WO2014129650A1 - ビームスプリッタ装置、走査型観察装置、レーザ走査型顕微鏡およびレーザ走査型内視鏡 - Google Patents

ビームスプリッタ装置、走査型観察装置、レーザ走査型顕微鏡およびレーザ走査型内視鏡 Download PDF

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Definitions

  • the control unit that synchronizes the detection timing of the signal light by the detection system with the pulsed light, and the signal light detected by the detection system is used as the pulsed light on the specimen.
  • a restoration unit that restores the two-dimensional information or the three-dimensional information in association with the scanning position
  • a display unit that displays the two-dimensional information or the three-dimensional information restored by the restoration unit.
  • a beam splitter apparatus 1 according to a first embodiment of the present invention and a laser scanning microscope 100 including the same will be described below with reference to FIGS. 1 to 16. First, the overall configuration of the laser scanning microscope 100 will be described.

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Abstract

本発明のビームスプリッタ装置（１）は、入力されたパルス光（Ｌ０）を複数の光路（１１ａ，１１ｂ，１２ａ，１２ｂ）に分岐する分波部（１３ａ，１３ｂ）と、複数の光路の各々においてパルス光をリレーするリレー光学系（１４１ａ～１４４ａ，１４１ｂ～１４４ｂ）と、各光路においてリレーされた複数のパルス光（Ｌ１～Ｌ４）を合波する合波部（１３ｃ）と、複数の光路の各々を導光するパルス光に対して、信号光（ＬＳ）を分離するに足る相対的な時間遅延および互いに異なる発散角をそれぞれ付与する遅延部（１２ａ，１２ｂ）および発散角設定部（１５１ａ，１５１ｂ，１５２ａ，１５２ｂ）とを備える。

Description

ビームスプリッタ装置、走査型観察装置、レーザ走査型顕微鏡およびレーザ走査型内視鏡
　本発明は、ビームスプリッタ装置、走査型観察装置、レーザ走査型顕微鏡およびレーザ走査型内視鏡に関するものである。
　従来、ビームを標本上で２次元走査することによって標本の画像を取得する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１によれば、ビームの焦点を波面変換素子を用いて光軸方向にも移動させることによって、画像の取得領域を標本の深さ方向に変更することができる。
特開２００４－１０９２１９号公報
　生体内の分子の反応によって発生する蛍光の寿命は、３ナノ秒程度であると言われている。したがって、特許文献１の装置を用いて生体の異なる深さにおける反応を蛍光寿命オーダーの略同一時刻で観察するためには、ビームを数１００ＭＨｚで高速変調する必要がある。しかしながら、波面変換素子は、その反射面の形状を機械的に変化させることによってビームの焦点位置を移動するものであるため、焦点の移動速度の向上には限界があり、上記のような高速変調は原理的に難しい。したがって、特許文献１の装置では、標本の異なる深さにおける略同一時刻での反応を観察することができないという問題がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本の異なる深さにおける同一時刻での反応をも観察することができるビームスプリッタ装置、走査型観察装置、レーザ走査型顕微鏡およびレーザ走査型内視鏡を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明の第１の態様は、パルス光の照射によって標本内の分子の反応を誘起し、この反応によって発生した信号光を観察する観察装置に適用されるビームスプリッタ装置であって、入力されたパルス光を複数の光路に分岐する分波部と、前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光をリレーするリレー光学系と、該リレー光学系によって前記各光路においてリレーされた複数の前記パルス光を合波する合波部と、前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光に対して、前記信号光を分離するに足る相対的な時間遅延を付与する遅延部と、前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光に対して互いに異なる発散角を付与する発散角設定部とを備えるビームスプリッタ装置である。
　本発明の第１の態様によれば、外部から入射されたパルス光は、分波部によって分岐された後、各光路において、リレー光学系によってリレーされながら時間遅延と発散角とが各々付与されて合波部によって合波される。したがって、合波部からは、光軸方向の異なる位置において焦点を結ぶ複数のパルス光が、時間遅延に相当する十分に短い時間間隔を空けて出射されることになる。すなわち、各パルス光は、標本の異なる深さ位置に略同時に照射される。これにより、標本の異なる深さにおける同一時刻での反応をも観察することができる。
　上記第１の態様においては、前記リレー光学系が、一対のレンズを備え、前記発散角設定部が、前記一対のレンズの間に配置されていてもよい。
　このようにすることで、一対のレンズの間において光軸方向のビーム集光位置を変更することによって、該一対のレンズ以降のビーム発散角が変更される。これにより、ビーム発散角を連続的に変更することができる。
　上記第１の態様においては、前記発散角設定部が、前記分波部によって分岐されたパルス光を前記合波部に向かって矩形に偏向するミラー対を備え、該ミラー対が、前記分波部からの前記パルス光の入射光軸に沿う方向に一体的に移動可能に設けられていてもよい。
　このようにすることで、ミラー対の、その入射光軸に沿う方向の移動によって、パルス光の焦点位置を光軸方向に変更することができる。
　上記第１の態様においては、前記ミラー対が、前記分波部からの前記パルス光の入射光軸に交差する方向に一体的に移動可能に設けられていてもよい。
　このようにすることで、ミラー対の、その入射光軸に交差する方向の移動によって、複数のパルス光の焦点位置を光軸に交差する方向に変更することができる。
　上記第１の態様においては、前記発散角設定部が、前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光を、互いに光軸方向に異なる位置に収束させる集光レンズと、前記合波部の後段に設けられ、前記各集光レンズによって収束光束に変換されたパルス光を共通して受光するとともに互いに異なる発散角を有する略平行光束に変換するコリメートレンズとを備えていてもよい。この場合、前記集光レンズが、光軸方向に移動可能に設けられていてもよい。
　このようにすることで、複数のパルス光の各時間遅延量を変化させることなく焦点位置を光軸方向にずらすことができる。
　上記第１の態様においては、前記各集光レンズが、互いに同期して光軸方向に移動可能に設けられていてもよい。
　このようにすることで、複数の集光レンズが同時に移動することによって、複数のパルス光の焦点位置が一体的に光軸方向に移動する。これにより、複数のパルスの照射位置を、標本の深さ方向に走査することができる。
　上記第１の態様においては、前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光の強度を調整する光強度調整部を備えていてもよい。
　このようにすることで、複数のパルス光の照射位置が標本の深さ方向に互いに異なることに起因する、標本から発せられる信号光の強度のばらつきを補償することができる。
　上記第１の態様においては、前記分波部および前記合波部のうち少なくとも一方が、偏光ビームスプリッタを備え、前記光強度調整部が、前記偏光ビームスプリッタの前段に設けられて前記パルス光の偏光を調整する偏光調整部を備えていてもよい。
　このようにすることで、偏光ビームスプリッタの分岐比率はパルス光の偏光に依存するので、偏光調整部によって偏光ビームスプリッタに入射するパルス光の偏光を調整することによって、各パルス光の強度を調整することができる。
　上記第１の態様においては、前記光強度調整部が、前記複数の光路に設けられ、前記パルス光の透過率を可変である平行平板を備えていてもよい。
　このようにすることで、各パルス光の強度を容易に調整することができる。
　上記第１の態様においては、前記分波部、前記リレー光学系、前記合波部、前記遅延部および前記発散角設定部が、直列に複数組備えられていてもよい。
　このようにすることで、単一のパルス光から最終的に生成されるパルス光の数を増倍することができる。
　本発明の第２の態様は、上記いずれかに記載のビームスプリッタ装置と、該ビームスプリッタ装置から出射された複数のパルス光を光軸に交差する方向に走査する走査部と、該走査部によって走査されるパルス光を前記標本に照射する観察光学系と、前記標本からの前記信号光を検出する検出系とを備える走査型観察装置である。
　本発明の第２の態様によれば、ビームスプリッタ装置から出射された複数のパルス光が、走査部によって走査されながら観察光学系によって標本に照射されると、標本において発生した信号光が検出系によって検出される。この場合に、各パルス光は、標本の異なる深さにおける観察面を略同時に同期して走査されるので、標本の異なる深さにおける同一時刻での反応をも観察することができる。
　上記第２の態様においては、前記観察光学系が、前記標本に前記パルス光を集光する対物レンズを備えていることが好ましい。
　このようにすることで、各パルス光によって効率良く信号光を発生させることができる。
　上記第２の態様においては、前記検出系による前記信号光の検出のタイミングを、前記パルス光に同期させる制御部と、前記検出系によって検出された前記信号光を、前記標本上における前記パルス光の走査位置と対応づけて２次元情報または３次元情報として復元する復元部と、該復元部によって復元された前記２次元情報または３次元情報を表示する表示部とを備えていてもよい。
　このようにすることで、パルス光の照射によって発生した信号光を適切なタイミングで検出し、検出した信号光の２次元画像または３次元画像を得ることができる。
　本発明の第３の態様は、上記いずれかに記載の走査型観察装置と、前記ビームスプリッタ装置に前記パルス光としてのパルスレーザを供給するレーザ光源とを備えるレーザ走査型顕微鏡である。
　本発明の第４の態様は、上記いずれかに記載の走査型観察装置を備えるレーザ走査型内視鏡である。
　本発明によれば、標本の異なる深さにおける同一時刻での反応をも観察することができるという効果を奏する。
本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す全体構成図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡において、標本に照射される４つのパルスレーザの焦点位置を説明する図である。 図１のレーザ走査型顕微鏡において、４つのパルスレーザが走査される観察面を説明する図である。 本発明の第１の実施形態に係るビームスプリッタ装置を示す全体構成図である。 図４のビームスプリッタ装置の第１の変形例を示す全体構成図である。 図４のビームスプリッタ装置の第２の変形例を示す全体構成図である。 図４のビームスプリッタ装置の第３の変形例を示す全体構成図である。 図４のビームスプリッタ装置の第４の変形例を示す全体構成図である。 図８のビームスプリッタ装置によって生成される４つのパルスレーザの焦点位置を説明する図である。 図８のビームスプリッタ装置によって生成される４つのパルスレーザが走査される観察面を説明する図である。 図４のビームスプリッタ装置の第５の変形例を示す全体構成図である。 図１１のビームスプリッタ装置によって生成される４つのパルスレーザの焦点位置を説明する図である。 図１１のビームスプリッタ装置によって生成される４つのパルスレーザが走査される観察面を説明する図である。 図４のビームスプリッタ装置の第６の変形例を示す全体構成図である。 図１４のビームスプリッタ装置によって生成される４つのパルスレーザの焦点位置を説明する図である。 図１４のビームスプリッタ装置によって生成される４つのパルスレーザが走査される観察面を説明する図である。 本発明の第２の実施形態に係るビームスプリッタ装置を示す全体構成図である。
〔第１の実施形態〕
　本発明の第１の実施形態に係るビームスプリッタ装置１およびこれを備えるレーザ走査型顕微鏡１００について、図１から図１６を参照して以下に説明する。
　まず、レーザ走査型顕微鏡１００の全体構成について説明する。
　本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００は、図１に示されるように、パルスレーザ（パルス光）Ｌ０を出射するレーザ光源２と、該レーザ光源２から出射されたパルスレーザＬ０から４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４を生成するビームスプリッタ装置１と、該ビームスプリッタ装置１から出射される４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４を光軸に交差する方向に走査する走査部３と、標本Ａを支持するステージ４と、該走査部３からのパルスレーザＬ１～Ｌ４を標本Ａに照射する観察光学系５と、パルスレーザＬ１～Ｌ４の照射によって標本Ａにおいて発生した信号光ＬＳを検出する検出系６と、レーザ光源２および検出系６が備える検出部６ｂの動作を同期させて検出信号ＬＳ’を生成する制御部７と、該制御部７によって生成した検出信号ＬＳ’と走査部３が備えるミラー駆動部３ｃからの走査位置情報とから標本Ａの画像を構築する復元部８と、該復元部８によって構築された画像を表示する表示部９とを備えている。符号１０は、観察光学系５が備える対物レンズ５ｂの瞳と光学的に共役な面を走査部３上に投影する瞳投影レンズである。
　レーザ光源２は、標本Ａに含まれる特定の分子の反応、例えば発光を誘起するパルスレーザＬ０を出射する。
　ビームスプリッタ装置１は、後で詳述するように、レーザ光源２から入射された単一のパルスレーザＬ０の光束を複数に分割することによって４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４を生成し、生成された４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４の各々に互いに異なる遅延時間と発散角とを与える。これによって、図２に示されるように、対物レンズ５ｂ（後述）によって収束されたときに光軸方向の異なる位置に焦点を結ぶ４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４を十分に短い時間間隔を空けて順番に出射する。
　走査部３は、互いに直交する２つの軸回りに回転可能な２つのミラー３ａ，３ｂを備えている。走査部３は、これら２つのミラー３ａ，３ｂの回転角度を制御してパルスレーザＬ１～Ｌ４の反射方向を適切に変更することによって、パルスレーザＬ１～Ｌ４を光軸に交差する平面においてラスタ走査するようになっている。対物レンズ５ｂの瞳と光学的に共役な面は、ミラー３ａ，３ｂの反射面上または両者の間のいずれかに位置している。必要に応じて、ビームスプリッタ装置１とミラー３ａとの間に、瞳をリレーするレンズ対を配置してもよい。
　観察光学系５は、瞳投影レンズ１０を通過したパルスレーザＬ１～Ｌ４を結像させる結像レンズ５ａと、該結像レンズ５ａによって結像されたパルスレーザＬ１～Ｌ４を標本Ａ上に収束する対物レンズ５ｂとを備えている。
　検出系６は、観察光学系５によって収集される光のうち、信号光ＬＳのみを反射するダイクロイックミラー６ａと、該ダイクロイックミラー６ａよって反射された信号光ＬＳを検出する検出部６ｂと、信号光ＬＳを検出部６ｂの受光部に集光させる検出レンズ６ｃとを備えている。
　制御部７は、検出部６ｂによって信号光ＬＳを検出するタイミングを、レーザ光源２からパルスレーザＬ０が出射されるタイミングに同期させる。
　復元部８は、検出部６ｂによって検出された信号光ＬＳとパルスレーザＬ１～Ｌ４の走査位置とを対応づけて２次元情報または３次元情報として復元し、復元した２次元情報または３次元情報を表示部９に出力する。
　次に、このように構成されたレーザ走査型顕微鏡１００の作用について説明する。
　レーザ光源２から出射されたパルスレーザＬ０は、ビームスプリッタ装置１において４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４に変換された後、走査部３を介して観察光学系５に入射され、観察光学系５から標本Ａ照射され、標本Ａ上においてラスタ走査される。
　パルスレーザＬ１～Ｌ４の照射によって標本Ａで発生した蛍光などの信号光ＬＳは、光検出部６ｂによって検出されてその強度に対応する電気信号に変換され、復元部８において、その標本Ａ上の位置と対応付けられることによって画像化され、生成された２次元画像または３次元画像が表示部９に表示される。このときに、ビームスプリッタ装置１によって生成された４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４は、図３に示されるように、深さ方向（Ｚ方向）の位置が異なる４つの観察面Ｐ１～Ｐ４上において略同時に同期して走査される。したがって、復元部８においては、標本Ａの異なる深さにおける４つの２次元画像、もしくは３次元画像を略同時に生成することができる。
　次に、本実施形態に係るビームスプリッタ装置１について説明する。
　本実施形態に係るビームスプリッタ装置１は、図４に示されるように、入射光軸Ｏｉｎ上に設けられ一直線状の主光路１１ａ，１１ｂと、該主光路１１ａ，１１ｂから分岐する２つの遅延光路（遅延部）１２ａ，１２ｂとを備えている。主光路１１ａ，１１ｂおよび２つの遅延光路１２ａ，１２ｂは、互いに異なる光路長を有し、第１の遅延光路１２ａは、主光路１１ａ，１１ｂの光路長よりも長さ２ｄだけ長い光路長を有し、第２の遅延光路１２ｂは、主光路１１ａ，１１ｂの光路長よりも長さｄだけ長い光路長を有している。
　主光路１１ａ，１１ｂには、入射側から順に、第１のビームスプリッタ（分波部）１３ａ、第２のビームスプリッタ（分波部）１３ｂおよび第３のビームスプリッタ（合波部）１３ｃが直列に設けられている。第１のビームスプリッタ１３ａおよび第２のビームスプリッタ１３ｂによって単一のパルスレーザＬ０が２度分割されることによって、第３のビームスプリッタ１３ｃにおいて、互いに異なる光路１１ａ，１１ｂ，１２ａ，１２ｂを経由した４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４が合流し、入射光軸Ｏｉｎの延長線である出射光軸Ｏｏｕｔに沿って出射されるようになっている。以下、主光路のうち、第１のビームスプリッタ１３ａと第２のビームスプリッタ１３ｂとの間の部分を第１の主光路１１ａと称し、第２のビームスプリッタ１３ｂと第３のビームスプリッタ１３ｃとの間の部分を第２の主光路１１ｂと称する。
　具体的には、第１のビームスプリッタ１３ａは、パルスレーザＬ０を半分に分割し、一方を第１の遅延光路１２ａへ反射し、他方を第１の主光路１１ａへ透過する。第２のビームスプリッタ１３ｂは、第１の主光路１１ａを経由してきたパルスレーザを半分に分割し、一方を第２の遅延光路１２ｂへ反射し、他方を第３のビームスプリッタ１３ｃへ透過する。さらに、第２のビームスプリッタ１３ｂは、第１の遅延光路１２ａを経由してきたパルスレーザを半分に分割し、一方を第２の遅延光路１２ｂへ反射し、他方を第３のビームスプリッタ１３ｃへ透過する。
　これにより、第３のビームスプリッタ１３ｃにおいて、第１の主光路１１ａおよび第２の主光路１１ｂを経由したパルスレーザＬ１と、第１の主光路１１ａおよび第２の遅延光路１２ｂを経由したパルスレーザＬ２と、第１の遅延光路１２ａおよび第２の主光路１１ｂを経由したパルスレーザＬ３と、第１の遅延光路１２ａおよび第２の遅延光路１２ｂを経由したパルスレーザＬ４とが合流する。第３のビームスプリッタは、第２の主光路１１ｂを経由したパルスレーザを透過し、第２の遅延光路１２ｂを経由したパルスレーザを反射することによって、４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４を単一の出射光軸Ｏｏｕｔに沿って出射する。
　なお、図４に示される光路構成においては、第１の遅延光路１２ａが、第２の遅延光路１２ｂの光路長の２倍の長さの光路長を有する設計となっているが、第１の遅延光路の光路長と第２の遅延光路の光路長はこの逆であってもよい。
　各光路１１ａ，１１ｂ，１２ａ，１２ｂには、像面と共役な共役面Ｓを形成するリレー光学系として、一対のレンズ１４１ａ，１４２ｂ；１４２ａ，１４２ｂ；１４３ａ，１４３ｂ；１４４ａ，１４４ｂが設けられている。
　また、第１の遅延光路１２ａには、一対のレンズ１４３ａ，１４３ｂの間に第１のミラー対（発散角設定部）１５１ａ，１５１ｂが設けられ、第２の遅延光路１２ｂには、一対のレンズ１４４ａ，１４４ｂの間に第２のミラー対（発散角設定部）１５２ａ，１５２ｂが設けられている。第１のミラー対１５１ａ，１５１ｂは、第１のビームスプリッタ１３ａによって反射されたパルスレーザを第２のビームスプリッタ１３ｂに向かって主光路１１ａに矩形に折り返す。第２のミラー対１５２ａ，１５２ｂは、第２のビームスプリッタ１３ｂによって反射されたパルスレーザを第３のビームスプリッタ１３ｃに向かって主光路１１ｂに矩形に折り返す。
　ここで、各ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの主光路１１ａ，１１ｂに垂直な方向（以下、Ｚ’方向という。）の位置に応じて、各ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂが各パルスレーザに与える発散角が決まり、この発散角の差に依存して、各パルスレーザが焦点を結ぶ位置が光軸方向に異なる。すなわち、各ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂは、図４において二点鎖線で示される、全てのパルスレーザＬ１～Ｌ４が同一位置に焦点を結ぶ基準位置から、主光路１１ａ，１１ｂに垂直な方向にずれた位置に配置されている。
　これにより、ビームスプリッタ装置１から出射された４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４が対物レンズ５ｂによって集光されたときに、図２に示されるように、標本Ａの異なる深さにおいて焦点Ｆ１～Ｆ４を形成するようになっている。このときの各焦点Ｆ１～Ｆ４の光軸方向の間隔ΔＦｚは、ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの基準位置からのずれ量ΔＺ’と、各ミラー対１５，１５ｂ以後の光学倍率Ｍを用いて、ΔＦｚ＝ΔＺ’／Ｍ２と表わされる。
　この場合に、本実施形態に係るビームスプリッタ装置１によれば、第３のビームスプリッタ１３ｃから出射されて最終的に標本Ａに照射される４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４は、各光路１１ａ，１１ｂ，１２ａ，１２ｂの光路長が互いに異なることに起因して相対的な時間遅延を有し、光路長差ｄに相当する時間間隔を空けて順番にビープスプリッタ装置１から出射される。すなわち、パルスレーザＬ０の周波数をＱＨｚ、光速をＣｍ／ｓ、第２の遅延光路１２ｂの遅延量ｄをｃ／４Ｑｍとしたときに、ビームスプリッタ装置１から出射されるパルスレーザＬ１～Ｌ４の周波数は４ＱＨｚとなり、パルスレーザＬ０の繰返し周波数が見かけ上増倍される。
　ここで、パルスレーザＬ１～Ｌ４が有する相対的な時間遅延が信号光ＬＳの寿命よりも長くなるように、光路長差ｄは設定されている。例えば、代表的な蛍光タンパク質であるＧＦＰの蛍光を観察する場合、この蛍光の寿命は約３ナノ秒であるので、パルスレーザＬ１～Ｌ４は、互いに３ナノ秒以上の相対的な時間遅延を有する。
　このように相対的な時間遅延に起因する時間だけパルスレーザＬ１～Ｌ４の標本Ａへの照射の時刻をずらすことによって、各観察面Ｐ１～Ｐ４において発生した信号光ＬＳ同士を区別して検出可能としつつ、実質的に４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４が同時に標本Ａに照射されているとみなすことができる程度までその時間間隔を十分に短くすることができる。これにより、深さの異なる４つの観察面Ｐ１～Ｐ４における同時刻での分子の反応を観察することができるという利点がある。
　なお、本実施形態においては、各ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂが、Ｚ’方向に一体で移動可能に設けられていてもよい。
　このようにすることで、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の焦点Ｆ１～Ｆ４の光軸方向の間隔、すなわち、観察面Ｐ１～Ｐ４のＺ方向の間隔を変更することができる。具体的には、第１のミラー対５ａの移動によって第３の観察面Ｐ３および第４の観察面Ｐ４のＺ方向の位置を一体的に変更し、第２のミラー対５ｂの移動によって第２の観察面Ｐ２および第４の観察面Ｐ４のＺ方向の位置を一体的に変更することができる。
　また、本実施形態においては、合波部として、偏光特性を有さないビームスプリッタ１３ｃを用いることとしたが、これに代えて、偏光ビームスプリッタを用いるとともに、主光路１１または第２の遅延光路１２ｂにλ／２板を配置してもよい。
　このようにすることで、合波部における光量の損失を低減することができる。
　次に、本実施形態に係るビームスプリッタ装置１の変形例について説明する。
（第１の変形例）
　本実施形態の第１の変形例に係るビームスプリッタ装置１－１は、図５に示されるように、第１の遅延光路１２ａが、もう１組のレンズ対（リレー光学系）１４５ａ，１４５ｂと、該もう１組のレンズ対１４５ａ，１４５ｂの間に設けられたもう１つのミラー対１５３ａ，１５３ｂとを備えている点において、ビームスプリッタ装置１と異なっている。
　第１の遅延光路１２ａは、ミラーＭ１，Ｍ２ともう１つのミラー対１５３ａ，１５３ｂとによって構成された矩形の光路を有している。もう１つのミラー対１５３ａ，１５３ｂを主光路１１ａ，１１ｂに沿う方向に一体的に移動することによって、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の焦点Ｆ１～Ｆ４の位置が変更されるようになっている。このときのミラー対１５３ａ，１５３ｂの移動量ＸＭと、標本Ａにおける焦点Ｆ１～Ｆ４の移動量ＸＥとは、下式の関係にある。したがって、焦点距離の短いレンズ１４５ａ，１４５ｂを用いることによって、焦点Ｆ１～Ｆ４の位置を変更するために必要なミラー対１５３ａ，１５３ｂの移動量を小さくすることができる。
　　２ＸＭ＝ＸＥ（ｍｆＲ／ｆｐ）２
　ただし、ｍを対物レンズ５ｂの倍率、ｄを対物レンズ５ｂの作動距離、ｆＰＢを瞳投影レンズ１０のバックフォーカス、ｆｐを瞳投影レンズ１０の焦点距離、ｆＲをミラー対１５３ａ，１５３ｂの前後のレンズ１４５ａ，１４５ｂの焦点距離としたときに、
　　｜２ＸＭ｜＜ｆＲ，ｆＰＢ（ｆＲ／ｆｐ）２，ｄ（ｍｆＲ／ｆｐ）２
の関係を満たす。
（第２の変形例）
　本実施形態の第２の変形例に係るビームスプリッタ装置１－２は、図６に示されるように、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の強度を調整する光強度調整部として、各光路１１ａ，１１ｂ，１２ａ，１２ｂに配置されたＮＤフィルタ（平行平板）１６を備えている点において、ビームスプリッタ装置１と異なっている。各ＮＤフィルタ１６の透過率は、標本Ａの最も浅い位置に焦点Ｆ１を形成するパルスレーザＬ１の強度が最も弱くなり、標本Ａの最も深い位置に焦点Ｆ４を形成するパルスレーザＬ４の強度が最も強くなるように、設定されている。
　標本Ａが生体組織のような散乱体である場合、観察面Ｐ１～Ｐ４の位置が深くなる程、信号光ＬＳが標本Ａによる散乱や収差の影響を強く受け、検出部６ｂによって検出される信号光ＬＳの強度が低下する。そこで、本変形例のように、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の強度を調整することによって、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の照射位置が深さ方向に異なることに起因する信号光ＬＳの検出強度のばらつきを補償することができる。
　また、ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂが移動可能に設けられている場合には、透過率が連続的に変化するＮＤフィルタ１６を使用し、ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの移動と連動してＮＤフィルタ１６を移動させるようにすることで、パルスレーザＬ１～Ｌ４の強度を自動で調整してもよい。この場合、ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの移動量と、信号光ＬＳの検出強度の変化量との関係を事前に測定または計算して把握しておけばよい。
（第３の変形例）
　本実施形態の第３の変形例に係るビームスプリッタ装置１は、図７に示されるように、第１のビームスプリッタ１３ａおよび第３のビームスプリッタ１３ｃが偏光ビームスプリッタであり、第２のビームスプリッタ１３ｂが無偏光ビームスプリッタであり、第１のビームスプリッタ１３ａの前段、第２の主光路１１ｂ、第１の遅延光路１２ａおよび第２の遅延光路１２ｂに、光強度調整部としてλ／２板（偏光調整部）１７ａ，１７ｂ，１７ｃ，１７ｄが設けられている点において、ビームスプリッタ装置１と異なっている。
　各偏光ビームスプリッタ１３ａ，１３ｃは、入射されたパルスレーザのうち、Ｐ偏光成分を透過し、Ｓ偏光成分を反射する。したがって、第１の偏光ビームスプリッタ１３ａの前段のλ／２板１７ａによってパルスレーザＬ０の偏光状態を調整することによって、偏光ビームスプリッタ１３ａにおけるパルスレーザの分岐比を変更することができる。λ／２板１７ｃは、第１の遅延光路１２ａを通るパルスレーザの偏光状態をＳ偏光からＰ偏光に変換し、第２のビームスプリッタ１３ｂ後のパルス光を全てＰ偏光に統一する。λ／２板１７ｂ，１７ｄは、Ｐ偏光である各光路１１ｂ，１２ｂのパルスレーザの偏光状態を調整することで、偏光ビームスプリッタ１３ｃにおけるパルスレーザの透過／反射率を変更することができる。その結果、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の強度を調整することができる。
　このようにしても、第２の変形例と同様に、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の照射位置が深さ方向に異なることに起因する信号光ＬＳの検出強度のばらつきを補償することができる。
（第４の変形例）
　本実施形態の第４の変形例に係るビームスプリッタ装置１－４は、図８に示されるように、ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの位置が、Ｚ’方向のみではなく、主光路１１ａ，１１ｂに平行な方向（以下、Ｙ’方向という。）にも、基準位置からずれている点において、ビームスプリッタ装置１と異なっている。
　このようにすることで、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の焦点Ｆ１～Ｆ４の位置が、光軸方向のみでなく、図９に示されるように、光軸に交差する方向（Ｙ方向）にも互いに異なる。したがって、図１０に示されるように、Ｚ方向の位置のみならずＹ方向の位置も互いに異なる４つの観察面Ｐ１～Ｐ４を同時に観察することができる。このような構成は、例えば、標本Ａ内を斜めに走行する神経の信号伝達のように、３次元的に伝達する信号を観察するのに有効である。なお、このときの各焦点Ｆ１～Ｆ４間のＹ方向の間隔ΔＦｙは、ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの基準位置からのＹ’方向のずれ量ΔＹ’と、各ミラー対１５，１５ｂ以後の光学倍率Ｍを用いて、ΔＦｙ＝ΔＹ’／Ｍと表わされる。
　さらに、ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの角度を変更し、ミラー対間のパルスレーザの光軸を紙面に垂直な方向に平行移動させることで、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の焦点Ｆ１～Ｆ４の位置を、Ｘ方向にも互いに異ならせることができる。
（第５の変形例）
　本実施形態の第５の変形例に係るビームスプリッタ装置１－５は、図１１に示されるように、第１のミラー対１５１ａ，１５１ｂが基準位置からＺ’方向にずれ、第２のミラー対１５２ａ，１５２ｂが基準位置からＹ’方向にずれている点において、ビームスプリッタ装置１と異なっている。
　このようにすることで、図１２に示されるように、パルスレーザＬ１，Ｌ２の焦点Ｆ１，Ｆ２とパルスレーザＬ３，Ｌ４の焦点Ｆ３，Ｆ４とがＺ方向に互いに異なり、パルスレーザＬ１，Ｌ３の焦点Ｆ１，Ｆ３とパルスレーザＬ２，Ｌ４の焦点Ｆ２，Ｆ４とがＹ方向に互いに異なる。したがって、図１３に示されるように、Ｚ方向の位置が異なる２つの観察面Ｐ１，Ｐ２の各々を２つのパルスレーザＬ１，Ｌ２／Ｌ３，Ｌ４を用いて同時に走査することができるので、観察面Ｐ１，Ｐ２の走査に要する時間を半分に短縮することができる。
　本変形例においては、第１のミラー対１５１ａ，１５１ｂが基準位置からＹ’方向にずれ、第２のミラー対１５２ａ，１５２ｂが基準位置からＺ’方向にずれていてもよい。この場合には、図１２および図１３において、パルスレーザＬ２とパルスレーザＬ３とが入れ替わる。
（第６の変形例）
　本実施形態の第６の変形例に係るビームスプリッタ装置１－６は、図１４に示されるように、第１のミラー対１５１ａ，１５１ｂが基準位置からＹ’方向およびＺ’方向にずれ、第２のミラー対１５２ａ，１５２ｂが基準位置からＹ’方向にずれている点において、ビームスプリッタ装置１と異なっている。
　このようにすることで、図１２に示される焦点Ｆ１～Ｆ４の位置に対して、図１５に示されるように、パルスレーザＬ１，Ｌ２の焦点Ｆ１，Ｆ２とパルスレーザＬ３，Ｌ４の焦点Ｆ３，Ｆ４とがＹ方向にも互いに異なる。したがって、図１６に示されるように、Ｚ方向の位置およびＹ方向の位置の異なる２つの観察面Ｐ１，Ｐ２の各々を２つのパルスレーザＬ１，Ｌ２／Ｌ３，Ｌ４を用いて同時に走査することができるので、観察面Ｐ１，Ｐ２の走査に要する時間を半分に短縮することができる。このような構成は、例えば、２つの細胞間の高速な信号伝達など、任意の２点間の相互作用の解析に有効である。
　本変形例においては、第１のミラー対１５１ａ，１５１ｂが基準位置からＺ’方向にずれ、第２のミラー対１５２ａ，１５２ｂが基準位置からＹ’方向およびＺ’方向にずれていてもよい。この場合には、図１４および図１５において、パルスレーザＬ２とパルスレーザＬ３とが入れ替わる。
〔第２の実施形態〕
　次に、本発明の第２の実施形態に係るビームスプリッタ装置１’およびこれを備えるレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態においては、上述した第１の実施形態と異なる構成について主に説明し、第１の実施形態と共通する構成については、同一の符号を付して説明を省略する。
　本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡は、第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００と同様に構成されている。
　本実施形態に係るビームスプリッタ装置１’は、図１７に示されるように、第１の主光路１１ａ、第１の遅延光路１２ａおよび第２の遅延光路１２ｂに、第３のビームスプリッタ１３ｃの後方において２次像面を形成する集光レンズ（発散角設定部）１８ａ，１８ｂ，１８ｃが設けられている。また、第３のビームスプリッタ１３ｃの後段には、４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４を共通して受光するとともに、２次像面から拡散光束となって入射される各ビームＬ１～Ｌ４を略平行光束に変換するコリメートレンズ１９が設けられている。
　ここで、各集光レンズ１８ａ～１８ｃは、全てのパルスレーザＬ１～Ｌ４が同一位置に焦点を結ぶ基準位置から、各々の光軸方向にずれた位置に配置されている。これにより、ビームスプリッタ装置１から出射された４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４は、第１の実施形態と同様に、対物レンズ５ｂによって集光されたときに、図２に示されるように、標本Ａの異なる深さ位置において焦点を形成し、図３に示されるように、標本Ａの異なる深さにおける４つの観察面Ｐ１～Ｐ４上を略同時に同期して走査される。したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏することができる。
　なお、本実施形態においては、各集光レンズ１８ａ～１８ｃが、各光路１１ａ，１２ａ，１２ｂの光軸方向に移動可能に設けられていてもよい。このようにすることで、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の焦点Ｆ１～Ｆ４のＺ方向の間隔を変更し、各観察面Ｐ１～Ｐ４のＺ方向の間隔を変更することができる。
　具体的には、集光レンズ１８ａの移動によって第１の観察面Ｐ１および第２の観察面Ｐ２のＺ方向の位置を一体的に変更し、集光レンズ１８ｂの移動によって第３の観察面Ｐ３および第４の観察面Ｐ４のＺ方向の位置を一体的に変更し、集光レンズ１８ｃの移動によって第２の観察面Ｐ２および第４の観察面Ｐ４のＺ方向の位置を一体的に変更することができる。このときに、集光レンズ１８ａ～１８ｃを移動したときに、各パルスレーザＬ１～Ｌ４が有する遅延時間の変動を伴わないため、時間制御をより容易に行うことができるという利点がある。
　また、本実施形態においては、第１の遅延光路１２ａが第２の遅延光路１２ｂの光路長の２倍の長さの光路長を有する光路設計が図１７に示されているが、第１の遅延光路の光路長と第２の遅延光路の光路長はこの逆であってもよい。
　また、本実施形態においては、合波部の第３のビームスプリッタ１３ｃとして、偏光ビームスプリッタを用いるとともに、第２の遅延光路１２ｂにλ／２板を配置してもよい。このようにすることで、合波部における光量の損失を低減することができる。
　また、本実施形態においては、第１の実施形態において説明した、各ミラー対１５１ａ，１５１ｂ；１５２ａ，１５２ｂの位置の調整によって各パルスレーザＬ１～Ｌ４に発散角を付与する構成と組み合わせてもよい。
　また、本実施形態においては、第１の実施形態の第２の変形例および第３の変形例と同様に、各光路１１ａ，１１ｂ，１２ａ，１２ｂに配置されるＮＤフィルタ、または、偏光ビームスプリッタとλ／２板との組み合わせを利用して、各パルスレーザＬ１～Ｌ４の強度を調整してもよい。
　次に、本実施形態に係るビームスプリッタ装置１’の変形例について説明する。
　本実施形態の変形例に係るビームスプリッタ装置は、集光レンズ１８ａと集光レンズ１８ｂとが、図示しないモータによって互いに同期して光軸に沿って移動可能に設けられている点において、ビームスプリッタ装置１’と異なっている。
　集光レンズ１８ａの移動によって第１の観察面Ｐ１と第２の観察面Ｐ２とがＺ方向に移動し、集光レンズ１８ｂの移動によって第３の観察面Ｐ３と第４の観察面Ｐ４とがＺ方向に移動する。したがって、これら２つの集光レンズ１８ａ，１８ｂを同期して移動させることによって、全ての観察面Ｐ１～Ｐ４を一体的にＺ方向に移動させることができる。これにより、４つのパルスレーザＬ１～Ｌ４を、Ｘ方向およびＹ方向のみならず、Ｚ方向にも高速で走査して、標本Ａの３次元画像を高速で取得することができる。
　なお、第１および第２の実施形態においては、第１～第３のビームスプリッタ１３ａ～１３ｃの後段に、もう１組の第１～第３のビームスプリッタ１３ａ～１３ｃが直列に接続され、上述した主光路１１ａ，１１ｂおよび遅延光路１２ａ，１２ｂがもう１組形成されていてもよい。
　このようにすることで、ビームスプリッタ装置１，１’によって単一のパルスレーザＬ０から生成するパルスレーザの数を、４個、１６個、６４個、…と増やすことができる。
　なお、第１および第２の実施形態においては、レーザ走査型顕微鏡を例に挙げて説明したが、本発明のビームスプリッタ装置および走査型観察装置は、レーザ走査型内視鏡にも適用可能である。すなわち、レーザ走査型内視鏡が備える挿入部の先端部に、観察光学系５と、信号光ＬＳを受光して検出系６に送信する導波路（例えば、光ファイバ）とを設け、挿入部の基端側に配置されたビームスプリッタ装置１，１’からパルスレーザＬ１～Ｌ４を光ファイバなどを介して観察光学系５に供給すればよい。
１，１’　ビームスプリッタ装置
２　レーザ光源
３　走査部
４　ステージ
５　観察光学系
５ａ　結像レンズ
５ｂ　対物レンズ
６　検出系
６ｂ　検出部
７　制御部
８　復元部
９　表示部
１０　瞳投影レンズ
１１ａ，１１ｂ　主光路
１２ａ，１２ｂ　遅延光路（遅延部）
１３ａ，１３ｂ　ビームスプリッタ（分波部）
１３ｃ　ビームスプリッタ（合波部）
１４１ａ～１４５ａ，１４１ｂ～１４５ｂ　レンズ（リレー光学系）
１５１ａ～１５３ａ，１５１ｂ～１５３ｂ　ミラー対（発散角設定部）
１６　ＮＤフィルタ（平行平板）
１７ａ，１７ｂ，１７ｃ，１７ｄ　λ／２板
１８ａ，１８ｂ，１８ｃ　集光レンズ（発散角設定部）
１９　コリメートレンズ
１００　レーザ走査型顕微鏡

Claims (16)

  1. 　パルス光の照射によって標本内の分子の反応を誘起し、この反応によって発生した信号光を観察する観察装置に適用されるビームスプリッタ装置であって、
    　入力されたパルス光を複数の光路に分岐する分波部と、
    　前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光をリレーするリレー光学系と、
    　該リレー光学系によって前記各光路においてリレーされた複数の前記パルス光を合波する合波部と、
    　前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光に対して、複数の前記信号光同士を分離するに足る相対的な時間遅延を付与する遅延部と、
    　前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光に対して互いに異なる発散角を付与する発散角設定部とを備えるビームスプリッタ装置。
  2. 　前記リレー光学系が、一対のレンズを備え、
    　前記発散角設定部が、前記一対のレンズの間に配置されている請求項１に記載のビームスプリッタ装置。
  3. 　前記発散角設定部が、前記分波部によって分岐されたパルス光を前記合波部に向かって矩形に偏向するミラー対を備え、
    　該ミラー対が、前記分波部からの前記パルス光の入射光軸に沿う方向に一体的に移動可能に設けられている請求項２に記載のビームスプリッタ装置。
  4. 　前記ミラー対が、前記分波部からの前記パルス光の入射光軸に交差する方向に一体的に移動可能に設けられている請求項３に記載のビームスプリッタ装置。
  5. 　前記発散角設定部が、
    　前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光を、互いに光軸方向に異なる位置に収束させる収束光束に変換する集光レンズと、
    　前記合波部の後段に設けられ、前記各集光レンズによって収束光束に変換されたパルス光を共通して受光するとともに互いに異なる発散角を有する略平行光束に変換するコリメートレンズとを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のビームスプリッタ装置。
  6. 　前記各集光レンズが、光軸方向に移動可能に設けられている請求項５に記載のビームスプリッタ装置。
  7. 　前記各集光レンズが、互いに同期して光軸方向に移動可能に設けられている請求項５または請求項６に記載のビームスプリッタ装置。
  8. 　前記複数の光路に設けられ、該各光路を導光するパルス光の強度を調整する光強度調整部を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載のビームスプリッタ装置。
  9. 　前記分波部および前記合波部のうち少なくとも一方が、偏光ビームスプリッタを備え、
    　前記光強度調整部が、前記偏光ビームスプリッタの前段に設けられて前記パルス光の偏光を調整する偏光調整部を備える請求項８に記載のビームスプリッタ装置。
  10. 　前記光強度調整部が、前記複数の光路に設けられ、前記パルス光の透過率を可変である平行平板を備える請求項８に記載のビームスプリッタ装置。
  11. 　前記分波部、前記リレー光学系、前記合波部、前記遅延部および前記発散角設定部が、直列に複数組備えられている請求項１から請求項１０のいずれかに記載のビームスプリッタ装置。
  12. 　請求項１から請求項１１のいずれかに記載のビームスプリッタ装置と、
    　該ビームスプリッタ装置から出射された複数のパルス光を光軸に交差する方向に走査する走査部と、
    　該走査部によって走査されるパルス光を前記標本に照射する観察光学系と、
    　前記標本からの前記信号光を検出する検出系とを備える走査型観察装置。
  13. 　前記観察光学系が、前記標本に前記パルス光を集光する対物レンズを備える請求項１２に記載の走査型観察装置。
  14. 　前記検出系による前記信号光の検出のタイミングを、前記パルス光に同期させる制御部と、
    　前記検出系によって検出された前記信号光を、前記標本上における前記パルス光の走査位置と対応づけて２次元情報または３次元情報として復元する復元部と、
    　該復元部によって復元された前記２次元情報または３次元情報を表示する表示部とを備える請求項１２または請求項１３に記載の走査型観察装置。
  15. 　請求項１２から請求項１４のいずれかに記載の走査型観察装置と、
    　前記ビームスプリッタ装置に前記パルス光としてのパルスレーザを供給するレーザ光源とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
  16. 　請求項１２から請求項１４のいずれかに記載の走査型観察装置を備えるレーザ走査型内視鏡。
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