JP6385711B2

JP6385711B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP6385711B2
Application number: JP2014093516A
Authority: JP
Inventors: 本田　進; 進本田
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Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2018-09-05
Anticipated expiration: 2034-04-30
Also published as: JP2015210470A

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、空間光変調素子により波面を変調したレーザ光をガルバノミラーユニットを経由させて対物レンズに入射させることで、レーザ光の集光点を標本の深さ方向に変化させながら深さ方向に交差する２次元的な画像を取得する顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

このような顕微鏡装置においては、ガルバノミラーユニットの揺動により、対物レンズの瞳面にリレーされる変調波面が瞳面上において光軸と直交する方向にシフトしてしまい、光学性能が劣化してしまうという問題がある。これに対し、特許文献１に記載の顕微鏡装置は、２枚の揺動ミラーの内の高速の揺動ミラーと空間光変調素子および対物レンズの瞳をそれぞれ共役な位置に配置するとともに、低速の揺動ミラーの揺動角度に応じて空間光変調素子の変調パターンを変化させるようになっている。これにより、高速の揺動ミラーと対物レンズの瞳との位置関係を一定に保つとともに、対物レンズの瞳位置での低速の揺動ミラーの揺動動作に応じたレーザ光のシフトも打ち消し、光学性能が低下するのを防止している。

特開２０１１−１７０３３８号公報

しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡装置により、標本の深さ方向の位置を変化させずに２次元的な画像を取得しようとすると、空間光変調素子による波面の変調を伴わないため、対物レンズの瞳位置での低速の揺動ミラーの揺動動作に応じたレーザ光のシフトを打ち消すことができない。そのため、標本の深さ方向の位置を変化させない場合は、明るさムラが生じて高精度な２次元的な画像を取得することができないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で、標本の観察深さ位置を変化させながら明るい２次元的な画像を取得したり、標本の観察深さ位置を変化させずに高精度な２次元的な画像を取得したりすることができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源からの照明光の波面を変調可能な空間光変調部と、互いに交差する２つの方向に光を偏向可能な２つの偏向手段を有し、前記空間光変調部から出射された照明光を偏向して２次元的に走査させるスキャナと、該スキャナにより走査された照明光を標本に照射する対物レンズと、該スキャナにより偏向された照明光を前記対物レンズに導くリレー光学系と、前記対物レンズの瞳位置と一方の前記偏向手段の偏向面とが光学的に共役関係を有する第１共役状態と、前記対物レンズの瞳位置と前記２つの偏向手段の各偏向面の間の位置とが光学的に共役関係を有する第２共役状態とを切り替え可能な共役状態切替部と、前記第１共役状態において、前記空間光変調部上の像を固定して他方の前記偏向手段により前記照明光を偏向させたと仮定した場合における前記対物レンズの瞳位置にリレーされる像の移動方向とは逆方向に、前記他方の偏向手段による偏向を停止させた状態を仮定した場合における前記対物レンズの瞳位置の像が移動するように、前記他方の偏向手段による偏向に応じて、前記空間光変調部上の像を形成する前記波面の変調領域を移動させ、前記第２共役状態において、前記空間光変調部を作動させず、前記光源からの照明光を前記空間光変調部による波面の変調を伴わせずに前記スキャナに入射させる変調領域調節部とを備え、前記空間光変調部が、前記第１共役状態において前記一方の偏向手段の偏向面と光学的に共役関係を有する顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、空間光変調部によって波面が変調された照明光がスキャナによって偏向されてリレー光学系を介して対物レンズに導かれ、対物レンズにより集光されて２つの偏向手段による偏向に応じて標本上で２次元的に走査される。このとき、空間光変調部上に形成された波面像は、スキャナにより偏向されてリレー光学系によって対物レンズの瞳位置にリレーされる。

ここで、空間光変調部により照明光の波面を変調してスキャナにより照明光を走査させることで、標本における照明光の集光点を深さ方向に変化させながら、深さ方向に交差する標本の２次元的な画像を取得することができる。この場合において、空間光変調部上の像が固定されていると、スキャナを構成する２つの偏向手段の内、対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていない偏向手段によって偏向されることにより、対物レンズの瞳位置にリレーされる像が光軸に交差する方向に移動させられる。

これに対し、共役状態切替部により、対物レンズの瞳位置と一方の偏向手段の偏向面とが光学的に共役関係を有する第１共役状態に切り替えるとともに、変調領域調節部により、他方の偏向手段による偏向に応じて空間光変調部上の像を形成する波面の変調領域を移動させることで、対物レンズの瞳位置にリレーされる像の移動が打ち消されて静止する。これにより、対物レンズの瞳全体にわたるように照明光を入射させて、最大限に明るい照明を行うことができる。
また、第１共役状態では、空間光変調部と上記一方の偏向手段とも光学的共役関係となるので、結果的に、空間光変調部は対物レンズ瞳位置と共役関係になる。したがって、空間光変調部により波面変調された照明光を対物レンズに正しく入射させることができる。

一方、空間光変調部による照明光の波面の変調を伴わずにスキャナにより照明光を走査せることで、標本の観察深さ位置を変化させずに２次元的な画像を取得することができる。この場合において、共役状態切替部により、対物レンズの瞳位置と２つの偏向手段の各偏向面の間の位置とが光学的に共役関係を有する第２共役状態に切り替えることで、２つの偏向手段の偏向による対物レンズの瞳位置での照明光の移動量が小さくなる。これにより、照明効率を向上して明るさムラを低減することができる。
したがって、簡易な構成で、標本の観察深さ位置を変化させながら明るい２次元的な画像を取得したり、標本の観察深さ位置を変化させずに高精度な２次元的な画像を取得したりすることができる。
上記発明においては、前記２つの偏向手段が、非平行な２つの軸線回りにそれぞれ揺動可能な２枚の揺動ミラーであることとしてもよい。

上記発明においては、前記共役状態切替部が、空気と異なる屈折率を有し、前記スキャナと前記リレー光学系との間の光路上に挿脱可能に形成されていることとしてもよい。

このように構成することで、例えば、照明光の光路上に共役状態切替部を挿入することにより、対物レンズの瞳位置と光学的に共役関係を有する位置が一方の偏向手段の偏向面に移動し、一方の偏向手段の偏向面に形成された像を対物レンズの瞳位置にリレーすることができる。また、照明光の光路上から共役状態切替部を脱離することにより、対物レンズの瞳位置と光学的に共役関係を有する位置が２つの偏向手段の各偏向面の間に移動し、２つの偏向手段の各偏向面の間の位置に形成された像を対物レンズの瞳位置にリレーすることができる。したがって、照明光の光路に共役状態切替部を挿脱するだけの簡易な構成で、第１共役状態と第２共役状態とを容易に切り替えることができる。

上記発明においては、前記リレー光学系が、前記対物レンズの瞳位置に像を縮小または拡大してリレーする投影倍率を有し、前記共役状態切替部が、前記リレー光学系を光軸方向に移動可能に形成されていることとしてもよい。

このように構成することで、共役状態切替部により、例えば、リレー光学系を光軸方向に移動させて、対物レンズの瞳位置と光学的に共役関係を有する位置を一方の偏向手段の偏向面まで延長することにより、一方の偏向手段の偏向面に形成される像を対物レンズの瞳位置にリレーすることができる。また、リレー光学系を反対方向に移動させて、対物レンズの瞳位置と光学的に共役関係を有する位置を２つの偏向手段の各偏向面の間まで短縮することにより、２つの偏向手段の各偏向面の間の位置に形成される像を対物レンズの瞳位置にリレーすることができる。したがって、リレー光学系を光軸方向に移動するだけの簡易な構成で、第１共役状態と第２共役状態とを容易に切り替えることができる。

上記発明においては、前記スキャナが、前記空間光変調部からの入射光軸と前記２つの偏向手段間の光軸とが平行になるように、前記空間光変調部からの照明光を前記入射光軸を含む平面に沿って折り返して一方の前記偏向手段の偏向面に入射させる折り返しミラーを備え、前記共役状態切替部が、前記折り返しミラーおよび前記一方の偏向手段を前記入射光軸に沿う方向に移動可能に形成されていることとしてもよい。

このように構成することで、共役状態切替部により、例えば、折り返しミラーおよび一方の偏向手段を入射光軸に沿う方向に移動させて、この偏向手段を他方の偏向手段に近接させることで、対物レンズの瞳位置と一方の偏向手段の偏向面の位置と光学的に共役関係にすることができる。また、折り返しミラーおよび一方の偏向手段を反対方向に移動させて、この偏向手段を他方の偏向手段から離間させることで、対物レンズの瞳位置と２つの偏向手段の各偏向面の間の位置とを光学的に共役関係にすることができる。したがって、折り返しミラーおよび一方の偏向手段を入射光軸に沿う方向に移動するだけの簡易な構成で、第１共役状態と第２共役状態とを容易に切り替えることができる。

本発明によれば、簡易な構成で、標本の観察深さ位置を変化させながら明るい２次元的な画像を取得したり、標本の観察深さ位置を変化させずに高精度な２次元的な画像を取得したりすることができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の第１共役状態を示す概略構成図である。本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の第２共役状態を示す概略構成図である。図１および図２の顕微鏡装置の空間光変調素子における変調領域を示す図である。図１および図２の顕微鏡装置のスキャナを示し、対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置が高速側のミラー上に配置されている例を示す斜視図である。本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置の第１共役状態を示す概略構成図である。本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置の第２共役状態を示す概略構成図である。本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置の第１共役状態を示す概略構成図である。本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置の第２共役状態を示す概略構成図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１０は、図１および図２に示されるように、レーザ光（照明光）を発生する光源１と、光源１から発せられたレーザ光の波面を変調可能な空間光変調部３と、空間光変調部３により波面が変調されたレーザ光をリレーする第１リレー光学系５と、第１リレー光学系５によりリレーされたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ７と、スキャナ７により走査されたレーザ光の光路長を補正可能なガラス部材（共役状態切替部）９と、ガラス部材９を通過したレーザ光をリレーする第２リレー光学系１１と、第２リレー光学系１１によりリレーされたレーザ光を集光する対物レンズ１３と、空間光変調部３およびスキャナ７を制御する制御部（変調領域調節部）１５とを備えている。図中、符号Ｐは対物レンズ１３の瞳位置を示している。

光源１は、例えば、多光子励起用のＩＲ（近赤外）極短パルスレーザ光源である。
空間光変調部３としては、例えば、光の位相を自由に変調可能な反射型あるいは透過型のＬＣＯＳ−ＳＬＭ（ＬｉｑｕｉｄＣｒｙｓｔａｌＯｎＳｉｌｉｃｏｎ − ＳｐａｔｉａｌＬｉｇｈｔＭｏｄｕｌａｔｏr）が用いられる。本実施形態においては、反射型のＬＣＯＳ−ＳＬＭを例示して説明する。

この空間光変調部３は、２次元的に配列された多数の微小変調素子（図示略）を備えており、これら微小変調素子ごとに入射したレーザ光に与える位相変化量を制御部１５により個々に制御することができるようになっている。

また、空間光変調部３は、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役な位置に配置されている。この空間光変調部３は、図３に示すように、実際に波面の変調を付与する領域（以下、変調領域Ｅという。）を含むそれよりも大きな領域（以下、照射領域Ｆという。）に対して、光源１からのレーザ光が照射されるようになっている。

空間光変調部３の変調領域Ｅは、入射した平面波の波面を変調して、対物レンズ１３の焦点位置において１点に集光させることができるような表面形状を有している。この変調領域Ｅは、各種光学系の収差や標本Ｓにおける屈折率分布等を考慮して予め算出あるいは測定しておくことができる。

そして、空間光変調部３は、制御部１５により設定された所定の変調パターンに基づき、入射したレーザ光の波面形状を変調領域Ｅの微小変調素子ごとに位相変調により変化させることができるようになっている。これにより、標本Ｓ上でのレーザ光の強度分布を３次元的に変化させて、標本Ｓに所望の３次元的なパターンのレーザ光を照射することができるようになっている。例えば、空間光変調部３は、標本Ｓ上の一点にレーザ光を照射したり、標本Ｓ上のＸＹＺ軸方向にわたる３次元的な多点にレーザ光を同時に照射したりすることができる。

スキャナ７は、図４に示すように、相互に直交する２つの揺動軸線Ｓ１，Ｓ２回りにそれぞれ揺動可能な２枚の揺動ミラー（偏向手段）８Ａ，８Ｂを備えており、これら揺動ミラー８Ａ，８Ｂにより、空間光変調部３から出射されたレーザ光を偏向して標本Ｓ上で２次元的に走査させることができるようになっている。これら揺動ミラー８Ａ，８Ｂは、モータ９Ａ，９Ｂにより揺動軸線Ｓ１，Ｓ２回りに揺動させられるようになっている。

一方の揺動ミラー８Ａの揺動速度は、他方の揺動ミラー８Ｂの揺動速度に対して十分に速く設定されている。高速側の揺動ミラー８Ａは標本Ｓ上におけるレーザ光の走査のために使用され、低速側の揺動ミラー８Ｂは標本Ｓ上におけるレーザ光の走査位置を送るために使用される。具体的には、高速側の揺動ミラー８Ａが水平方向にレーザ光を１ライン（片道または往復）走査させるように動作するごとに、低速側の揺動ミラー８Ｂが垂直方向に１ライン分ずらすように動作することで、標本Ｓ上でレーザ光をラスター走査するようになっている。

また、高速側の揺動ミラー８Ａは、空間光変調部３と光学的に共役な位置に配置されている。図１における空間光変調部３と高速側の揺動ミラー８Ａとを結ぶ実線は、高速側の揺動ミラー８Ａと空間光変調部３とが光学的に共役関係を有することを示している。図５および図７において同様である。

ガラス部材９は、空気と異なる屈折率を有しており、手動によりスキャナ７と第２リレー光学系１１との間の光路上に挿脱可能に形成されている。ガラス部材９がレーザ光の光路に挿入されると、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置が高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線Ｓ１上に移動し、高速側の揺動ミラー８の表面に形成された像が対物レンズ１３の瞳位置Ｐにリレーされるようになっている。以下、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線上の位置とが光学的に共役関係を有する状態を第１共役状態とする。

また、ガラス部材９をレーザ光の光路上から脱離すると、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置が２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間に移動し、２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置に形成された像が対物レンズ１３の瞳位置Ｐにリレーされるようになっている。以下、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置とが光学的に共役関係を有する状態を第２共役状態とする。図１および図２における対物レンズ１３の瞳位置Ｐと高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線Ｓ１（図４参照）上の位置または２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置とを結ぶ実線は、それぞれ対物レンズ１３の瞳位置Ｐと高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線Ｓ１上の位置または２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置とが光学的に共役関係を有することを示している。図５〜図８において同様である。

第１リレー光学系５および第２リレー光学系１１は、それぞれ複数のレンズにより構成されている。第１リレー光学系５は、空間光変調部３の表面に形成された像を高速側の揺動ミラー８Ａの表面にリレーするように構成されている。第２リレー光学系１１は、高速側の揺動ミラー８Ａの表面に形成された像を対物レンズ１３の瞳位置Ｐにリレーするように構成されている。
対物レンズ１３は、レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生する蛍光（戻り光）を集光するようになっている。

また、顕微鏡装置１０には、光源１からのレーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生して対物レンズ１３により集光された蛍光（戻り光）をレーザ光の経路から分岐させる第１ダイクロイックミラー１７と、第１ダイクロイックミラー１７により分岐された蛍光を検出する光電子増倍管（ＰｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒＴｕｂｅ）のような光検出器１９とが備えられている。光検出器１９は、多光子励起蛍光観察用のノンディスキャン検出器である。

また、顕微鏡装置１０には、１光子励起用のレーザ光を発生するレーザ光源２１と、レーザ光源２１から発せられたレーザ光の経路を光源１から発せられたレーザ光の経路に合流させる一方、レーザ光源２１からのレーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生しスキャナ７を介して光路を戻る蛍光（戻り光）を分岐させる第２ダイクロイックミラー２３と、第２ダイクロイックミラー２３により分岐された蛍光をレーザ光の経路から分岐させる第３ダイクロイックミラー２５と、第３ダイクロイックミラー２５により分岐された蛍光を検出する共焦点検出部２７とが備えられている。

レーザ光源２１は、例えば、可視レーザ光源である。
共焦点検出部２７は、第３ダイクロイックミラー２５により分岐された蛍光を集光する集光レンズと、集光レンズにより集光された蛍光の光束を制限するピンホールと、ピンホールを通過した蛍光を検出する光電子増倍管のような光検出器とにより構成されている。
なお、第２ダイクロイックミラー２３に代えて、挿脱式の全反射ミラーを採用することとしてもよい。

例えば、ＰＣ（ＰｅｒｓｏｎａｌＣｏｍｐｕｔｅｒ、図示略）により、光検出器１９により検出された蛍光の強度情報とその検出時のスキャナ７によるレーザ光の走査位置情報とに基づいて、標本Ｓの２次元的な蛍光画像を取得することができる。同様にして、ＰＣにより、共焦点検出部２７により検出された蛍光の強度情報とその検出時のスキャナ７によるレーザ光の走査位置情報とに基づいて、標本Ｓの２次元的な蛍光画像を取得することができる。

このように構成された顕微鏡装置１０は、光源１からレーザ光を発生させて標本Ｓに照射し、標本Ｓから戻る蛍光を第１ダイクロイックミラー１７を介して光検出器１９により検出することで、多光子励起蛍光観察を行うことができる。この場合、蛍光を空間光変調部３に戻さないので、第１共役状態に切り替えて空間光変調部３を動作させて、標本Ｓにおける観察深さの変更や収差補正を行うこととしても、空間光変調部３による蛍光ロスは生じない。第１共役状態では、空間光変調部３と高速側の揺動ミラー８Ａとが光学的に共役関係を有するので、結果的に、空間光変調部３は対物レンズ１３の瞳位置Ｐと共役関係を有する。したがって、空間光変調部３により波面変調されたレーザ光を対物レンズ１３に正しく入射させることができる。多光子励起蛍光観察では、第２共役状態に切り替えて空間光変調部３を動作させずに画像取得することもできる。

また、この顕微鏡装置１９は、レーザ光源２１からレーザ光を発生させて標本Ｓに照射し、標本Ｓにおいて発生した蛍光をスキャナ７、第２ダイクロイックミラー２３および第３ダイクロイックミラー２５等を介して共焦点検出部２７により検出することで、１光子励起蛍光観察を行うことができる。この場合、空間光変調部３は使用しない（光路が空間光変調部３を経由しない）ので、第２共役状態に切り替えて画像取得を行う。蛍光が空間光変調部３に戻らないので、空間光変調部３の偏光依存性による蛍光ロスを防止することができる。

制御部１５は、スキャナ７のモータに対して、各揺動ミラー８Ａ，８Ｂの揺動角度を指令する角度指令信号を出力するようになっている。また、制御部１５は、第１共役状態での多光子励起蛍光観察においては、空間光変調部３における変調領域Ｅの表面が予め設定された所定の変調パターンの形状となるように、空間光変調部３に対して形状指令信号を出力するようになっている。

また、制御部１５は、第２共役状態での１光子励起蛍光観察においては、空間光変調部３を作動させず、光源１からのレーザ光を空間光変調部３による位相変調を伴わせずに第１リレー光学系５に向けて反射させるようになっている。

さらに、制御部１５は、第１共役状態での多光子励起蛍光観察において、角度指令信号に同期して、空間光変調部３に対してレーザ光の照射領域Ｆ内で変調領域Ｅを移動させる移動指令信号を出力するようになっている。具体的には、制御部１５は、空間光変調部３の変調領域Ｅを固定して低速側の揺動ミラー８Ｂを揺動させたと仮定したときに対物レンズ１３の瞳位置における変調領域Ｅの像の移動方向とは逆方向に、低速側の揺動ミラー８Ｂを固定したと仮定した状態でこの変調領域Ｅの像を移動させるように、揺動ミラー８Ｂの揺動に応じて空間光変調部３における波面の変調領域Ｅを移動させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１０の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１０を用いた標本Ｓの蛍光観察は、標本Ｓの観察深さ位置を変化させながら２次元的な画像を取得する場合と、標本Ｓの観察深さ位置を変化させずに２次元的な画像を取得する場合とに切り替えて行うことができる。

まず、標本Ｓの観察深さ位置を変化させながら画像を取得して観察する場合について説明する。
この場合、レーザ光の光路上にガラス部材９を挿入して第１共役状態とし、制御部１５からスキャナ７への角度指令信号と空間光変調部３への形状指令信号を出力して、光源１からレーザ光を発生させる。この場合の形状指令信号は、レーザ光の集光位置が観察深さ方向（光軸方向）に所望量変化するような波面変調を与えるための制御信号である。

光源１から発せられたレーザ光は空間光変調部３の照射領域Ｆに照射され、その内の変調領域Ｅに入射したレーザ光のみが波面を変調されて反射され、第１リレー光学系５を介してスキャナ７の揺動ミラー８Ａに入射する。以下、空間光変調部３の変調領域Ｅで波面変調されたレーザ光の、空間光変調部３と光学的に共役な位置に配置された高速側の揺動ミラー８Ａの面上におけるビーム断面をレーザ光の像と表記する。

スキャナ７においては、高速側の揺動ミラー８Ａが揺動させられることにより、揺動ミラー８Ａにより反射されたレーザ光が走査方向に揺動させられる。そして、低速側の揺動ミラー８Ｂが揺動させられることにより、揺動ミラー８Ｂにより反射されたレーザ光が高速走査方向と直交した送り方向に揺動させられる。これにより、レーザ光が２次元的にラスター走査される。

スキャナ７により走査されたレーザ光は、ガラス部材９を透過した後、第２リレー光学系１１を介して対物レンズ１３に入射する。これにより、高速側の揺動ミラー８Ａの面上に形成されたレーザ光の像が、揺動ミラー８Ａと光学的に共役な位置に配置されている対物レンズ１３の瞳位置Ｐにリレーされる。この結果、空間光変調部３の変調領域Ｅで波面変調されたレーザ光が、高速側の揺動ミラー８Ａの面上を介して対物レンズ１３の瞳位置Ｐにリレーされ、空間光変調部３の所定の変調パターンに従い対物レンズ１３を介して標本Ｓに照射される。

レーザ光が照射されることにより標本Ｓから戻る蛍光は、対物レンズ１３により集光されて第１ダイクロイックミラー１７によりレーザ光の光路から分岐され、光検出器１９により検出される。そして、ＰＣにおいて、光検出器１９から出力される蛍光の強度情報とスキャナ７によるレーザ光の走査位置情報とに基づいて、標本Ｓの２次元的な蛍光画像が生成される。これにより、所望の観察深さでの標本Ｓの２次元観察画像が得られる。観察深さ位置を変化させるように空間光変調部３の位相変調パターンを変化させながら画像を繰り返して取得して、観察深さの異なる複数の２次元画像を得ることで、標本Ｓを３次元的に観察することができる。

この場合において、仮に、空間光変調部３における変調領域Ｅを固定したままの状態でスキャナ７を作動させると、２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの揺動に従って、対物レンズ１３の瞳位置Ｐにリレーされたレーザ光の像が光軸に交差する方向に直線的に移動する。

これに対し、第１共役状態においてはスキャナ７の高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線Ｓ１上と空間光変調部３の表面および対物レンズ１３の瞳位置Ｐとが光学的に共役関係を有するので、高速の揺動ミラー８Ａの揺動動作に拘わらず、揺動ミラー８Ａとレーザ光の位置は対物レンズ１３の瞳位置Ｐ上で一定に保たれる。したがって、高速側の揺動ミラー８Ａの揺動に応じた空間光変調部３の変調領域Ｅの移動を行わずに済む。

そこで、低速側の揺動ミラー８Ｂの揺動に応じてのみ空間光変調部３の変調領域Ｅを移動させる。低速側の揺動ミラー８Ｂの揺動に従って対物レンズ１３の瞳位置Ｐにおいて移動する変調領域Ｅの像の移動方向をＫ方向、移動量をΔＫとする。また、スキャナ７の低速側のミラー８Ｂを停止させた状態で空間光変調部３の変調領域Ｅを照射領域Ｆの範囲内で移動させた場合に、対物レンズ１３の瞳位置Ｐにおいて移動する変調領域Ｅの像の移動方向をＱ方向、移動量をΔＱとする。

本実施形態においては、制御部１５が、Ｋ方向とＱ方向とが逆方向となり、かつ、ΔＫ＝ΔＱとなるように、角度指令信号に同期して空間光変調部３に対して移動指令信号を出力し、空間光変調部３の変調領域Ｅを移動させる。これにより、低速側の揺動ミラー８Ｂの揺動に拘わらず、対物レンズ１３の瞳位置Ｐにリレーされるレーザ光の像を静止させた状態に維持することができる。これにより、揺動ミラー８Ｂの揺動状態に関わらず、空間光変調部３の変調領域Ｅで変調されたレーザ光を対物レンズ１３の瞳の全体に渡るように入射させて、標本Ｓに対して最大限に明るい照明を行うことができる。

また、スキャナ７の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの揺動によっても対物レンズ１３の瞳位置Ｐにおける変調領域Ｅの像が移動しないように、空間光変調部３の変調領域Ｅをレーザ光の光軸に交差する方向に移動させることで、空間光変調部３により変調した波面を対物レンズ１３の瞳位置Ｐに正確にリレーし、集光性能の低下を防止することができる。

これにより、各種光学系の収差や、標本Ａ内の屈折率分布等によって発生する収差を空間光変調部３による波面変調により正確に補償することができ、対物レンズ１３によって標本Ｓ内の所望の１点にレーザ光を精度よく集光させることができる。なお、光源１から発せられるレーザ光を極短パルスレーザ光とすれば、対物レンズ１３の焦点位置のみにおいて多光子励起効果によって蛍光を発生させ、鮮明な蛍光画像を取得することが可能となる。

また、高速側の揺動ミラー８Ａの揺動に応じた空間光変調部３の変調領域Ｅの移動を行わずに済むので、空間光変調部３は、高速側の揺動ミラー８Ａと比較して十分に速度の遅い低速側の揺動ミラー８Ｂの揺動に応じて変調領域Ｅを移動させれば足り、応答性が低くてよい。すなわち、揺動ミラー８Ａ，８Ｂの揺動による対物レンズ１３の瞳位置Ｐにおけるレーザ光の像の変位をより確実に防止することができる。また、空間光変調部３を移動させるのではなく、空間光変調部３上の変調領域Ｅを移動させるので、振動を伴わずに高速に移動させることができる。

次に、標本Ｓの観察深さ位置を変化させずに画像を取得して観察する場合について説明する。
この場合、レーザ光の光路からガラス部材９を脱離させて第２共役状態とし、制御部１５からスキャナ７に角度指令信号を出力する一方、空間光変調部３を作動させずにレーザ光源１からレーザ光を発生させる。

レーザ光源１から発せられたレーザ光は、空間光変調部３による位相変調を伴わずにスキャナ７により走査された後、ガラス部材９を透過せずに第２リレー光学系１１を介して対物レンズ１３により標本Ｓに照射される。

標本Ｓから戻る蛍光は、対物レンズ１３により集光されて第１ダイクロイックミラー１７によりレーザ光の光路から分岐され、光検出器１９により検出される。空間光変調部３によるレーザ光の波面の変調を伴わずにスキャナ７によりレーザ光を走査せることで、ＰＣにより標本Ｓの観察深さ位置を変化させずに２次元的な画像を取得することができる。
なお、レーザ光源１の代わりにレーザ光源２１を用い、検出手段として共焦点検出部２７を用いることで、１光子励起による蛍光観察画像を取得できる。

この場合において、第２共役状態においては、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置とが光学的に共役関係を有することで、対物レンズ１３の瞳位置Ｐにおける、２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂのそれぞれの揺動によるレーザ光の移動量が小さくなる。

具体的には、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと揺動ミラー８Ａの揺動軸線Ｓ１上の位置とが共役関係を有する場合と比較して、揺動ミラー８Ａ，８Ｂのいずれの揺動に対しても対物レンズ１３の瞳位置Ｐにおけるレーザ光が移動することになるが、その移動量は、第１共役状態における揺動ミラー８Ｂの揺動による移動量の略半分となる。
これにより、揺動ミラー８Ａ，８Ｂの揺動による照明効率の変化を小さくすることができ、得られる画像の明るさムラを低減することができる。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１０によれば、ガラス部材９により第１共役状態と第２共役状態とを切り替えることで、標本Ｓの観察深さ位置を変化させながら明るい２次元的な画像を取得したり、標本Ｓの観察深さ位置を変化させずに高精度な２次元的な画像を取得したりすることができる。また、レーザ光の光路に対してガラス部材９を挿脱するだけの簡易な構成で、第１共役状態と第２共役状態とを容易に切り替えることができる。
なお、第２共役状態では、空間光変調部３と高速側の揺動ミラー８とが光学的に共役関係を有さなくてもよい。

本実施形態においては、ガラス部材９を手動で挿脱することとして説明したが、これに代えて、ガラス部材９の挿脱を自動で行う電動挿脱手段を設けると好ましい。この場合、制御部１５により電動挿脱手段の動作を制御することとすればよい。

また、本実施形態においては、第１共役状態での多光子励起蛍光観察の場合において、第１ダイクロイックミラー１７を採用して光検出器１９により蛍光を検出することとしたが、これに代えて、例えば、第１ダイクロイックミラー１７を設けずに、標本Ｓを挟んで対物レンズ１３と反対側に集光レンズや光検出器等の検出手段を配置し、対物レンズ１３と反対側で蛍光（戻り光）を検出することとしてもよい。

また、本実施形態の画像取得の方法として、２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂを同時に動作させて、標本Ｓに対する走査の方向を任意に回転させるローテーションスキャンを行う場合がある。

この場合は、２つの揺動ミラー８Ａ，８Ｂの駆動速度は、走査方向の回転角度に依存するので、どちらかの揺動ミラー８Ａ，８Ｂを高速側，低速側と定義することができない。したがって、低速側の揺動ミラーに合せて空間光変調部３の変調領域Ｅを制御することはできないので、光源１による多光子励起観察を行う場合でも、第２共役状態で、空間光変調部３を動作させずに画像取得を行うのが望ましい。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置２０は、図４、図５および図６に示すように、第２リレー光学系１１が対物レンズ１３の瞳位置Ｐに像を拡大してリレーする投影倍率を有し、共役状態切替部として、ガラス部材９に代えて、第２リレー光学系１１を光軸方向に移動させる移動機構１９を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１０と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

移動機構１９は、第２リレー光学系１１を構成する複数のレンズ全体を支持し、これらのレンズの位置関係を変えずに第２リレー光学系１１を光軸方向に移動させることができるようになっている。また、移動機構１９は、図５に示すように、第２リレー光学系１１をスキャナ７に近接する方向に移動させることで、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置を高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線Ｓ１（図４参照）上まで延長させることができるようになっている（第１共役状態）。また、移動機構１９は、図６に示すように、第２リレー光学系１１をスキャナ７から離間する方向に移動させることで、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置を２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置まで短縮させることができるようになっている（第２共役状態）。図５において、Ｌは光路長であり、Ｍは投影倍率を示している。

制御部１５は、空間光変調部３およびスキャナ７の制御に加え、移動機構１９による第２リレー光学系１１の光軸方向の移動を制御し、第１共役状態と第２共役状態とを切り替えるようになっている。

このように構成された顕微鏡装置１０によれば、標本Ｓの観察深さ位置を変化させながら２次元的な画像を取得して観察する場合は、制御部１５が、移動機構１９により第２リレー光学系１１をスキャナ７に近接する方向に移動させて第１共役状態に設定する。一方、標本Ｓの観察深さ位置を変化させずに２次元的な画像を取得して観察する場合は、制御部１５が、移動機構１９により第２リレー光学系１１をスキャナ７から離間する方向に移動させて第２共役状態に設定する。

本実施形態に係る顕微鏡装置２０によれば、移動機構１９により第１共役状態と第２共役状態とを切り替えることで、標本Ｓの観察深さ位置を変化させながら明るい２次元的な画像を取得したり、標本Ｓの観察深さ位置を変化させずにムラを低減した高精度な２次元的な画像を取得したりすることができる。また、移動機構１９により第２リレー光学系１１を光軸方向に移動させるだけの簡易な構成で、第１共役状態と第２共役状態とを容易に切り替えることができる。

本実施形態においては、第２リレー光学系１１が対物レンズ１３の瞳位置Ｐに像を拡大してリレーする投影倍率を有することとしたが、第２リレー光学系１１が対物レンズ１３の瞳位置Ｐに像を縮小してリレーする投影倍率を有することとしてもよい。

この場合、第２リレー光学系１１をスキャナ７から離間する方向に移動させることで、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置を高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線上まで延長させることができる（第１共役状態）。また、第２リレー光学系１１をスキャナ７に近接する方向に移動させることで、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置を２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置まで短縮させることができる（第２共役状態）。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置３０は、図４、図７および図８に示すように、スキャナ７が、第１リレー光学系５からのレーザ光を高速側の揺動ミラー８Ａに向けて折り返す折り返しミラー８Ｃを備え、共役状態切替部として、ガラス部材９や移動機構１９に代えて、折り返しミラー８Ｃおよび高速側の揺動ミラー８Ａを入射光軸に沿う方向に移動させる移動機構２９を備える点で第１実施形態および第２実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１０または第２実施形態に係る顕微鏡装置２０と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。また、図７および図８においては、説明の都合上、レーザ光源２１、第２ダイクロイックミラー２３、第３ダイクロイックミラー２５および共焦点検出部２７の記載を省略する。

折り返しミラー８Ｃは、第１リレー光学系５からの入射光軸と２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂ間の光軸とが平行になるように、第１リレー光学系５からのレーザ光を入射光軸を含む平面に沿って折り返して高速側の揺動ミラー８Ａに入射させるようになっている。

移動機構２９は、折り返しミラー８Ｃおよび高速側の揺動ミラー８Ａを支持し、これら折り返しミラー８Ｃおよび揺動ミラー８Ａをそれぞれの位置関係を変えずに入射光軸に沿う方向に移動させて、低速側の揺動ミラー８Ｂに対して高速側の揺動ミラー８Ａを入射光軸に沿って近接させたり離間させたりすることができるようになっている。

また、移動機構２９は、高速側の揺動ミラー８Ａを低速側の揺動ミラー８Ｂに近接する方向に移動させることで、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置に高速側の揺動ミラー８Ａの揺動軸線Ｓ１（図４参照）を配置することができるようになっている（第１共役状態）。また、移動機構２９は、高速側の揺動ミラー８Ａをスキャナ７から離間する方向に移動させることで、対物レンズ１３の瞳位置Ｐと光学的に共役関係を有する位置を２枚の揺動ミラー８Ａ，８Ｂの略中間位置とすることができるようになっている（第２共役状態）。

制御部１５は、空間光変調部３およびスキャナ７の制御に加え、移動機構２９による折り返しミラー８Ｃおよび高速側の揺動ミラー８Ａの入射光軸方向の移動を制御し、第１共役状態と第２共役状態とを切り替えるようになっている。

このように構成された顕微鏡装置１０によれば、標本Ｓの観察深さ位置を変化させながら２次元的な画像を取得して観察する場合は、制御部１５が、移動機構２９により高速側の揺動ミラー８Ａを低速側の揺動ミラー８Ｂに近接する方向に移動させて第１共役状態に設定する。一方、標本Ｓの観察深さ位置を変化させずに２次元的な画像を取得して観察する場合は、制御部１５が、移動機構２９により高速側の揺動ミラー８Ａを低速側の揺動ミラー８Ｂから離間する方向に移動させて第２共役状態に設定する。

本実施形態に係る顕微鏡装置３０によれば、移動機構２９により第１共役状態と第２共役状態とを切り替えることで、標本Ｓの観察深さ位置を変化させながら明るい２次元的な画像を取得したり、標本Ｓの観察深さ位置を変化させずにムラを低減した高精度な２次元的な画像を取得したりすることができる。また、折り返しミラー８Ｃおよび高速側の揺動ミラー８Ａを入射光軸に沿う方向に移動するだけの簡易な構成で、第１共役状態と第２共役状態とを容易に切り替えることができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、上記各実施形態においては、共役状態切替部として、ガラス部材を例示して説明したが、スキャナ７と第２リレー光学系１１との間の光路に対して挿脱することでレーザ光の光路長を補正して第１共役状態と第２共役状態とを切り替えることができるものであればよく、これに限定されるものではない。

１光源
３空間光変調部
５第１リレー光学系
７スキャナ
８Ａ揺動ミラー（偏向手段）
８Ｂ揺動ミラー（偏向手段）
８Ｃ折り返しミラー
９ガラス部材（共役状態切替部）
１０，２０，３０顕微鏡装置
１１第２リレー光学系
１３対物レンズ
１５制御部（変調領域調節部）
Ｐ瞳位置
Ｓ標本

Claims

光源からの照明光の波面を変調可能な空間光変調部と、
互いに交差する２つの方向に光を偏向可能な２つの偏向手段を有し、前記空間光変調部から出射された照明光を偏向して２次元的に走査させるスキャナと、
該スキャナにより走査された照明光を標本に照射する対物レンズと、
該スキャナにより偏向された照明光を前記対物レンズに導くリレー光学系と、
前記対物レンズの瞳位置と一方の前記偏向手段の偏向面とが光学的に共役関係を有する第１共役状態と、前記対物レンズの瞳位置と前記２つの偏向手段の各偏向面の間の位置とが光学的に共役関係を有する第２共役状態とを切り替え可能な共役状態切替部と、
前記第１共役状態において、前記空間光変調部上の像を固定して他方の前記偏向手段により前記照明光を偏向させたと仮定した場合における前記対物レンズの瞳位置にリレーされる像の移動方向とは逆方向に、前記他方の偏向手段による偏向を停止させた状態を仮定した場合における前記対物レンズの瞳位置の像が移動するように、前記他方の偏向手段による偏向に応じて、前記空間光変調部上の像を形成する前記波面の変調領域を移動させ、前記第２共役状態において、前記空間光変調部を作動させず、前記光源からの照明光を前記空間光変調部による波面の変調を伴わせずに前記スキャナに入射させる変調領域調節部とを備え、
前記空間光変調部が、前記第１共役状態において前記一方の偏向手段の偏向面と光学的に共役関係を有する顕微鏡装置。
前記２つの偏向手段が、非平行な２つの軸線回りにそれぞれ揺動可能な２枚の揺動ミラーである請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記共役状態切替部が、空気と異なる屈折率を有し、前記スキャナと前記リレー光学系との間の光路上に挿脱可能に形成されている請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記リレー光学系が、前記対物レンズの瞳位置に像を縮小または拡大してリレーする投影倍率を有し、
前記共役状態切替部が、前記リレー光学系を光軸方向に移動可能に形成されている請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記スキャナが、前記空間光変調部からの入射光軸と前記２つの偏向手段間の光軸とが平行になるように、前記空間光変調部からの照明光を前記入射光軸を含む平面に沿って折り返して一方の前記偏向手段の偏向面に入射させる折り返しミラーを備え、
前記共役状態切替部が、前記折り返しミラーおよび前記一方の偏向手段を前記入射光軸に沿う方向に移動可能に形成されている請求項１に記載の顕微鏡装置。