JP6720165B2 - 画像取得装置および画像取得方法 - Google Patents
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Description
また、DMDの変わりにEOMのような高速変調可能なデバイスを使用すれば上記課題を解決することができるが、多重数分の変調デバイスが必要となるためシステムが非常に高価になるという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、多重数分のデバイスを必要とすることなくフレームレートを向上することができる画像取得装置および画像取得方法を提供することを目的としている。
また、上記態様においては、前記非変調照明光に対応する前記復調信号と前記合成信号との積の時間積分が前記合成信号の時間積分であってもよい。
このようにすることで、複数の変調器によって、相互に直交する復調信号を有する2以上の照明光を生成することができ、直交性を有する復調信号を用いることによって得られる信号量が増加し、フレームレートをさらに向上することができる。
本実施形態に係る画像取得装置1は、多光子励起型の走査型蛍光顕微鏡であって、図1に示されるように、一定のピーク強度を有する極短パルスレーザ光を所定時間間隔で射出する光源2と、該光源2からの光から相互に一次独立なパターンを有し、変調された変調照明光と変調されていない非変調照明光とを含む2つの照明光L1,L2を生成する照明光生成部3と、生成された複数の照明光L1,L2を試料Aの異なる位置に照射する照明光学系4と、照明光L1,L2の複数の照射位置において発生した蛍光(信号光)の合成蛍光(合成信号光)を検出して合成信号を出力する光検出部5と、出力された合成信号から、各照射位置において発生した蛍光を復調する復調部(信号光復調部)6とを備えている。
これにより、2つの光路を通過した変調パターンの照明光L1と変調を受けていないパターンの照明光L2とは、相互に一次独立なパターンで時間変化する強度を有するようになる。
照明光学系4のリレーレンズ15a,15bと対物レンズ16との間には、照明光L1,L2を透過し、蛍光を反射する特性を有するダイクロイックミラー17が配置されている。光検出部5は、例えば、光電子増倍管等の光検出器5aと、該光検出器5aにより検出された蛍光の強度信号を増幅する増幅器5bとを備えている。
また、露光時間をパルス4つ分とすると、照明光L1に対応する露光時間中の蛍光信号の時系列データD1は(0,α,0,α)となる。一方、照明光L2に対応する露光時間中の蛍光信号の時系列データD2は(β,β,β,β)となる。そのため合成蛍光信号の時系列データDはD=D1+D2=(β,α+β,β,α+β)となる。
本実施形態に係る画像取得方法は、図3に示されるように、光源2から射出された極短パルスレーザ光から、相互に一次独立なパターンを有する複数の照明光L1,L2を生成する照明光生成ステップS1と、生成された複数の照明光L1,L2を試料Aの異なる位置に照射する照射ステップS2と、照明光L1,L2が照射された複数の照射位置において発生した蛍光が合成された合成蛍光を検出する光検出ステップS3と、検出された合成蛍光から、各照明光L1,L2のパターンに同期する復調信号を用いて、各照射位置において発生した蛍光を復調する蛍光復調ステップ(信号光復調ステップ)S4とを含んでいる。
そして、多重化された2つの照明光L1,L2を試料Aに同時に照射するので、スキャナ14によって2つの照明光L1,L2のスポットを試料Aにおいて走査することによりサンプルにおける二つの異なる領域を同時にイメージングすることができるため、多重数分のデバイスを必要とすることなく観察範囲の画像を取得するフレームレートを2倍に向上することができるという利点がある。
また、この場合、光源2としては一定の強度を有する連続光を射出するものを採用すればよい。
また、変調器として電気光学変調器8を例示したが、これに代えて音響光学変調器等の変調器を採用してもよい。
また、レンズ9a,9bを光軸に沿う方向に移動可能に設け、光軸に沿ってレンズ9a,9bを移動させることにより、試料Aにおける各集光点のZ方向位置を調整するようにしてもよい。
3つの光路への分岐は、光源2からの光を照明光L1,L2の光路と照明光L3の光路とに分岐するビームスプリッタ7aと、ビームスプリッタ7aの下流側に配置され、分岐された照明光L1,L2の光路を照明光L1の光路と照明光L2の光路とにさらに分岐するビームスプリッタ7bとによりなされる。3つの光路には、結像レンズ9a,9b,9cがそれぞれ配置されている。
1つの光路には電気光学変調器8がなく、他の2つの光路には、相互に直交する変調パターンの照明光(変調照明光)L1,L2を生成する電気光学変調器(変調器)8a,8bをそれぞれ配置している。
照明光L1のパルス一つに対応する蛍光信号をα、照明光L2のパルス一つに対応する蛍光信号をβ、照明光L3のパルス一つに対応する蛍光信号をγとする。
照明光L1のパルス一つに対応する蛍光信号をα、照明光L2のパルス一つに対応する蛍光信号をβ、照明光L3のパルス一つに対応する蛍光信号をγとする。
この場合に、信号制御部12は、音響光学偏向素子23のドライバ28を制御して、2つの変調パターンの光L2a,L2bの周波数を任意に調節することができ、周波数に応じて射出方向が異なることを利用して試料Aにおける照明光L2の照射位置を音響光学偏向素子23の電気的な制御によって任意に調節することができる。
例えば、図11に示される例では、2組の音響光学偏向素子23a,23b、レンズ24a,24b、プリズム25a,25b、ミラー26およびビームスプリッタ27a,27bを利用している。
このようにすることで、4つの照明光L1からL4を多重化して試料Aに照射し、さらにフレームレートを向上することができるという利点がある。
すなわち、電気光学変調器8からは、位相が反転した2つの照明光L1,L2が射出されるので、一方の照明光L2の光路長を調節してレーザ光の発振周期の半分の時間遅延を与えることで、検出タイミングが異なる、照明光L1,L2を生成することができる。また、電気光学変調器8を有しない光路にビームスプリッタ30を配置して分岐し、分岐された光の光路長を調節してレーザ光の発振周期の半分の時間遅延を与えることで、検出タイミングが異なる照明光L3,L4を生成することができる。
そして、電気光学変調器8により50%デューティに変調すると、図13Bおよび図13Gに示される40MHzでオンオフされる第1の照明光L1と、図13Cおよび図13Hに示される位相が反転した第2の照明光L2の2つの照明光L1,L2が生成される。
一方、電気光学変調器8を有しない光路を通過する光がビームスプリッタ30により分岐されることにより、図13D、図13E、図13Iおよび図13Jに示されるように、周波数80MHzでオンオフされる第3、第4の照明光L3,L4が生成される。
なお、擬似的なシート状の照明光に代えて、シリンドリカルレンズを用いて生成されたシート状の照明光を採用してもよい。
2 光源
3 照明光生成部
4 照明光学系
5 光検出部
6 復調部(信号光復調部)
7,7a,7b 第1ビームスプリッタ(光分岐部)
8,8a,8b 電気光学変調器(変調器)
S1 照明光生成ステップ
S2 照射ステップ
S3 光検出ステップ
S4 蛍光復調ステップ(信号光復調ステップ)
L1,L2,L2a,L2b,L3,L4 照明光の主光線
A 試料
Claims (7)
- 複数の領域を同時に照明しながら、各々の照明領域に対応する局所信号を分離して取得する画像取得装置であって、
光源から射出された光の強度を変調し相互に一次独立なパターンを有し、変調された変調照明光と変調されていない非変調照明光とを含む複数の照明光を生成する照明光生成部と、
該照明光生成部により生成された複数の前記照明光を試料の異なる位置に照射する照明光学系と、
該照明光学系により前記照明光が照射された複数の照射位置において発生した信号光が合成された合成信号光を検出して合成信号を出力する光検出部と、
該光検出部により出力された前記合成信号から、前記変調照明光に対応した復調信号と前記合成信号との積の時間積分を用いて前記変調照明光に対応する変調局所信号を分離し、前記合成信号の時間積分から前記変調局所信号の総和を差分して前記非変調照明光に対応する非変調局所信号を分離する復調部とを備える画像取得装置。 - 前記変調照明光に対応しない前記復調信号と前記変調照明光に対応しない前記変調局所信号および前記非変調局所信号との積の時間積分がゼロである請求項1に記載の画像取得装置。
- 前記非変調照明光に対応する前記復調信号と前記合成信号との積の時間積分が前記合成信号の時間積分である請求項2に記載の画像取得装置。
- 前記照明光生成部が生成した複数の前記照明光の少なくとも一つの光路に光の強度を変調する変調器を備える請求項1から請求項3のいずれかに記載の画像取得装置。
- 前記変調器を2以上備え、
各該変調器が、相互に直交する前記復調信号を有する前記変調照明光をそれぞれ生成する請求項4に記載の画像取得装置。 - 複数の前記照射位置を前記試料中の任意位置に配置する機能を有する請求項1から請求項3のいずれかに記載の画像取得装置。
- 光源から射出された光の強度を変調し相互に一次独立なパターンを有し、変調された変調照明光と変調されていない非変調照明光とを含む複数の照明光を生成する照明光生成ステップと、
該照明光生成ステップにより生成された複数の前記照明光を試料の異なる位置に照射する照射ステップと、
該照射ステップにより前記照明光が照射された複数の照射位置において発生した信号光が合成された合成信号光を検出して合成信号を出力する光検出ステップと、
該光検出ステップにより出力された前記合成信号から、前記変調照明光に対応した復調信号と前記合成信号との積の時間積分を用いて前記変調照明光に対応する変調局所信号を分離し、前記合成信号の時間積分から前記変調局所信号の総和を差分して前記非変調照明光に対応する非変調局所信号を分離する信号光復調ステップとを含む画像取得方法。
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