JP4723842B2 - 走査型光学顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、走査型光学顕微鏡に関し、特に、ビームスプリッター等による光量の損失もなく、波面変換素子を用いる形態と用いない形態を容易に切り換え可能なレーザー走査型顕微鏡等の走査型光学顕微鏡に関するものである。

従来、例えばＬＳＭ（レーザー走査型顕微鏡）において、観測する物体の三次元像を得るためには、その物体又は対物レンズを機械的に光軸方向に移動させて、物体内部の各面における光学像を順次取り込んでいく必要があった。しかし、この方法は機械的駆動を必要とするために、位置制御を高い精度と再現性で実現することは困難である。また、物体を移動させる方法においては、物体が大きい場合には高速走査ができない等の問題があった。

さらに、生体物体を観察する際に、対物レンズを物体に直接接触させるか、あるいは、物体を培養液に浸した状態で対物レンズを走査すると、その振動による悪影響を観察する物体に与えることになり、好ましくない。

これらの問題点を解決する方法として、特許文献１（図８、図９）や特許文献２（図１０）に示された装置がある。

特許文献１の装置は、パワーを変化させることのできる光学素子（波面変換素子）を備えた顕微鏡であって、図８、図９にその構成図を示す。この構成において、短パルス・レーザーＫＰＬのビームは、プリチャープ・ユニットＰＣＵに到達し、これからビーム・スプリッターＳＴ１及びビーム・スプリッターＳＴ２、ＳＴ３を経て２つのアダプティブミラーＡＤ１、ＡＤ２へ到来し、ここで作動する。第１のアダプティブミラーＡＤ１（粗）は、波面の粗調整用に挿入されており、これによって焦点をＺ方向へスライドさせる。第２のアダプティブミラーＡＤ２（精）では、波面歪みと伝搬時間差（ＰＴＤ）の影響が補正される。レーザー光は、ビーム・スプリッターＤＢＳ、ｘ／ｙ走査ユニット、光学部品ＳＬ、ＴＬ、ミラーＳＰ、さらに対物レンズＯＬを経由して対象物（物体）Ｏへ到達する。その対象物Ｏから到来する光は、ビーム・スプリッターＤＢＳ、レンズＬ、ピンホールＰＨ、及びフィルターＥＦを経由して検出器ＰＭＴへ戻り、この検出器ＰＭＴはこれ自体としてＰＣＵ、ＡＤ１、ＡＤ２と同様に制御ユニットに接続されている。これにより、例えばアダプティブミラーＡＤ１、ＡＤ２と同様プリチャープ・ユニットも調整して、検出器ＰＭＴに最大信号が加わるようにする。

特許文献２の装置は、図１０にその構成図を示すように、光源１１と、その光源１１から発せられた照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子２２と、該波面変換素子２２から発せられた波面変換後の光束を直交する２方向に走査する光走査手段３と、光走査手段３によって偏向した光束を試料に集光する対物レンズ４と、試料から発せられた信号光を検出する検出器５３とを備え、波面変換素子２２を光走査手段３と同期して動作させる走査型光学顕微鏡である。

このように、これらの装置では、パワー等を変化させることのできる光学素子（アダプティブミラー、波面変換素子）を備えた顕微鏡であって、これらの先行例では、観察光路及び／又は照明光路内に波面変換素子を有し、その波面変換素子を用いて光学系の焦点距離を変化させると共に、この焦点距離変化に伴って生じる収差も補正するものである。こうすることによって、対物レンズと物体との距離を変えることなく、物体空間での焦点の形成と移動、さらに、収差補正を行うことができる。
特開平１１−１０１９４２号公報 特開２００４−１０９２１９号公報 特開２０００−２９２５１７号公報

上記の従来技術において、特許文献１の場合では、ビームスプリッターを用いて波面変換素子に垂直に光を入射させる構成となっているが、この手法では、ビーム・スプリッターによる大幅な光量のロスが生じてしまい、観測を行う上で大きな問題となる。

一方、その影響をなくすために、特許文献２では、波面変換素子に特定の角度で光を入射させる手法が示されている。本手法では、ビームスプリッターを用いない構成になっている分、光量の損失は少ない。しかし、波面変換素子に入射させる角度が大きいために、波面変換素子における光束の形状が楕円となる。したがって、波面変換素子に印加する電圧の制御が難しくなる。波面変換素子の制御を容易にするためには、楕円の波面変換素子の製作等があるが、その分波面変換素子の製造が難しくなると共に、そのアライメントにおいても困難となる。

さらに、図７に示した波面変換素子を用いない場合の光学系と比較すると、図７から図１０に変更するには、光学系の配置に関して大きな変更が必要となる。例えば、図１０での光束走査手段３における照明光の幅と図７の光束走査手段３での照明光の幅を等しくするためには、波面変換素子２２の大きさに応じて、図１０におけるコリメータレンズ１２、集光レンズ５２の仕様変更が必要となり、それに応じてレーザ光源１１や検出器５３の配置も変更する必要がある。逆に、これらの仕様を同一にしようとすると、波面変換素子２２の大きさや形状に関する仕様が制限され、製作がより困難になる。

したがって、一旦波面変換素子を用いる装置を組み立ててしまうと、波面変換素子を用いない場合のシステムを再現するのは難しい。それに伴って、波面変換素子を用いない装置と用いた装置では全く別の装置として製作しなければならず、製作上の手間も大きくなる。

本発明は従来技術のこのような問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、ビームスプリッター等による光量の損失もなく、波面変換素子に入射する角度を大きくすることなく、その制御が容易で、さらに、従来のレーザー走査型顕微鏡の光学配置を大きく変更することなく、波面変換素子の大きさにも容易に対応することが可能な走査型光学顕微鏡を提供することである。

上記目的を達成する本発明の走査型光学顕微鏡は、光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子を含む波面変換素子光学系と、前記波面変換素子光学系で波面変換された照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備え、前記波面変換素子光学系に、前記光源からの光束を前記波面変換素子に導くための第１の反射面と、波面変換後の光束を前記光束走査手段に導くための第２の反射面とが含まれ、
前記波面変換素子光学系において、前記第１の反射面から反射した光束を前記波面変換素子に入射させるための第１の伝達レンズ系及び第２の伝達レンズ系の２つのレンズ系を有し、前記波面変換素子から変調を受けて反射された光束が再び前記第２の伝達レンズ系を透過し、この第２の伝達レンズ系を透過した光束が第３の伝達レンズ系を透過した後に、前記第２の反射面に入射するように構成されており、前記第２の伝達レンズ系の中心軸に対して前記第１の伝達レンズ系の中心軸か前記第３の伝達レンズ系の中心軸の少なくとも一方が特定の間隔だけ離れて配置されていることを特徴とするものである。

この場合に、前記波面変換素子光学系に含まれる前記第２の伝達レンズ系の中心軸と前記第１の伝達レンズ系の中心軸との間隔をｄ１、前記第２の伝達レンズ系の中心軸と前記第３の伝達レンズ系の中心軸とのの間隔をｄ２とした場合、ｄ１とｄ２の何れか大きい方をｄ、前記第２の伝達レンズ系の焦点距離をｆとするとき、
ｄ／ｆ＜０．４２ ・・・（２）
を満足することが望ましい。

また、前記波面変換素子光学系に含まれる前記第１の反射面と前記第２の反射面が移動可能に構成されていてもよい。

本発明の走査型光学顕微鏡では、波面変換素子光学系に反射面を２つ設けており、波面変換素子に入射させる角度を自由に変えることが可能となり、波面変換素子での制御を容易にすることが可能となる。さらに、波面変換素子光学系に入射する光束と、波面変換素子によって変調された光束が波面変換素子光学系から射出する光束との進行方向を同じにすることが可能となる。そのため、波面変換素子を用いない場合の基本的構成（図７）に波面変換素子光学系を付加するだけで、波面変換素子を用いた装置を構築することも可能となる。

さらに、波面変換素子光学系を構成する３つのレンズ系の仕様を適切に決定することで、波面変換素子での光束の大きさを調整し、その制御も容易にすることが可能となる。

また、２つの反射面を移動可能に構成することで、波面変換素子を用いる場合と用いない場合とを、同一の装置で簡単に実現することができるので、観測対象や対物レンズの種類に対応して最適な観察を容易に実現することができる。

以下に、本発明の走査型光学顕微鏡の実施形態について説明する。なお、説明に用いる図中において、繰り返し用いられる同一の要素には同一の記号を付し、重複する説明は行わない。また、光束が入射してくる方向を前側、射出して行く方向を後側とし、光源としてレーザー発振器を用いたレーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）を例にあげて説明する。

まず、本発明の第１実施形態の走査型光学顕微鏡を、図１〜図４を参照にして説明する。

図１は、第１実施形態のレーザー走査型顕微鏡の全体の構成を示す図である。図１において、光源としてのレーザー光源１１は、照明光としてのレーザ光束を発し、その照明光はコリメータレンズ１２によって平面波に変換される。次に、この照明光はダイクロックミラー５１で反射した後に、波面変換素子光学系２に入射する。波面変換素子光学系２は、第１の反射面である反射ミラー２１１、第２の反射面である反射ミラー２１２、第１の伝達レンズ系２２、第２の伝達レンズ系２３、第３の伝達レンズ系２５、及び、波面変換素子で構成される。その波面変換素子としては、ミラーの反射面が電気的制御によって制御可能な形状可変ミラー（以下、ＤＦＭ）２４が用いられている。

波面変換素子光学系２に入射した照明光は、第１の反射面である反射ミラー２１１で反射されて、第１の伝達レンズ系２２に入射し、次に第２の伝達レンズ系２３に入射する。第２の伝達レンズ系２３と第１の伝達レンズ系２２は、それぞれのレンズの中心軸は一致せずに特定の間隔ｄ１だけ離れているが、第２の伝達レンズ系２３の前側焦平面と第１の伝達レンズ系２２の後側焦平面が一致するように配置されている。そのため、第１の伝達レンズ系２２を透過した照明光は第２の伝達レンズ系２３を透過し、略コリメート光束で、その進行方向は第２の伝達レンズ系２３の後側焦点に向かう光束となる。

第２の伝達レンズ系２３の後側焦平面近傍には、ＤＦＭ２４の反射面を平面にした場合にその反射面と、第２の伝達レンズ系２３の後側焦平面とが一致するように配置されている。第２の伝達レンズ系２３を透過した照明光は、略コリメート光束で第２の伝達レンズ系２３の後側焦点に向かう光束となるので、ＤＦＭ２４に対して特定の角度θで入射する。ＤＦＭ２４に入射した照明光は、そこで所定の波面変換が行われる。ＤＦＭ２４によって波面変換が施された照明光は反射され、再び第２の伝達レンズ系２３に入射し、次に第３の伝達レンズ系２５に入射する。この第３の伝達レンズ系２５でも、第２の伝達レンズ系２３とはその中心軸がｄ２だけ離れており、さらに、第２の伝達レンズ系２３の後側焦平面と第３の伝達レンズ系の前側焦平面とは一致するように配置されている。したがって、ＤＦＭ２４で波面変換がなされない場合（ＤＦＭ２４の反射面を平面にした場合）には、第３の伝達レンズ系２５から射出する照明光は略コリメートな光束となる。この第３の伝達レンズ系２５から射出した照明光は、第２の反射面である反射ミラー２１２によって反射され、波面変換素子光学系２から射出される。

波面変換素子光学系２から射出した照明光は、光束走査手段３に入射する。ここで、光束走査手段３は第３の伝達レンズ系２５の後側焦平面と一致するように、波面変換素子光学系２が配置されている。第３の伝達レンズ系２５の前側焦平面は第２の伝達レンズ系２３の後側焦平面と一致するように配置されているので、光束走査手段３の面とＤＦＭ２４の面とは共役な面となる。

光束走査手段３は、互いに直交する２つの軸で回転が可能なジンバルミラーからなる（特許文献３参照）。ジンバルミラーで適切に照明光の向きを変えることで、物体面で互いに直交するｘ及びｙ方向に入射する照明光を走査できるようにする。

光束走査手段３で特定の角度に反射された照明光は、瞳投影レンズ（第１のリレー光学系）７３に入射し、次に結像レンズ７４に入射し、最後に対物レンズ４を透過することで、物体Ｏに集光する。瞳投影レンズ７３、結像レンズ７４、対物レンズ４はテレセントリックな光学系で形成され、それぞれの前側焦平面と後側焦平面が略一致するように配置されている。

照明光が集光した物体Ｏからは測定すべき蛍光光束が発生する。その蛍光光束は、照明光が通ってきたのと逆向きに進む。つまり、対物レンズ４、結像レンズ７４、瞳投影レンズ７３を透過し、光束走査手段３で反射されて、波面変換素子光学系２に入射する。波面変換素子光学系２に入射した光束は、反射ミラー２１２で反射され、次に第３の伝達レンズ系２５を透過し、第２の伝達レンズ系２３を透過し、ＤＦＭ２４で変調を受けて、反射する。さらに、第２の伝達レンズ系２３、第１の伝達レンズ系２２を透過し、反射ミラー２１１で反射されて、波面変換素子光学系２を射出する。波面変換素子光学系２から射出した蛍光光束は、次にダイクロックミラー５１で検出すべき特定の波長のみが透過され、集光レンズ５２に入射する。集光レンズ５２の後側焦平面にはピンホール付の検出器５３が配置され、目的とする波長で、ピンホールを透過した光量が検出される。

この実施形態の構成では、図７に示す基本的な構成でのダイクロックミラー５１と光束走査手段３の間に、波面変換素子光学系２を配置するだけで、波面変換素子を用いた構成を容易に実現することが可能となる。

本実施形態におけるＤＦＭ２４の変調について、図２を参照にして説明する。図２では、波面変換素子光学系２における第２の伝達レンズ系２３、及び、ＤＦＭ２４に関する部分について示してある。本説明では、第２の伝達レンズ系２３を理想レンズとし、照明光束は波長λが４８８ｎｍとしている。また、第２の伝達レンズ系２３に入射する照明光は、第１の伝達レンズ系２２を透過した照明光が第２の伝達レンズ系２３の前側焦平面に集光するが、その集光点から、ＮＡ０．０５で広がる点光原として第２の伝達レンズ系２３に入射するものとしている。また、第２の伝達光学系２３の中心軸から第１の伝達レンズ系２２の中心軸の距離ｄ１、及び、第２の伝達レンズ系２３の中心軸から第３の伝達レンズ系２５の中心軸の距離ｄ２は、それぞれ同じ距離ｄだけ離れているものとしてシミュレーションを行った。

第２の伝達レンズ系２３に入射する照明光は、波面変換素子であるＤＦＭ２４によって変調され、再び理想レンズである第２の伝達レンズ系２３を透過する。ＤＦＭ２４での変調がない場合には、ＤＦＭ２４で反射された光束は第２の伝達レンズ系２３後側焦平面に集光する。ここで、第２の伝達レンズ系２３の後側焦平面より１０ｍｍだけ第２の伝達レンズ系２３側に集光するようにＤＦＭ２４での変調を行う。変調を行うＤＦＭ２４は、直径１０ｍｍの内側で面形状が変調し、直径の１０ｍｍの周辺は固定のタイプとする。反射面の直交座標を（ｘ’，ｙ’，ｚ’）とした場合に、反射面の形状Ｚ（ｘ’，ｙ’）は、次の（１）式に示すような４次の自由曲面とし、その係数Ｃ_j において、ｊは４以内とする。

Ｚ（ｘ’，ｙ’）＝ΣＣ_j ｘ’^m ｙ’ⁿ
ｊ＝［（ｍ＋ｎ）² ＋ｍ＋３ｎ］／２＋１ ・・・（１）
このシステムで、照明光はＤＦＭ２４に対して特定の角度θで入射する。この角度θは、第２の伝達レンズ系２３の焦点距離ｆと、第１の伝達レンズ系２２の中心軸と第２の伝達レンズ系２３の間隔ｄによって決定される。角度θが変わると、補正に必要なＤＦＭ２４の形状はｙ’軸方向に関して非対称の形となる。一例として、図３のグラフ１に、光軸との角度θが２．８６°と２６．６°の場合に最適な性能を出すのに必要なＤＦＭ２４の形状を示す。このグラフ１に示した形状は、ｙ’方向とｚ’方向に関する面形状の断面図である。このグラフ１から分かるように、照明光のＤＦＭ２４への入射角度θが大きくなると、非対称性だけでなく、ＤＦＭ２４の変位量も大きくなり、制御も困難になってくる。また、ＤＦＭ２４への入射角度θに対する性能の評価として、波面収差の量を図４のグラフ２に示す。このグラフ２から、角度θが大きくなればなる程、ＤＦＭ２４を変調しても、波面収差の量が増えるので、精度の低下につながることが分かる。この波面収差がλを超えると、顕微鏡の性能としては問題となる。

したがって、グラフ２から、許容できる入射角度θとしては、θ＜２３°であり、この角度θは、第２の伝達レンズ系２３の焦点距離ｆと第１の伝達レンズ系２２と第２の伝達レンズ系２５の中心軸の間隔ｄによって決まる。すなわち、
ｄ／ｆ＜ｔａｎ（２３°）
したがって、
ｄ／ｆ＜０．４２ ・・・（２）
であることが、より望ましい。

また、波面変換素子光学系２において、第１の伝達レンズ系２２と第２の伝達レンズ系２３との中心軸の距離ｄ１と、第３の伝達レンズ系２５と第２の伝達レンズ系２３との距離ｄ２が等しくなくとも、図５に示すように、波面変換素子のＤＦＭ２４で反射する角度を調整することで、波面変換素子光学系２を構築することは可能である。この場合には、距離ｄ１とｄ２のどちらか大きい方が、上記（２）式を満足することが望ましい。

次に、第１実施形態の変形例として、図６に第２実施形態のレーザー走査型顕微鏡の全体の構成を示す。図５では、第１実施形態における波面変換素子光学系２と比較して、第１の反射面、第２の反射面が、反射面を２つ有する直角プリズムミラー２１３の直交する反射面２１４、２１５によって構成され、このプリズムミラー２１３を移動することが可能な装置となっている。

この直角プリズムミラー２１３にある第１の反射面２１４で反射された照明光は、ＤＦＭ２４にレンズ等の光学素子を介さずに入射し、特定の変調を受ける。この変調された光束は、次に第２の反射面２１５に入射する構成となっており、ＤＦＭ２４に少ない入射角度で入射させることが可能となる。また、ＤＦＭ２４の反射する領域が、全ての対物レンズの種類に対応できず、特定の対物レンズでは光束がケラレる可能性がある。その場合には、本実施形態では、直角プリズムミラー２１３が移動する構成にもなっており、ＤＦＭ２４でケラレが発生するような対物レンズでは、直角プリズムミラー２１３を光路外に移動してＤＦＭ２４を用いない光学系での観察を可能とすることができる。

したがって、直角プリズムミラー２１３を移動させることで、観測対象や対物レンズの種類に対応して最適な観測が可能となる。

第１実施形態のレーザー走査型顕微鏡の全体の構成を示す図である。 第１実施形態の波面変換素子の作用を説明するための図である。 第１実施形態の波面変換素子の入射角度に応じた面形状の断面図である。 第１実施形態の波面変換素子の入射角度と波面収差の関係を示す図である。 第１実施形態の波面変換素子光学系における３つのレンズ系の配置の変形を示す図である。 第２実施形態のレーザー走査型顕微鏡の全体の構成を示す図である。 波面変換素子を用いない場合のレーザー走査型顕微鏡の全体の構成を示す図である。 従来の波面変換素子を備えた顕微鏡の構成を示す図である。 従来の波面変換素子を備えた顕微鏡の構成を示す図である。 従来の別の波面変換素子を備えた走査型光学顕微鏡の構成を示す図である。

符号の説明

Ｏ…物体
２…波面変換素子光学系
３…光束走査手段
４…対物レンズ
１１…レーザー光源
１２…コリメータレンズ
２２…第１の伝達レンズ系
２３…第２の伝達レンズ系
２４…形状可変ミラー（ＤＦＭ）
２５…第３の伝達レンズ系
５１…ダイクロックミラー
５２…集光レンズ
５３…検出器
７３…瞳投影レンズ（第１のリレー光学系）
７４…結像レンズ
２１１…反射ミラー（第１の反射面）
２１２…反射ミラー（第２の反射面）
２１３…直角プリズムミラー
２１４…第１の反射面
２１５…第２の反射面

Claims (3)

1. 光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子を含む波面変換素子光学系と、前記波面変換素子光学系で波面変換された照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備え、前記波面変換素子光学系に、前記光源からの光束を前記波面変換素子に導くための第１の反射面と、波面変換後の光束を前記光束走査手段に導くための第２の反射面とが含まれ、
   前記波面変換素子光学系において、前記第１の反射面から反射した光束を前記波面変換素子に入射させるための第１の伝達レンズ系及び第２の伝達レンズ系の２つのレンズ系を有し、前記波面変換素子から変調を受けて反射された光束が再び前記第２の伝達レンズ系を透過し、この第２の伝達レンズ系を透過した光束が第３の伝達レンズ系を透過した後に、前記第２の反射面に入射するように構成されており、前記第２の伝達レンズ系の中心軸に対して前記第１の伝達レンズ系の中心軸か前記第３の伝達レンズ系の中心軸の少なくとも一方が特定の間隔だけ離れて配置されていることを特徴とする走査型光学顕微鏡。
2. 前記波面変換素子光学系に含まれる前記第２の伝達レンズ系の中心軸と前記第１の伝達レンズ系の中心軸との間隔をｄ１、前記第２の伝達レンズ系の中心軸と前記第３の伝達レンズ系の中心軸とのの間隔をｄ２とした場合、ｄ１とｄ２の何れか大きい方をｄ、前記第２の伝達レンズ系の焦点距離をｆとするとき、
   ｄ／ｆ＜０．４２ ・・・（２）
   を満足することを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡。
3. 前記波面変換素子光学系に含まれる前記第１の反射面と前記第２の反射面が移動可能に構成されていることを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡。

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