩ画面３００には、共焦点の観察画像３３０と減衰蛍光の観察画像３３２とが並べて表示される。これに代えて、重ねて表示されてもよい。また、互いにリンク付けされることで、共焦点の観察画像３３０の対象領域をクリックする減衰蛍光の観察画像３３２が表示されるようにしてもよい。さらに、共焦点観察のタイムラプスによる画像取得が指定されている場合には、タイムラプス画像３３４が時間順に並べて表示される。同様に、減衰蛍光観察のタイムラプスによる画像取得が指定されている場合には、タイムラプス画像３３５が時間順に並べて表示される。

図１１は顕微鏡装置１２の動作（Ｓ１０）の一例を示すフローチャートである。

フローチャートＳ１０において、制御部１３０は、ＧＵＩ画面３００のチェックボックス３１６の入力に基づいて、減衰蛍光観察の画像を取得するかどうかを判断する（Ｓ１００）。ステップＳ１００の判断がＹｅｓの場合に、制御部１３０は入力欄３１８、３２０の入力に基づいて、減衰蛍光観察の活性化光およびプローブ光の変調周波数を発振器１３２に設定する（Ｓ１０２）。なお、ポンプ光はＯＮ状態に設定される。さらに、制御部１３０は入力欄３２３、３２６の入力に基づいて復調周波数を発振器１３２に設定する（Ｓ１０１）。

制御部１３０はピンホール４０８の径を設定する（Ｓ１０４）。減衰蛍光観察時においてピンホール４０８はデフォルトで開放、すなわち図１０の入力欄３２２においてデフォルトで「ＯＰＥＮ」が設定されている。ユーザが入力欄３２２の値をデフォルトから変更した場合には、変更された値に基づいてピンポール４０８の大きさが設定される。減衰蛍光観察時において、ピンホール４０８を開放することで、ピンホール共役面である焦点面から生じたにも関わらず散乱等により結像関係が乱されてしまった蛍光も検出することができるので、より多くの光子を検出することができ、結果として信号対雑音比の向上が可能となる。

以上の設定に基づいて、減衰蛍光観察の画像が取得される（Ｓ１０６）。減衰蛍光観察の画像を取得する方法は、顕微鏡装置１０で説明したものと同一であり、説明を省略する。

ステップＳ１０６の後、または、ステップＳ１００の判断がＮｏの場合に、共焦点観察の画像を取得するかどうかが、チェックボックス３０２の入力に基づいて判断される（Ｓ１０８）。共焦点観察の画像を取得すると判断された場合に（Ｓ１０８：Ｙｅｓ）、チェックボックス３０４、３０６に基づいて共焦点観察に用いられるポンプ光を変調するか否かが判断され（Ｓ１１２）、変調する場合には（Ｓ１１２：Ｙｅｓ）、入力欄３０８に入力された変調周波数が設定される（Ｓ１１４）。

ステップＳ１１４の後にまたはステップＳ１１２でポンプ光を変調しない場合に（Ｓ１１２：Ｎｏ）、ユーザからの入力欄３１０への入力に基づいてピンホール４０８の径が設定される（Ｓ１１６）。

上記設定に基づいて共焦点観察の画像が取得される（Ｓ１１８）。より詳しくは、ポンプ光についてＡＯＭ５４４をＯＮ状態にするか、または、強度変調し、活性化光およびプローブ光をＯＦＦ状態にして、走査部１５０で観察対象物１８４を走査しつつ、ピクセルごと検出部１３６で蛍光を検出する。当該検出結果を位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。

画像生成部２２２は、記憶部２２６から位置情報に対応付けられた検出結果を読み出して、共焦点の観察画像３３０および減衰蛍光の観察画像３３２を生成し、表示部２２４に表示する（Ｓ１２０）。

さらに、チェックボックス３１２で共焦点観察のタイムラプス画像の取得を受け付けた場合に、顕微鏡装置１２は入力欄３１４で設定された時間間隔で共焦点観察を実行してそれぞれの観察画像を生成する。同様に、チェックボックス３２４で減衰蛍光観察のタイムラプス画像の取得を受け付けた場合に、顕微鏡装置１２は入力欄３２６で設定された時間間隔で減衰蛍光観察を実行してそれぞれの観察画像を生成する。

顕微鏡装置１２で、さらに光スイッチ過程による蛍光を検出してもよい。この場合に、プローブ光のＡＯＭ５２４をＯＦＦ状態に、ポンプ光のＡＯＭ５４４をＯＮ状態にそれぞれ設定する。活性化光をＡＯＭ５１４によってｆ１で強度変調する。これにより発生する蛍光を受光部４１０で検出し、復調周波数ｆ１でロックインアンプ１３４にてロックイン検出する。この信号は活性化光とポンプ光の積で生じるので、本質的にセクショニング能力を有するためにピンホール４０８を開放することが好ましい。

なお、観察対象物１８４の広い視野の画像を共焦点観察で取得し、共焦点観察の画像のうちの一部の領域を指定して減衰蛍光観察の画像を取得する構成としても良い。この場合、共焦点観察で画像を取得して、減衰蛍光観察に適した範囲が自動で選択されてもよい。

図１２は、共焦点観察に基づいて減衰蛍光観察の範囲を選択する動作（Ｓ３０）のフローチャートである。まず、共焦点観察により画像が取得される（Ｓ３００）。この場合に、図１１の動作（Ｓ１０）におけるステップＳ１１２からＳ１１８が実行される。次に、ユーザからの入力に基づいて減衰蛍光観察の範囲を自動選択するか否かが判断される（Ｓ３０２）。

自動選択する場合には（Ｓ３０２：Ｙｅｓ）、共焦点画像を画像処理解析し、減衰蛍光観察に適した範囲を選択する。例えば、画像を微分フィルタ処理し、ピークが多く生じる領域を選択する。

一方、自動選択しない場合には（Ｓ３０２：Ｎｏ）、ユーザからの指定に基づいて減衰蛍光観察の領域を設定する（Ｓ３０８）。この場合に、図１０の共焦点の観察画像３３０上で領域指定を受け付けてもよい。

ステップＳ３０４またはＳ３０８で設定された領域について、減衰蛍光観察を実行して観察画像を取得する（Ｓ３０６）。この場合に、図１１の動作（Ｓ１０）におけるステップＳ１０２からＳ１０６が実行される。

図１３は、顕微鏡装置１２において、共焦点観察をするか減衰蛍光観察をするかを自動選択する動作（Ｓ２０）のフローチャートであり、図１４は当該動作で用いられるＧＵＩ画面３５０を示す。

記憶部２２６には、蛍光物質の名称に対応付けて、共焦点観察が好ましいか減衰蛍光観察が好ましいか、および、共焦点観察の場合のポンプ光の波長または減衰蛍光観察の場合のポンプ光およびプローブ光の波長が記憶されている。ＧＵＩ画面３５０には、記憶部２２６に記憶されている蛍光物質３５３の名称がチェックボックス３５２とともに表示される。

ユーザによるチェックボックス３５２へのチェックにより蛍光物質が選択される（Ｓ２００）。制御部１３０は、選択された蛍光物質に応じて、記憶部２２６を参照して共焦点観察が好ましいか減衰蛍光観察が好ましいかを判断する（Ｓ２０２）。共焦点観察が好ましいと判断した場合には、ＧＵＩ画面３５０においてポンプ光のボックス３５５に色が付き、当該蛍光物質に対応したポンプ光の波長が自動選択されて、表示欄３５４に表示される（Ｓ２０４）。この場合、活性化光のボックス３６０およびプローブ光のボックス３５７は白色であって、波長の表示欄３５６、３６１がグレーアウトされる。減衰蛍光観察が好ましいと判断した場合には、ＧＵＩ画面３５０においてポンプ光のボックス３５５に色が付き、当該蛍光物質に対応したポンプ光の波長が自動選択されて表示欄３５４に表示されるとともに、活性化光のボックス３６０およびプローブ光のボックス３５７にも色が付いて、当該蛍光物質に対応した活性化光の波長およびプローブ光の波長が自動選択されて表示欄３５６、３６１に表示される（Ｓ２０４）。いずれの場合も、表示欄３５８に蛍光物質の吸収帯、蛍光帯、光源の波長および検出領域の関係が図示される（Ｓ２０６）。

減衰蛍光観察が好ましいと判断された場合には、ユーザの実行の指示に基づき、波長制御部２３０がレーザ光源１０２、１０４、５００の光の波長を設定する。さらに、周波数制御部２２９が発振器１３２に変調周波数を設定する。この場合に、図１０のＧＵＩ画面３００で変調周波数の入力を受け付けてもよいし、蛍光物質に変調周波数を対応付けて記憶部２２６に記憶しておき、蛍光物質の選択に伴って当該変調周波数を自動的に設定してもよい。上記設定に基づいて、図１１のステップＳ１０２からＳ１０６と同様に減衰蛍光観察の画像が取得される。

一方、共焦点観察が好ましいと判断された場合には、ユーザの実行の指示に基づき、波長制御部２３０がレーザ光源１０２の光の波長を設定する。上記設定に基づいて、図１１のステップＳ１１２からＳ１１８と同様に共焦点観察の画像が取得される。

図１５はさらに他の顕微鏡装置１４の構成を示す図である。顕微鏡装置１４におい顕微鏡装置１０、１２と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。

顕微鏡装置１０においては、活性化光の強度変調のためにＡＯＭ５１４を設けるとともにプローブ光の強度変調のためにＡＯＭ５２４を設けた。これに対し、顕微鏡装置１４では、単体の音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦともいう）５３４により活性化光およびプローブ光の両方を変調する。ＡＯＴＦ５３４およびドライバ５３２が強度変調部５３０を構成する。

この場合に、発振器１３２からの発振に基づいてドライバ５３２がＡＯＴＦ５３４により、活性化光をｆ１で、プローブ光をｆ３でそれぞれ強度変調する。ＡＯＴＦ５３４では波長ごとに異なる周波数で強度変調することができるため、より簡易な装置構成で多色観察を実現することができる。この場合にポンプ光は強度変調せずに、常にＯＮ状態とする。

なお、プローブ光の波長が短くなって試料の励起スペクトルに近づくと、プローブ光による蛍光励起が無視できない場合がある。この信号は、活性化光とプローブ光の積で生じるので、ＰＳＮ−ＲＦ信号より分解能が悪く、混入した場合は分解能を低下させる恐れがある。この場合は、ポンプ光を周波数ｆ２で強度変調することが望ましい。ポンプ光の変調にはポンプ光用の強度変調部を更に設けてもよいし、顕微鏡装置１４におけるＡＯＴＦ５３４で、活性化光およびプローブ光に加えてポンプ光も強度変調してもよい。ＰＳＮ−ＲＦ信号を検出するために、復調周波数を ｆ１±ｆ２±ｆ３に設定することが望ましい。

図１６は、さらに他の顕微鏡装置１８の構成を示す図である。顕微鏡装置１８は、ポジ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物１８４に、不活性光、強度変調させたポンプ光およびプローブ光を観察対象物１８４に照射することで、観察対象物１８４の蛍光物質より生じる誘導放出により減衰した蛍光信号をロックイン検出する。なお、顕微鏡装置１８において顕微鏡装置１０から１４と同一の構成について同一の番号を付して説明を省略する。

ポジ型スイッチング蛍光物質としてＫｏｈｉｎｏｒが挙げられる。

顕微鏡装置１８においては、顕微鏡装置１４の活性化光用のレーザ光源５００に代えて不活性化光用のレーザ光源５０２を配している。例えば、不活性化 光: ４０５ｎｍ, ポンプ光: ４８８ ｎｍ,プローブ光:６００ｎｍのレーザ光をそれぞれ用いる。ＡＯＴＦ５３４は、ポンプ光とプローブ光を周波数ｆ２、ｆ３で強度変調する。この場合に不活性化光は強度変調せずに、常にＯＮ状態とする。

図１７を用いて顕微鏡装置１８の減衰蛍光による観察の原理を説明する。図１７は状態遷移図である。

ポジ型スイッチング蛍光物質は図１７に示すように状態遷移する。活性化状態においてはポンプ光で励起され、プローブ光で誘導放出されて減衰した蛍光が出射される。さらに活性化状態からは不活性化光の励起により発光できない不活性化状態に遷移する。ここで、信号として、時間的に以下の過程を経て生じる蛍光信号を検出する。
（Ｓｔｅｐ１）ポンプ光によるスイッチング(不活性化状態から活性化状態へ)(1)
（Ｓｔｅｐ２）ポンプ光による励起(2)
（Ｓｔｅｐ３）プローブ光による誘導放出(3)

この過程を経て生じる蛍光信号は、ポンプ光、ポンプ光、プローブ光の積の結果として得られるため、信号発生領域が制限される。発生する蛍光信号をＰＳＰ−ＲＦ信号と定義する。この蛍光信号は、観察対象物１８４の蛍光スペクトルのうち、プローブ光と重複しない領域に設定することが望ましい。このために、光学フィルタ１６６によって、不活性化光、ポンプ光、プローブ光を除去することが望ましい。

この３つの過程を経て生じる ＰＳＰ−ＲＦを検出するために、ポンプ光強度を周波数ｆ２で、プローブ光強度を周波数ｆ３で強度変調する。不活性化光、ポンプ光、プローブ光の時間波形を Ｉ_{Ｄｅａｃｔ}、 Ｉ_Ｐｕｍｐ、 Ｉ_{Ｐｒｏｂｅ}とすると、
ここで、 Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３はそれぞれ不活性化光、ポンプ光、プローブ光の光強度である。ＰＳＰ−ＲＦ信号は、
従って、２ｆ２±ｆ３で生じる蛍光信号を取得することで、分解能の向上したＰＳＰ−ＲＦ信号を取得することができる。より具体的には、発振器１３２から上記復調周波数がロックインアンプ１３４に入力される。ロックインアンプ１３４は復調周波数に同期する信号を抽出する。走査部１５０で観察対象物１８４を走査しつつ、ロックインアンプ１３４でピクセルごとにロックイン検出を実施し、当該ピクセルの位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。画像生成部２２２は、記憶部２２６から位置情報に対応付けられた検出結果を読み出して、減衰蛍光の観察画像を生成し、表示部２２４に表示する。

図１８は分解能向上の原理について示す図である。不活性化光、ポンプ光、プローブ光の光スポットの強度分布をそれぞれ Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３とする。
（Ｓｔｅｐ１）ポンプ光により光スイッチング （ＯＦＦ→ＯＮ）が発生する発生分布を Ａ_１とすると、それはポンプ光の強度分布に等しいので、
（Ｓｔｅｐ２）ポンプ光により励起が発生する発生分布を Ａ_２とする。この信号発生分布は、 Ｓｔｅｐ１の発生分布 Ａ_１と、ポンプ光スポットの強度分布Ｓ_２の積に等しいので、
（Ｓｔｅｐ３）プローブ光により誘導放出が発生する発生分布を Ａ_３とする。この信号発生分布は、 Ｓｔｅｐ２の発生分布 Ａ_２と、プローブ光スポットのっ強度分布Ｓ_３の積に等しいので、
この発生分布 Ａ_３はＰＳＰ−ＲＦ信号の発生分布と等価である。このように、３つの光の積で生じる蛍光信号を検出することで、図１８に示すように、光スポットの中心からの蛍光発生の寄与を大きくかつ周辺からの蛍光発生の寄与を小さくすることができるので、観察対象物１８４からの信号発生領域を回折限界以下に制限でき、結果として分解能を向上させることができる。

観察対象物１８４への集光位置ごとに、時間的に不活性化光を照射後に、ポンプ光とプローブ光を照射する構成としても良い。これにより、プローブ光によりＯＮ状態にスイッチする確率が向上するので、信号対雑音比が向上するという利点がある。

図１９は、さらに他の顕微鏡装置２０の構成を示す図である。顕微鏡装置２０において顕微鏡装置１０から１８と同一の構成について同一の番号を付して説明を省略する。

顕微鏡装置２０は、ポジ型スイッチング蛍光物質およびネガ型スイッチング蛍光物質の両方を含む観察対象物１８４に、ポンプ光およびプローブ光と、活性化光および不活性化とを観察対象物１８４に照射することで、観察対象物１８４のポジ型スイッチング蛍光物質およびネガ型スイッチング蛍光物質より生じる誘導放出により減衰した蛍光信号をロックイン検出する。特に、顕微鏡装置２０は、ポジ型スイッチング蛍光物質からの減衰蛍光信号と、ネガ型スイッチング蛍光物質からの減衰蛍光信号とを同時に観察することができる顕微鏡装置である。

顕微鏡装置２０は、顕微鏡装置１４とは、スイッチング光用のレーザ光源５０６および他のロックインアンプ１３５を設けている点が異なる。また、観察対象物１８４にはポジ型スイッチング蛍光物質およびネガ型スイッチング蛍光物質の両方が導入されている。

レーザ光源５０６から出射されるスイッチング光は、ネガ型スイッチング蛍光物質に対して活性化光として機能し、ポジ型スイッチング蛍光物質に対して不活性化光として機能する。言い換えれば、ネガ型スイッチング蛍光物質の活性化光の波長と、ポジ型スイッチング蛍光物質の不活性化光の波長とが同一となるような、ネガ型スイッチング蛍光物質とポジ型スイッチング蛍光物質とが用いられる。このような蛍光物質を用いることで、スイッチング光を共通化できるので、装置構成がシンプルになり、コストも抑えられるという利点がある。

なおここで波長が同一とは、それぞれの波長がレーザ光源５０６から出射される光の波長範囲に入っていれば、完全に同一でなくてよい。光波長としては、例えば、スイッチング光：４０５ｎｍ、ポンプ光: ４８８ｎｍ、プローブ光: ６００ｎｍのレーザ光がそれぞれ用いられる。

顕微鏡装置２０において、ＡＯＴＦ５３４により、スイッチング光をｆ１で、ポンプ光をｆ２で、プローブ光をｆ３でそれぞれ強度変調する。発生する蛍光信号を受光部１７４で受光し、受光部１７４の出力信号を分岐してそれぞれをロックインアンプ１３４、１３５に入力する。

ロックインアンプ１３４はネガ型スイッチング蛍光物質の信号取得用であり、復調周波数を ｆ１±ｆ２±ｆ３に設定する。一方、ロックインアンプ１３５はポジ型スイッチング蛍光物質の信号取得用であり、復調周波数を２ｆ２±ｆ３に設定する。このように復調周波数に差を設けることにより、同一の装置構成においてネガ型スイッチング蛍光物質とポジ型スイッチング蛍光物質のプローブを同時観察することが可能となる。

図２０は、さらに他の顕微鏡装置２２の構成を示す図である。顕微鏡装置２２において顕微鏡装置１０から２０と同一の構成について同一の番号を付して説明を省略する。

顕微鏡装置２２は、顕微鏡装置２０と同様に、ポジ型スイッチング蛍光物質およびネガ型スイッチング蛍光物質の両方を含む観察対象物１８４に、ポンプ光およびプローブ光と、活性化光および不活性化とを観察対象物１８４に照射することで、観察対象物１８４のポジ型スイッチング蛍光物質およびネガ型スイッチング蛍光物質より生じる誘導放出により減衰した蛍光信号をロックイン検出する。ただし、顕微鏡装置２２においては、ポジ型スイッチング蛍光物質からの減衰蛍光信号と、ネガ型スイッチング蛍光物質からの減衰蛍光信号とをシーケンシャル、すなわち時分割で観察することができる顕微鏡装置である。

顕微鏡装置２２は、顕微鏡装置２０とはロックインアンプ１３５が設けていない点が異なる。一方、単一のロックインアンプ１３４に対し、復調周波数を時分割で変えて検出する。より具体的には、ＡＯＴＦ５３４で、表１に示すようにスイッチング光をｆ１、ポンプ光をｆ２、プローブ光ｆ３で強度変調して観察対象物１８４に照射する。受光部１７４で出力された信号に対して、ある時間帯ではロックインアンプ１３４において復調周波数ｆｐでロックイン検出することで、ポジ型スイッチング蛍光物質による。減衰蛍光信号を検出する。他の時間帯ではロックインアンプ１３４において復調周波数ｆｎでロックイン検出することで、ネガ型スイッチング蛍光物質による減衰蛍光信号を検出する。

図２１は、さらに他の顕微鏡装置２４の構成を示す図である。顕微鏡装置２４において顕微鏡装置１０から２２と同一の構成について同一の番号を付して説明を省略する。

顕微鏡装置２４においては、対物レンズ１６４に対向して対物レンズ１９０が配され、さらに対物レンズ１９０からの光路に光学フィルタ１９２および検出部１９４が配される。検出部１９４の一例はフォトダイオードである。また、光学フィルタ１９２はプローブ光を含む波長帯域を透過させ、他の波長領域を遮断する。

ＡＯＴＦ５３４で、表２に示すようにスイッチング光をｆ１、ポンプ光をｆ２、プローブ光ｆ３で強度変調して観察対象物１８４に照射する。受光部１７４で出力された信号に対して、ロックインアンプ１３４において復調周波数ｆｍでロックイン検出することで、ポジ型スイッチング蛍光物質による減衰蛍光信号を検出し、受光部１９４で出力された信号に対してロックイン検出することにより、観察対象物１８４を通過したプローブ光による信号を検出する。プローブ光による誘導放出光の信号発生領域が活性化光とポンプ光とプローブ光の重複領域となるために、蛍光検出と同様に空間分解能を向上させることができる。なお、光学フィルタ１９２としてプローブ光波長のみを透過するような狭帯域なフィルタを用いた場合には、誘導放出光のみが検出される。一方、広帯域なフィルタを用いた場合にはプローブ光に加えて蛍光も検出されるため、光量が増大される。

この装置構成において、実施形態１で述べたＰＳＮ−ＲＦ信号も取得できるので、周波数の変更だけで、どちらの信号を取得するかを容易に切り替えることができる。あるいはロックインアンプを２つ用意してそれぞれの復調周波数を表２に応じて蛍光検出用と誘導放出検出用に設定することで、同時観察も可能となる。なお、ここでは例としてネガ型スイッチング蛍光物質からの誘導放出信号を取得する場合について説明したが、ポジ型スイッチング蛍光物質に対しても同様に適用可能である。

なお、顕微鏡装置１２から２４において走査部１５０に代えて、図７の走査部１５１または図８の走査部１５６が用いられてもよい。

レーザ光源１０２等として連続発振方式を用いたが、パルスレーザを用いてもよい。また、受光部１７４等として光電子倍増管を用いたが、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を用いても良い。

また、上記実施形態において励起には一光子励起を用いたが、二光子励起、三光子励起といった多光子励起を用いても良い。

顕微鏡装置１４から２４において、顕微鏡装置１６のデスキャン光学系を用いてもよい。また、減衰蛍光観察時、デスキャンにより蛍光を検出する構成において、ピンホール４０８等を絞る構成としても良い。その結果、結像系の点像分布関数も光学分解能向上に寄与するため、さらなる分解能向上が可能となる。光量が十分確保される明るい蛍光物質を観察する場合には、ピンホール４０８等を絞る構成とすることが望ましい。一方で、光量が十分に確保されない暗い蛍光物質を観察する場合には、ピンホール４０８等を開放することが望ましい。

また、広視野観察時において倍率色収差によりポンプ光とプローブ光の面内方向のスポットズレが問題となる場合や、深部観察において軸上色収差によりポンプ光とプローブ光の光軸方向のスポットずれが問題となる場合は、ポンプ光のビーム径をプローブ光のビーム径に比べて細くすることが望ましい。これにより、ポンプ光のスポットが面内方向・光軸方向に広がり、ビームのオーバーラップがより容易になる。なお、ポンプ光のビーム径を細くする理由は、ポンプ光はプローブ光に比べて波長が短いことから、同一の対物レンズにおいて同一のビーム径でスポットを生成した際に、ポンプ光の方がプローブ光に比べてスポット径が小さいためである。

上記いずれの実施形態においても、ＡＯＭに代えて、ＡＯＴＦを用いてもよい。他の例として、ＥＯＭ(電気光学素子)と偏光子を用いて、偏光方向を高速に切り替えることで、光強度の変調を実現しても良い。あるいは、チョッパーなどのメカニカルシャッターを用いても良い。

顕微鏡装置１０から２６のいずれかの光の光路に、位相板（ラジアル偏光子）を挿入する構成としても良い。これにより、位相板を透過した光の点像分布関数が面内方向でよりシャープになり、分解能向上効果が増大する。一般的にこのような位相板を用いると、面内方向の分布がシャープになる代わりに、（ｉ）サイドローブが生じる、（ｉｉ）光軸方向の分布が太くなるといった課題がある。しかしながら、提案手法では、信号発生領域は３つの光の重複領域となるために、これらの課題が解消され、面内方向分布がシャープになるという恩恵だけを受けることができる。なお、各光それぞれに異なる位相板を挿入しても良いし、３つの光の共通光路に同一の位相板を挿入しても良い。なお、他の形状の位相板でも良い。また、位相板の変わりにマスクを挿入し、光の振幅に分布を持たせることで、点像分布関数の形状を制御しても良い。例えば、輪帯板を挿入してベッセルビームを生成しても同様の効果が得られる。

また、顕微鏡装置１０、１４、１８、２０、２２、２４においても、顕微鏡装置１２と同様に、波長制御部２３０を設けてレーザ光源の光の波長を制御してもよい。また、上記実施形態はいずれも顕微鏡装置を用いたが、減衰蛍光が観察できる蛍光観察装置であれば顕微鏡に限られない。

また、ダイクロイックミラー１６２、４０２は照明光を透過させて、蛍光を反射するが、これに代えて、照明光を反射して蛍光を透過するようにしてもよい。

なお、特定の周波数の信号成分を検出する方式としてロックインアンプについて説明したが、他の方法でも良い。例えば、時間信号をフーリエ変換することで特定の周波数の信号成分を検出しても良い。例えば、周波数変換器により、復調周波数を持つ参照信号と信号光を乗算し、直流成分のみを抽出する構成としても良い。なお、ここでいう直流成分とは、正弦波の振動成分を直流に変換した値に相当する。

発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、請求の範囲の記載から明らかである。

請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。

なお、いずれかの顕微鏡装置において、スイッチング光、ポンプ光、プローブ光の偏光は同一であることが望ましい。例えば、同一の直線偏光、円偏光であることが望ましい。あるいは、ポンプ光とプローブ光の偏光を直交する直線偏光とした場合と、平行な直線偏光とした場合でそれぞれ減衰蛍光による画像を取得し、両者を比較することで、観察対象物の偏光特性を可視化する構成としても良い。これは、誘導放出の効率が偏光に依存するためである。あるいは、スイッチング光とポンプ光の偏光を直交させる構成としても良い。この場合、光スイッチングの偏光特性を可視化できる。

１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４ 顕微鏡装置
１００ 光源
１０２、１０４、５００、５０２、５０６ レーザ光源
１３０ 制御部
１３２ 発振器
１３４、１３５ ロックインアンプ
１３６、１９４ 検出部
１４０ 照明光学系
１５０、１５１、１５６ 走査部
１５２ レゾナントスキャナ
１５３ ガルバノスキャナ
１５４、１５５ ミラー
１６０ 観察光学系
１６２ ダイクロイックミラー
１６４ 対物レンズ
１６６、１９２、４０４ 光学フィルタ
４０６ レンズ
１７２、１７３ レンズペア
１７４、４１０ 受光部
１８０ ステージ
１８２ スライドガラス
１８４ 観察対象物
１８６ 標本
２２０ 入力部
２２２ 画像生成部
２２４ 表示部
２２６ 記憶部
２２８ スキャナ制御部
２２９ 周波数制御部
２３０ 波長制御部
４０８ ピンホール
４０２、４５４、４５６ ダイクロイックミラー
４５８、４６０ ミラー
５１０ 第１強度変調部
５１２、５２２、５３２、５４２ ドライバ
５１４、５２４、５４４ 音響光学素子
５２０ 第２強度変調部
５３０ 強度変調部
５３４ 音響光学チューナブルフィルタ
５４０ 第３強度変調部
３００、３５０ ＧＵＩ画面
３０２、３０４、３１２、３１６、３２４、３５２ チェックボックス
３５４、３５６、３５８ 表示欄
３０８、３１０、３１４、３１８、３２０、３２２、３２３、３２５、３２６ 入力欄
３３０、３３２ 観察画像
３３４ タイムラプス画像

Claims (13)

1. 活性化光によって不活性化状態から活性化状態に移行し、活性化状態においてポンプ光によって励起されるネガ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察装置であって、
   前記活性化光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、
   前記観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第２の強度変調部と、
   前記ポンプ光、並びに、強度変調された前記プローブ光および前記活性化光を照射した前記観察対象物からの蛍光を受光する受光部と、
   前記受光部で検出される受光信号のうち周波数ｆ１±ｆ３の成分を検出する検出部と
   を備える蛍光観察装置。
2. 前記ポンプ光、前記プローブ光および前記活性化光で前記観察対象物を二次元的に走査する走査部をさらに備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
3. 前記走査部は、主走査方向を走査する共振ミラーと副走査方向を走査するガルバノミラーとを有する請求項２に記載の蛍光観察装置。
4. 前記受光部は、前記走査部を前記ポンプ光、前記プローブ光および前記活性化光とは逆方向に通過した蛍光を受光する請求項３に記載の蛍光観察装置。
5. 前記受光部の直前に配されたピンホールをさらに備え、前記受光部は前記ピンホールを通過した蛍光を受光する請求項４に記載の蛍光観察装置。
6. 前記ポンプ光を前記周波数ｆ１、ｆ３のいずれとも異なる周波数ｆ２で強度変調する第３の強度変調部をさらに備え、
   前記検出部は、前記受光部で検出される受光信号のうち周波数ｆ１±ｆ２±ｆ３の成分を検出する請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光観察装置。
7. 活性化状態においてポンプ光によって励起され、不活性化光によって活性化状態から不活性化状態に移行するポジ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察装置であって、
   前記ポンプ光を周波数ｆ２で強度変調する第１の強度変調部と、
   前記観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第２の強度変調部と、
   強度変調された前記ポンプ光および前記プローブ光、並びに、前記不活性化光を照射した前記観察対象物からの蛍光を受光する受光部と、
   前記受光部で検出される受光信号のうち周波数２ｆ２±ｆ３の成分を検出する検出部とを備える蛍光観察装置。
8. 前記ポンプ光、前記プローブ光および前記不活性化光で前記観察対象物を二次元的に走査する走査部をさらに備える請求項７に記載の蛍光観察装置。
9. 前記走査部は、主走査方向を走査する共振ミラーと副走査方向を走査するガルバノミラーとを有する請求項８に記載の蛍光観察装置。
10. 前記受光部は、前記走査部を前記ポンプ光、前記プローブ光および前記不活性化光とは逆方向に通過した蛍光を受光する請求項９に記載の蛍光観察装置。
11. 前記受光部の直前に配されたピンホールをさらに備え、前記受光部は前記ピンホールを通過した蛍光を受光する請求項１０に記載の蛍光観察装置。
12. 活性化光によって不活性化状態から活性化状態に移行し、活性化状態においてポンプ光によって励起されるネガ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察方法であって、
    前記活性化光を周波数ｆ１で強度変調し、
    前記観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ３で強度変調し、
    前記ポンプ光、並びに、強度変調された前記プローブ光および前記活性化光を前記観察対象物に照射する工程と、
    前記観察対象物からの蛍光を受光部で受光し、前記受光部で検出される受光信号のうち周波数ｆ１±ｆ３の成分を検出する工程と、
    を含む蛍光観察方法。
13. 活性化状態においてポンプ光によって励起され、不活性化光によって活性化状態から不活性化状態に移行するポジ型スイッチング蛍光物質を含む観察対象物からの蛍光を観察する蛍光観察方法であって、
    前記ポンプ光を周波数ｆ２で強度変調し、
    前記観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調し、
    強度変調された前記ポンプ光および前記プローブ光、並びに、前記不活性化光を前記観察対象物に照射する工程と、
    前記観察対象物からの蛍光を受光部で受光し、前記受光部で検出される受光信号のうち周波数２ｆ２±ｆ３の成分を検出する工程と、
    を含む蛍光観察方法。