JP2009300952A - レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＭＤおよびスキャナを用いた試料の蛍光観察を行いながら、刺激用のレーザ光の利用効率を向上し、試料に対して効果的な刺激を与える。
【解決手段】刺激用および観察用のレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を発生するレーザ光源２，３と、レーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を可変パターンで選択する多数の微小素子を配列してなる微小素子アレイ８と、該微小素子アレイ８により選択されたパターンのレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を少なくとも一方向に走査するスキャナ２９と、走査されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を試料Ａに照射する照射光学系９と、試料Ａにおいて発生し、照射光学系２９および微小素子アレイ８を介して戻る蛍光Ｆを検出する検出光学系１１と、微小素子アレイ８とレーザ光源２，３との間に配置され、微小素子アレイ８への刺激用のレーザ光Ｌ_２の照射範囲Ｂ_２を観察用のレーザ光Ｌ_１のスキャナ２９による走査範囲の一部に制限する照射制限手段２５とを備えるレーザ顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、レーザ顕微鏡に関するものである。

従来、照明と検出の共通光路にディジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）およびガルバノミラーを配置して、ＤＭＤ上にライン状のレーザ光を結像させるとともに、ＤＭＤで反射されたライン状のレーザ光を、ラインに直交する方向にガルバノミラーで走査するレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。レーザ光が結像しているＤＭＤの微小ミラーをオンオフ制御することで、１点、複数点またはラインスキャンを選択することができる。

特開２００４−１９９０６３号公報

しかしながら、特許文献１に記載されたレーザ顕微鏡においては、ＤＭＤに結像させたライン状のレーザ光から、微小ミラーをオンオフさせることで利用する光スポットを選択しているので、利用されずに捨てられるレーザ光が多く、損失が大きいという不都合がある。
特に、試料における狭い領域を刺激するための照明においては、高い強度のレーザ光が必要となる場合があるので、そのような場合にはＤＭＤによって利用するレーザ光を間引いて照射する特許文献１の方法では、効果的な刺激を与えることができないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、ＤＭＤおよびスキャナを用いた試料の蛍光観察を行いながら、刺激用のレーザ光の利用効率を向上し、試料に対して効果的な刺激を与えることができるレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、刺激用および観察用のレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光を可変パターンで選択する多数の微小素子を配列してなる微小素子アレイと、該微小素子アレイにより選択されたパターンのレーザ光を少なくとも一方向に走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を試料に照射する照射光学系と、試料において発生し、前記照射光学系および前記微小素子アレイを介して戻る蛍光を検出する検出光学系と、前記微小素子アレイと前記レーザ光源との間に配置され、前記微小素子アレイへの刺激用のレーザ光の照射範囲を観察用のレーザ光の前記スキャナによる走査範囲の一部に制限する照射制限手段とを備えるレーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光が微小素子アレイによって選択された後、スキャナによって少なくとも一方向に走査され、照射光学系を介して試料に照射されると、試料内に存在する蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、照射光学系および微小素子アレイを介して戻り、検出光学系により検出されることにより蛍光画像が取得される。この場合に、レーザ光源と微小素子アレイとの間に配置された照射制限手段の作動により、刺激用のレーザ光の微小素子アレイへの照射範囲が、観察用のレーザ光の前記スキャナによる走査範囲の一部に制限される。したがって、観察用のレーザ光により広い範囲にわたって蛍光画像を取得し、微小素子アレイの狭い範囲に集めた刺激用のレーザ光によって、試料における狭い領域に強度の強い効果的な刺激を与えることができる。

上記発明においては、前記刺激用のレーザ光および前記観察用のレーザ光を導光する共通光路と、該共通光路に設けられ微小素子アレイに入射させるレーザ光を選択するレーザ光選択手段とを備え、前記照射制限手段が、共通光路に配置された波面変換素子であってもよい。
このようにすることで、レーザ光源から発せられた刺激用のレーザ光および観察用のレーザ光は、共通光路を導光させられ、レーザ光選択手段によって切り替えられて、微小素子アレイに入射される。刺激用のレーザ光が微小素子アレイに入射される際には、波面変換素子によってレーザ光の波面を変化させ、光束径を小さくすることで、微小素子アレイへの照射範囲を観察用のレーザ光を入射させる場合よりも制限することができる。

また、上記発明においては、前記刺激用のレーザ光を導光する刺激用光路と、前記観察用のレーザ光を導光する観察用光路と、これらの光路を合成する光路合成手段とを備え、前記照射制限手段が前記刺激用光路に設けられていてもよい。
このようにすることで、刺激用のレーザ光が刺激用光路を導光させられる間に照射制限手段を通過し、その後、光路合成手段によって、観察用のレーザ光を導光する観察用光路と合成された共通の光路に沿って微小素子アレイに入射させられる。これにより、刺激用のレーザ光の照射範囲が観察用のレーザ光の照射範囲よりも制限された形態で微小素子アレイに入射させられる。

また、上記発明においては、前記刺激用光路に、刺激用のレーザ光の光束を微小素子アレイ上で線状に結像させるライン集光光学系を備えていてもよい。
このようにすることで、刺激用光路に備えられたライン集光光学系を通過することで、直線状の断面形状を有する光束となった刺激用のレーザ光が直線状の形態で微小素子アレイに結像される。この場合に、照射制限手段により直線の長さを短縮した状態で微小偏向素子アレイに入射させるので、微小素子アレイによってレーザ光を廃棄せずに、試料における狭い領域に強度の強い効果的な刺激を与えることができる。ライン集光光学系としては、シリンドリカルレンズあるいはパウエルレンズと凸レンズとを組み合わせたもの等を採用することができる。

また、上記発明においては、前記ライン集光光学系が、前記刺激用光路に挿脱可能に設けられていてもよい。
ライン集光レンズを刺激用光路に挿入することで、刺激用のレーザ光を微小素子アレイ上の直線状の領域に結像させ、ライン集光レンズを刺激用光路から離脱させることで、刺激用のレーザ光を微小素子アレイ上の円形領域に照射させることができる。これにより、試料に入射させる刺激用のレーザ光の照射範囲の形態を、観察方法に合わせて切り替えることができる。

また、上記発明においては、前記照射制限手段が、微小偏向素子アレイにおける刺激用のレーザ光の照射範囲を回折限界スポットまで縮小可能であってもよい。
このようにすることで、刺激用レーザ光の利用効率が極めて高く、短時間に刺激することができる。

また、上記発明においては、前記観察用のレーザ光の前記微小素子アレイへの照射位置に対して、前記刺激用のレーザ光の前記微小素子アレイへの照射位置を異ならせる照射位置変更手段を備えていてもよい。
このようにすることで、刺激用のレーザ光と観察用のレーザ光とを微小素子アレイの異なる位置に照射させて、選択されたレーザ光を同一のスキャナにより走査することで、刺激と観察の時間差を極めて小さくして、刺激直後の試料の変化を観察することが可能となる。

また、上記発明においては、前記スキャナが、前記レーザ光を光軸に直交する２方向に走査することにしてもよい。
このようにすることで、観察範囲の中の任意の位置に刺激を与えて観察を行うことができる。

また、上記発明においては、前記微小素子アレイの微小素子が、異なる２方向に傾斜可能に設けられた微小偏向素子であり、前記光路合成手段が、前記微小素子アレイによって構成されていてもよい。
このようにすることで、微小偏向素子の２方向の傾斜方向に合わせて、刺激用のレーザ光および観察用のレーザ光が同一方向に偏向されるようにそれぞれ入射させることで、両レーザ光の光路を合成することができる。これにより、別途光路合成手段を用意する必要がなく、構成を簡略化することができる。

また、上記発明においては、前記微小素子アレイの微小素子が、異なる２方向に傾斜可能に設けられた微小偏向素子であり、前記微小素子アレイから試料までの光路が、観察用のレーザ光を導光する観察用照射光路と、刺激用のレーザ光を導光する刺激用照射光路と、これらの光路を合成する照射光路合成手段とを備え、前記スキャナが、前記観察用照射光路および前記刺激用照射光路にそれぞれ設けられていていてもよい。
このようにすることで、同一方向から微小素子アレイに入射させた観察用のレーザ光と刺激用のレーザ光とを異なる２方向に偏向させて、それぞれ観察用照射光路と、刺激用照射光路とに導光させることができる。観察用のレーザ光および刺激用のレーザ光はそれぞれ観察用照射光路および刺激用照射光路に設けられたスキャナによって別々に走査されるので、照射位置変更手段によって微小素子アレイへの照射位置を異ならせるだけで、異なる位置および範囲の刺激と観察とを同時に行うことができる。

また、上記発明においては、前記刺激用照射光路に設けられたスキャナが、前記刺激用のレーザ光を光軸に直交する２方向に走査することとしてもよい。
このようにすることで、観察範囲の中の任意の位置に刺激を与えて観察を行うことができる。
また、上記発明においては、前記微小素子アレイが、該微小素子アレイへの刺激用のレーザ光の照射範囲内においてレーザ光を選択する微小素子を設定することとしてもよい。
このようにすることで、刺激を行いたい領域をさらに絞って刺激用のレーザ光を照射することができる。例えば、細胞の特定部位のみに刺激用のレーザ光を照射し、該特定部位に隣接する細胞の褪色や劣化を防止することができる。

本発明によれば、ＤＭＤおよびスキャナを用いた試料の蛍光観察を行いながら、刺激用のレーザ光の利用効率を向上し、試料に対して効果的な刺激を与えることができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１は、図１に示されるように、観察用のレーザ光Ｌ_１を発生する第１のレーザ光源２と、刺激用のレーザ光Ｌ_２を発生する第２のレーザ光源３と、これらのレーザ光源２，３から発せられたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２をそれぞれ導光する観察用光路４および刺激用光路５と、これらの光路４，５を導光されてきたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を共通光路６に合流させる第２の偏光ビームスプリッタ７と、該偏光ビームスプリッタ７により共通光路に合流されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を偏向する多数の微小可動ミラー（図示略）を有するＤＭＤ８と、ＤＭＤ８により偏向されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を試料Ａに照射する照射光学系９と、試料Ａにおいて発生し、照射光学系９およびＤＭＤ８を介して共通光路６に戻る蛍光Ｆをレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の共通光路６から分岐する励起ダイクロイックミラー１０と、分岐された蛍光Ｆを検出する検出光学系１１とを備えている。

観察用光路４には、観察用のレーザ光Ｌ_１の偏光を切り替えるλ／２板１２と、合成ダイクロイックミラー１３と、第１の偏光ビームスプリッタ１４と、レーザ光Ｌ_１をオンオフするための音響光学素子１５と、レーザ光Ｌ_１のガウシアン分布を補正するビーム均質化光学系１６と、レーザ光Ｌ_１の光束径を調節するビームエキスパンダ１７と、レーザ光Ｌ_１の断面を略円形からライン状に変換するシリンドリカルレンズ（ライン集光光学系）１８とが備えられている。

刺激用光路５には、刺激用のレーザ光Ｌ_２の偏光を切り替えるλ／２板１９と、レーザ光を観察用光路の合成ダイクロイックミラー１３に入射させるように偏向するミラー２０と、合成ダイクロイックミラー１３により観察用のレーザ光Ｌ_１と共通の光路２１を通過した後、第１の偏光ビームスプリッタ１４により分岐された刺激用のレーザ光Ｌ_２を偏向するミラー２２と、レーザ光Ｌ_２をオンオフするための音響光学素子２３と、レーザ光Ｌ_２のガウシアン分布を補正するビーム均質化光学系２４と、レーザ光Ｌ_２の光束径を調節するビームエキスパンダ２５と、刺激用のレーザ光Ｌ_２を光軸に直交する方向にシフトさせる光軸調整ミラー２６と、レーザ光Ｌ_２の断面を略円形からライン状に変換するシリンドリカルレンズ２７とが備えられている。

光軸調整ミラー２６は、例えば、照射光学系９に備えられた２方向（例えば、ＸＹ方向）のうち、一方向（例えば、Ｘ方向）に光軸をシフトさせるようになっている。
シリンドリカルレンズ２７は、光軸に挿脱できるようになっている。

合成ダイクロイックミラー１３によって観察用光路４と刺激用光路５とを合流させることにより、合成ダイクロイックミラー１３までの光源装置と、それ以降の光学系とを分離することができるようになっている。合成ダイクロイックミラー１３から第１の偏光ビームスプリッタ１４までの光路を通過するレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を光ファイバ等の導光手段（図示略）によって導光することもできるようになっている。

ＤＭＤ８は、試料Ａと共役な位置に配置されている。
これにより、試料Ａの像が、ＤＭＤ８上に結像されるようになっている。

照射光学系９は、ＤＭＤ８により偏向されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２をリレーするリレーレンズ２８と、リレーされたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を光軸に交差する２方向に走査するガルバノミラー２９と、瞳投影レンズ３０と、結像レンズ３１と、対物レンズ３２とを備えている。ＤＭＤ８において照射光学系９の方向に偏向されたレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２はリレーレンズ２８によりリレーされた後、ガルバノミラー２９によって２次元的に走査され、瞳投影レンズ３０、結像レンズ３１および対物レンズ３２によって試料Ａに集光させられるようになっている。

試料Ａにおける観察用のレーザ光Ｌ_１の照射位置においては、レーザ光Ｌ_１によって蛍光物質が励起されることにより蛍光Ｆが発生する。発生した蛍光Ｆは対物レンズ３２によって集光された後、結像レンズ３１、瞳投影レンズ３０、ガルバノミラー２９およびリレーレンズ２８を介してＤＭＤ８の同一の微小可動ミラーによって共通光路６に戻され、励起ダイクロイックミラー１０によって共通光路６から分岐されて検出光学系１１により検出されるようになっている。

検出光学系１１は、励起ダイクロイックミラー１０により分岐された蛍光Ｆに含まれるレーザ光Ｌ_１，Ｌ_２の成分を遮断するバリアフィルタ３３と、該バリアフィルタ３３を通過した蛍光Ｆをリレーする２つのリレーレンズ３４，３５と、該リレーレンズ３４，３５の間に配置され、リレーされた蛍光Ｆを光軸に交差する一方向に走査するガルバノミラー３６と、リレーされた蛍光Ｆを検出する２次元ＣＣＤ３７とを備えている。ガルバノミラー３６は、例えば、照射光学系９に備えられた２方向（例えば、ＸＹ方向）のうち、一方向（例えば、Ｘ方向）に蛍光Ｆを走査することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、第１のレーザ光源２から発せられた観察用のレーザ光Ｌ_１は、λ／２板１２によって偏光方向を調整された後、合成ダイクロイックミラー１３および偏光ビームスプリッタ１４を透過する。そして、音響光学素子１５がオン状態となったときに、音響光学素子１５を通過してビーム均質化光学系１６によりガウシアン分布を補正され、ビームエキスパンダ１７によって光束径が調節される。観察用のレーザ光Ｌ_１の光束径は、例えば、視野範囲の全体にわたって照射できる大きさに設定される。

そして、シリンドリカルレンズ１８を通過させられることにより一方向に集光され、偏光ビームスプリッタ７および励起ダイクロイックミラー１０を透過して、ＤＭＤ８に、Ｙ方向に延びるライン状に結像される。ＤＭＤ８に結像されたレーザ光Ｌ_１の内、オン状態となっているＤＭＤ８の微小可動ミラーにより偏向されたレーザ光Ｌ_１のみが、照射光学系９に入射され、リレーレンズ２８によってリレーされた後、ガルバノミラー２９によってＸ方向に走査される。

走査されたレーザ光Ｌ_１は、瞳投影レンズ３０、結像レンズ３１および対物レンズ３２を介して、ＤＭＤ８におけるオン状態の微小可動ミラーと同一のパターンで試料Ａに照射される。
特に、Ｙ方向に延びるライン状に結像されたレーザ光Ｌ_１の内、Ｙ方向に間隔をあけて１個ずつ、相互に離れた微小可動ミラーをオン状態に切り替え、その周囲の微小可動ミラーをオフ状態にすることにより、図２（ｂ）に示されるように、複数のスポット光が間隔をあけて一列に並ぶパターンで観察用のレーザ光Ｌ_１を試料Ａに照射することができる。

これにより、試料Ａに照射される各スポットは、回折限界スポットとなる。
また、Ｘ方向に１回走査される毎に、オン状態となる微小可動ミラーをＹ方向に１個ずつずらして行くことで、試料Ａの観察範囲の全面にわたって隙間なくレーザ光Ｌ_１を照射することができる。

試料Ａにおいて各スポットが形成された位置で発生した蛍光Ｆは、対物レンズ３２により集光され、結像レンズ３１、瞳投影レンズ３０、ガルバノミラー２９およびリレーレンズ２８を介してＤＭＤ８の同一のオン状態の微小可動ミラーに戻り、共通光路６に偏向されて戻される。

このとき、十分に面積が小さい単一の微小可動ミラーは、共焦点ピンホールとして機能し、試料Ａにおける観察用のレーザ光Ｌ_１の集光位置からの蛍光Ｆのみが共通光路６に偏向されて戻り、その周囲から発生した蛍光は共通光路６に戻らないようにカットされる。

共通光路６に戻った蛍光Ｆは、励起ダイクロイックミラー１０によって共通光路６から分岐され、バリアフィルタ３３、リレーレンズ３４、ガルバノミラー３６およびリレーレンズ３５を介して２次元ＣＣＤ３７の撮像面に結像される。ガルバノミラー３６を照射光学系９のガルバノミラー２９に同期させてＸ方向に走査することにより２次元ＣＣＤ３７におけるライン状の結像位置をＸ方向に変化させて、２次元的な蛍光画像を取得することができる。

第２のレーザ光源３から発せられた刺激用のレーザ光Ｌ_２は、λ／２板１９によって偏光方向を整えられた後、ミラー２０、合成ダイクロイックミラー１３および偏光ビームスプリッタ１４において反射される。そして、音響光学素子２３がオン状態となったときに、音響光学素子２３を通過してビーム均質化光学系２４によりガウシアン分布を補正され、ビームエキスパンダ２５によって光束径が調節される。刺激用のレーザ光Ｌ_２の光束径は、観察用のレーザ光Ｌ_１の光束径より小さくなるように制限される。

そして、光軸調整ミラー２６の作動により、光軸位置を調節される。シリンドリカルレンズ２７が光軸に挿入されている場合には、該シリンドリカルレンズ２７を通過させられることにより一方向に集光され、偏光ビームスプリッタ７により偏向され、励起ダイクロイックミラー１０を透過して、ＤＭＤ８に、Ｙ方向に延びるライン状に結像される。

シリンドリカルレンズ２７が光軸から離脱されている場合には、ビームエキスパンダ２５によって調整された光束径のまま、ＤＭＤ８に照射される。ＤＭＤ８に照射されたレーザ光の内、オン状態となっているＤＭＤ８の微小可動ミラーにより偏向されたレーザ光Ｌ_２のみが、照射光学系９に入射され、リレーレンズ２８によってリレーされた後、ガルバノミラー２９によってＸＹ方向に走査される。
走査されたレーザ光Ｌ_２は、瞳投影レンズ３０、結像レンズ３１および対物レンズ３２を介して、ＤＭＤ８におけるオン状態の微小可動ミラーと同一のパターンで試料Ａに照射される。

この場合において、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、刺激用光路５に設けられたビームエキスパンダ２５によって刺激用のレーザ光Ｌ_２の光束径が調節されるので、ＤＭＤ８の微小可動ミラーのオンオフパターンのみによって、試料Ａへの照射パターンを決定する場合と比較して、捨ててしまうレーザ光Ｌ_２を少なくして、レーザ光Ｌ_２の利用効率を高め、高い強度の刺激用のレーザ光Ｌ_２を試料Ａに照射することができるという利点がある。

次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いた観察方法について以下に説明する。
第１の観察方法は、図２（ａ）に示されるように、刺激用光路５に設けられているシリンドリカルレンズ２７を光軸上に挿入し、光軸調整ミラー２６の作動により、ＤＭＤ８面上における刺激用のレーザ光Ｌ_２の照射範囲Ｂ_２を観察用のレーザ光Ｌ_１の照射範囲Ｂ_１に対してＸ方向前方に微小可動ミラー数個分シフトさせて行われる。図中、四角形はオン状態の微小可動ミラー８ａを示している。

観察用光路４の音響光学素子１５および刺激用光路５の音響光学素子２３を同時にオン状態に切り替えて、ガルバノミラー２９によりＸ方向に走査する。
刺激用光路５のビームエキスパンダ２５を作動させ、光束径を絞っておくことで、ＤＭＤ８の不要な領域に照射させて捨ててしまう刺激用のレーザ光Ｌ_２を低減し、高い利用効率で、強度の高い刺激用のレーザ光Ｌ_２を試料Ａに照射して効果的な刺激を行うことができる。

そして、この第１の観察方法によれば、試料Ａに照射した刺激用のレーザ光Ｌ_２のスポットＣ_２の位置を、その直後に観察用のレーザ光Ｌ_１のスポットＣ_１が通過するので、刺激と観察との時間差を極めて小さくすることができる。すなわち、刺激直後の試料Ａの変化を観察することができるという利点がある。

第２の観察方法は、図３に示されるように、観察用のレーザ光Ｌ_１と刺激用のレーザ光Ｌ_２とを切り替えて照射する。まず、図３（ａ）に示されるように、刺激用光路５の音響光学素子２３がオン状態となったときに、ＤＭＤ８面上の照射範囲Ｂ_２にほぼ等しいライン状の領域の微小可動ミラー８ａをオン状態に切り替え、ガルバノミラー２９の作動によって、図３（ｂ）に示されるように、試料Ａにおける照射範囲が刺激領域Ｄに一致するようにＸＹ２方向にオフセットさせ、かつ、刺激領域に合わせて刺激用のレーザ光Ｌ_２のスポットＣ_２をＸ方向に走査させる。これにより観察範囲内の所望の部分的な領域に刺激用のレーザ光Ｌ_２を照射することができる。

この後に、刺激用光路５の音響光学素子２３をオフ状態に切り替え、観察用光路４の音響光学素子１５をオン状態に切り替えて、図３（ｃ），（ｄ）に示されるように、第１の観察方法と同様にして、観察範囲の全体にわたって観察用のレーザ光Ｌ_１を照射し、２次元的な蛍光画像を取得する。
このようにすることで、刺激用光路５のビームエキスパンダ２５の作動により光束径を絞るので、ＤＭＤ８の不要な領域に照射させて捨ててしまう刺激用のレーザ光Ｌ_２を低減し、高い利用効率で、強度の高い刺激用のレーザ光Ｌ_２を試料Ａに照射して効果的な刺激を行うことができる。また、比較的狭い領域への刺激用のレーザ光Ｌ_２の照射と、蛍光観察とを、音響光学素子の切替速度相当の速度で高速に切り替えて行うことができる。

なお、第２の観察方法においては、刺激用のレーザ光Ｌ_２の照射領域ＤをＸＹ２方向にオフセットさせることとしたが、Ｙ方向へのオフセットを行わない場合には、ガルバノミラー２９としてＸ方向のみに走査可能なものを準備すればよい。

第３の観察方法は、刺激用光路５内のシリンドリカルレンズ２７を光軸から離脱させ、刺激用のレーザ光Ｌ_２をライン状に形成することなく円形の光束のままでＤＭＤ８に照射することにより行われる。ＤＭＤ８においては、刺激用光路５の音響光学素子２３がオン状態となったときには、図４（ａ）に示されるように、刺激用のレーザ光Ｌ_２の照射範囲Ｂ_２にほぼ等しい円形領域の微小可動ミラー８ａがオン状態に切り替えられる。オン状態の円形領域は、ガルバノミラー２９の作動によって、図４（ｂ）に示されるように、試料ＡにおけるスポットＣ_２が刺激領域に一致するようにＸＹ２方向にオフセットさせる。観察用のレーザ光Ｌ_１の照射は第１，第２の観察方法と同じである。

このようにすることで、刺激用光路５のビームエキスパンダ２５の作動により光束径を絞るので、ＤＭＤ８の不要な領域に照射させて捨ててしまう刺激用のレーザ光Ｌ_２を低減し、高い利用効率で、強度の高い刺激用のレーザ光Ｌ_２を試料Ａに照射して効果的な刺激を行うことができる。特に、刺激用のレーザ光Ｌ_２を走査しないので、レーザ光Ｌ_２の利用効率が空間的のみならず時間的にも高く、短時間に刺激することができる。

また、比較的狭い領域への刺激用のレーザ光Ｌ_２の照射と、蛍光観察とを高速に切り替えて行うことができる。
なお、ＤＭＤ８面上における刺激用のレーザ光Ｌ_２の照射範囲Ｂ_２全体の微小可動ミラー８ａをオン状態に切り替えることにしたが、その内の一部の微小可動ミラー８ａのみをオン状態にしてもよい。既にビームエキスパンダ２５により照射範囲が制限されているので、レーザ光Ｌ_２の強度は高められており、このようにすることで、刺激を行いたい微小領域、例えば、図５に示されるように、刺激を行いたい細胞Ｘの特定部位に絞って高い強度の刺激用のレーザ光Ｌ_２を照射することができる。また、刺激を行いたい領域に隣接する領域における細胞Ｘの褪色や劣化を防止することができる。

第４の観察方法は、第３の観察方法においてビームエキスパンダ２５による光束の縮小率を高め、図６（ａ）に示されるように、ＤＭＤ８面上の極めて小さい照射範囲Ｂ_２、例えば、単一の微小可動ミラー８ａのみに集光するようにしたものである。これにより、試料Ａに照射される刺激用のレーザ光Ｌ_２は、図６（ｂ）に示されるように、回折限界スポットとなる。照射範囲が１点に集中しているため、レーザ光Ｌ_２の利用効率が高く、極めて短時間に刺激を行うことができるという利点がある。
なお、ＤＭＤ８面上に集光している刺激用のレーザ光Ｌ_２の集光位置を光軸方向に若干ずらすことにより、複数の微小可動ミラー８ａ上にレーザ光Ｌ_２を照射させ、その照射範囲Ｂ_２の微小可動ミラー８ａをオン状態にすることで、数ミクロン以上のポイントマクロ刺激が可能となる。

次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡４０について、図７および図８を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係るレーザ顕微鏡４０は、図７に示されるように、ＤＭＤ８の２つの異なるオン状態を利用する点で、単一のオン状態を利用する第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と相違している。
ＤＭＤ８の２つの異なるオン状態は、図８に示されるように、微小可動ミラー８ａを逆方向にほぼ同一の角度で傾斜させた状態である。

本実施形態においては、観察用光路４を通過してきた観察用のレーザ光Ｌ_１を第１のオン状態となった微小可動ミラー８ａによって照射光学系９に入射させ、刺激用光路５を通過してきた刺激用のレーザ光Ｌ_２を第２のオン状態となった微小可動ミラー８ａによって同一の照射光学系９に入射させるようになっている。このようにすることで、観察用のレーザ光Ｌ_１と刺激用のレーザ光Ｌ_２とをＤＭＤ８面上で合成することが可能となる。したがって、両レーザ光Ｌ_１，Ｌ_２を共通光路６に合流させる必要がなく、偏光ビームスプリッタ７を省略することができる。

次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡５０について、図９〜図１１を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係るレーザ顕微鏡５０も、ＤＭＤ８の２つの異なるオン状態を利用する点で、単一のオン状態を利用する第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と相違している。また、観察用のレーザ光Ｌ_１を通過させる第１の照射光学系９Ａと、刺激用のレーザ光Ｌ_２を通過させる第２の照射光学系９Ｂとを有している点においても相違している。

本実施形態においては、共通光路６を通過してＤＭＤ８に入射される観察用のレーザ光Ｌ_１を第１のオン状態となった微小可動ミラー８ａによって第１の照射光学系９Ａに入射させ、共通光路６を通過してＤＭＤ８に入射される刺激用のレーザ光Ｌ_２を第２のオン状態となった微小可動ミラー８ａによって第２の照射光学系９Ｂに入射させるようになっている。図中、符号５１，５２は、第２の照射光学系９Ｂに設けられたミラーである。

２つの照射光学系９Ａ，９Ｂは、それぞれ、第１の実施形態と同様の構成要素、すなわち、リレーレンズ２８Ａ，２８Ｂ、ガルバノミラー２９Ａ，２９Ｂ、瞳投影レンズ３０Ａ，３０Ｂおよび結像レンズ３１Ａ，３１Ｂをそれぞれ備えている。また、２つの照射光学系９Ａ，９Ｂは、共通の対物レンズ３２の前段に配置されたダイクロイックミラー５３により合流されている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡５０によれば、観察用のレーザ光Ｌ_１および刺激用のレーザ光Ｌ_２を別個のガルバノミラー２９Ａ，２９Ｂにより走査するので、光軸調整ミラー２６によって、図１１（ａ），（ｃ），（ｅ）に示されるように、両レーザ光Ｌ_１，Ｌ_２のＤＭＤ８面上への照射範囲Ｂ_１，Ｂ_２を完全にずらしておくことにより、図１１（ｂ），（ｄ），（ｆ）に示されるように、第１の実施形態における第２〜第４の観察方法においても、観察と刺激とを同時に行うことができるという利点がある。

上記各実施形態においては、ビームエキスパンダ２５により光束径を絞ることで、ＤＭＤへの照射範囲を制限したが、これに代えて、共通光路に配置した波面変換素子によって光束径を絞ることにしてもよい。波面変換素子は、レーザ光の波面を高速に切替可能なので、例えば、図１の偏光ビームスプリッタ７，１４を全反射ミラーに置き換えて、刺激用光路５と観察用光路４とを完全に共通化しても、ＤＭＤや音響光学素子の切替動作に同期して光束径を変更するように制御することで、刺激と観察とを高速に切り替えることができる。刺激用光路５と観察用光路４とを共通化することで、光路構成が簡単になるので、製造が容易になり安価に製造することができるという利点がある。

また、上記実施形態においては、微小素子アレイとして、レーザ光を可変パターンで偏向する多数の微小可動ミラーを備えたＤＭＤを例示したが、これに代えて、レーザ光を可変パターンで透過可能な多数の液晶素子を備えた液晶素子アレイを採用してもよい。
また、シリンドリカルレンズに代えて、例えば、パウエルレンズと凸レンズとを組み合わせた他のライン集光光学系を採用してもよい。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡を示すブロック図である。 図１のレーザ顕微鏡による第１の観察方法を説明する（ａ）ＤＭＤ面上における照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｂ）試料面上におけるスポット位置をそれぞれ示す図である。 図１のレーザ顕微鏡による第２の観察方法を説明する（ａ）ＤＭＤ面上における刺激用のレーザ光の照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｂ）試料面上における刺激用のレーザ光のスポット位置、（ｃ）ＤＭＤ面上における観察用のレーザ光の照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｄ）試料面上における観察用のレーザ光のスポット位置をそれぞれ示す図である。 図１のレーザ顕微鏡による第３の観察方法を説明する（ａ）ＤＭＤ面上における刺激用のレーザ光の照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｂ）試料面上における刺激用のレーザ光のスポット位置をそれぞれ示す図である。 図４（ａ）の刺激用のレーザ光の照射範囲内の内の刺激を行いたい細胞の特定部位のみの微小可動ミラーをオン状態に切り替えた照射例を示す図である。 図１のレーザ顕微鏡による第４の観察方法を説明する（ａ）ＤＭＤ面上における刺激用のレーザ光の照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｂ）試料面上における刺激用のレーザ光のスポット位置をそれぞれ示す図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡を示すブロック図である。 図７のレーザ顕微鏡におけるＤＭＤの微小可動ミラーの状態とレーザ光の偏向方向を説明する図である。 本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡を示すブロック図である。 図９のレーザ顕微鏡におけるＤＭＤの微小可動ミラーの状態とレーザ光の偏向方向を説明する図である。 図９のレーザ顕微鏡による（ａ）第２の観察方法を説明するＤＭＤ面上における刺激用のレーザ光の照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｂ）試料面上における刺激用のレーザ光のスポット位置、（ｃ）第３の観察方法を説明するＤＭＤ面上における刺激用のレーザ光の照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｄ）試料面上における刺激用のレーザ光のスポット位置、（ｅ）第４の観察方法を説明するＤＭＤ面上における刺激用のレーザ光の照射範囲とオン状態の微小可動ミラーの位置、（ｆ）試料面上における刺激用のレーザ光のスポット位置をそれぞれ示す図である。

符号の説明

Ａ 試料
Ｂ_１，Ｂ_２ 照射範囲
Ｆ 蛍光
Ｌ_１，Ｌ_２ レーザ光
１，４０，５０ レーザ顕微鏡
２，３ レーザ光源
４ 観察用光路
５ 刺激用光路
６ 共通光路
７ 偏光ビームスプリッタ（光路合成手段）
８ ＤＭＤ（微小素子アレイ、光路合成手段）
８ａ 微小可動ミラー（微小素子、微小偏向素子）
９，９Ａ，９Ｂ 照射光学系
１１ 検出光学系
１５，２３ 音響光学素子（レーザ光選択手段）
２５ ビームエキスパンダ（照射制限手段）
２６ 光軸調整ミラー（照射位置変更手段）
２７ シリンドリカルレンズ（ライン集光レンズ）
２９，２９Ａ，２９Ｂ ガルバノミラー（スキャナ）

Claims (12)

1. 刺激用および観察用のレーザ光を発生するレーザ光源と、
   該レーザ光源からのレーザ光を可変パターンで選択する多数の微小素子を配列してなる微小素子アレイと、
   該微小素子アレイにより選択されたパターンのレーザ光を少なくとも一方向に走査するスキャナと、
   該スキャナにより走査されたレーザ光を試料に照射する照射光学系と、
   試料において発生し、前記照射光学系および前記微小素子アレイを介して戻る蛍光を検出する検出光学系と、
   前記微小素子アレイと前記レーザ光源との間に配置され、前記微小素子アレイへの刺激用のレーザ光の照射範囲を観察用のレーザ光の前記スキャナによる走査範囲の一部に制限する照射制限手段とを備えるレーザ顕微鏡。
2. 前記刺激用のレーザ光および前記観察用のレーザ光を導光する共通光路と、該共通光路に設けられ微小偏向素子アレイに入射させるレーザ光を選択するレーザ光選択手段とを備え、
   前記照射制限手段が、共通光路に配置された波面変換素子である請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
3. 前記刺激用のレーザ光を導光する刺激用光路と、前記観察用のレーザ光を導光する観察用光路と、これらの光路を合成する光路合成手段とを備え、
   前記照射制限手段が前記刺激用光路に設けられている請求項１に記載のレーザ顕微鏡。
4. 前記刺激用光路に、刺激用のレーザ光の光束を前記微小素子アレイ上で線状に結像させるライン集光光学系を備える請求項３に記載のレーザ顕微鏡。
5. 前記ライン集光光学系が、前記刺激用光路に挿脱可能に設けられている請求項４に記載のレーザ顕微鏡。
6. 前記照射制限手段が、微小素子アレイにおける刺激用のレーザ光の照射範囲を回折限界スポットまで縮小可能である請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
7. 前記観察用のレーザ光の前記微小素子アレイへの照射位置に対して、前記刺激用のレーザ光の前記微小素子アレイへの照射位置を異ならせる照射位置変更手段を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
8. 前記スキャナが、前記レーザ光を光軸に直交する２方向に走査する請求項１から請求項６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
9. 前記微小素子アレイの微小素子が、異なる２方向に傾斜可能に設けられた微小偏向素子であり、
   前記光路合成手段が、前記微小素子アレイによって構成されている請求項３に記載のレーザ顕微鏡。
10. 前記微小素子アレイの微小素子が、異なる２方向に傾斜可能に設けられた微小偏向素子であり、
    前記微小素子アレイから試料までの光路が、観察用のレーザ光を導光する観察用照射光路と、刺激用のレーザ光を導光する刺激用照射光路と、これらの光路を合成する照射光路合成手段とを備え、
    前記スキャナが、前記観察用照射光路および前記刺激用照射光路にそれぞれ設けられている請求項７に記載のレーザ顕微鏡。
11. 前記刺激用照射光路に設けられたスキャナが、前記刺激用のレーザ光を光軸に直交する２方向に走査する請求項１０に記載のレーザ顕微鏡。
12. 前記微小素子アレイが、該微小素子アレイへの刺激用のレーザ光の照射範囲内においてレーザ光を選択する微小素子を設定する請求項１に記載のレーザ顕微鏡。

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