JPWO2017158697A1 - 画像取得方法および画像取得装置 - Google Patents

Abstract

Ｓ／Ｎ比を低下させることなく焦点外信号光を除外して鮮明な信号光画像を取得することを目的として、本発明に係る画像取得方法は、光源から発せられたパルス状の照明光を試料に集光させて走査し、各走査位置において非線形光学過程により発生した信号光を検出し、検出された信号光に基づいて試料の画像を生成する画像取得方法であって、試料における照明光の焦点位置において発生する焦点信号光と焦点外信号光の両方を含む混合画像を取得する第１のステップ（Ｓ２，Ｓ７）と、焦点外信号光の強度が異なる複数の混合画像に基づいて焦点外信号光の画像を取得する第２のステップ（Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５）と、第１のステップ（Ｓ２，Ｓ７）において取得された混合画像から第２のステップ（Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５）において取得された焦点外信号光の画像を減算して焦点信号光の画像を取得する第３のステップ（Ｓ８）とを含む。

Description

本発明は、画像取得方法および画像取得装置に関するものである。

２光子励起顕微鏡のような画像取得装置においては、試料の深部を観察する際に、試料中での散乱等によるレーザ光のパワーの低下を補うために、照射するレーザ光のパワーを増大させることが行われる。この場合には試料の表面領域においても強いパワーのレーザ光によって２光子吸収効果が発生し、結果として発生した焦点外蛍光がノイズとなって検出されてしまう。

このような場合に、焦点外蛍光信号を除去して焦点からの蛍光信号のみの画像を生成する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
この方法は、デフォーマブルミラーを用いて集光位置におけるレーザ光の空間分布を変調することで集光位置における蛍光の発生効率を下げた画像を取得し、焦点外蛍光信号および焦点からの蛍光信号の両方を含む画像から減算することで焦点からの蛍光信号を取得するものである。

Ａ．Ｌｅｒａｙ，Ｋ．Ｌｉｌｌｉｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｒｔｚ，"Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｒｅｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｉｃｋ Ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ−Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，"Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．９４，１４４９（２００８）．

しかしながら、非特許文献１のように焦点位置における蛍光強度を変調して焦点外蛍光画像を取得する方法では、変調が十分ではない場合には焦点外蛍光の画像内に焦点からの蛍光信号が含まれてしまい、差分によって焦点からの蛍光信号にロスが発生するという不都合がある。２光子蛍光観察においては蛍光が励起光よりも短波長であって試料内において強い散乱を受けるため、その回収効率が低く、Ｓ／Ｎ比が低い。このため、焦点からの蛍光信号にロスを生ずることは、Ｓ／Ｎ比をさらに低下させることになり好ましくない。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、Ｓ／Ｎ比を低下させることなく焦点外信号光を除外して鮮明な信号光画像を取得することができる画像取得方法および画像取得装置を提供することを目的としている。

本発明の一態様は、光源から発せられたパルス状の照明光を試料に集光させて走査し、各走査位置において非線形光学過程により発生した信号光を検出し、検出された該信号光に基づいて前記試料の画像を生成する画像取得方法であって、前記試料における前記照明光の焦点位置において発生する焦点信号光と、焦点位置以外の位置において発生する焦点外信号光の両方を含む混合画像を取得する第１のステップと、前記焦点外信号光の強度が異なる複数の前記混合画像に基づいて前記焦点外信号光の画像を取得する第２のステップと、前記第１のステップにおいて取得された前記混合画像から前記第２のステップにおいて取得された前記焦点外信号光の画像を減算して前記焦点信号光の画像を取得する第３のステップとを含む画像取得方法である。

本態様によれば、光源から発せられたパルス状の照明光が、試料に集光されて走査されると、各走査位置において非線形光学過程により、照明光の焦点位置において焦点信号光が発生し、焦点位置以外の位置において焦点外信号光が発生する。第１のステップにおいては焦点信号光と焦点外信号光の両方を含む混合画像が取得される。

一方、第２のステップにおいては、焦点外信号光の強度が異なる複数の混合画像が取得され、取得された複数の混合画像に基づいて焦点外信号光の画像が取得される。
そして、第３のステップにおいて、混合画像から焦点外信号光の画像が減算されることにより、焦点信号光の画像が取得される。

この場合において、本態様によれば、焦点位置における信号強度を変調することなく焦点外信号光の画像を生成できる。したがって、混合画像から焦点外信号光の画像を減算する際に、焦点位置からの信号にロスが発生することがない。その結果、Ｓ／Ｎ比を低下させることなく焦点外信号光を除外して鮮明な信号光画像を取得することができる。

上記態様においては、前記第２のステップが、２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に同時に集光して前記試料の第１画像を生成する同時照明ステップと、２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に非同時に集光して前記試料の第２画像を生成する非同時照明ステップと、前記同時照明ステップにおいて生成された前記第１画像と前記非同時照明ステップにおいて生成された前記第２画像とに基づいて前記焦点外信号光の画像を取得する演算ステップとを含んでいてもよい。
このようにすることで、２つのパルス状の照明光を試料の異なる位置に同時に集光して生成された第１画像には高強度の焦点外信号光が含まれ、２つのパルス状の照明光を試料の異なる位置に非同時に集光して生成された第２画像には第１画像よりも低強度の焦点外信号光が含まれる。これにより、２つのパルス状の照明光の試料への照射方法を変えて取得された第１画像と第２画像とから焦点外信号光の画像を容易に取得することができる。

また、上記態様においては、前記演算ステップが、前記同時照明ステップにおいて生成された前記第１画像から前記非同時照明ステップにおいて生成された前記第２画像を減算してもよい。
このようにすることで、第１画像から第２画像を減算するだけで焦点外信号光の画像を容易に取得することができる。

また、上記態様においては、前記第１のステップが、いずれか一方の前記照明光を遮断した状態で検出された前記信号光に基づいて前記混合画像を生成してもよい。
このようにすることで、一方の光路の照明光のオンオフにより第１のステップと第２のステップとを簡単に切り替えることができる。

また、上記態様においては、前記同時照明ステップと前記非同時照明ステップとが、２つの前記照明光の光路長が等しい状態と異なる状態とで時間周期的に切り替えることにより実施されてもよい。
このようにすることで、２つの照明光の光路長を等しくして同時照明ステップを行い、２つの照明光の光路長を異ならせて非同時照明ステップを行うことを時間周期的に簡単に切り替えることができる。

また、上記態様においては、２つの前記照明光として、繰り返し周波数の異なる照明光を採用してもよい。
このようにすることで、繰り返し周波数の異なる２つの照明光を試料に照射すると、２つの照明光が同時に照射される同時照明ステップと、別々に照射される非同時照明ステップとを、自動的に時間周期的に切り替えることができる。

また、上記態様においては、前記第２のステップが、検出された前記信号光を時間周期的に復調した復調信号に基づいて前記焦点外信号光画像を生成してもよい。
このようにすることで、時間周期的に切り替えられた同時照明ステップと非同時照明ステップとにより取得された信号光をそれぞれ時間周期的に復調して抽出することができ、焦点外信号光画像を簡易に生成することができる。

また、上記態様においては、前記非線形光学過程が多光子吸収過程であり、前記照明光が極短パルスレーザ光であり、前記信号光が蛍光であってもよい。
このようにすることで、多光子励起顕微鏡に適用して、Ｓ／Ｎ比の高い蛍光画像を取得することができる。

また、本発明の他の態様は、光源から発せられたパルス状の照明光を走査する走査部と、該走査部により走査される前記照明光を試料に照射する照明光学系と、該照明光学系による前記照明光の前記試料における照射位置において前記非線形光学過程で発生した信号光を検出する検出光学系と、該検出光学系により検出された前記信号光に基づいて信号光画像を生成する画像生成部とを備え、該画像生成部が、前記試料における前記照明光の焦点位置以外の位置において発生した焦点外信号光の強度が異なる複数の画像から焦点外信号光画像を生成し、前記試料における前記照明光の焦点位置において発生した焦点信号光および前記焦点外信号光の両方を含む混合画像から前記焦点外信号光画像を減算して焦点信号光画像を生成する画像取得装置である。

本態様によれば、光源から発せられた照明光が、走査部によって走査され、照明光学系によって試料に照射されると、照明光の各走査位置において非線形光学過程により信号光が発生し、検出光学系によって検出される。検出された信号光には照明光の焦点位置において発生した焦点信号光と、焦点位置以外の位置において発生した焦点外信号光とを含んでいる。画像生成部により、焦点外信号光の強度が異なる複数の画像から焦点外信号光画像が生成され、焦点信号光と焦点外信号光の両方を含む混合画像から焦点外信号光画像を減算することにより焦点信号光画像が生成される。

すなわち、本態様によれば、焦点位置における信号強度を変調することなく焦点外信号光の画像を生成できる。したがって、混合画像から焦点外信号光の画像を減算する際に、焦点位置からの信号にロスが発生することがない。その結果、Ｓ／Ｎ比を低下させることなく焦点外信号光を除外して鮮明な信号光画像を取得することができる。

上記態様においては、前記画像生成部が、２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に同時に集光して前記試料の第１画像を生成し、２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に非同時に集光して前記試料の第２画像を生成し、前記第１画像と前記第２画像とに基づいて前記焦点外信号光画像を取得してもよい。
また、上記態様においては、前記画像生成部が、前記第１画像から前記第２画像を減算して前記焦点外信号光画像を取得してもよい。

また、上記態様においては、２つの前記照明光の一方の光路に、該光路を通過する前記照明光の強度を変調する光強度変調素子を備え、前記画像生成部が、前記光強度変調素子により一方の光路を通過する前記照明光を他方の光路を通過する前記照明光と等しい強度に設定したときに検出された前記信号光に基づいて前記焦点外信号光画像を生成し、前記光強度変調素子により一方の光路を通過する前記照明光を遮断したときに検出された前記信号光に基づいて前記混合画像を生成してもよい。

このようにすることで、光強度変調素子により一方の光路を通過する照明光の強度が変調され、一方の光路を通過する照明光を他方の光路を通過する照明光と等しい強度に設定したときに検出された信号光に基づいて焦点外信号光画像が生成され、光強度変調素子により一方の光路を通過する照明光を遮断したときに検出された信号光に基づいて混合画像が生成される。

また、上記態様においては、２つの前記照明光の一方の光路に、前記光路を通過する前記照明光の光路長を時間周期的に変調する光路長変調素子を備え、前記画像生成部が、前記光路長変調素子により２つの前記照明光の光路長が等しくされたときに検出された前記信号光に基づいて前記第１画像を生成し、２つの前記照明光の光路長が異ならされたときに検出された前記信号光に基づいて前記第２画像を生成してもよい。

このようにすることで、光路長変調素子により、２つの照明光の光路長が等しくされたときに検出された信号光に基づいて第１画像が生成され、２つの照明光の光路長が異ならされたときに検出された信号光に基づいて第２画像が生成される。

また、上記態様においては、前記画像生成部は、繰り返し周波数が異なる２つのパルス状の前記照明光を前記試料に照射することにより、２つの前記照明光を同時に前記試料に集光する状態と２つの前記照明光を非同時に前記試料に集光する状態とを時間周期的に切り替えてもよい。

また、上記態様においては、検出された前記信号光を時間周期的に復調する復調部を備え、前記画像生成部が、該復調部により復調された復調信号を用いて前記焦点外信号光画像を生成してもよい。
このようにすることで、時間周期的に切り替えられた同時照明ステップと非同時照明ステップとにより取得された信号光を、復調部によってそれぞれ時間周期的に復調して抽出することができ、焦点外信号光画像を簡易に生成することができる。

また、上記態様においては、前記非線形光学過程が多光子吸収過程であり、前記照明光が極短パルスレーザ光であり、前記信号光が蛍光であってもよい。

本発明によれば、Ｓ／Ｎ比を低下させることなく焦点外信号光を除外して鮮明な信号光画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。 試料内において発生する焦点蛍光と焦点外蛍光とを説明する図である。 図１の画像取得装置を用いた本発明の一実施形態に係る画像取得方法を説明するフローチャートである。 図１の画像取得装置の第１の変形例を示す模式図である。 図４の画像取得装置を用いた画像取得方法を説明するフローチャートである。 図１の画像取得装置の第２の変形例を示す模式図である。 図６の画像取得装置を用いた画像取得方法を説明するフローチャートである。 図１の画像取得装置の第３の変形例を示す模式図である。

以下、本発明の一実施形態に係る画像取得装置１および画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る画像取得装置１は、多光子励起型の走査型蛍光顕微鏡であって、図１に示されるように、近赤外の極短パルスレーザ光（以下、レーザ光という。）を射出するチタンサファイアレーザ等の光源（レーザ光源）２と、該光源２からのレーザ光を試料Ｘに照射する照明光学系３と、該照明光学系３の途中位置に配置され、レーザ光を２次元的に走査する走査部４と、レーザ光が試料Ｘに照射されることにより、試料Ｘにおいて発生した蛍光（信号光）を検出する検出光学系５と、該検出光学系５により検出された蛍光の強度に基づいて画像を生成する処理装置（画像生成部）６とを備えている。

照明光学系３は、光源２からのレーザ光のビーム径を調節するビーム径調整光学系７と、レーザ光の偏光方向を４５°方向に設定するλ／２板８と、レーザ光を２つの光路に分岐する第１偏光ビームスプリッタ９と、一方の光路に設けられた光路調整光学系１０と、２つの光路を通過してきたレーザ光（第１レーザ光と第２レーザ光）を合波する第２偏光ビームスプリッタ１１と、合波されたレーザ光を通過させるλ／４板１２と、リレーレンズ１３と、瞳投影レンズ１４と、結像レンズ１５と、対物レンズ１６とを備えている。図中、符号１７は光路を形成するためのミラーである。

第１偏光ビームスプリッタ９は、λ／２板８により偏光方向が４５°に設定された後のレーザ光が入射することによって、入射したレーザ光を、強度比が１：１の互いに直交する偏光方向の第１レーザ光（照明光）Ｌ１と第２レーザ光（照明光）Ｌ２とに分岐するようになっている。

第２偏光ビームスプリッタ１１は、透過する第１レーザ光Ｌ１に対して偏向される第２レーザ光Ｌ２の射出角度がわずかに異なるように設定されている。
第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の射出角度の差はわずかであるため、図１では第２偏光ビームスプリッタ１１以降の２つのレーザ光Ｌ１，Ｌ２の光路を同一の線で示している。

光路調整光学系１０は、一対のミラー１８を矢印の方向に移動させることにより、第２偏光ビームスプリッタ１１による合波後の第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とのパルスのタイミングが同時または非同時となるように、第２レーザ光Ｌ２の光路長を調整するようになっている。
λ／４板１２は、合波された第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２をそれぞれ円偏光に変換するようになっている。

走査部４は、例えば、２軸のガルバノミラー１９であって、リレーレンズ１３と瞳投影レンズ１４との間に配置されている。走査部４は、リレーレンズ１３、瞳投影レンズ１４および結像レンズ１５によって、第２偏光ビームスプリッタ１１および対物レンズ１６の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。

検出光学系５は、結像レンズ１５と対物レンズ１６との間に配置され、対物レンズ１６によって集光された蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー２０と、該ダイクロイックミラー２０によって分岐された蛍光を集光する集光レンズ２１と、集光された蛍光を検出する光電子増倍管のような光検出器２２とを備えている。

処理装置６においては、光検出器２２により検出された蛍光の強度と、各走査位置の座標とに基づいて試料Ｘの蛍光画像が生成される。本実施形態においては、λ／２板８を操作して、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の強度が１：１となるように設定した状態で取得された２枚の蛍光画像と、λ／２板８を操作して、第１レーザ光Ｌ１のみが照射されるように設定した状態で、取得された１枚の蛍光画像の合計３枚の蛍光画像に基づいて、レーザ光の焦点位置からの蛍光に基づく焦点蛍光画像を生成するようになっている。

第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の強度が１：１となるように設定した状態では、光路調整光学系１０によって第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とのパルスのタイミングが同時となる光路長に設定されたときに光検出器２２により検出された蛍光の蛍光画像と、光路調整光学系１０によって第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とのパルスのタイミングが非同時となる光路長に設定されたときに光検出器２２により検出された蛍光の蛍光画像とが生成されるようになっている。

ここで、対物レンズ１６で試料Ｘ内にレーザ光が集光される様子を図２に示す。パルス状の第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２は対物レンズ１６の瞳に異なる角度で入射し、各々が第１焦点Ｐ１および第２焦点Ｐ２に集光される。第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の対物レンズ１６の瞳への入射角度は、第２偏光ビームスプリッタ１１のあおり角を調節することによって、第１焦点Ｐ１および第２焦点Ｐ２をその領域に重なりがない程度に離間させることができる角度に設定されている。

試料Ｘに蛍光物質が含まれている場合には、第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２によって蛍光物質が励起され、第１焦点Ｐ１および第２焦点Ｐ２において多光子吸収効果によって蛍光（焦点蛍光、焦点信号光）が発生する。
ここで、第１焦点Ｐ１および第２焦点Ｐ２が試料Ｘの深部に配置されており、第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２のパワーが強い場合には、試料Ｘの表面付近である領域Ｓにおいても蛍光（焦点外蛍光、焦点外信号光）が発生する。

２光子励起顕微鏡のような画像取得装置１では、ピンホールのような遮光部材を備えないので、この領域Ｓからの焦点外蛍光および第１焦点Ｐ１および第２焦点Ｐ２からの焦点蛍光とが混合して検出される。
各々の領域で発生した蛍光信号を数式で表現すると以下の通りとなる。
まず、第１焦点Ｐ１および第２焦点Ｐ２において発生する焦点蛍光を式（１）および式（２）に示す。

ここで、Ｉ_ｆｌ−１は第１焦点Ｐ１からの焦点蛍光の強度、Ｉ_ｆｌ−２は第２焦点Ｐ２からの焦点蛍光の強度を示している。また、Ｉ_１−Ｆは第１焦点Ｐ１における第１レーザ光Ｌ１の強度、Ｉ_２−Ｆは第２焦点Ｐ２における第２レーザ光Ｌ２の強度である。また、αおよびβは第１焦点Ｐ１および第２焦点Ｐ２における蛍光発生効率を示す係数であり、蛍光物質の種類、濃度および分布に依存する。蛍光強度がレーザ光の強度の２乗に比例しているのは、２光子励起だからである。

次に、領域Ｓにおける蛍光強度Ｉ_ｆｌ−Ｓを式（３）および式（４）に示す。

ここで、Ｉ_１−ＳおよびＩ_２−Ｓは、それぞれ領域Ｓにおける第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２の強度であり、γは領域Ｓにおける蛍光発生効率を示す係数である。図２に示されるように、領域Ｓには第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２の両方が照射されており、その強度は（Ｉ_１−Ｓ＋Ｉ_２−Ｓ）となる。２光子励起であるため、蛍光強度はレーザ光の強度の２乗であり、（Ｉ_１−Ｓ＋Ｉ_２−Ｓ）^２＝（Ｉ_１−Ｓ ^２＋Ｉ_２−Ｓ ^２＋２Ｉ_１−Ｓ・Ｉ_２−Ｓ）に比例する。

また、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが同時に照射された場合には、領域Ｓでは第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが、時間的および空間的に重なるため、Ｉ_１−Ｓ・Ｉ_２−Ｓは成分を有し、式（３）のようになる。一方、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが非同時に照射された場合には、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とは時間的に重ならないため、Ｉ_１−Ｓ・Ｉ_２−Ｓはゼロとなり、式（４）のようになる。

すなわち、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とを同時または非同時に切り替えて照射することにより、領域Ｓから発生する焦点外蛍光の強度は、式（３）と式（４）とで切り替わることになる。

実際に光検出器２２により検出される蛍光信号は、第１焦点Ｐ１、第２焦点Ｐ２および領域Ｓのそれぞれにおいて発生した蛍光が混合されたものとなるため、式（５）で示されるようになる。第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との照射タイミングを同時と非同時とで切り替えることにより、式（５）内の焦点外蛍光Ｉ_ｆｌ−Ｓの項が式（３）と式（４）とに切り替わる。
したがって、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の照射タイミングが同時の場合と非同時の場合とで各々蛍光画像を取得し、その差分を演算すると、実質的には式（３）と式（４）との差分をとることになり、結果として式（６）が得られることになる。

式（６）では、係数α，βの項が消去され、係数γの項のみ残っている。このことは、第１焦点Ｐ１、第２焦点Ｐ２および領域Ｓからの蛍光が混在する混合画像を用いて、領域Ｓからの蛍光のみの蛍光画像を抽出できることを意味している。すなわち、２光子励起顕微鏡を用いた試料Ｘの深部観察において、２つのレーザ光Ｌ１，Ｌ２を試料Ｘ内の近接した位置に同時および非同時に照射して各々蛍光画像を取得し、その画像どうしで差分演算を行うことにより、焦点外蛍光画像を生成することができる。そして、このようにして生成された焦点外蛍光画像を、焦点蛍光および焦点外蛍光が混在する画像から減算することにより、焦点蛍光画像を生成することができることになる。

このように構成された本実施形態に係る画像取得装置１を用いた画像取得方法について以下に説明する。
本実施形態に係る画像取得方法は、図２に示されるように、まず、試料Ｘ内における画像取得位置を設定する（ステップＳ１）。

このステップＳ１においては、λ／２板８を回転させて、第１偏光ビームスプリッタ９でのレーザ光の分岐比率を調整し、第１レーザ光Ｌ１もしくは第２レーザ光Ｌ２のどちらか一方のみが照射されるようにしておいてよい。
次に、λ／２板８を回転させて、対物レンズ１６から射出される第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との強度比が１：１となるように設定する（第１のステップＳ２）。このとき、式（１）から式（６）において、Ｉ_１−Ｆ＝Ｉ_２−Ｆ＝Ｉ_Ｆ、Ｉ_１−Ｓ＝Ｉ_２−Ｓ＝Ｉ_Ｓとする。

この状態で、光路調整光学系１０によって第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが試料Ｘに同時に照射されるように第２レーザ光Ｌ２の光路長を設定し、走査部４を作動させて第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２を試料Ｘにおいて走査させ、蛍光画像（第１画像）Ａを取得する（同時照明ステップＳ３、第２のステップ）。このとき、蛍光画像Ａの信号強度は式（１）から（３）および式（５）から式（７）のようになる。

また、この状態で、光路調整光学系１０によって第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが試料Ｘに非同時に照射されるように第２レーザ光Ｌ２の光路長を設定し、走査部４を作動させて第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２を試料Ｘにおいて走査させ、蛍光画像（第２画像）Ｂを取得する（非同時照明ステップＳ４、第２のステップ）。このとき、蛍光画像Ｂの信号強度は式（１）、（２）、（４）および式（５）から式（８）のようになる。
そして、処理装置６において、取得された蛍光画像Ａから蛍光画像Ｂを減算することにより、差分画像Ｃを生成する（演算ステップＳ５、第２のステップ）。差分画像Ｃの信号強度は、式（９）の通りとなる。

次に、λ／２板８を回転させて第１偏光ビームスプリッタ９でのレーザ光の分岐比率を調整し、第１レーザ光Ｌ１のみが試料Ｘに照射されるように設定する（ステップＳ６）。そして、走査部４の作動により、第１レーザ光Ｌ１を試料Ｘにおいて走査させ蛍光画像Ｄを取得する（第１のステップＳ７）。

蛍光画像Ｄには、第１焦点Ｐ１および領域Ｓからの蛍光信号が含まれている。また、第１偏光ビームスプリッタ９において２つに分岐されていたレーザ光を第１レーザ光Ｌ１のみに統合するため、第１焦点Ｐ１および領域Ｓにおける第１レーザ光Ｌ１の強度は、それぞれ２Ｉ_Ｆおよび２Ｉ_Ｓとなる。その結果、蛍光画像Ｄの信号強度は式（１０）のようになる。

処理装置６は、蛍光画像Ｄの信号強度を１／２倍して、蛍光画像Ｃを減算することにより差分画像Ｅを生成する（第３のステップＳ８）。差分画像Ｅの信号強度は式（９）および式（１０）から式（１１）のようになる。式（１１）には係数αの項のみが含まれており、係数β，γの項は除去されている。これにより、第１焦点Ｐ１からの蛍光信号のみを含む蛍光画像が生成されたことになる。

このように、本実施形態に係る画像取得装置１および画像取得方法によれば、焦点蛍光と焦点外蛍光とが混合された混合画像から、焦点蛍光のみを含む焦点蛍光画像を生成することができる。この時点で、他に観察を行う位置が残っている場合にはステップＳ１からの処理を繰り返す。

本実施形態に係る画像取得装置１および画像取得方法によれば、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の照射タイミングを切り替えることで、焦点外蛍光信号の強度が異なる２つの蛍光画像Ａ，Ｂを取得し、蛍光画像Ａ，Ｂ間で差分演算を行うことにより焦点外蛍光のみの差分画像Ｃを生成している。そして、焦点蛍光と焦点外蛍光とを含む蛍光画像Ｄと差分画像Ｃとの差分演算により焦点蛍光のみの差分画像Ｅを生成している。

これらの処理において焦点での集光分布を変調する等の動作を行っていないので、蛍光画像Ｄと差分画像Ｃとの差分演算時に焦点蛍光信号にロスを発生することがない。したがって、Ｓ／Ｎ比を低下させることなく、焦点蛍光画像を取得することができるという利点がある。

なお、本実施形態に係る画像取得装置１においては、第１偏光ビームスプリッタ９の前段に配置されたλ／２板８に代えて、λ／４板を採用してもよい。また、第２偏光ビームスプリッタ１１の後段に配置されたλ／４板１２に代えて、試料Ｘに偏光依存性がない場合には、λ／４板１２を取り除いて、第１レーザ光Ｌ１および第２レーザ光Ｌ２が直線偏光となるようにしてもよい。

また、図３のフローチャートにおいて、画像取得順序は限定されるものではなく、蛍光画像Ａ，Ｂを取得する前に蛍光画像Ｄを取得してもよい。また、ステップＳ２において第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との強度比率を１：１に設定することに代えて、それ以外の比率に設定し、係数γの項が除去できるような係数を乗算してから差分演算を行うことにしてもよい。また、蛍光画像Ｄの取得時に、第１レーザ光Ｌ１のみを照射することとしたが、第２レーザ光Ｌ２のみを照射することにしてもよい。

また、図４に示されるように、第１偏光ビームスプリッタ９と第２偏光ビームスプリッタ１１との間の第２レーザ光Ｌ２の光路に、第２レーザ光Ｌ２を強度変調してオンオフする光強度変調素子２３を配置してもよい。光強度変調素子２３としては、音響光学素子や電気光学素子を採用することができる。

このような構成の画像取得装置１による画像取得方法を図５に示されるフローチャートに従って説明する。
画像取得位置の設定（ステップＳ１）および第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２との強度比率を１：１となるようなλ／２板８の設定（第１のステップＳ２）は上記と同様である。この状態で、光強度変調素子２３を作動させて、第２レーザ光Ｌ２をオンオフさせる。

次に、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが同時に試料Ｘに照射される照射タイミングとなる状態で、蛍光画像を取得する。この際に、第２レーザＬ２光は、デューティ比１：１の矩形波形状でオンオフされるように時間周期的に強度が変調されており、画像取得の１ピクセル内に少なくとも強度変調の１周期が含まれるように画像取得速度や強度変調周波数が調節されている。

そして、第２レーザ光Ｌ２がオンの照射タイミングとオフの照射タイミングでそれぞれ蛍光検出を行い、オンの照射タイミングでの蛍光画像Ａとオフの照射タイミングでの蛍光画像Ａ′とをそれぞれ取得する（同時照明ステップＳ３′、第２のステップ）。

次に、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とが非同時に試料Ｘに照射される照射タイミングで、同様に、第２レーザ光Ｌ２がオンの照射タイミングでの蛍光画像Ｂとオフの照射タイミングでの蛍光画像Ｂ′とをそれぞれ取得する（非同時照明ステップＳ４′、第２のステップ）。蛍光画像Ａ，Ｂの蛍光強度は、式（７）および式（８）となる。一方、蛍光画像Ａ′，Ｂ′の取得時には、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２とは分岐したままの状態であるため、励起強度はＩ_Ｆ，Ｉ_Ｓとなり、蛍光強度は、式（１０）を１／４倍した値となる。
式（１０）の場合と比較して励起強度が１／２倍となるため、蛍光強度はその２乗の１／４倍となっている。

そして、上記と同様にして蛍光画像Ａから蛍光画像Ｂを減算することにより、式（９）の蛍光強度を有する焦点外蛍光画像Ｃが生成される（演算ステップＳ５、第２のステップ）。そして、蛍光画像Ａ′，Ｂ′を加算して焦点外蛍光画像Ｃを減算することにより、式（１１）の蛍光強度を有する焦点蛍光画像Ｅを取得することができる（第３のステップＳ８）。

すなわち、このようにすることで、第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の照射タイミングを同時または非同時に切り替えて画像取得する際に、強度変調によって第１レーザ光Ｌ１のみの画像も同時に取得することができる。光強度変調素子２３として電気光学素子を用いた場合には、強度変調速度が２軸のガルバノミラー１９の走査速度よりも圧倒的に早いので、実質的に２枚の画像取得時間で焦点蛍光画像を取得することができるという利点がある。

また、本実施形態に係る画像取得装置１においては、図６に示されるように、光路調整光学系１０に光路長変調素子２４を設け、光検出器２２からの信号をロックインアンプ（復調部）２５を通して処理することにしてもよい。光路長変調素子２４としては、例えば、ピエゾシェーカを採用することができる。光路長変調素子２４は、光路調整光学系１０を移動させて、第２レーザ光Ｌ２の光路の光路長を時間周期的に変動させるようになっている。このようにすることで、変復調技術を利用して、画像取得枚数２枚で焦点蛍光画像を取得することができる。

すなわち、図７のフローチャートで示すように、第２レーザ光Ｌ２の光路長を光路長変調素子２４の作動によって時間周期的に変調させて、ロックインアンプ２５から出力される復調信号に基づいて蛍光画像Ａを生成する。ロックインアンプ２５は光路長変調素子２４からの同期信号をリファレンス信号として作動し、光路長変調素子２４の変調周波数に同期して信号の復調を行う。

ロックインアンプ２５から出力される復調信号は、第２レーザ光Ｌ２のパルスタイミングが変化したことによる信号の変化分に等しく、すなわち、式（７）および式（８）の差分に他ならない。したがって、取得された蛍光画像Ａは式（９）により示される焦点外蛍光画像となっている。

この後に、λ／２板８を調整して第１レーザ光Ｌ１のみを試料Ｘに照射させ、ロックインアンプ２５による復調を行うことなく、光検出器２２により検出された信号を用いて蛍光画像Ｂを生成する。蛍光画像Ｂの蛍光強度は式（１０）に等しい。蛍光画像Ｂを１／２倍して蛍光画像Ａを減算することにより、式（１１）の差分画像Ｃ、すなわち焦点蛍光画像を生成することができる。

このようにすることで、焦点外蛍光画像の生成の際に、光路長変調素子２４による光路長の変調とロックインアンプ２５による信号の復調によって、直接的に焦点外蛍光画像を取得でき、それによって、画像取得枚数を２枚で済ませることができ、焦点蛍光画像の取得に要する時間を短縮することができるという利点がある。

また、上記各実施形態においては、第２レーザ光Ｌ２の光路長の切替によって、同時照射と非同時照射とを切り替えることとしたが、これに代えて、図８に示されるように、別々のレーザ光源２６，２７から射出される第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の繰り返し周波数をわずかに異ならせておくことにしてもよい。この場合には、各レーザ光源２６，２７の同期信号をミキサ２８に入力して繰り返し周波数の差の周波数の同期信号をロックインアンプ２５に出力してリファレンス信号として利用すればよい。

第１レーザ光Ｌ１と第２レーザ光Ｌ２の繰り返し周波数がわずかに異なるため、その照射タイミングが周期的にずれ、繰り返し周波数の差分の周期で同時照射と非同時照射とを繰り返すようになる。すなわち、ピエゾシェーカ２４で第２レーザ光Ｌ２の光路長を変調した場合と同様の効果を得ることができる。したがって、図８の画像取得装置１によっても画像取得枚数を２枚として、焦点蛍光画像を取得することができる。なお、非線形光学過程で蛍光を発生させることができれば、第１レーザ光Ｌ１の波長と第２レーザ光Ｌ２の波長とは異なっていてもよい。

以上、本発明のいくつかの実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
例えば、走査部４として２軸のガルバノミラー１９を用いたものを例示したが、ステージ走査によって画像を取得する方式を採用してもよい。

また、上記実施形態においては、２光子励起顕微鏡について説明したが、非線形光学過程を利用した走査型顕微鏡であれば、例えば、ＳＨＧ顕微鏡のような他の方式の顕微鏡についても本発明を適用することができる。

１ 画像取得装置
２，２６，２７ 光源（レーザ光源）
３ 照明光学系
４ 走査部
５ 検出光学系
６ 処理装置（画像生成部）
２３ 光強度変調素子
２４ 光路長変調素子
２５ ロックインアンプ（復調部）
Ｓ２，Ｓ７ 第１のステップ
Ｓ３，Ｓ３′，Ｓ４，Ｓ４′，Ｓ５ 第２のステップ
Ｓ８ 第３のステップ
Ｓ３，Ｓ３′ 同時照明ステップ
Ｓ４，Ｓ４′ 非同時照明ステップ
Ｓ５ 演算ステップ
Ａ 蛍光画像（第１画像）
Ｂ 蛍光画像（第２画像）
Ｌ１，Ｌ２ レーザ光（照明光）
Ｘ 試料

Claims (16)

1. 光源から発せられたパルス状の照明光を試料に集光させて走査し、各走査位置において非線形光学過程により発生した信号光を検出し、検出された該信号光に基づいて前記試料の画像を生成する画像取得方法であって、
   前記試料における前記照明光の焦点位置において発生する焦点信号光と、焦点位置以外の位置において発生する焦点外信号光の両方を含む混合画像を取得する第１のステップと、
   前記焦点外信号光の強度が異なる複数の前記混合画像に基づいて前記焦点外信号光の画像を取得する第２のステップと、
   前記第１のステップにおいて取得された前記混合画像から前記第２のステップにおいて取得された前記焦点外信号光の画像を減算して前記焦点信号光の画像を取得する第３のステップとを含む画像取得方法。
2. 前記第２のステップが、
   ２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に同時に集光して前記試料の第１画像を生成する同時照明ステップと、
   ２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に非同時に集光して前記試料の第２画像を生成する非同時照明ステップと、
   前記同時照明ステップにおいて生成された前記第１画像と前記非同時照明ステップにおいて生成された前記第２画像とに基づいて前記焦点外信号光の画像を取得する演算ステップとを含む請求項１に記載の画像取得方法。
3. 前記演算ステップが、前記同時照明ステップにおいて生成された前記第１画像から前記非同時照明ステップにおいて生成された前記第２画像を減算する請求項２に記載の画像取得方法。
4. 前記第１のステップが、いずれか一方の前記照明光を遮断した状態で検出された前記信号光に基づいて前記混合画像を生成する請求項２または請求項３に記載の画像取得方法。
5. 前記同時照明ステップと前記非同時照明ステップとが、２つの前記照明光の光路長が等しい状態と異なる状態とで時間周期的に切り替えることにより実施される請求項２から請求項４のいずれかに記載の画像取得方法。
6. ２つの前記照明光として、繰り返し周波数の異なる照明光を採用する請求項２から請求項４のいずれかに記載の画像取得方法。
7. 前記第２のステップが、検出された前記信号光を時間周期的に復調した復調信号に基づいて前記焦点外信号光画像を生成する請求項５または請求項６に記載の画像取得方法。
8. 前記非線形光学過程が多光子吸収過程であり、
   前記照明光が極短パルスレーザ光であり、
   前記信号光が蛍光である請求項１から請求項７のいずれかに記載の画像取得方法。
9. 光源から発せられたパルス状の照明光を走査する走査部と、
   該走査部により走査される前記照明光を試料に照射する照明光学系と、
   該照明光学系による前記照明光の前記試料における照射位置において前記非線形光学過程で発生した信号光を検出する検出光学系と、
   該検出光学系により検出された前記信号光に基づいて信号光画像を生成する画像生成部とを備え、
   該画像生成部が、前記試料における前記照明光の焦点位置以外の位置において発生した焦点外信号光の強度が異なる複数の画像から焦点外信号光画像を生成し、前記試料における前記照明光の焦点位置において発生した焦点信号光および前記焦点外信号光の両方を含む混合画像から前記焦点外信号光画像を減算して焦点信号光画像を生成する画像取得装置。
10. 前記画像生成部が、２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に同時に集光して前記試料の第１画像を生成し、２つのパルス状の前記照明光を前記試料の異なる位置に非同時に集光して前記試料の第２画像を生成し、前記第１画像と前記第２画像とに基づいて前記焦点外信号光画像を取得する請求項９に記載の画像取得装置。
11. 前記画像生成部が、前記第１画像から前記第２画像を減算して前記焦点外信号光画像を取得する請求項１０に記載の画像取得装置。
12. ２つの前記照明光の一方の光路に、該光路を通過する前記照明光の強度を変調する光強度変調素子を備え、
    前記画像生成部が、前記光強度変調素子により一方の光路を通過する前記照明光を他方の光路を通過する前記照明光と等しい強度に設定したときに検出された前記信号光に基づいて前記焦点外信号光画像を生成し、前記光強度変調素子により一方の光路を通過する前記照明光を遮断したときに検出された前記信号光に基づいて前記混合画像を生成する請求項１０または請求項１１に記載の画像取得装置。
13. ２つの前記照明光の一方の光路に、前記光路を通過する前記照明光の光路長を時間周期的に変調する光路長変調素子を備え、
    前記画像生成部が、前記光路長変調素子により２つの前記照明光の光路長が等しくされたときに検出された前記信号光に基づいて前記第１画像を生成し、２つの前記照明光の光路長が異ならされたときに検出された前記信号光に基づいて前記第２画像を生成する請求項１０から請求項１２のいずれかに記載の画像取得装置。
14. 前記画像生成部は、繰り返し周波数が異なる２つのパルス状の前記照明光を前記試料に照射することにより、２つの前記照明光を同時に前記試料に集光する状態と２つの前記照明光を非同時に前記試料に集光する状態とを時間周期的に切り替える請求項１０または請求項１１に記載の画像取得装置。
15. 検出された前記信号光を時間周期的に復調する復調部を備え、
    前記画像生成部が、該復調部により復調された復調信号を用いて前記焦点外信号光画像を生成する請求項１３または請求項１４に記載の画像取得装置。
16. 前記非線形光学過程が多光子吸収過程であり、
    前記照明光が極短パルスレーザ光であり、
    前記信号光が蛍光である請求項９から請求項１５のいずれかに記載の画像取得装置。

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