JP5603786B2

JP5603786B2 - 顕微鏡装置

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Publication number: JP5603786B2
Application number: JP2011008248A
Authority: JP
Inventors: 義彰村山
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2010-01-21
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2031-01-18
Also published as: EP2360505B1; US20110255157A1; JP2011170338A; EP2360505A1; US8873123B2

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、デフォーマブルミラーによって波面を変形させたレーザ光をガルバノミラーユニットを経由して対物レンズに入射させる走査型共焦点顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この装置は、デフォーマブルミラーの反射面を変化させることにより、レーザ光の集光点が深さ方向に変化するように構成されている。

特開２００５−１６５２１２号公報

しかしながら、特許文献１に開示されている走査型共焦点顕微鏡装置では、レンズと結像レンズとにより対物レンズの瞳面へリレーされる変調波面が、ガルバノミラーの揺動によって瞳面上において光軸と直交する方向にシフトされてしまう。このようなシフトが発生すると、偏心と同様のコマ収差が増大するという不都合がある。このようなシフトは撮像領域の中央では少ないが周辺になるに従って増大し、光学性能が著しく低下してしまうことになる。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光源から導かれてきた照明光の標本への集光性能を変化させることなく、標本上において照明光を２次元的に走査することができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられ略平面波に変換された照明光の波面を変調する空間光変調素子と、非平行な２つの軸線回りにそれぞれ揺動する２枚のミラーを有し、前記空間光変調素子により波面が変調された照明光を２次元的に走査するスキャナと、該スキャナにより進行方向を変えられた照明光を対物光学系に導くリレー光学系と、前記ミラーの揺動に応じて、前記空間光変調素子上の像を形成する前記波面の変調領域を移動させる変調領域調節部とを備え、前記空間光変調素子と前記対物光学系の瞳位置とが光学的に共役な位置関係に配置され、前記空間光変調素子に、前記変調領域を含みそれより大きな照射領域に照明光が照射され、前記変調領域に入射された部分の照明光のみが波面を変調され、前記変調領域調節部が、前記空間光変調素子上の像を固定して前記ミラーを揺動させたと仮定した場合における前記対物光学系の瞳位置にリレーされる像の移動方向とは逆方向に、前記ミラーを停止させた状態を仮定した場合における前記対物光学系の瞳位置の像が移動するように前記変調領域を移動させる顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、空間光変調素子によって波面が変調された照明光がスキャナによって進行方向を変更され、リレー光学系を介して対物光学系に導かれ、対物光学系によって標本上に集光される。このとき、空間光変調素子上に形成された波面像は、スキャナにより偏向され、リレー光学系によって対物光学系の瞳位置にリレーされる。スキャナを構成する２枚のミラーは、平行でない２つの軸線回りにそれぞれ揺動させられるので、照明光は標本上において２次元的に走査される。

この場合において、空間光変調素子上の像が固定されていると、スキャナを構成する２枚のミラーの内、対物光学系の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていないミラーが揺動させられることにより、対物光学系の瞳位置にリレーされる像が光軸に交差する方向に移動させられる。本発明によれば、変調領域調節部が、ミラーの揺動に応じて空間光変調素子上の像を形成する波面の変調領域を移動させることにより、対物光学系の瞳位置にリレーされる像の移動を打ち消して、停止させることができる。
この場合に、撮像領域の中心だけではなく、撮像領域の周辺においても偏心と同様のコマ収差の影響が発生せず、光学性能を維持することができる。

上記発明においては、前記変調領域調節部が、前記空間光変調素子内において前記変調領域を移動させてもよい。
このようにすることで、空間光変調素子自体を機械的に移動させないので、変調領域の高速移動が可能となり、その際に振動を伴わずに済む。

また、上記発明においては、前記変調領域調節部が、前記空間光変調素子を移動させてもよい。
このようにすることで、変調領域を空間光変調素子のほぼ全体にわたって設けることができ、空間光変調素子の空間分解能を最大限に利用して、よりきめ細かい波面の変調を行うことができる。

また、上記発明においては、前記スキャナの一方のミラーの揺動軸線に直交する平面内に他方のミラーの揺動軸線が配置され、前記対物光学系の瞳位置といずれかの前記ミラーの揺動軸線上の位置とが光学的に共役関係であってもよい。
このようにすることで、空間光変調素子上の像を形成する波面の変調領域を一方向に直線状に移動させるだけで、対物光学系の瞳位置に形成される像を静止させることができる。

また、上記発明においては、前記対物光学系の瞳位置と、２枚の前記ミラーの内、より高速に揺動させられるミラーの揺動軸線上の位置とが光学的に共役であってもよい。
このようにすることで、空間光変調素子における変調領域の移動を低速側のミラーの揺動速度に合わせて行うことができ、より容易に、対物光学系の瞳位置に形成される像を静止させることができる。

また、上記発明においては、前記対物光学系の瞳位置と、２枚の前記ミラーの間の位置とが光学的に共役関係であってもよい。
このようにすることで、２枚のミラーのそれぞれの揺動による対物光学系の入射瞳位置にリレーされる像の一方向の移動量は小さくなる。したがって、そのリレーされる像の移動量に応じて空間光変調素子において設定される照射領域の面積を小さくすることができ、空間光変調素子の各部における光量密度を高めて、照明効率を向上することができる。

また、上記発明においては、前記リレー光学系が第２のリレー光学系であり、前記空間光変調素子上の波面像を、前記第２のリレー光学系による前記対物光学系の瞳位置と共役関係にある位置へリレーする第１のリレー光学系を備えていてもよい。
このようにすることで、第２のリレー光学系による対物光学系の瞳位置と光学的に共役関係にある位置と、空間光変調素子上の位置との間で発生する波面の変形を、第１のリレー光学系によってリレーすることにより防止でき、より正確に対物光学系の瞳位置での波面補正を行うことができる。

本発明によれば、光源から導かれてきた照明光の標本への集光性能を変化させることなく、標本上において照明光を２次元的に走査することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を示す全体構成図である。図１の顕微鏡装置のスキャナを示し、対物光学系の瞳位置と光学的に共役な位置が高速側のミラー上に配置されている例を示す斜視図である。図２の場合において、図１の顕微鏡装置の空間光変調素子における変調領域の移動を説明する図である。図２の変形例であって、図１の顕微鏡装置のスキャナを示し、対物光学系の瞳位置と光学的に共役な位置が高速側と低速側のミラーの中間に配置されている例を示す斜視図である。図４の場合において、図１の顕微鏡装置の空間光変調素子における変調領域の移動を説明する図である。図５の変形例であって、空間光変調素子自体を移動させる場合の変調領域の移動を説明する図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光（照明光）を発生する光源２と、光源２から発せられたレーザ光の波面を略平面波に変換するコリメータレンズ３と、略平面波に変換されたレーザ光の波面を変調する波面変調部４と、該波面変調部４によって波面が変調されたレーザ光をリレーする第１のリレー光学系５と、該第１のリレー光学系５によってリレーされたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ６と、該スキャナ６により走査されたレーザ光をリレーする第２のリレー光学系（リレー光学系）７と、該第２のリレー光学系７によってリレーされたレーザ光を集光する対物光学系８と、スキャナ６および波面変調部４を制御する制御部９と、対物光学系８により集光された標本Ａからの蛍光を検出する光検出器１０とを備えている。図中、符号１１は、スライドガラス上に載置された標本Ａを搭載するステージである。

波面変調部４は、コリメータレンズ３によって略平面波に変換されたレーザ光を反射するプリズム１２と、該プリズム１２により反射されたレーザ光を反射し、その際に、その表面形状に従う形態にレーザ光の波面を変調してプリズム１２に戻す反射型の空間光変調素子１３とを備えている。

プリズム１２により反射されたレーザ光は空間光変調素子１３によって同じプリズム１２に戻るように光路が折り返され、プリズム１２によって光源２からのレーザ光と同軸の光路に戻されるようになっている。
空間光変調素子１３は、制御部９からの形状指令信号によって、その表面形状を任意に変化させることができるセグメントタイプのＭＥＭＳによって構成されている。空間光変調素子１３と対物光学系８の入射瞳位置とは光学的に共役な位置関係に配置されている。

コリメータレンズ３によって空間光変調素子１３に入射されるレーザ光は、図３に鎖線で示されるように、実際に波面の変調を付与する領域（以下、変調領域という。）Ｂを含み、それよりも大きな領域（以下、照射領域という。）Ｃに照射されるようになっている。

スキャナ６は、図２に示されるように、捻れの位置に配置される２つの揺動軸線Ｓ_１，Ｓ_２回りにそれぞれ揺動可能に設けられた２つのミラー６ａ，６ｂを備えている。一方の揺動軸線Ｓ_１は、他方の揺動軸線Ｓ_２に直交する平面内に配置されている。これにより、上記平面に沿う一方向から見ると、図１に示されるように、２つの揺動軸線Ｓ_１，Ｓ_２は相互に直交して配置されている。

一方のミラー６ａの揺動速度は、他方のミラー６ｂの揺動速度に対して十分に速く設定されている。高速側のミラー６ａはレーザ光の標本Ａ上における走査のために使用され、低速側のミラー６ｂはレーザ光の標本Ａ上における走査位置を送るために使用される。図中、符号６ｃ，６ｄは各ミラー６ａ，６ｂを揺動動作させるためのモータ、符号１４はミラーである。
高速側のミラー６ａは、図２に示されるように、対物光学系８の入射瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。図２におけるハッチングは、高速側のミラー６ａが対物光学系８の入射瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていることを示している。

第１のリレー光学系５および第２のリレー光学系７は、複数のレンズにより構成されている。第１のリレー光学系５は、空間光変調素子１３の表面に形成された像を高速側のミラー６ａの表面にリレーするように構成されている。第２のリレー光学系７は、高速側のミラー６ａの表面に形成された像を対物光学系８の入射瞳位置にリレーするように構成されている。

図１において、符号１５はレーザ光を反射し蛍光を透過するダイクロイックミラー、符号１６は集光レンズである。ダイクロイックミラー１５を透過した蛍光は集光レンズ１６によって集光され、光検出器１０によって検出されるようになっている。光検出器１０によって検出された蛍光の強度と、その検出時のスキャナ６によるレーザ光の走査位置情報とを対応づけて記憶しておくことにより、２次元的な蛍光画像を取得することができるようになっている。

制御部９は、空間光変調素子１３の変調領域Ｂにおける表面形状が予め設定された形状となるように、空間光変調素子１３に対して形状指令信号を出力するようになっている。空間光変調素子１３の変調領域Ｂの表面形状は、該変調領域Ｂに入射された平面波の波面を変調して、対物光学系８の焦点位置において１点に集光させることができるような表面形状であり、各種光学系の収差や標本Ａにおける屈折率分布等を考慮して、予め算出あるいは測定しておくことができる。

また、制御部９は、スキャナ６の各ミラー６ａ，６ｂを揺動させるモータ６ｃ，６ｄに対して、揺動角度を指令する角度指令信号を出力する。そして、制御部９は、この角度指令信号に同期して、空間光変調素子１３へのレーザ光の照射範囲Ｃ内において、上記のような表面形状を実現する変調領域Ｂを、図３に矢印Ｄに示されるように移動させる移動指令信号を出力するようになっている。

具体的には、空間光変調素子１３の変調領域Ｂを固定して低速側のミラー６ｂを揺動させたと仮定したときに対物光学系８の入射瞳位置におけるレーザ光の像の移動方向とは逆方向に、低速側のミラー６ｂを固定したと仮定した状態でレーザ光の像を移動させるように、ミラー６ｂの揺動に応じて空間光変調素子１３における波面の変調領域Ｂを移動させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いて標本Ａの蛍光観察を行うには、制御部９から空間光変調素子１３に対して変調領域Ｂにおける表面形状を指令する形状指令信号を出力した状態で、光源２において発生させたレーザ光をコリメータレンズ３を介して略平面波として、波面変調部４に入射させる。

波面変調部４に入射されたレーザ光は、プリズム１２によって反射されて空間光変調素子１３に入射される。空間光変調素子１３には、変調領域Ｂを含みそれより大きな照射領域Ｃにレーザ光が照射され、変調領域Ｂに入射された部分のレーザ光のみが波面を変調されて反射され、プリズム１２によって反射されて第１のリレー光学系５に入射される。

第１のリレー光学系５は、空間光変調素子１３の変調領域Ｂの像を、これと光学的に共役な位置に配置されたスキャナ６の高速側のミラー６ａ面上にリレーする。スキャナ６においては、高速側のミラー６ａが揺動させられることにより、反射されたレーザ光が走査方向に揺動させられ、低速側のミラー６ｂが揺動させられることにより、反射されたレーザ光が送り方向に揺動させられる。これにより、レーザ光が２次元的に走査される。

スキャナ６により走査されたレーザ光は、第２のリレー光学系７に入射される。
第２のリレー光学系７は、高速側のミラー６ａ面上に形成されたレーザ光の像を、これと光学的に共役な位置に配置されている対物光学系８の入射瞳位置にリレーする。

このようにすることで、空間光変調素子１３の変調領域Ｂの像が、対物光学系８の入射瞳位置にリレーされる。
この場合において、仮に、空間光変調素子１３における変調領域Ｂを固定したままの状態で、スキャナ６を作動させると、低速側のミラー６ｂの揺動に従って、対物光学系８の入射瞳位置にリレーされたレーザ光の像が光軸に交差する方向に直線的に移動する。この移動方向をＰ方向、移動量をΔＰとする。逆に、スキャナ６の低速側のミラー６ｂを停止させた状態で空間光変調素子１３における変調領域Ｂを照射領域Ｃの範囲内において矢印Ｄのように移動させることとしても、対物光学系８の入射瞳位置にリレーされるレーザ光の像が光軸に交差する方向に直線的に移動する。この移動方向をＱ方向、移動量をΔＱとする。

本実施形態においては、制御部９が、Ｐ方向とＱ方向とが逆方向となり、かつ、ΔＰ＝ΔＱとなるように、空間光変調素子１３の変調領域Ｂを移動させるので、低速側のミラー６ｂの揺動に拘わらず、対物光学系８の入射瞳位置にリレーされるレーザ光の像を静止させた状態に維持することができる。入射瞳位置に入射するレーザ光が光軸に交差する方向に変動しないので、入射瞳全体にわたるようにレーザ光を入射させることができ、最大限に明るい照明を行うことができる。

また、この場合において、スキャナ６のミラー６ａ，６ｂの揺動によっても、対物光学系８の入射瞳位置における像が移動しないようにするために、空間光変調素子１３における変調領域Ｂをレーザ光の光軸に交差する方向に移動させるので、空間光変調素子１３で変調した波面を対物光学系８の入射瞳位置に正確にリレーし、集光性能の低下を防止することができる。

これにより、各種光学系の収差や、標本Ａ内の屈折率分布等によって発生する収差が補償され、対物光学系８によって標本Ａ内の所望の１点にレーザ光を精度良く集光させることができるという利点がある。光源２から発生されるレーザ光を極短パルスレーザ光とすれば、対物光学系８の焦点位置のみにおいて多光子励起効果によって蛍光を発生させ、鮮明な蛍光画像を取得することが可能となる。

また、本実施形態においては、スキャナ６を構成する高速側のミラー６ａの揺動軸線上を、空間光変調素子１３の表面および対物光学系８の入射瞳位置と光学的に共役な位置に設定したので、高速側のミラー６ａの揺動に応じた変調領域Ｂの移動を行わずに済む。したがって、空間光変調素子１３は、高速側のミラー６ａと比較して十分に速度の遅い低速側のミラー６ｂの揺動に応じて変調領域Ｂを移動させれば足り、応答性は低くてよい。すなわち、ミラー６ａ，６ｂの揺動による対物光学系８の入射瞳位置に入射されるレーザ光の像の変位をより確実に防止することができる。
また、空間光変調素子１３を移動させるのではなく、空間光変調素子１３上の変調領域を移動させるので、振動を伴わずに高速に移動させることができる。

なお、本実施形態においては、スキャナ６の高速側のミラー６ａの揺動軸線Ｓ１上に対物光学系８の入射瞳位置と光学的に共役な位置を配置したが、これに限定されるものではない。例えば、図４に示されるように、対物光学系８の入射瞳位置と光学的に共役な位置を、２つのミラー６ａ，６ｂの中間位置に配置してもよい。図中、ハッチングは、共役な位置を示している。

このようにすることで、対物光学系８の入射瞳位置にリレーされるレーザ光の像は、２つのミラー６ａ，６ｂのいずれの揺動によっても影響を受けるので、これを静止させておくためには、図５に示されるように、矢印Ｄ方向のみならず、これに直交する矢印Ｅ方向にも変調領域Ｂを移動させる必要がある。

その一方で、対物光学系８の入射瞳位置と光学的に共役な位置を２つのミラー６ａ，６ｂの間に配置することで、ミラー６ａ，６ｂのそれぞれの揺動による対物光学系８の入射瞳位置にリレーされる像の一方向の移動量は小さくなる。したがって、上記実施形態と比較して、照射領域Ｃの面積を小さく設定することができ、空間光変調素子１３の各部における光量密度を高めて、照明効率を向上することができるという利点がある。例えば、対物光学系８の入射瞳位置と光学的に共役な位置が、２つのミラー６ａ，６ｂのちょうど中間に配置された場合には、２つのミラー６ａ，６ｂの一方に配置された場合に比べて、対物光学系８の入射瞳位置にリレーされる像の一方向の移動量は半分となる。

また、本実施形態においては、空間光変調素子１３上において変調領域Ｂを移動させることとしたが、これに代えて、図６に示されるように、照明領域Ｃに対して空間光変調素子１３自体を光軸に交差する方向に移動させることにしてもよい。このようにすることで、変調領域Ｂを空間光変調素子１３のほぼ全体にわたって設けることができ、空間光変調素子１３の空間分解能を最大限に利用して、よりきめ細かい波面の変調を行うことができる。

また、本実施形態においては、空間光変調素子１３として、その表面形状を変化させるセグメントタイプのＭＥＭＳミラーを例示したが、これに代えて、他の任意の空間光変調素子１３、例えば、液晶素子、デフォーマブルミラー等でもよい。

Ｂ変調領域
１顕微鏡装置
２光源
５第１のリレー光学系
６スキャナ
６ａ，６ｂミラー
７第２のリレー光学系（リレー光学系）
８対物光学系
９制御部（変調領域調節部）
１３空間光変調素子
Ｓ_１，Ｓ_２揺動軸線（軸線）

Claims

光源から発せられ略平面波に変換された照明光の波面を変調する空間光変調素子と、
非平行な２つの軸線回りにそれぞれ揺動する２枚のミラーを有し、前記空間光変調素子により波面が変調された照明光を２次元的に走査するスキャナと、
該スキャナにより進行方向を変えられた照明光を対物光学系に導くリレー光学系と、
前記ミラーの揺動に応じて、前記空間光変調素子上の像を形成する前記波面の変調領域を移動させる変調領域調節部とを備え、
前記空間光変調素子と前記対物光学系の瞳位置とが光学的に共役な位置関係に配置され、前記空間光変調素子に、前記変調領域を含みそれより大きな照射領域に照明光が照射され、前記変調領域に入射された部分の照明光のみが波面を変調され、
前記変調領域調節部が、前記空間光変調素子上の像を固定して前記ミラーを揺動させたと仮定した場合における前記対物光学系の瞳位置にリレーされる像の移動方向とは逆方向に、前記ミラーを停止させた状態を仮定した場合における前記対物光学系の瞳位置の像が移動するように前記変調領域を移動させる顕微鏡装置。
前記変調領域調節部が、前記空間光変調素子内において前記変調領域を移動させる請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記変調領域調節部が、前記空間光変調素子を移動させる請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記スキャナの一方のミラーの揺動軸線に直交する平面内に他方のミラーの揺動軸線が配置され、
前記対物光学系の瞳位置と、いずれかの前記ミラーの揺動軸線上の位置とが光学的に共役関係である請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記対物光学系の瞳位置と、２枚の前記ミラーの内、より高速に揺動させられるミラーの揺動軸線上の位置とが光学的に共役関係である請求項４に記載の顕微鏡装置。
前記対物光学系の瞳位置と、２枚の前記ミラーの間の位置とが光学的に共役関係である請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記リレー光学系が第２のリレー光学系であり、
前記空間光変調素子上の像を前記第２のリレー光学系による対物光学系の瞳位置と光学的に共役関係にある位置へリレーする第１のリレー光学系を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡装置。