JP5568991B2 - 走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、光の振幅と位相を独立して制御可能な光学素子を走査型顕微鏡に用いる場合に、より画質のよい観察画像を得ることができるようにした走査型顕微鏡に関する。

近年、生物顕微鏡の分野では、非線形効果を利用した顕微鏡が注目を浴びている。なかでも、多光子励起を利用した走査型顕微鏡は拡散に強く、試料の深い部位まで観察することができるため、ユーザからの需要が増加している（例えば、特許文献１参照）。例えば、このような走査型顕微鏡を用いれば、これまで観察の難しかった脳などの拡散の大きい試料の観察が可能となる。

通常、走査型顕微鏡では、走査した光を非走査光に変え、ピンホールを通過させて共焦点効果を得ることにより、光軸方向の分解能が得られる。これに対して、多光子励起を利用した走査型顕微鏡では、試料における励起光の集光位置の部位だけが励起されるので、ピンホールを用いなくても光軸方向の分解能を得ることができる。

多光子励起では、一般的に、光源としてＩＲパルスレーザが用いられる。ＩＲパルスレーザから射出される励起光（赤外光）の波長帯域は、略700乃至1000nmとされ、励起光の波長を自由に変化させることが可能とされている。

ところが、ＩＲパルスレーザからの励起光は、レンズなどの媒質を通過するときに群速度分散が生じてパルスが広がり、励起光の強度（ピーク）が低くなる。励起光の強度が低くなると、多光子励起が生じる確率が低下するため、励起光のパワーに比べて暗い画像しか得られなくなってしまう。

そのため、プリチャープと呼ばれるプリズムや回折格子のペアを用いて、励起光に予め負の分散を与えておくことで、レンズなどの媒質を通過するときの分散を補償させる方法が一般的に用いられている。また、多光子励起を利用した走査型顕微鏡では、音響光学素子などを励起光の光路に設け、負の分散が与えられた励起光の光量を調節することもある。

さらに、近年、音響光学プログラマブル分散フィルタと呼ばれる光学素子が開発されている。この光学素子は、プリチャープと音響光学素子の両方の機能を備えているため、多光子励起の走査型顕微鏡に利用すれば、励起光の分散と光量の調整を１つの素子で行うことができるようになる。

特許第２８４８９５２号公報

しかしながら、音響光学プログラマブル分散フィルタは、時間的に連続して使用することができないため、音響光学プログラマブル分散フィルタを走査型顕微鏡に利用した場合、試料の観察に支障をきたすことになる。

具体的には、音響光学プログラマブル分散フィルタは、有効に動作して励起光の分散と光量を調整すると、その後、有効に動作できない期間が生じる。つまり、有効に動作する期間と有効に動作しない期間とが繰り返され、試料の観察中において、半分程度の時間しか、充分なパワーの励起光を試料に照射することができなくなる。

そうすると、走査型顕微鏡において試料を観察して得られる観察画像には、試料の画像が表示されない領域が生じ、観察画像の画質が劣化してしまう。また、音響光学プログラマブル分散フィルタの動作に合わせて走査型顕微鏡の各部を動作させると、試料観察の時間効率や、励起光の高速走査に支障をきたすことになる。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、試料に照射する光の振幅と位相を独立して制御可能な光学素子を走査型顕微鏡に用いる場合に、より画質のよい観察画像を得ることができるようにするものである。

本発明の走査型顕微鏡は、観察対象の試料上で光を走査させる走査型顕微鏡であって、前記光の振幅および位相を独立に制御可能であり、動作可能な期間と動作できない期間が生じる光学素子を複数と、前記走査が実行されている間の各時刻において、前記複数の光学素子のうちの少なくとも何れかが、前記光の振幅および位相を制御可能に動作するように前記複数の光学素子の動作を制御する制御手段と、前記複数の光学素子のうち、少なくとも前記光の振幅および位相を制御可能に動作している前記光学素子に、前記光を入射させる偏向手段と、前記複数の光学素子から射出された前記光が、同一光路を通って前記試料に照射されるように、前記光学素子からの前記光を合成する合成手段とを備える。

本発明によれば、試料に照射する光の振幅と位相を独立して制御可能な光学素子を走査型顕微鏡に用いる場合に、より画質のよい観察画像を得ることができる。

本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。 調整部の構成例を示す図である。 合成素子の構成例を示す図である。 各分散フィルタの有効期間と無効期間について説明する図である。 調整部の他の構成例を示す図である。 調整部の他の構成例を示す図である。

以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。

［走査型顕微鏡の構成］
図１は、本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。

走査型顕微鏡１１は、観察対象の試料１２に光を照射して、試料１２の観察画像を得るためのものである。すなわち、走査型顕微鏡１１には、パルス状の赤外光を射出するＩＲパルスレーザ２１が設けられており、ＩＲパルスレーザ２１からの赤外光は調整部２２により、振幅および位相が調整されてコンフォーカルヘッド２３に入射する。

そして、調整部２２からコンフォーカルヘッド２３に入射した赤外光は、コンフォーカルヘッド２３により偏向され、第２対物レンズ２４、ダイクロイックミラー２５、および対物レンズ２６を介して試料１２に照射される。

コンフォーカルヘッド２３内部には、ミラー２７、ダイクロイックミラー２８、ガルバノスキャナ２９、および瞳投影レンズ３０が設けられている。ＩＲパルスレーザ２１からコンフォーカルヘッド２３内部に入射した赤外光は、ミラー２７において反射されて、さらにダイクロイックミラー２８で反射され、ガルバノスキャナ２９に入射する。

そして、ガルバノスキャナ２９に入射した赤外光は、ガルバノスキャナ２９により偏向され、瞳投影レンズ３０により集光されて第２対物レンズ２４乃至対物レンズ２６を介して試料１２に照射される。つまり、赤外光は、ガルバノスキャナ２９により試料１２の観察面上で走査される。なお、図１において、矢印Ｚ１１は、対物レンズ２６に入射する赤外光の一次像面の位置を示している。

また、例えば、ＩＲパルスレーザ２１からの赤外光が、多光子励起によるイメージングに用いられる場合、赤外光が試料１２に照射されると、試料１２からは多光子励起により蛍光が発現する。この蛍光は観察光であり、対物レンズ２６を通ってダイクロイックミラー２５で反射され、レンズ３１およびレンズ３２により集光されて、ディテクタ３３に入射する。

ディテクタ３３は、入射した観察光を受光して光電変換し、その結果得られた電気信号を出力する。この電気信号は、図示せぬコンピュータ等に供給され、コンピュータはこの電気信号に基づいて、試料１２の観察画像を生成する。

また、ＩＲパルスレーザ２１からの赤外光が、試料１２のスペクトル解析等に利用される場合、赤外光が試料１２に照射されて生じた蛍光（観察光）は、対物レンズ２６乃至第２対物レンズ２４、および瞳投影レンズ３０を介してガルバノスキャナ２９に入射する。

そして、この観察光は、ガルバノスキャナ２９によりデスキャンされてダイクロイックミラー２８を透過し、集光レンズ３４により集光される。集光レンズ３４により集光された観察光は、ピンホール３５を通ってディテクタ３６に受光される。ディテクタ３６は、入射した観察光を受光して光電変換し、その結果得られた電気信号を、図示せぬコンピュータに供給する。この電気信号は、観察光（蛍光）のスペクトル分析等に利用される。

［調整部の構成］
また、図１の調整部２２では、赤外光の位相と振幅をそれぞれ独立に調整することができるようにされており、調整部２２は、例えば図２に示すように構成される。

すなわち、調整部２２は、音響光学素子６１、分散フィルタ６２−１乃至分散フィルタ６２−３、および合成素子６３から構成される。

音響光学素子６１は、ＩＲパルスレーザ２１から入射した赤外光を偏向させて、赤外光を分散フィルタ６２−１乃至分散フィルタ６２−３の何れかに入射させる。

分散フィルタ６２−１乃至分散フィルタ６２−３は、例えば、赤外光の位相と振幅をそれぞれ独立して制御可能な音響光学プログラマブル分散フィルタからなり、音響光学素子６１から入射した赤外光の振幅と位相を整形し、合成素子６３に入射させる。すなわち、赤外光の位相が調整されることで赤外光に負の分散が与えられ、それとは独立して赤外光の振幅（強度）が適度な大きさとなるように調整される。なお、以下、分散フィルタ６２−１乃至分散フィルタ６２−３を個々に区別する必要のない場合、単に分散フィルタ６２とも称する。

合成素子６３は、分散フィルタ６２から入射した赤外光が同一光路を通って試料１２に照射されるように、赤外光を合成し、コンフォーカルヘッド２３へと入射させる。なお、より詳細には、各時刻において、３つの分散フィルタ６２のうちの何れか１つから合成素子６３に赤外光が入射するので、合成素子６３は、入射した赤外光をコンフォーカルヘッド２３に入射させる。

［合成素子の構成］
また、合成素子６３は、具体的には、例えば図３に示すように複数のミラー等から構成される。なお、図３において、図２における場合と対応する部分には同じ符号を付してあり、その説明は適宜省略する。

図３の例では、合成素子６３は、ミラー９１、ハーフミラー９２、ハーフミラー９３、およびミラー９４から構成される。分散フィルタ６２−１から射出された赤外光は、ミラー９１により反射され、さらにハーフミラー９２により反射されてハーフミラー９３を透過し、コンフォーカルヘッド２３に入射する。

また、分散フィルタ６２−２から射出された赤外光は、ハーフミラー９２を透過し、さらにハーフミラー９３を透過してコンフォーカルヘッド２３に入射する。分散フィルタ６２−３から射出された赤外光は、ミラー９４により反射され、さらにハーフミラー９３により反射されてコンフォーカルヘッド２３に入射する。

このように、各分散フィルタ６２から射出された赤外光の光路は、ミラー９１乃至ミラー９４により適宜偏向され、これらの赤外光は同じ出射角度で合成素子６３から出射する。

［分散フィルタの説明］
ところで、ＩＲパルスレーザ２１から射出された赤外光の振幅と位相は、分散フィルタ６２において、任意に制御することができる。

例えば、赤外光に負の分散が与えられるように、つまり赤外光のパルスの広がり（パルス幅）がより小さくなるように赤外光の位相を調整し、かつ赤外光の振幅を適度な大きさに調整すれば、適切な分散および強度（振幅）の赤外光を試料１２に照射することができる。すなわち、コンフォーカルヘッド２３内の光学系や、第２対物レンズ２４乃至対物レンズ２６で生じる赤外光の分散を補償することができる。

このように、赤外光の振幅および位相を分散フィルタ６２により調整すれば、試料１２への照射時における赤外光のエネルギー効率をより高めることができる。これにより、より高い確率で試料１２における多光子励起を発生させることができ、より確実に試料１２の観察を行うことができるようになる。

しかしながら、分散フィルタ６２は、その性質上、常に赤外光の振幅および位相が整形されるように動作することはできない。

ここで、赤外光の振幅および位相が整形されるように動作可能な期間を有効期間と呼び、赤外光の振幅および位相が整形されるように動作できない期間を無効期間と呼ぶこととすると、無効期間は、有効期間とほぼ同じ長さとなる。また、１つの分散フィルタ６２を動作させた場合、有効期間と無効期間が交互に繰り返し生じることになる。

例えば、走査型顕微鏡に、１つの分散フィルタを設け、その分散フィルタにより赤外光の振幅および位相を調整するとする。そして、観察対象の試料上で赤外光を走査させて、５１２画素×５１２画素からなる試料の観察画像が１秒間で得られるように走査型顕微鏡を動作させるとする。

このような場合、観察画像の１ライン分の画像が約１／５００秒で取得されることになる。つまり、約１／５００秒の間に、１ラインに相当する試料の観察面の各領域に対して、赤外光が照射されることになる。

通常、分散フィルタの有効期間と無効期間の繰り返しの周波数は３０ｋＨｚ程度であるので、１つの分散フィルタを用いて赤外光の振幅と位相の調整を行うと、１ライン分の画像を取得する期間には、約６０（＝30000×（1/500））回の無効期間が含まれることになる。すなわち、観察画像の１ラインには、約６０箇所だけ、何も表示されない箇所（試料が表示されない箇所）が生じることになり、観察画像の画質が劣化してしまう。

そこで、走査型顕微鏡１１では、赤外光の振幅と位相を制御する光学素子として、３つの分散フィルタ６２を設け、例えば図４に示すように、各時刻において、３つの分散フィルタ６２のうちの何れかが有効に動作するように、調整部２２により分散フィルタ６２の動作が制御される。

なお、図４において、横方向は時間を示しており、矢印Ｆ１１乃至Ｆ１３は、分散フィルタ６２−１乃至分散フィルタ６２−３の有効期間および無効期間を示している。すなわち、矢印Ｆ１１乃至Ｆ１３により示される矩形波の上に突の期間は、有効期間を示しており、下に突の期間は無効期間を示している。

図４の例では、３つの分散フィルタ６２の何れかが有効期間となっている間は、他の２つの分散フィルタ６２は、ほぼ無効期間となっており、各分散フィルタ６２は、有効期間と無効期間が交互に繰り返されるように、調整部２２により動作が制御されている。また、各分散フィルタ６２における有効期間と無効期間の繰り返しのタイミングは、それぞれ１／３周期ずつずらされている。

例えば、時刻ｔ１から時刻ｔ２の期間は、分散フィルタ６２−１だけが有効に動作しており、他の分散フィルタ６２は殆ど有効に動作していない。また、時刻ｔ２から時刻ｔ３の期間は、分散フィルタ６２−２だけが有効に動作しており、時刻ｔ３から時刻ｔ４の期間は、分散フィルタ６２−３だけが有効に動作している。

このように、調整部２２は、各時刻において何れかの分散フィルタ６２が有効に動作するように、つまり各分散フィルタ６２の有効期間にずれが生じるように分散フィルタ６２の動作を制御する。そして、調整部２２は、有効に動作している分散フィルタ６２に赤外光が入射するように音響光学素子６１の動作を制御する。

具体的には、時刻ｔ１から時刻ｔ２の間は、分散フィルタ６２−１に赤外光が入射し、時刻ｔ２から時刻ｔ３の間は、分散フィルタ６２−２に赤外光が入射し、時刻ｔ３から時刻ｔ４の間は、分散フィルタ６２−３に赤外光が入射するようにされる。また、時刻ｔ４から時刻ｔ５の間は、再び分散フィルタ６２−１に赤外光が入射するようにされる。

つまり、分散フィルタ６２−１、分散フィルタ６２−２、分散フィルタ６２−３の順番で、繰り返しそれらの分散フィルタ６２に赤外光が入射するように、赤外光の光路が偏向される。

このように、有効に動作している分散フィルタ６２に赤外光が入射するように、音響光学素子６１の動作を制御することで、合成素子６３から、常に振幅と位相が適切に調整された赤外光が射出されるようにすることができる。これにより、常に、試料１２に振幅と位相が適切に調整された赤外光を照射することができ、各時刻において、より確実に試料１２での多光子励起を発生させ、より画質のよい観察画像を得ることができる。

また、赤外光の走査等の走査型顕微鏡１１全体の動作を、分散フィルタ６２の動作に合わせる必要がなくなるため、時間的により効率よく試料１２を観察できるだけでなく、赤外光の走査もより高速に行うことができる。

［変形例１］
なお、以上においては、音響光学素子６１を用いて、有効に動作している分散フィルタ６２に赤外光を入射させる例について説明したが、図５に示すように、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ（Polarizing Beam Splitter））等の光学素子が用いられるようにしてもよい。

図５の例では、調整部２２は、分散フィルタ６２−１、分散フィルタ６２−２、偏光ビームスプリッタ１１１、ミラー１１２、ミラー１１３、および偏光ビームスプリッタ１１４から構成される。なお、図５において、図３における場合と対応する部分には同一の符号を付しており、その説明は適宜、省略する。

ＩＲパルスレーザ２１から射出された赤外光は、偏光ビームスプリッタ１１１に入射し、分離される。例えば、偏光ビームスプリッタ１１１には偏光面が設けられており、入射した赤外光のＰ偏光の成分は、偏光面をそのまま透過して分散フィルタ６２−１に入射する。そして、分散フィルタ６２−１に入射した赤外光は、分散フィルタ６２−１において振幅と位相が調整されて偏光ビームスプリッタ１１４を透過し、コンフォーカルヘッド２３へと入射する。

これに対して、偏光ビームスプリッタ１１１に入射した赤外光のＳ偏光の成分は、偏光ビームスプリッタ１１１の偏光面において反射し、ミラー１１２に入射する。そして、ミラー１１２に入射した赤外光は、ミラー１１２で反射して分散フィルタ６２−２に入射し、分散フィルタ６２−２で振幅と位相が調整され、ミラー１１３に入射する。ミラー１１３に入射した赤外光は、ミラー１１３で反射し、さらに偏光ビームスプリッタ１１４の偏光面で反射して、コンフォーカルヘッド２３へと入射する。

このように、図５の調整部２２では、偏光ビームスプリッタ１１１を利用して、赤外光を成分ごとに分離し、分散フィルタ６２に入射させる。そして、振幅および位相が調整された赤外光を、偏光ビームスプリッタ１１４を用いて合成し、射出する。これにより、分散フィルタ６２−１からの赤外光と、分散フィルタ６２−２からの赤外光との光路が同一光路となるように、それらの赤外光を合成することができる。

なお、図５では、赤外光が成分ごとに分離されるため、分散フィルタ６２−１と分散フィルタ６２−２には、常に赤外光が入射することになるが、各時刻において、分散フィルタ６２−１と分散フィルタ６２−２の何れか一方だけが有効期間となるように制御される。

この場合、有効に動作していない、つまり無効期間である分散フィルタ６２では、入射した赤外光は、有効に動作しているときとは異なる角度で射出されるため、無効期間中の分散フィルタ６２に入射した赤外光は、コンフォーカルヘッド２３には入射しない。すなわち、２つの分散フィルタ６２のうち、有効に動作しているものから射出された赤外光のみがコンフォーカルヘッド２３に入射されることになる。

このように、偏光ビームスプリッタを利用して、複数の分散フィルタ６２に赤外光を入射させることによっても、常に振幅と位相が適切に調整された赤外光を試料１２に照射することができるようになり、より画質のよい観察画像を得ることができる。

［変形例２］
また、偏光ビームスプリッタではなく、ハーフミラーを利用して赤外光が分岐されるようにしてもよい。図６は、ハーフミラーを利用する場合における調整部２２の構成例を示す図である。

図６では、調整部２２は、分散フィルタ６２−１、分散フィルタ６２−２、ハーフミラー１４１、ミラー１４２、ミラー１４３、およびハーフミラー１４４から構成される。なお、図６において、図３における場合と対応する部分には同一の符号を付しており、その説明は適宜、省略する。

ＩＲパルスレーザ２１からハーフミラー１４１に入射した赤外光は、その一部がそのままハーフミラー１４１を透過して分散フィルタ６２−１に入射し、残りの赤外光はハーフミラー１４１で反射してミラー１４２に入射する。

ハーフミラー１４１から分散フィルタ６２−１に入射した赤外光は、分散フィルタ６２−１において振幅と位相が調整されてハーフミラー１４４を透過し、コンフォーカルヘッド２３へと入射する。

これに対して、ハーフミラー１４１からミラー１４２に入射した赤外光は、ミラー１４２で反射して分散フィルタ６２−２に入射する。そして、分散フィルタ６２−２に入射した赤外光は、分散フィルタ６２−２で振幅と位相が調整され、ミラー１４３で反射し、ハーフミラー１４４に入射する。さらにハーフミラー１４４に入射した赤外光は、ハーフミラー１４４で反射され、コンフォーカルヘッド２３へと入射する。

このように、図６の調整部２２では、ハーフミラー１４１を利用して赤外光を分岐させ、２つの分散フィルタ６２に入射させる。そして、振幅および位相が調整された赤外光を、ハーフミラー１４４を用いて合成し、射出する。これにより、分散フィルタ６２−１からの赤外光と、分散フィルタ６２−２からの赤外光との光路が同一光路となるように、それらの赤外光を合成することができる。

なお、図６においても、図５の場合と同様に、常に分散フィルタ６２−１と分散フィルタ６２−２に赤外光が入射することになるが、各時刻において、分散フィルタ６２−１と分散フィルタ６２−２の何れか一方だけが有効期間となるように制御される。

この場合、有効に動作していない分散フィルタ６２では、入射した赤外光は、有効に動作しているときとは異なる角度で射出され、無効期間中の分散フィルタ６２に入射した赤外光は、コンフォーカルヘッド２３には入射しない。

このように、ハーフミラーを利用して、複数の分散フィルタ６２に赤外光を入射させることによっても、常に振幅と位相が適切に調整された赤外光を試料１２に照射することができるようになり、より画質のよい観察画像を得ることができる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１１ 走査型顕微鏡， ２１ ＩＲパルスレーザ， ２２ 調整部， ２３ コンフォーカルヘッド， ２６ 対物レンズ， ６１ 音響光学素子， ６２−１乃至６２−３，６２ 分散フィルタ， ９１ ミラー， ９２ ハーフミラー， ９３ ハーフミラー， ９４ ミラー， １１１ 偏光ビームスプリッタ， １１２ ミラー， １１３ ミラー， １１４ 偏光ビームスプリッタ， １４１ ハーフミラー， １４２ ミラー， １４３ ミラー， １４４ ハーフミラー

Claims (4)

1. 観察対象の試料上で光を走査させる走査型顕微鏡であって、
   前記光の振幅および位相を独立に制御可能であり、動作可能な期間と動作できない期間が生じる光学素子を複数と、
   前記走査が実行されている間の各時刻において、前記複数の光学素子のうちの少なくとも何れかが、前記光の振幅および位相を制御可能に動作するように前記複数の光学素子の動作を制御する制御手段と、
   前記複数の光学素子のうち、少なくとも前記光の振幅および位相を制御可能に動作している前記光学素子に、前記光を入射させる偏向手段と、
   前記複数の光学素子から射出された前記光が、同一光路を通って前記試料に照射されるように、前記光学素子からの前記光を合成する合成手段と
   を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
2. 前記偏向手段は、前記光を偏向させて、前記複数の光学素子のうち、前記光の振幅および位相を制御可能に動作している前記光学素子に前記光を入射させる音響光学素子である
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
3. 前記偏向手段は、ハーフミラーを備える
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
4. 前記偏向手段は、偏光ビームスプリッタを備える
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。

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