JP6161424B2 - 顕微鏡システム - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡システムに関するものである。

従来、複数の隣接する部分画像を組み合わせて、より広い視野の画像、いわゆるマップ画像を生成する顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に記載の顕微鏡システムは、試料の存在位置が対物レンズの焦点位置の光軸方向に分布している場合であっても、合成したマップ画像から試料の存在の有無を判定できるようにするため、ピンホールの口径を増加し、試料における対物レンズの焦点面以外の光軸上から発せられる蛍光も検出して部分画像を取得している。

特開２０１０−８５４２０号公報

しかしながら、従来の顕微鏡システムでは、対物レンズの焦点位置の光軸方向に前後する部分は単位面積当たりのレーザ密度が低いため、蛍光色素を励起できない領域が存在してしまう可能性がある。また、多光子励起は対物レンズの焦点面以外では起きないため、従来の顕微鏡システムでは、多光子励起により試料における対物レンズの焦点面以外の光軸上から発せられる蛍光を検出することはできないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料における対物レンズの焦点面の光軸方向に分布する情報を含むマップ画像を簡易に生成することができる顕微鏡システムを提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、試料が載置され、該試料の位置を調節可能な電動ステージと、光源から発せられたレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を前記電動ステージ上の前記試料に集光する対物レンズと、該対物レンズによるレーザ光の照射により前記試料において発生した蛍光を前記レーザ光の光路から分岐させる光路分岐部と、該光路分岐部により前記レーザ光の光路から分岐された前記蛍光を検出して前記試料の画像を取得する画像取得部と、前記試料に対して前記画像取得部により所定の視野範囲ごとに分割して取得する部分画像の取得位置を設定する取得位置設定部と、前記光源と前記光路分岐部との間の光路上に配され、前記レーザ光の断面形状を変更可能な形状変更部と、前記取得位置設定部によって設定された前記取得位置に合わせて前記電動ステージおよび／または前記スキャナにより前記視野範囲を移動させ、前記形状変更部により被写界深度を広げる方向にレーザ光の断面形状を変更して前記画像取得部により前記部分画像を取得させる制御部と、前記取得位置ごとに取得された前記部分画像を配列してマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備える顕微鏡システムを提供する。
上記構成においては、前記レーザ光の照射により、前記試料において多光子励起効果によって前記蛍光を発生させることとしてもよい。

本発明によれば、電動ステージに試料を載置すると、取得位置設定部により部分画像の取得位置が設定され、制御部が、電動ステージおよび／またはスキャナによりその取得位置に合わせて視野範囲を移動させる。そして、各取得位置において、レーザ光がスキャナにより走査されて対物レンズにより試料に照射され、試料からの蛍光が画像取得部により検出されて部分画像が取得される。これにより、マップ画像生成部によって、取得位置ごとに部分画像が配列されて、より広い視野範囲にわたる試料のマップ画像が生成される。

この場合において、制御部が、部分画像を取得する際に形状変更部によって被写界深度を広げる方向にレーザ光の断面形状を変更することで、画像取得部により、対物レンズの焦点面から発せられる蛍光だけでなく、対物レンズの焦点面以外の光軸上から発せられる蛍光をも検出して部分画像を取得することができる。その結果、対物レンズの焦点面の光軸方向に分布する情報を含むマップ画像を生成することができる。

上記構成においては、前記形状変更部が、入射したレーザ光の光束径を細くし、光束中心の密度を増大させて射出する光学部材であることとしてもよい。
このように構成することで、レーザ光の光軸に交差する方向の分解能の低下を抑え、開口数を小さくして被写界深度を広げることができる。

上記構成においては、前記形状変更部が、通過するレーザ光の光束径を制限するメカ絞り部材であることとしてもよい。
このように構成することで、レーザ光の光軸に交差する方向の分解能が低下するものの、開口数を小さくして被写界深度をより広い範囲まで広げることができる。

上記構成においては、前記形状変更部が、前記対物レンズの瞳位置に輪帯状の光束形状のレーザ光を入射させるアキシコンプリズムであることとしてもよい。
このように構成することで、レーザ光の光軸に交差する方向の分解能を増加するとともに、レーザ光を長焦点化して被写界深度を広げることができる。

上記構成においては、前記形状変更部が、レーザ光の位相を変調して、前記試料にベッセル状のレーザ光を生成する位相変調部材であることとしてもよい。
このように構成することで、レーザ光の光軸に交差する方向の分解能を増加するとともに、レーザ光を長焦点化して被写界深度を広げることができる。

本発明によれば、試料における対物レンズの焦点面の光軸方向に分布する情報を含むマップ画像を簡易に生成することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムの概略構成図である。 モニタに表示される試料の観察範囲および部分画像の取得位置を示す図である。

以下、本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムについて、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示されるように、レーザ走査型顕微鏡３と、レーザ走査型顕微鏡３を制御するコントローラ５とを備えている。

レーザ走査型顕微鏡３は、試料（図示略）が載置される電動ステージ１１と、レーザ光を発生する光源１３と、光源１３から発せられたレーザ光の断面形状を変更可能なビーム形状変更部（形状変更部）１５と、ビーム形状変更部１５を通過したレーザ光を走査するスキャナ１７と、スキャナ１７により走査されたレーザ光を試料に照射し、試料において発生する蛍光を集光する対物レンズ１９と、対物レンズ１９により集光された蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー（図示略）と、ダイクロイックミラーにより分岐された蛍光を検出して試料の画像を取得する画像取得部２１と備えている。

電動ステージ１１は、図示しない３個のモータを備えており、相互に直交するＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動軸に沿って独立して移動することができるようになっている。これにより、電動ステージ１１は、載置された試料を３次元方向に移動させることができるようになっている。

ビーム形状変更部１５は、例えばビームエキスパンダ（光学部材）であり、入射したレーザ光の光束径を光学的に細くして射出するようになっている。ビームエキスパンダによりレーザ光の光束径を細くすることで、光束中心の密度を増大して長焦点化し、被写界深度を広げることができる。かつ、レーザ光のガウシアン分布の強度の弱い裾野部分が対物レンズ１９の瞳を満たすので、レーザ光の断面形状を変更する前と比較して、レーザ光の光軸に交差する方向（Ｘ，Ｙ方向）の分解能の低下を抑えることができる。また、対物レンズ１９の瞳に入射するレーザ光の光束中心の密度が増大しているので散乱の影響にも強い。

スキャナ１７は、例えば、近接ガルバノミラーであり、相互に直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー（図示略）を対向させて構成されている。このスキャナ１７は、２枚のガルバノミラーを揺動させてレーザ光を偏向することで、試料上でレーザ光を２次元的に走査することができるようになっている。

コントローラ５は、試料の画像を分割して取得する部分画像の取得位置を設定する取得位置設定部３１と、取得位置設定部３１によって設定された取得位置において画像取得部２１により部分画像を取得するようレーザ走査型顕微鏡３を制御する制御部３３と、取得位置ごとに取得された部分画像を配列してマップ画像を生成するマップ画像生成部３５とを備えている。

また、コントローラ５には、図２に示すようなモニタ３７が接続されており、画像取得部２１により取得された画像やマップ画像生成部により生成した画像等をモニタ３７に表示することができるようになっている。

取得位置設定部３１は、図示しない入力部によりユーザが入力する指示に従い、図２に示すように、試料の画像を取得する観察範囲Ｋを設定するようになっている。また、取得位置設定部３１は、設定した観察範囲Ｋを対物レンズ１９の視野範囲ごとに複数の分割領域に分割し、各分割領域を画像取得部２１により部分画像を取得する複数の取得位置Ｐとして設定するようになっている。

取得位置設定部３１により設定された観察範囲Ｋおよび取得位置Ｐは、モニタ３７上で試料の画像に表示されるようになっている。また、取得位置設定部３１により部分画像の取得位置Ｐが設定されると、各取得位置Ｐの座標情報がマップ画像生成部３５に送られるようになっている。

制御部３３は、取得位置設定部３１により設定された取得位置Ｐに合わせて電動ステージ１１およびスキャナ１７により視野範囲を移動させるようになっている。取得位置Ｐの移動順序、すなわち部分画像の取得順序は、ユーザが設定することとしてもよいし、取得位置設定部３１により設定されることとしてもよい。

また、制御部３３は、画像取得部２１により各取得位置Ｐにおいて部分画像を取得する際に、ビーム形状変更部１５により被写界深度を広げる方向にレーザ光の断面形状を変更するようになっている。

マップ画像生成部３５は、画像取得部２１により取得された各取得位置Ｐの部分画像をそれぞれの座標情報に従って配列し、観察範囲全体の２次元的なマップ画像を生成するようになっている。

このように構成された顕微鏡システム１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１により試料のマップ画像を取得するには、まず、ユーザが、電動ステージ１１に試料を載置し、コントローラ５を作動させて入力部により試料の観察範囲Ｋを指示する。

コントローラ５においては、取得位置設定部３１により、図２に示すように、ユーザの指示に従い試料の観察範囲Ｋが設定される。そして、取得位置設定部３１により、設定した観察範囲Ｋが所定の視野範囲ごとに分割され、部分画像の複数の取得位置Ｐが設定される。

次いで、制御部３３により電動ステージ１１およびスキャナ１７が制御され、部分画像の最初の取得位置Ｐに合わせて視野範囲が移動させられる。そして、光源１３から発せられたレーザ光がビーム形状変更部１５により被写界深度を広げる方向に断面形状を変更された後、スキャナ１７により偏向されて対物レンズ１９により試料に照射される。これにより、スキャナ１７の揺動動作に応じて試料上でレーザ光が２次元的に走査される。

レーザ光が照射されることにより試料において蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ１９により集光され、スキャナ１７を介してダイクロイックミラーにより分岐されて画像取得部２１により検出される。これにより、画像取得部２１において、試料の最初の取得位置Ｐの２次元的な部分画像が取得される。

続いて、制御部３３により電動ステージ１１およびスキャナ１７が制御され、部分画像の２番目の取得位置Ｐに合わせて視野範囲が移動させられる。そして、最初の取得位置Ｐと同様に、光源１３から発せられたレーザ光が２次元的に走査され、試料からの蛍光が画像取得部２１により検出されることにより、２番目の取得位置Ｐの部分画像が取得される。

このように、制御部３３によりレーザ走査型顕微鏡３が制御され、画像取得位置設定部３１により設定された部分画像の各取得位置Ｐにおいてそれぞれ部分画像が取得される。

次いで、マップ画像生成部３５の作動により、画像取得部２１によって取得された全ての取得位置Ｐの部分画像がそれぞれの座標情報に従って配列され、観察範囲全体の２次元的なマップ画像が生成される。これにより、より広い視野範囲にわたるマップ画像によって試料を観察することができる。

この場合において、制御部３３が、各取得位置Ｐにおいて部分画像を取得する際に、ビーム形状変更部１５によって被写界深度を広げる方向にレーザ光の断面形状を変更することで、画像取得部２１により、対物レンズ１９の焦点面から発せられる蛍光だけでなく、対物レンズ１９の焦点面以外の光軸上から発せられる蛍光をも検出して部分画像を取得することができる。
したがって、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、対物レンズ１９の焦点面の光軸方向に分布する情報を含むマップ画像を簡易に生成することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、ビーム形状変更部１５として、ビームエキスパンダを例示して説明したが、レンズ部材を用いたものではなく、焦点距離の異なる凹面ミラーを組み合わせたもの（光学部材）でもよい。

また、第１変形例は、ビーム形状変更部として、光源１３から発せられたレーザ光を通過させる際にレーザ光の光束径を制限するメカ絞り（メカ絞り部材）を採用することとしてもよい。

メカ絞りにより、レーザの光束のうち半径方向の外側部分をカットし開口数を小さくすることで、長焦点化して被写界深度を広げることができる。この場合、レーザ光の光軸に交差するＸ，Ｙ方向の分解能が低下するものの、被写界深度をさらに広げることができ、散乱の影響にも強い。

また、第２変形例は、ビーム形状変更部として、レーザ光の位相を変調して対物レンズ１９の瞳位置に輪帯状の光束形状のレーザ光を入射させるアキシコンプリズムを採用することとしてもよい。この場合、同一屈折率、同一頂角を有する一対の円錐状のプリズムを互いに光軸を一致させて頂点どうしを対向させて配置したアキシコンプリズムを採用することとすればよい。

このようなアキシコンプリズムにより、光源１３から発せられた円柱状の光束形状を有するレーザ光を一方のプリズムに入射して他方のプリズムから輪帯状の光束形状の平行光に変換して射出することで、長焦点化して被写界深度を広げることができる。例えば、レーザ光の断面形状を変更する前と比較して、レーザ光の光軸に交差する方向の分解能を増加するとともに、被写界深度をさらに広げることができる。

また、第３変形例は、ビーム形状変更部として、ＬＣＯＳ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｏｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ、位相変調部材）を採用し、レーザ光の位相を変調して試料にベッセル状のレーザ光を生成するようにしてもよい。この場合、対物レンズ１９の瞳位置と共役な位置にＬＣＯＳを配置することとすればよい。

ＬＣＯＳにより、光源１３から発せられたレーザ光の波面形状を位相変調により変化させて試料にベッセル状のレーザ光を生成することで、長焦点化して被写界深度を広げることができる。

以上、本発明によれば、ピンホールを開くことにより焦点面以外の光軸から発生する蛍光を取得する従来の方法と異なり、照明側のスポットを長くすることにより、焦点面以外の領域でも効率的に蛍光を励起することができ、焦点面以外の光軸上から発する蛍光を取得したマップ画像を簡易に作成することができる。
特に、多光子励起の場合は、光子密度が極めて高い領域でのみ蛍光が発生するので、本発明のように照明側のスポットを長くすることにより、焦点面以外の領域の光子密度を高め、多光子励起による蛍光を発生させることができるので有効である。

１ 顕微鏡システム
１１ 電動ステージ
１５ ビーム形状変更部（形状変更部）
１７ スキャナ
１９ 対物レンズ
２１ 画像取得部
３１ 取得位置設定部
３３ 制御部
３５ マップ画像生成部
Ｐ 取得位置

Claims (6)

1. 試料が載置され、該試料の位置を調節可能な電動ステージと、
   光源から発せられたレーザ光を走査するスキャナと、
   該スキャナにより走査されたレーザ光を前記電動ステージ上の前記試料に集光する対物レンズと、
   該対物レンズによるレーザ光の照射により前記試料において発生した蛍光を前記レーザ光の光路から分岐させる光路分岐部と、
   該光路分岐部により前記レーザ光の光路から分岐された前記蛍光を検出して前記試料の画像を取得する画像取得部と、
   前記試料に対して前記画像取得部により所定の視野範囲ごとに分割して取得する部分画像の取得位置を設定する取得位置設定部と、
   前記光源と前記光路分岐部との間の光路上に配され、前記レーザ光の断面形状を変更可能な形状変更部と、
   前記取得位置設定部によって設定された前記取得位置に合わせて前記電動ステージおよび／または前記スキャナにより前記視野範囲を移動させ、前記形状変更部により被写界深度を広げる方向にレーザ光の断面形状を変更して前記画像取得部により前記部分画像を取得させる制御部と、
   前記取得位置ごとに取得された前記部分画像を配列してマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備える顕微鏡システム。
2. 前記レーザ光の照射により、前記試料において多光子励起効果によって前記蛍光を発生させる請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記形状変更部が、入射したレーザ光の光束を光学的に細くし、光束中心の密度を増大させて射出する光学部材である請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
4. 前記形状変更部が、通過するレーザ光の光束径を制限するメカ絞り部材である請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
5. 前記形状変更部が、前記対物レンズの瞳位置に輪帯状の光束形状のレーザ光を入射させるアキシコンプリズムである請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
6. 前記形状変更部が、レーザ光の位相を変調して、前記試料にベッセル状のレーザ光を生成する位相変調部材である請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。

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