JP4047225B2 - 適応光学装置を有する顕微鏡、特にレーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、照明光路および／または検出光路を光学的構成グループの特性および／または試料の特性に可変的に適合させるための適応光学装置を有する顕微鏡、特にレーザ走査型顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
適応光学系を顕微鏡に利用することは、現状の技術ではすでにそれ自体知られており、たとえばＰＣＴ／ＷＯ９９／０６６５６に記述されている。もっとも、そこで開示された照明光路内および／または検出光路内での適応光学系の場合、少なくとも１つのビームスプリッタを使用して構造上の配列をする必要があり、それによって光学的損失が現われる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
原理的に示されている現状の技術の添付図６中では、適応素子をミラーにより光路内へ損失なく結合させる手段も、たしかに同様に知られているが、しかし光路が反射鏡面に斜めに当たるため、かなりの収差が追加発生する。その上現状の技術では、適応光学素子と波面センサが連携する必要があり、それによって一般には別の損失が発生する。
【０００４】
波面センサとしては、この関連において、たとえばシャック・ハルトマン・センサまたは干渉計のような、たとえばＰＣＴ／ＧＢ９９／０３１９４に述べられているような古典的なセンサが利用される。しかしこの種のセンサは、共焦点レーザ走査型顕微鏡で意図されているような、試料の３次元走査にはあまり適していない。これは共焦点検出とは異なり、焦点外れの光が比較的多く入射センサの方へ向かうという事実に起因している。
【０００５】
この現状の技術から出発して、本発明の基礎となる課題は、上記種類の顕微鏡を、適応光学系の照明光路内および／または検出光路内への、損失のない、収差のない結合が保証されるように改良することである。本発明のもう１つの課題は、適応光学系の適正な制御を、特別な波面センサを使用せずに実現することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明による場合、適応光学装置としては以下のものがある：
双方ともそれらの反射鏡面が、顕微鏡光路の光軸に垂直に向けられている２つの反射性適応素子と、そのスプリッタ層が顕微鏡光路の２つの直交するアームの交点に存在する１つの偏光性ビームスプリッタ。
但し、第１の適応素子が一方のアームに、他の適応素子がもう一方のアームに属していて、各アーム内にはビームスプリッタと適応素子との間に１枚のλ／４板が存在するものとする。ならびに検出光に向けて配置された、評価装置および調整装置を通じて適応素子と結びつけられている１つの検出装置。
この場合検出装置としては、レーザ走査型顕微鏡内に元々存在している検出装置を利用するのが好ましい。
【０００７】
この配置を用いて、検出器信号を評価もしくは加工するごとに、３次元での試料読み取り時に、迅速な深さ走査を顕微鏡対物レンズまたは試料を動かすことなく達成すること、試料に起因する収差を均衡化すること、ならびに誤って利用されまたは不完全に補正された光学部品、それも特に顕微鏡対物レンズに起因する収差を補正することが可能である。
【０００８】
本発明の１つの構成において、偏光性ビームスプリッタが使用され、各アームの中でビームスプリッタと適応素子との間に１枚のλ／４板が存在する。この配置において、照明光源から来る光は、一方のアームの中で、その偏光状態に依存してスプリッタ層および１枚のλ／４板を通って第１の適応素子に向かい、その反射鏡面からスプリッタへ戻し反射され、そこから顕微鏡対物レンズの方向に伝播する。第１の適応素子の方向に拡散する光に関して、直交偏光を有する光は、その終端には第２の適応素子が存在する他方のアームの方向に導かれる。光は、この素子において反射し、１枚のλ／４板を通過した後スプリッタ層へ戻され、これを通って顕微鏡対物レンズに到達する。
【０００９】
試料から放射され、顕微鏡対物レンズを通過した検出光は、その偏光状態に依存して一方のアームまたは他方のアームを通り抜け、適合した反射性適応素子からスプリッタ層へ戻り反射し、そこから検出装置へと伝播する。
【００１０】
検出装置は、１つの第２偏光性ビームスプリッタ、ならびに２つの光電子変換器を有する。その偏光状態に依存して、検出光はこのビームスプリッタのスプリッタ層を通って一方の光電子変換器へ移動するか、またはスプリッタ層から他方の光電子変換器へ方向転換する。変換器からの信号は、適応素子を持つビームスプリッタ配置の一定アームを通じて検出器側に送られる光に明確に組み入れることができる。
この配置の本質的な長所は、適応光学系を損失なく、収差なく顕微鏡の照明光路内および／または検出光路内へ結合させることが可能な点である。その上、以下により詳しく説明する通り、適応光学系の調整においてさまざまな有利なモードが判明する。本発明に基づく配置は、点走査レーザ走査型顕微鏡においてだけでなく、線走査レーザ走査型顕微鏡においても利用できる。
【００１１】
適応素子と組み合わされるビームスプリッタと検出装置との間に、共焦点レーザ走査型顕微鏡に適合した構成、検出光をピンホールへフォーカシングするためのピンホール光学系、ならびに検出光を平行化するための光学系が配備されている。
【００１２】
また、本発明の課題は、以下のものを含む１つの適応光学装置を用いても解決される。
双方ともそれらの反射鏡面が、顕微鏡光路の光軸に垂直に向けられている１つの適応反射素子および１つの非適応反射素子、およびそのスプリッタ層が、顕微鏡光路の２本の直交アームの交点に存在する１つの偏光性ビームスプリッタ。但し、適応素子が一方のアームに、非適応素子が他方のアームに属していて、各アーム内にはビームスプリッタとそれぞれの反射素子との間に１枚のλ／４板が存在するものとする。ならびに、検出光に向けて配置された、評価装置および調整装置を通じて適応素子と結びつけられている検出装置。
【００１３】
検出装置としては、好ましくは、レーザ走査型顕微鏡に元々存在する検出装置を利用する。
一方のアーム内において、照明光源から来る光が、その偏光状態に依存してスプリッタ層およびλ／４板を通って適応素子に向けられており、その反射鏡面からスプリッタ層へ戻し反射され、そこから顕微鏡対物レンズの方向に伝播するという構成を想定することができる。
【００１４】
第１適応素子の方向に拡散する光に関して、直交する偏光を有する光は、その終端に非適応素子（ミラー）が存在する他方のアームの方向に導かれる。このミラーにおいて、反射後、光はλ／４板を通過してスプリッタ層へ戻され、これを通って顕微鏡対物レンズに到達する。
この構成では、励起側で適当に偏光させて適応素子を避けて通すこと、および非適応素子からの信号検出と結合させて補正されていない像を得たり、もしくは偏光の回転により補正された像と補正されていない像間のすばやい切り換えが可能である。
前記した両構成の場合、適応装置は、第１の配置で記述したように励起光路内および検出光路内に配備することも、励起光路内にのみ配備することも可能である。後者は特に多光子配置との関係において利用するのに適しており、その場合適応光学装置は励起側で照明光路と検出光路の分岐前に置かれる。
【００１５】
適応素子は、好ましくは、顕微鏡光路のひとみ平面内に設置する。
有利なのは、ひとみ平面が走査装置の反射面と同一であること、および試料全体にわたる横方向の走査移動に従って導かれる回折抑制スポットが試料内に作り出されるよう、走査光学系、顕微鏡対物レンズならびに円筒レンズ間で互いの位置づけがなされていることである。すでに詳述したように、ここでは点走査のみならず線走査も対象にすることができる。
適応反射素子としては、たとえば区分調整可能な鏡面を有するミラー、薄膜ミラーまたは反射式空間光変調器が使用の対象となる。
本発明に基づく特に好ましい配置構成は、各適応素子の口径を顕微鏡対物レンズの口径に適合させるのに利用できるズーム光学系が適応素子に組み込まれていることにある。
【００１６】
また、以下のものを含む別な構成も可能である：
スプリッタ面内に透過領域および反射領域を有する光学的ビームスプリッタが、中間像平面内において組み込まれている照明光路のひとみ平面内に配置された適応凹面鏡であって、但し、照明光が、まずスプリッタ面へ、次にその反射領域から凹面鏡へ向けられ、凹面鏡から透過領域へ焦点合わせされ、そこを通って試料に到達する適応凹面鏡、および／または、
スプリッタ面内に透過領域および反射領域を有する光学的ビームスプリッタが、中間像平面内に組み込まれている検出光路のひとみ平面内に配置された適応凹面鏡であって、但し、検出光が、まずスプリッタ面へ、次にその反射領域から凹面鏡へ向けられ、凹面鏡から透過領域へ焦点合わせされ、そこを通って検出装置に到達する適応凹面鏡、ならびに、
入力側で顕微鏡の検出装置と、出力側で１つのまたは両方の凹面鏡の形を変化させるための、および／または各凹面鏡とそれに対応するビームスプリッタ間の距離を変更するための調整装置と結合している評価装置。
【００１７】
この配置によって、迅速に焦点合わせするため、または光学的構成グループや検査対象試料に起因する像誤差を補正するため、適応凹面鏡を照明光路内で利用することができる。この場合、スプリッタ面の透過領域は、共焦点絞りもしくは空間フィルタとしての作用はせず、少なくとも５エアリより大きい直径を有している。
【００１８】
試料から来る検出光を照明光路から分岐するには、ビームスプリッタを配備することができるが、好ましくは照明光用の視準器光学系と走査装置との間に位置設定する。
点走査する装置が試料を走査するために配備されている場合、スプリッタ面の透過領域は円形または楕円形の開口として形成されている。楕円形開口としての形成は、スプリッタ面が入射するビームに対して４５°傾斜しているとき、凹面鏡の方向に円形の投影をもたらすという長所を持つ。
試料を走査するための線走査装置の場合、スプリッタ面の透過領域はスリット形の開口として形成されている。
【００１９】
さらに、有利な態様として、それぞれ対応のスプリッタ面の透過領域を通って入る照明光および／または検出光には、入射するビーム成分が当たり、当該光のビーム強度を評価するのに用いられる検出器を後置することができる。
本発明に基づく配置内に配備されているすべての適応凹面鏡について言えるが、それらを光軸の方向に移動させるために１つの装置と結合させることができる。尚、この移動装置も同様に評価装置および調整装置と結合している。その場合、適応凹面鏡の移動だけでなく、鏡面の幾何構造を然るべき制御により変更することから生ずる焦点距離の変化も焦点合わせに影響を及ぼす。このようにして、なかでも凹面鏡の口径を、使用顕微鏡対物レンズのひとみへ適合させることが可能になる。
【００２０】
特に最後に挙げた態様の長所は、ほとんど損失なく、収差なく適応素子を顕微鏡光路内へ結合させることのほか、屈折素子を避けることによって理想的な色補正が達成される点にある。
適応凹面鏡としては、すでに上に挙げた反射適応素子が使用対象となる。そのほか、焦点距離を短くするため適応凹面鏡に屈折素子を付けることもできる。加えて、特に蛍光検出の場合では、照明光を抑制するため、波長フィルタを検出光路の方向へ向けさせる装置が配備できる。
さらに、適応凹面鏡の場所にそれぞれ１つずつひとみを作るのに用いるリレー光学系も光路内へ組み入れることができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下では本発明を実施例に基づき説明する。
図１には、本発明に基づく配置が、共焦点レーザ走査型顕微鏡の光路を基に示されており、その場合照明光源１から出る照明光２は試料３に向いている。その場合、走査光学系４、円筒レンズ５および顕微鏡対物レンズ６によって、回折抑制スポットが生成され、画像取得のため、走査装置７により試料３全体にわたり横方向に動かされる。
【００２２】
試料３から放出された光は、逆方向に顕微鏡対物レンズ６、円筒レンズ５、走査光学系４を通過し、検出光路９と照明光路２との分岐に用いられるビームスプリッタ８を通って、検出装置１０に向けられる。その場合、検出光路９内にはビームスプリッタ８の後ろにピンホール光学系１１、ピンホール１２およびコリメーション光学系１３が配置されている。
その上、特に蛍光検出において、照明光２が検出装置１０に到達するのを妨ぐ波長フィルタ１４が配備されている。
【００２３】
本発明に従えば、顕微鏡光路の一方のアーム１６の光軸に垂直に反射鏡面が向いている第１の適応ミラー１５が設置されている。そのほか、顕微鏡光路のもう一方のアーム１８の光軸に垂直に向けられている反射鏡面を有する別の適応ミラー１７がある。
【００２４】
両アーム１６および１８が互いになす角の交点には、そのスプリッタ層が両アーム１６，１８内の光線方向に対して４５°傾いた状態の偏光性ビームスプリッタ１９が配置されている。
さらに、ビームスプリッタ１９と適応ミラー１５との間には、１枚のλ／４板２０ならびに１つのズーム光学系２１が、そしてビームスプリッタ１９と適応ミラー１７との間には、１枚のλ／４板２２および１つのズーム光学系２３が存在する。
【００２５】
以上のほか、適応ミラー１５および１７の平面を顕微鏡配置のひとみ平面２５内へ結像させるレンズ２４も配備されている。しかしこの課題は、構成の適合化と同時にズーム光学系２１もしくは２３に担わせることもでき、その場合レンズ２４は不要である。
【００２６】
試料３を走査する際、照明光２は、ビームスプリッタ８で偏向した後、その偏光状態に依存してビームスプリッタ１９のスプリッタ層を通って適応ミラー１５へ、またはスプリッタ層により偏向して、適応ミラー１７へ達することも、あるいは両適応ミラー１５，１７に達することもある。
その場合、光は、それぞれ当たった適応ミラー１５または１７から、再びビームスプリッタ１９へ戻り反射する。それにより、それぞれビームスプリッタ１９の方向へ戻る照明光は、λ／４板２０もしくは２２を再度通過後、それぞれ入射光に垂直に偏光される。その結果、照明光はビームスプリッタ１９のスプリッタ層を通じて再び顕微鏡光路内へ組み入れられ、試料３に向けられる。
この結合は、適応ミラー１５，１７、偏光性ビームスプリッタ１９のみならずλ／４板２０，２２も含む、本発明に基づく適応装置により損失なく行われる。
【００２７】
試料３から放出される光は、ビームスプリッタ１９もしくは適応ミラー１５，１７を通って逆の順序で光路を通過する。その後、検出光はその偏光状態に依存して、ビームスプリッタ１９のスプリッタ層から適応ミラー１５へ偏向するか、またはビームスプリッタ１９のスプリッタ層を通って適応ミラー１７に、または両適応ミラー１５，１７に到る。この場合でも、検出光は適応ミラー１５，１７でそれぞれ反射し、λ／４板２０もしくは２２を再度通過した後、向かってくる検出光に垂直に偏光する。これは、適応ミラー１５を経由して検出装置１０に到達する光が、適応ミラー１７から来る光に垂直に偏光していることを意味する。
【００２８】
このことを前提として、検出装置１０内には偏光性ビームスプリッタ２６ならびに２つの光電子変換器２７.１，２７.２が配備されている。それにより、適応ミラー１５からの検出光は、光電子変換器２７.１により、また適応ミラー１７からの検出光は光電子変換器２７.２により検出することが可能である。すなわち、検出側では適応ミラー１５と１７に別々に分類される信号が、光電子変換器２７.１，２７.２の出力部においては隣接する。
【００２９】
さらに本発明に従えば、光電子変換器２７.１の出力信号は、図示されていない評価装置および調整装置を通じて、適応ミラー１５と結合しており、また光電子変換器２７.２の出力側も同様に、やはり図示されていない評価装置および調整装置を通じて、適応ミラー１７と結合している。
このほか、ズーム装置２１および２３もまたそれぞれ対応の評価装置および調整装置と結合している。
【００３０】
本発明に基づく配置によれば、迅速に焦点合わせするために、または光学的構成グループまたは検査すべき試料に起因する像誤差を補正するためには、適応光学系の利用が比較的少ない機器技術コストのもと高い効率で可能である。当該方法はずっと後段でより詳しく説明する。
【００３１】
以下では図２に基づく別の実施例を説明する。
照明光源２８から出た照明光２９は、ここでも走査光学系３０、円筒レンズ３１および顕微鏡対物レンズ３２を通って試料３３へ向けられる。回折抑制スポットが横方向に試料３３全体にわたって走査装置３４によって導かれ、それにより試料３３の像情報が取得される。
試料３３から放出された光は、逆方向に顕微鏡対物レンズ３２および円筒レンズ３１を通過し、ビームスプリッタ３５により照明光路から分離され、別の検出光路３６としてピンホール光学系３７を通じて検出器３８に向けられる。
【００３２】
本発明に従えば、照明光２９の光路内で、照明光源２８と走査装置３４との間に１枚の適応ミラー３９および１枚の従来型非適応ミラー４０が配備され、それらの反射鏡面が照明光路の２つあるアーム４１，４２にそれぞれ垂直に向けられている。このとき両アーム４１，４２は直角をなし、それらの交点には偏光性ビームスプリッタ４３のスプリッタ面が存在する。スプリッタ面は両アーム４１，４２内の光線方向に対してそれぞれ４５°傾斜している。
ビームスプリッタ４３とミラー４０との間の光路内にはさらにλ／４板４４が、適応ミラー３９とビームスプリッタ４３との間の光路内にはλ／４板４５ならびにズーム光学系４６が組み入れられている。
【００３３】
この顕微鏡装置を操作する際には、前記実施例に準じて、照明光２９は、その偏光状態に依存してビームスプリッタ４３のスプリッタ面を通ってλ／４板４５、およびズーム光学系４６を通じて適応ミラー３９へ到り、そこから同じ道を辿ってビームスプリッタ４３のスプリッタ面へ戻り反射する。スプリッタ面からは、試料３３の方へ転向する。それは照明光２９がλ／４板４５の再通過後、入射する照明光２９に対して垂直に偏光しているためである。
【００３４】
逸脱偏光の場合、照明光２９は、まずビームスプリッタ４３のスプリッタ層からミラー４０の方向へ偏向し、そこでスプリッタ層へ戻り反射し、λ／４板４４を２回通過する。照明光はλ／４板４４の２回通過後、入射する照明光２６に対して垂直な偏光方向を持ち、その結果今度はスプリッタ層を通って試料３３に到達する。試料３３から放出された光は既述の経路を辿って検出器３８に達するが、当検出器は図示されていない評価装置および調整装置を通じて適応ミラー３９と、および／またはズーム装置４６と結合している。
像取得におけるこの配置の利用方法については、以下により詳しく説明する。ズーム光学系４６用の評価装置内で発生する調整信号は、顕微鏡対物レンズへ最適適合させるために光の広がりを利用することができる。
【００３５】
図３ａは本発明に基づく配置の別な実施例についての模式図である。
この場合照明光源４８から発する照明光４９は、光学的ビームスプリッタのスプリッタ面５０に当たる。
図３ｂから、スプリッタ面５０は、円形開口として形成された透過領域５１を有していて、これが反射領域５２によって囲まれているのが分かる。透過領域５１は、これに代え楕円形の開口として形成することもできる。図３ａがさらに示すように、スプリッタ面５０は、衝突する照明光４９に対し４５°傾斜している。それによって、反射領域５２に衝突する照明光４９のビーム成分４９.１は、顕微鏡配置のひとみ内に存在する適応凹面鏡５３の方向へ転向することが可能になる。
【００３６】
適応凹面鏡５３は、ビーム成分４９.１を、配置の中間像平面内にり照明光路内の共焦点絞りとして作用する透過領域５１へ、戻り方向にて焦点合わせする。
この場合、さまざまな直径の透過領域を有するスプリッタ面を使用することによって、顕微鏡配置の光学的分解能に影響を与えたり、調整したりすることができる。透過領域５１が、楕円形であれば、スプリッタ面５０が４５°傾斜していることから、凹面鏡５３から来る光線は見かけ上円形形態を取る。
【００３７】
透過領域５１へフォーカシングされたビーム成分４９.１は、透過領域５１を通って進み、続いてレンズ５４によって平行化される。走査光学系５５、円筒レンズ５６および顕微鏡対物レンズ５７により、試料５８の中に、、試料５８の撮像に用いられる回折抑制されたスポットが生成される。その目的のため走査装置５９によりスポットを横方向に試料５８全体にわたり移動させる。
試料５８から発し、像情報を運ぶ検出光は、戻り経路を辿って顕微鏡対物レンズ５７、円筒レンズ５６、走査光学系５５および走査装置５９を通り、検出光路６１を照明光路から分離するダイクロイック・ビームスプリッタ６０に到達し、別のビームスプリッタのスプリッタ面６２に達する。スプリッタ面６２は、その幾何構造および検出光路６１への位置設定に関し、スプリッタ面５０と同様に形成されている。
【００３８】
従って、スプリッタ面６２も同様に反射領域５２（図３ｂ参照）を有するから、検出光の主要ビーム成分６１.１が適応凹面鏡６３へ偏向する。凹面鏡６３はビーム成分６１.１を透過領域５１へ戻し反射させ、焦点合わせしてこれを通過させる。その後検出光は検出器６４に達する。検出器６４により検出光の強度が測定され、測定値は、適応凹面鏡５３および６３の鏡面の幾何構造を変更させるための調整装置と結合している評価装置（図示してない）へ送られる。
ミラーの幾何構造を調整することで、最適の収差補正が得られるように、もしくは求める通りに焦点ぼけが調整されるように、一方の凹面鏡において、または両方の凹面鏡５３，６３において、反射した波面に対し影響を与えるものとする。
【００３９】
この実施例の別の態様では、照明光４９の方向に見てスプリッタ面５０の後方に、別の検出器６５、たとえば、照明光の平均出力を監視するために利用できるモニタダイオードを設置することができる。
ここで分離される光の量は、次の関数より求められ、
Ｔ＝Ａ_ＨＴ／Ａ_pupille＝ｒ_ＨＴ ^２／ｒ_pupille ^２
ここでＴは透過、Ａ_ＨＴは透過領域の面積、Ａ_pupilleは有効ひとみ断面積、ｒ_ＨＴは透過領域の半径、ｒ_pupilleはひとみの半径であり、好ましくはＴ〜１％とする。反射領域の半径はこの場合、約５ｍｍで、透過領域の半径（投射方向もしくはビーム方向に見て）は０.２５ｍｍ未満とするのが有利である。
オプションとして、検出光路６１内へ、特に蛍光検出において照明光を検出器６４に到達させないようにする役目を担う、転向可能な波長フィルタを配備することができる。
【００４０】
さらに、検出光路６１内、適応凹面鏡６３の場所に、ひとみ生成用のリレー光学系６７を組み入れれば有利になることも明らかである。これは、同時にズーム光学系として形成することができ、ビーム幅の可変的調整を可能にする。その場合、スプリッタ面６２は顕微鏡配置の中間像平面内にあり、検出光路６１内の共焦点絞りとして作用する。
スプリッタ面６２上へ落ちる光線の直径またはスプリッタ面６２の透過領域５１の直径を変更するが、もしくはさまざまな直径の透過領域５１を有するスプリッタ面を相互交換すれば、このように顕微鏡配置の光学的分解能に影響を与えることができ、もしくは調整することができる。
【００４１】
スプリッタ面５０および６２においては焦点が合っていない場合、それぞれ透過領域５１上へ落ちる照明光もしくは検出光の成分が失われる。しかし、透過領域５１と反射領域５２の面積比は、
Ｒ＝（Ａ_pupille−Ａ_ＨＴ）／Ａ_pupille＝（ｒ_pupille ^２−ｒ_ＨＴ ^２）／ｒ_pupille ^２
である。
ここで、Ａ_pupilleは有効ひとみ面積、Ａ_ＨＴは透過領域５１の面積、ｒ_pupilleはひとみ半径、ｒ_ＨＴは透過領域５１の半径を意味する。この場合、反射領域５２の半径は顕微鏡配置の典型では約５ｍｍであり、一方透過領域５１の半径は０.２５ｍｍ未満である。
これより、面積比率、つまり両者のスプリッタ面５０および６２における光線分割の効率はＲ＞９９％となる。こうして求められた効率はそれぞれの光の波長に依存しない。
【００４２】
以下では本発明に基づく配置の作業法を、共焦点レーザ走査型顕微鏡のさまざまな操作法ごとに記述する。この説明には、図１の実施例だけを用いることとする。その他の実施例に基づく配置は、それに準じて適用することができる。
反射顕微鏡法
この操作法では、試料３から散乱または反射した光が像生成のために使用される。
試料３が複屈折しないか、あるいは偏光に顕著に依存する反射能を持たない場合、以下のように操作することができる。
照明光の偏光は、強度の等しい光が適応ミラー１５および１７に当たるように配位されている。検出光路９内では、試料から反射した光は、両アーム１６および１８を通過する際に再び適応ミラー１５および１７に当たる。その場合、変換器２７.１に当たる光は、励起側ばかりでなく検出側でも適応ミラー１５から反射したもので、変換器２７.２に達する光は、励起側ばかりでなく検出側でも適応ミラー１７から反射したものである。
【００４３】
その場合、共焦点配置内の検出器において、収差のない結像の場合より弱い光強度が記録されるのは、焦点ぼけ、試料、または光学素子に起因する収差が原因である。この場合受信信号は、試料内のある特別な点についてだけの評価ではなく、予備設定した試料上の走査面全体にわたる平均値として評価することもできる。適応ミラー１５および１７の鏡面の幾何構造を変更して、その場合の受信信号への影響を測定すれば、測定結果を基に、ミラーの幾何構造を確認し調整することができ、それにより最適の受信信号が得られると共に光学システムの収差が補正される。
【００４４】
好ましい作業法においては、適応ミラー１５および１７の鏡面の幾何構造は、ツェルニケ多項式を利用して変形する。その場合、鏡面の形態は、展開係数（ｚ_１，ｚ_２，…ｚ_ｉ，…ｚ_Ｎ）により明確に決定される。当該の配置では、適応ミラー１５のミラー形態（ｚ_１，ｚ_２，…ｚ_ｉ＋Δｚ_ｉ，…ｚ_Ｎ）および適応ミラー１７のミラー形態（ｚ_１，ｚ_２，…ｚ_ｉ，…ｚ_Ｎ）を調整することで、ツェルニケ係数∂Ｉ／∂ｚ_ｉ＝ΔＩ／Δｚ_ｉの考慮のもと１回の測定で受信信号の強度勾配が得られる。
正規化された勾配は、ｇｒａｄ_ｉ＝（Ｉ_ｉ ^Ｄｅｌ１−Ｉ_ｉ ^Ｄｅｌ２）／Δｚ_Ｉ＊２／（Ｉ_ｉ ^Ｄｅｌ１＋Ｉ_ｉ ^Ｄｅｌ２）から得られるが、ここでＩ_ｉ ^Ｄｅｌ１およびＩ_ｉ ^Ｄｅｌ２は光電子変換器２７.１および２７.２によって測定された強度値である。
【００４５】
この測定はすべての関与係数について実行される。新しいミラー形態は、勾配（ｚ_１’，ｚ_２’，…ｚ_Ｎ’）＝（ｚ_１＋（Δｚ_１）^２ｇｒａｄ_１，ｚ_２＋（Δｚ_２）^２ｇｒａｄ_２，…ｚ_Ｎ＋（Δｚ_Ｎ）^２ｇｒａｄ_Ｎ）から得られる。すなわち新しい係数はそれぞれｚ_ｉ’＝ｚ_ｉ＋（Δｚ_ｉ）^２ｇｒａｄ_ｉで与えられる。この作業は、一定の補正基準が満たされるまで繰り返し行われる。ステップ量Δｚ_ｉは適当な方法で適合させることができる。
【００４６】
図４は前記逐次過程の実例として、波長４８８ｎｍでＮＡ＝１.２の水浸対物レンズを用いて行った生物学試料内部の深さ２００μｍにおける結像について示したものである。
試料と水浸層との間の屈折率の差は１.３８−１.３３＝０.０５であるが、収差を考慮してシュトレール率は、０.０６（収差がない場合の強度で除した測定強度）となる。第１次および第２次球面収差を算入して前記方法で約６０回逐次操作の末、最適補正値が得られ、シュトレール率０.９２となった。
さらに補正を続けるには、追加のツェルニケ項を算入しなければならない。この際各逐次操作ステップにおいて、利用した係数ごとに勾配を測定し、ミラーの幾何構造に対し既述したように影響を与える。
予め見積った補正により最適化を始めれば、逐次過程がかなり速まる。こうすると約６０回の逐次作業でも、ミラー調整の作業頻度を０.５Ｈｚとして最適補正値が０.３秒未満で得られる。
【００４７】
自明の通り、逐次過程の詳細は簡単に変更することができる。前記説明は、そのような１方法の実施態様例についてのものに過ぎない。原則的には、さまざまな種類の最適化方法が利用できる。
試料が複屈折して作用するか、またはその反射能が強く偏光に依存する場合、適応ミラー１５および１７について同一の調整を利用する必要がある。変換器２７.１および２７.２の受信値を加算すれば、試料の偏光依存効果は除去される。局所勾配を得るためには、（（ｚ_１，ｚ_２，…ｚ_ｉ，…ｚ_Ｎ）および（ｚ_１，ｚ_２，…ｚ_ｉ＋Δｚ_ｉ／４，…ｚ_Ｎ）と表したミラーポジションと共に）各係数ごとに２つの測定値が必要である。偏光に敏感な測定については受信信号の差も同時に利用できる。
【００４８】
特別な形の位相コントラストが、「微分干渉コントラスト」（ＤＩＣ）である。本発明に基づく配置によれば、このコントラスト法が簡単に実行できる。その場合、照明光は適応ミラー１５と１７間で等しい強度に分割される。両適応ミラーは、一方の偏光ビームを他方の偏光ビームに対して傾倒させるために利用される。両ビームの照明スポットの分離、およびそれの試料上での方向づけに対しては、適応ミラー１５および１７で直接影響を与えることができる。それらの光路は検出光路内において適応ミラー１５および１７を過ぎる際に自動的に補正される。すなわちそれらは検出器上で一致する。両ビームの偏光方向に４５°の軸の傾きを有する偏光器を検出器の前に設置すれば、２本のビームの干渉が変換器２７.１および２７.２において生じ、これが共焦点または非共焦点で検出できる。
【００４９】
蛍光顕微鏡法
この操作法では、照明光によって蛍光が試料内で励起され、これが像生成に使用される。
特に生物学試料内での蛍光励起に関しては、光の偏光は副次的なものである。典型的な例では、試料は、たとえば適応ミラー１５からの線偏光を用いて励起することができる。蛍光ビームは一般に非偏光であり、ビームスプリッタ１９において分割される。
すでに反射顕微鏡法を基に詳細説明したのと同一の方法が、ビーム強度の勾配およびそれによるミラーの幾何構造の最適化を、測定により求めるのに利用することができる。この場合、励起光が適応素子を通ることから勾配決定に必要である、さまざまなミラーポジションでの補正が検出側だけで行われる。
【００５０】
像生成はミラー１５および１７の最適化された同一位置で損失なく行われるが、その場合変換器２７.１および２７.２の信号が加算される。
さまざまな補正を照明光路内および検出光路内において行うためには、以下のように操作することができる。その場合でも試料は、たとえば適応ミラー１５から来る線偏光された光を用いて励起される。こうして適応ミラー１７のミラー幾何構造を最適化するために変換器２７.２により受信された信号は、適応ミラー１５のミラー形態を最適化するための変換器２７.１の受信信号に依存せずに利用できるが、その場合、１つの勾配を決定するのにそれぞれ１つの新しいミラーポジションによる測定が２回必要である。
像生成はそのように最適化されたミラーポジションにより行われる。その場合、励起光がミラー１５を、検出光がミラー１７を経由する。
【００５１】
図５は、ＮＡ＝１.２の水浸対物レンズを用いて深さ５０μｍにおいて生物学試料を結像する際の補正例を示している。励起波長はその場合４８８μｍで、蛍光波長は５５０μｍである。試料屈折率の水浸層屈折率からの偏差は、１.３８−１.３３＝０.０５で、光学系の色収差を伴わずシュトレール率０.１１となる。励起ビームに比較して蛍光ビームの約０.６μｍの焦点変更に相当する色収差（焦点合わせする顕微鏡対物レンズの一次的縦方向色収差）があるとき、シュトレール率はさらに約０.０６に低下する。
色収差がないとき、最適補正は、第１次および第２次の球面収差を考慮して、約１５回以内の逐次操作で達成される。色収差があれば、励起ビームおよび蛍光ビームに同一の最適化補正があっても、最適化されたシュトレール率はわずか０.２に過ぎない。本発明を用いて実施できる励起光路および蛍光光路における独立補正の場合、色収差があるにもかかわらずシュトレール率０.９９が達成される。
【００５２】
非線型励起の場合のレーザ顕微鏡法
非線形励起（多光子励起蛍光、高調発生）の場合、共焦点検出に等価な分解能が検出用ピンホールなしに達成される。ピンホールが利用されていなければ、像収差の補正が必要なのは照明ビーム内だけである。
この場合、図２に基づき説明したとおり、たとえば適応ミラー１７は非適応ミラーおよびλ／４板によって代替させることができる。その場合、検出器３８の受信信号は上述のように直接、適応ミラー３９構造の最適化に利用されるが、但しここでも、１つの勾配を決定するために２つの測定値（ミラーポジション）が必要である。
【００５３】
分解能をさらに高めるためにピンホールを利用する場合、検出光路内での補正が重要であり、それは蛍光の場合にはかなり前段で蛍光顕微鏡法について述べた上、図１に基づき詳細説明したようにして達成できる。このようにして、特に、照明光路内および検出光路内で独立に補正することが可能である。励起ビームの波長と蛍光ビームの波長との間には典型的な大きな差異があるので、ピンホールの利用を可能にするには独立した補正が必要である。
【００５４】
ここに記述した適応光学系の逐次制御における長所は、現実の波面形成が適応素子によって正確に認識される必要がないことである。それは信号の最適化が変形法によって逐次達成されるからである。最適化のためには、さまざまな適応状態（逐次作業）を経由することが必要なので、最適化の間に試料の移動、試料の腿色または損傷が現れ得ることに注意しなければならない。試料の腿色または損傷は、照明ビームの強度を落として軽減することができる。それは本発明に基づく方法では適応補正に対しても、像生成の場合と同じ検出感度が利用されているからである。
【００５５】
適応補正のための逐次過程における受信信号の改善促進は、照明強度の一層の軽減を可能にする。適応素子の初期位置を適切に選択すれば、過程経過における逐次操作の回数を減少させ、その結果、試料内へのエネルギー注入を少なくすることも可能になる。
最適化自体にとっては、前記の過程は副次的な役割をするものである。それは勾配がそれぞれ現実の試料の状態に対応して求められ、最適化過程の制御に利用されるからである。
【００５６】
小さくても構造化された試料部分が最適化の間に走査されるならば、試料と光学系間の相対的移動も補正できる。その場合、試料の移動を（たとえば相互相関によって）補正するために像情報を利用することができる。
移動補正は、適応ミラーにより測定量だけデフォーカシングして、および／または顕微鏡内配置の走査装置７もしくは３４により達成される。試料の迅速移動における補正可能性は、像把握全般に亘って適応光学系の適用を広げる可能性でもある。連続する複数像の電子的分析（たとえば高周波におけるコントラストの改善に関して）は、適応ミラーによる補正過程の評価に用いられる別なオプションである。
【図面の簡単な説明】
【図１】２つの適応ミラーを含む、本発明に基づく適応光学装置を有する共焦点レーザ走査型顕微鏡の光路
【図２】１つの適応ミラーおよび１つの非適応ミラーを含む、本発明に基づく適応光学装置を有する共焦点レーザ走査型顕微鏡の変形光路態様
【図３】１つの反射領域および１つの透過領域を持つビームスプリッタを有する本発明に基づく配置の、また別な実施例の模式図
【図４】本発明に基づく配置による生物学試料の結像における測定値の逐次的取得
【図５】本発明に基づく配置による生物学試料の結像における補正可能性の例
【図６】現状の技術の原理図
【符合の説明】
１ 照明光源
２ 照明光
３ 試料
４ 走査光学系
５ 鏡胴レンズ
６ 顕微鏡対物レンズ
７ 走査装置
８ ビームスプリッタ
９ 検出光路
１０ 検出装置
１１ ピンホール光学系
１２ ピンホール
１３ コリメーション光学系
１４ 波長フィルタ
１５ 適応ミラー
１６,１８ 直交アーム
１７ 適応ミラー
１９ ビームスプリッタ
２０,２２ λ／４板
２１ ズーム光学系
２３ ズーム光学系
２４ レンズ
２５ ひとみ平面
２６ ビームスプリッタ
２７.１,２７.２ 変換器
２８ 照明光源
２９ 照明光
３０ 走査光学系
３１ 鏡胴レンズ
３２ 顕微鏡対物レンズ
３３ 試料
３４ 走査装置
３５ ビームスプリッタ
３６ 検出光路
３７ ピンホール光学系
３８ 検出器
３９ 適応ミラー
４０ 非適応のミラー
４１,４２ アーム
４３ ビームスプリッタ
４４,４５ λ／４板
４６ ズーム光学系
４８ 照明光源
４９ 照明光
４９.１ ビーム成分
５０ スプリッタ面
５１ 透過領域
５２ 反射領域
５３ 凹面鏡
５４ レンズ
５５ 走査光学系
５６ 円筒レンズ
５７ 顕微鏡対物レンズ
５８ 試料
５９ 走査装置
６０ ビームスプリッタ
６１ 検出光路
６１.１ ビーム成分
６２ スプリッタ面
６３ 凹面鏡
６４,６５ 検出器
６６ 波長フィルタ
６７ リレー光学系

Claims (18)

1. 顕微鏡光路内に適応光学装置を有するほか、
   少なくとも１つが適応光学素子として形成されていて、双方ともその反射鏡面が顕微鏡光路の光軸に垂直に配置されている２つの反射素子と、
   スプリッタ層が、顕微鏡光路の２本の直交アームの、または１本の折りたたまれた顕微鏡光路の２本の直交する部分の交点に存在する、偏光性ビームスプリッタであって、適応素子の第１が一方のアームに、他がもう一方のアームに属しており、各アームにおいてビームスプリッタと反射性適応素子との間にλ／４板が存在するビームスプリッタと、
   検出光の方向に向けられた、評価装置および調整装置を通じて適応素子と結合している検出装置と、
   を含む顕微鏡。
2. 一方の直交アームにおいて照明光源からの光が、その偏光状態に依存して、
   スプリッタ層およびλ／４板を通って第１の適応素子に当たり、その後その反射鏡面からスプリッタ層へ戻り反射し、そこで顕微鏡対物レンズの方向へ転向すること、および／または
   スプリッタ層から第２の適応素子の方向に転向し、λ／４板を通過した後、第２の適応素子に当たり、そこからスプリッタ層へ戻り反射し、そこを通って顕微鏡対物レンズに到達すること、
   もう一方の直交アームにおいて、試料から顕微鏡対物レンズを通ってくる検出光が、その偏向状態に依存して、
   スプリッタ層およびλ／４板を通って第２の適応素子に当たり、次にその反射鏡面からスプリッタ層へ戻り反射し、そこで検出装置の方向へ転向すること、および／または、
   スプリッタ層から第１の適応素子の方向に転向し、λ／４板を通過した後、第１の適応素子に当たり、そこからスプリッタ層へ戻り反射し、これを通って検出装置に到達すること、および、
   検出装置が第２の偏光性ビームスプリッタ、ならびに評価装置および調整装置を通じて適応素子と結合している２つの光電子変換器を有し、検出光がその偏光状態に依存してビームスプリッタを通過するか、またはそのスプリッタ層から転向して、一方のまたはもう一方の光電子変換器に到達すること
   を特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
3. ビームスプリッタと検出装置との間に、検出光をピンホールにフォーカシングするためのピンホール光学系および意図された検出光を平行化するためのレンズが配備されていることを特徴とする先行請求項の１つに記載の顕微鏡。
4. 顕微鏡光路内に適応光学装置を有するほか、
   双方の反射鏡面が顕微鏡光路の光軸に垂直に配置されている適応反射素子および非適応反射素子と、
   スプリッタ層が、顕微鏡光路の２本の直交アームまたは何回か折りたたまれた顕微鏡光路の２本の直交部分の交点に存在する偏光性ビームスプリッタであって、適応素子が一方のアームに、非適応素子がもう一方のアームに属していて、各アームにおいてビームスプリッタと各反射素子との間にλ／４板が存在する偏光性ビームスプリッタと、
   検出光の方向に向けられた評価装置および調整装置を通じて適応素子と結合している検出装置と、
   を含む顕微鏡。
5. 一方の直交アームにおいて、照明光源から来る光がその偏光状態に依存して、
   スプリッタ層およびλ／４板を通って適応素子に当たり、その反射鏡面からスプリッタ層へ戻り反射し、そこから顕微鏡対物レンズの方向へ転向すること、および／または、
   スプリッタ層から反射素子の方向に転向し、λ／４板を通過した後、反射素子からスプリッタ層へ戻り反射し、そこを通って顕微鏡対物レンズに到達すること、
   もう一方の直交アームにおいて、試料から顕微鏡対物レンズを通ってくる光がその偏光状態に依存して、
   スプリッタ層およびλ／４板を通って反射素子に当たり、そこからスプリッタ層へ戻り反射し、そこから検出装置に到達すること、および／または、
   スプリッタ層から適応素子の方向に転向し、λ／４板を通過した後、適応素子からスプリッタ層へ戻り反射し、そこから同様に検出装置に到達すること
   を特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
6. 適応素子が、それぞれ顕微鏡光路のひとみ平面内に位置しており、ビームスプリッタと顕微鏡対物レンズ間の光路内に、適応素子の平面を顕微鏡配置のひとみ平面内へ結像するための光学系が存在していることを特徴とする先行請求項の１つに記載の顕微鏡。
7. ひとみ平面が、走査装置の反射面と同一であって、走査移動に基づき横方向に試料全体にわたり導かれる回折抑制スポットが試料内に作り出されるように、走査光学系、顕微鏡対物レンズならびに鏡胴レンズが位置設定されていることを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡。
8. 適応素子ミラーに区分調整可能な鏡面、薄膜ミラーまたは反射させる空間光変調器が配備されていることを特徴とする先行請求項の１つに記載の顕微鏡。
9. 適応素子の少なくとも１つに、この適応素子の口径を顕微鏡対物レンズの口径へ適合させるのに用いられるズーム光学系が属していることを特徴とする先行請求項の１つに記載の顕微鏡。
10. 適応光学装置を有するほか、
    照明光路のひとみ平面内に配置された適応凹面鏡であって、それに対応してスプリッタ面内に透過領域および反射領域を有する光学的ビームスプリッタが中間像平面内に組み込まれていて、照明光がまずスプリッタ面に、次にその反射領域から凹面鏡へ向けられ、凹面鏡から透過領域にフォーカシングされ、およびこれを通って試料に到達する適応凹面鏡、および／または、
    検出光路のひとみ平面内に配置された適応凹面鏡であって、それに対応してスプリッタ面内に透過領域および反射領域を有する光学的ビームスプリッタが中間像平面内に組み込まれていて、検出光がまずスプリッタ面に、次にその反射領域から凹面鏡へ向けられ、凹面鏡から透過領域にフォーカシングされ、およびこれを通って検出装置に到達する適応凹面鏡、ならびに、
    照明光路内の適応素子と、および／または検出光路内の適応素子と結びつけられている評価装置および調整装置であって、検出装置の出力信号が、照明光もしくは検出光の波面を適応制御するために利用される評価装置および調整装置、
    を含む顕微鏡。
11. 顕微鏡光路内に、試料からの検出光を顕微鏡光路から分岐するために、ビームスプリッタが配備されていることを特徴とする請求項１０に記載に顕微鏡。
12. 点走査する装置が、試料を走査するために配備されていて、スプリッタ面の透過領域が、円形または楕円系の孔として形成されていることを特徴とする請求項１０または１１に記載の顕微鏡。
13. 線走査する装置が、試料を走査するために配備されていて、スプリッタ面の透過領域が、スリット状の孔として形成されていることを特徴とする請求項１０または１１に記載の顕微鏡。
14. スプリッタ面が、衝突ビームに対して４５°傾斜していることを特徴とする請求項１２または１３に記載の顕微鏡。
15. 照明光源からの光および／または試料からの検出光のうち、透過領域を通過した光線成分を受光するために検出器が、スプリッタ面の後方に従属して設置されていることを特徴とする請求項１１から１４の１つに記載の顕微鏡。
16. 適応素子が、光軸方向での移動装置と結合しており、移動装置も同様に評価装置および調整装置と結合していて、その場合適応素子の移動によるだけでなく、凹面鏡面の焦点距離変更によっても照明光の光線幅に影響が現われることを特徴とする請求項１１から１５の１つに記載の顕微鏡。
17. 受信された隣接の光信号の強度に関する情報が、検出装置の出力側に存在し、これらの情報がそれぞれ対応の評価ユニット内にて、そこに記憶されている情報と比較され、その差から調整信号が生成され、それが適応素子の反射鏡面を追加調整するために利用されることを特徴とする先行請求項のうち１つに記載の顕微鏡。
18. 同時にまたはあらかじめ取得され、評価装置内に記憶されている検出情報が、適応素子の定義付けされた別な位置で取得されることを特徴とする請求項１７に記載の顕微鏡。

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