JP6260391B2 - 共焦点顕微鏡装置及び共焦点観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡装置及び共焦点観察方法に関する。

従来、共焦点顕微鏡は、蛍光標本に励起光を集光し、励起光の集光点から射出する蛍光をピンホール越しに検出することで高分解能を達成している。この共焦点顕微鏡の分解能は基本的に、励起光の集光点のＰＳＦ（ＰＳＦ：Point spread function）と、標本に投影されるピンホール像の強度分布との積の分布によって決まる。よって、共焦点顕微鏡の分解能は、顕微鏡の結像性能に依存する。

特許第５２４２１４８号公報

本発明は、顕微鏡の結像性能を超えた高い分解能で観察が可能な共焦点顕微鏡装置及び共焦点観察方法を提供する。

本発明を例示する共焦点顕微鏡装置の一態様は、観察対象面に照明光を集光する照明光学系と、前記観察対象面における前記照明光の集光点から射出した観察光を集光する観察光学系と、前記観察光学系に関して前記集光点と共役な位置に主ピンホールを配置すると共に、前記共役な位置から外れた位置に副ピンホールを配置したマスク部と、前記主ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す主強度信号と、前記副ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す副強度信号とを個別に生成する検出部と、前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記主ピンホールの像である主ピンホール像と、前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記副ピンホールの像である副ピンホール像と、前記観察対象面に前記照明光学系が形成する前記照明光の集光点とからなるプローブで前記観察対象面を走査する走査部と、前記観察対象面の観察対象点に前記主ピンホール像が位置しているときに生成された前記主強度信号から、前記観察対象点に前記副ピンホール像が位置しているときに生成された前記副強度信号に応じた値を減算することにより、前記主ピンホール像より小さい領域を射出元とした前記観察光の強度信号を生成する演算部とを備える。

本発明を例示する共焦点観察方法の一態様は、観察対象面に照明光を照明光学系で集光し、前記観察対象面における前記照明光の集光点から射出した観察光を観察光学系で集光し、前記観察光学系に関して前記集光点と共役な位置に主ピンホールを配置すると共に、前記共役な位置から外れた位置に副ピンホールを配置し、前記主ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す主強度信号と、前記副ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す副強度信号とを個別に生成し、前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記主ピンホールの像である主ピンホール像と、前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記副ピンホールの像である副ピンホール像と、前記観察対象面に前記照明光学系が形成する前記照明光の集光点とからなるプローブで前記観察対象面を走査し、前記観察対象面の観察対象点に前記主ピンホール像が位置しているときに生成された前記主強度信号から、前記観察対象点に前記副ピンホール像が位置しているときに生成された前記副強度信号に応じた値を減算することにより、前記主ピンホール像より小さい領域を射出元とした前記観察光の強度信号を生成する。

本発明によれば、顕微鏡の結像性能を超えた高い分解能で観察が可能な共焦点顕微鏡装置及び共焦点観察方法が実現する。

共焦点顕微鏡装置の構成図である。 ピンホールマスク２１をｚ方向から見た図である。 ピンホール像の位置関係を示す図である。 励起光スポットとピンホール像との位置関係を示す図である。 複数のサンプリング座標の配列を説明する図である。 演算装置４０による演算処理を説明する図である。 本実施形態の超解像効果を説明する図である。 飽和因子Ｓと放射ＰＳＦとの関係を示す図である。 実効ＰＳＦと減算係数αとの関係の一例である。

［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態として共焦点顕微鏡装置を説明する。

図１は、本実施形態の共焦点顕微鏡装置の構成図である。図１に示すとおり共焦点顕微鏡装置には、レーザ光源１１、光ファイバ７、コリメートレンズ１２、フィルタ１３、ダイクロイックミラー１４、ガルバノスキャナ１５、リレーレンズ１６、対物レンズ１７、試料１８、フィルタ１９、集光レンズ２０、ピンホールマスク２１、光ファイバ２２−０〜２２−６、光検出器２３−０〜２３−６、制御装置３９、演算装置４０などが配置される。演算装置４０には、フレームメモリＭ_１〜Ｍ_６が搭載される。

なお、図１では、光ファイバ２２−０〜２２−６を代表して３つの光ファイバ２２−０、２２−１、２２−２のみを図示し、光検出器２３−０〜２３−６を代表して３つの光検出器２３−０、２３−１、２３−２のみを図示し、フレームメモリＭ_０〜Ｍ_６を代表して３つのフレームメモリＭ_０、Ｍ_１、Ｍ_２のみを図示した。

試料１８は、生体細胞などの観察対象物を含み、その観察対象物は所定の蛍光物質により予め染色されている。試料１８の光軸方向（ｚ方向）の位置は、試料１８の観察対象面Ｐが対物レンズ１７の焦点面に位置するよう不図示の上下動機構によって予め調整されている。ここでは、試料１８のｚ方向の厚さが十分に薄いと仮定する。

レーザ光源１１は、蛍光物質の励起波長と同じ波長のレーザ光（励起光）を出射する。レーザ光源１１から射出した励起光は、光ファイバ７の内部を伝搬してからコリメートレンズ１２により平行光束化された後、フィルタ１３へ入射する。なお、フィルタ１３には、励起光と同じ波長の光を透過し、かつ、蛍光物質から発せられる蛍光（後述）と同じ波長の光をカットする波長選択性が付与されている。

フィルタ１３へ入射した励起光は、フィルタ１３を透過してダイクロイックミラー１４へ入射する。なお、ダイクロイックミラー１４には、励起光と同じ波長の光を反射し、かつ蛍光と同じ波長の光を透過する反射／透過波長選択性が付与されている。

ダイクロイックミラー１４へ入射した励起光は、ダイクロイックミラー１４を反射した後、ガルバノスキャナ１５の２つのミラーで順に反射すると、リレーレンズ１６を介して対物レンズ１７の瞳側へ入射する。なお、リレーレンズ１６には、対物レンズ１７の瞳面とガルバノスキャナ１５の配置面とを共役に結ぶ働きがある。

対物レンズ１７の瞳側へ入射した励起光は、対物レンズ１７の先端側から射出するときに集光光となり、試料１８の観察対象面Ｐの１点に向かって集光し、光スポット（励起光スポット）を形成する。観察対象面Ｐにおける励起光スポットでは蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

励起光スポットで発生した蛍光は、励起光スポットを形成した励起光と同じ光路を逆に辿り、対物レンズ１７、リレーレンズ１６、ガルバノスキャナ１５の２つのミラーを経て、ダイクロイックミラー１４へ向かう。ダイクロイックミラー１４へ入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１４を透過し、フィルタ１９へ入射する。なお、フィルタ１９には、励起光と同じ波長の光をカットし、かつ蛍光と同じ波長の光を透過する波長選択性が付与されている。

フィルタ１９へ入射した蛍光は、フィルタ１９を透過して集光レンズ２０へ入射すると、集光レンズ２０の集光作用を受け、ピンホールマスク２１の配置面に向かって集光する。なお、ピンホールマスク２１の配置面は、対物レンズ１７、リレーレンズ１６、集光レンズ２０からなる観察光学系に関して試料１８の観察対象面Ｐと共役である。

ここで、図２に示すとおり、ピンホールマスク２１には、開口部として円形のピンホール２１−０〜２１−６が形成されており、開口部以外の領域はマスク部となっている。なお、図１では、ピンホール２１−０〜２１−６を代表するピンホール２１−０、２１−１、２１−２のみを図示した。

図２において、ピンホール２１−０の中心位置は、励起光スポットの中心と共役な位置であり、ピンホール２１−１〜２１−６の各々の中心位置は、励起光スポットの中心と共役な位置から外れている。よって、以下ではピンホール２１−０を「主ピンホール２１−０」と称し、ピンホール２１−１〜２１−６を「副ピンホール２１−１〜２１−６」と称す。

また、本実施形態では、副ピンホール２１−１〜２１−６の各々の径は、主ピンホール２１−０の径と同じサイズに設定される。

また、本実施形態では、図３に示すとおり主ピンホール像１８−０の中心から副ピンホール像１８−１〜１８−６の各々の中心までの距離は、エアリーディスク半径ａに一致している。エアリーディスク半径ａは、共焦点顕微鏡の光学系に固有の値である。

なお、図３では、主ピンホール像１８−０のサイズと、副ピンホール像１８−１〜１８−６のサイズと、励起光スポット１００のサイズとを、エアリーディスク半径ａと比較して小さめに描いた。

ここで、「主ピンホール像１８−０」とは、主ピンホール２１−０に発光体を仮想的に配置したときに観察光学系が観察対象面Ｐに形成する仮想的な光強度分布のことであり、「副ピンホール像１８−１〜１８−６」とは、副ピンホール２１−１〜２１−６に発光体を仮想的に配置したときに観察光学系が観察対象面Ｐに形成する仮想的な光強度分布のことである。

また、図２に示すとおり副ピンホール２１−１〜２１−６は、主ピンホール２１−０の周りに等間隔で配置される。よって、図３に示すとおり副ピンホール像１８−１〜１８−６は、主ピンホール像１８−０の周りに等間隔で配置される。

以下、副ピンホール像１８−２、１８−５の配列方向をｙ方向（＝後述する副走査方向）とし、ｙ方向に垂直な方向をｘ方向（＝後述する主走査方向）とする。

この場合に、ピンホール像のｘ方向の最小配列ピッチをΔｘとおき、ピンホール像のｙ方向の最小配列ピッチをΔｙとおくと、Δｘ＝ａ（√３）／２、Δｙ＝ａ／２が成り立つ。また、主ピンホール像１８−０の中心座標を（ｘ，ｙ）とおくと、副ピンホール像１８−１〜１８−６の各々の中心座標は以下のとおり表される。
・副ピンホール１８−１の中心座標：（ｘ−Δｘ，ｙ＋Δｙ）、
・副ピンホール１８−２の中心座標：（ｘ，ｙ＋２Δｙ）、
・副ピンホール１８−３の中心座標：（ｘ＋Δｘ，ｙ＋Δｙ）、
・副ピンホール１８−４の中心座標：（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）、
・副ピンホール１８−５の中心座標：（ｘ，ｙ−２Δｙ）、
・副ピンホール１８−６の中心座標：（ｘ−Δｘ，ｙ−Δｙ）
図４は、主ピンホール像１８−０の分布域と、副ピンホール像１８−１〜１８−６の各々の分布域と、励起光スポット１００の分布域との関係を示す図である。ここでは、主ピンホール像１８−０の半径、副ピンホール像１８−１〜１８−６の各々の半径、励起光スポット１００の半径は、何れもエアリーディスク半径ａにほぼ一致していると仮定した。

図４に示すとおり主ピンホール像１８−０の分布域と励起光スポット１００の分布域とはほぼ一致しており、副ピンホール像１８−１〜１８−６の各々の分布域は、主ピンホール像１８−０及び励起光スポット１００の分布域に対して部分的に重複している。これら主ピンホール像１８−０、副ピンホール像１８−１〜１８−６、励起光スポット１００の全体が、本実施形態のプローブ３００として使用される。

図１に戻り、ピンホールマスク２１の主ピンホール２１−０及び副ピンホール２１−１〜２１−６を個別に通過した蛍光は、光ファイバ２２−０〜２２−６の入射端へ個別に入射する。光ファイバ２２−０〜２２−６へ個別に入射した蛍光は、光ファイバ２２−０〜２２−６の射出端から個別に射出し、光検出器２３−０〜２３−６へ個別に入射する。

光検出器２３−０〜２３−６へ個別に入射した蛍光は、光検出器２３−０〜２３−６において個別に蛍光信号Ｉ_０〜Ｉ_６へと変換される。光検出器２３−０〜２３−６の生成した蛍光信号Ｉ_０〜Ｉ_６は、制御装置３９を介して演算装置４０に取り込まれる。

演算装置４０のフレームメモリＭ_０は制御装置３９から送出される蛍光信号Ｉ_０を蓄積する。また、演算装置４０のフレームメモリＭ_１は制御装置３９から送出される蛍光信号Ｉ_１を蓄積する。また、演算装置４０のフレームメモリＭ_２は制御装置３９から送出される蛍光信号Ｉ_２を蓄積する。また、演算装置４０のフレームメモリＭ_３は制御装置３９から送出される蛍光信号Ｉ_３を蓄積する。また、演算装置４０のフレームメモリＭ_４は制御装置３９から送出される蛍光信号Ｉ_４を蓄積する。また、演算装置４０のフレームメモリＭ_５は制御装置３９から送出される蛍光信号Ｉ_５を蓄積する。また、演算装置４０のフレームメモリＭ_６は制御装置３９から送出される蛍光信号Ｉ_６を蓄積する。

なお、以上の説明では、７つのピンホール２１−０〜２１−６を個別に通過した７つの蛍光を７つの光検出器２３−０〜２３−６へ個別に導光するために、７つの光ファイバ２２−０〜２２−６を使用したが、７つのピンホール２１−０〜２１−６の間隔が十分に広い場合は、光ファイバ２２−０〜２２−６を省略し、ピンホール２１−０〜２１−６の背後へ直接的に７つの光検出器２３−０〜２３−６を配置してもよい。

また、以上の説明では、７つのピンホール２１−０〜２１−６の形成されたピンホールマスク２１を使用したが、このピンホールマスク２１を省略し、７つの光ファイバ２２−０〜２２−６の各々の入射端を７つのピンホール２１−０〜２１−６の代わりに使用してもよい。但し、その場合、光ファイバ２２−０〜２２−６の入射端の径は、７つのピンホール２１−０〜２１−６の各々の径と同じサイズに設定される。

また、以上の説明では、７つのピンホール２１−０〜２１−６を個別に通過した７つの蛍光を個別に検出するために７つの光検出器２３−０〜２３−６を使用したが、７つのピンホール２１−０〜２１−６を個別に通過した７つの蛍光を個別に検出するために、単一の撮像素子の互いに異なる７つの画素領域を使用してもよい。また、７つの光検出器２３−０〜２３−６の代わりに単一の撮像素子を使用し、かつ、ピンホールマスク２１を省略して７つの光ファイバ２２−０〜２２−６の各々の入射端をピンホール２１−０〜２１−６の代わりに使用することも、もちろん可能である。

さて、図１に示したガルバノスキャナ１５の２つのミラーのうち不図示の主走査ミラーが駆動されると、観察対象面Ｐにおけるプローブ３００の形成先が主走査方向（＝ｘ方向）にかけて移動（走査）する。また、ガルバノスキャナ１５の２つのミラーのうち不図示の副走査ミラーが駆動されると、観察対象面Ｐにおけるプローブ３００の形成先が副走査方向（＝ｙ方向）にかけて移動（走査）する。

そこで、制御装置３９は、プローブ３００の形成先が観察対象面Ｐの各座標にあるときに、レーザ光源１１を点灯し、かつ光検出器２３−０〜２３−６を駆動することにより、各座標から蛍光信号Ｉ_０〜Ｉ_６をサンプリングする。以下、蛍光信号Ｉ_０〜Ｉ_６のサンプリングタイミングにおけるプローブ３００の中心座標（すなわち励起光スポット１００及び主ピンホール像１８−０の中心座標）を「サンプリング座標」と称す。

したがって、演算装置４０のフレームメモリＭ_０には、複数のサンプリング座標の各々に対応する蛍光信号Ｉ_０が蓄積される。以下、フレームメモリＭ_０に蓄積された蛍光信号Ｉ_０を座標順に並べてなる画像を、必要に応じて「蛍光画像Ｉ_０」と称す。

また、演算装置４０のフレームメモリＭ_１には、複数のサンプリング座標の各々に対応する蛍光信号Ｉ_１が蓄積される。以下、フレームメモリＭ_１に蓄積された蛍光信号Ｉ_１を座標順に並べてなる画像を、必要に応じて「蛍光画像Ｉ_１」と称す。

また、演算装置４０のフレームメモリＭ_２には、複数のサンプリング座標の各々に対応する蛍光信号Ｉ_２が蓄積される。以下、フレームメモリＭ_２に蓄積された蛍光信号Ｉ_２を座標順に並べてなる画像を、必要に応じて「蛍光画像Ｉ_２」と称す。

また、演算装置４０のフレームメモリＭ_３には、複数のサンプリング座標の各々に対応する蛍光信号Ｉ_３が蓄積される。以下、フレームメモリＭ_３に蓄積された蛍光信号Ｉ_３を座標順に並べてなる画像を、必要に応じて「蛍光画像Ｉ_３」と称す。

また、演算装置４０のフレームメモリＭ_４には、複数のサンプリング座標の各々に対応する蛍光信号Ｉ_４が蓄積される。以下、フレームメモリＭ_４に蓄積された蛍光信号Ｉ_４を座標順に並べてなる画像を、必要に応じて「蛍光画像Ｉ_４」と称す。

また、演算装置４０のフレームメモリＭ_５には、複数のサンプリング座標の各々に対応する蛍光信号Ｉ_５が蓄積される。以下、フレームメモリＭ_５に蓄積された蛍光信号Ｉ_５を座標順に並べてなる画像を、必要に応じて「蛍光画像Ｉ_５」と称す。

また、演算装置４０のフレームメモリＭ_６には、複数のサンプリング座標の各々に対応する蛍光信号Ｉ_６が蓄積される。以下、フレームメモリＭ_６に蓄積された蛍光信号Ｉ_６を座標順に並べてなる画像を、必要に応じて「蛍光画像Ｉ_６」と称す。

図５は、観察対象面Ｐにおけるサンプリング座標の配列を説明する図である。図５の横軸が主走査方向（＝ｘ方向）であり、図５の縦軸が副走査方向（＝ｙ方向）である。 図５に示すとおりサンプリング座標のｘ方向の配列ピッチ（すなわちｘ方向の走査ピッチ）は、ｘ方向におけるプローブ３００の幅（＝２Δｘ）よりも細かく設定され、サンプリング座標のｙ方向の配列ピッチ（すなわちｙ方向の走査ピッチ）は、ｙ方向におけるプローブ３００の幅（＝４Δｙ）よりも細かく設定される。

具体的に、ｘ方向の走査ピッチは、プローブ３００におけるｘ方向のピンホール像の最小配列ピッチΔｘと同じに設定され、ｙ方向の走査ピッチは、プローブ３００におけるｙ方向のピンホール像の最小配列ピッチΔｙと同じに設定される。

ｘ方向及びｙ方向の走査ピッチをこのように設定すれば、サンプリング座標の各々に全てのピンホール像１８−０〜１８−６を互いに異なるタイミングで位置させることができる。この場合、超解像に必要な蛍光信号Ｉ_０〜Ｉ_６をサンプリング座標の各々からサンプリングすることができる。

次に、本実施形態の励起光パワーについて説明する。

本実施形態の制御装置３９は、レーザ光源１１のパワー、つまり励起光のパワーを、励起光スポット１００における蛍光発生量が飽和するよう十分に高く設定することにより、励起光スポット１００による放射ＰＳＦのピークを平坦化する。

ここで、プローブ３００の中心（＝励起光スポット１００の中心）を原点としたプローブ内座標（ｕ，ｖ）を導入する。なお、ここではプローブ内座標（ｕ，ｖ）を、観察対象面Ｐにおけるプローブ３００の中心座標（＝サンプリング座標（ｘ，ｙ））と使い分けている。

このプローブ内座標（ｕ，ｖ）を用いて放射ＰＳＦをＰＳＦ_ｅｍ（ｕ，ｖ）とおくと、ＰＳＦ_ｅｍ（ｕ，ｖ）は以下の式（１）で表される。

ＰＳＦ_ｅｍ（ｕ，ｖ）＝（Ｓ^−１・ＰＳＦ_ｉｌｌ（ｕ，ｖ））／（Ｓ^−１＋ＰＳＦ_ｉｌｌ（ｕ，ｖ）） …（１）
なお、ここでは励起光スポット１００の強度分布（励起ＰＳＦ）をＰＳＦ_ｉｌｌ（ｕ，ｖ）と表した。また、式（１）におけるＳは励起光の強度と蛍光物質の特性とによって決まる因子であって、この因子Ｓが大きいときほど蛍光発生量の飽和度が高まり、放射ＰＳＦの平坦度も高まる。よって、以下ではこの因子Ｓを「飽和因子」と称す。

本実施形態では、励起光の強度を適度に高めることにより、飽和因子Ｓを適度に大きくし、放射ＰＳＦのピークを適度に平坦化する。これによって超解像観察が確実となる。

本装置では、ピンホール２１−ｉでサンプリングされる蛍光信号Ｉ_ｉの点応答関数をＰＳＦ_ｄｅｔ ^ｉ（ｕ，ｖ）とおくと、ＰＳＦ_ｄｅｔ ^ｉ（ｕ，ｖ）は放射ＰＳＦ（ＰＳＦ_ｅｍ（ｕ，ｖ））にピンホール像１８−ｉによるマスクＩ_ｐ ^ｉ（ｕ，ｖ）がかかったものとなり、一般的に次式（２）で表される。

ＰＳＦ_ｄｅｔ ^ｉ（ｕ，ｖ）＝ＰＳＦ_ｅｍ（ｕ，ｖ）×Ｉ_ｐ ^ｉ（ｕ，ｖ） …（２）
次に、本実施形態の超解像原理を説明する。

図６（Ａ）、（Ｂ）は、プローブ３００の中心座標（サンプリング座標）と、そのプローブ３００でサンプリングされる蛍光信号Ｉ_ｉとの関係を説明する図である。

図６（Ａ）、（Ｂ）においてプローブ３００を構成する３つのカーブは、主ピンホール像１８−０の強度分布、副ピンホール像１８−１の強度分布、励起光スポット１００による放射ＰＳＦを模式的に表したものである。なお、図６（Ａ）、（Ｂ）では、他の副ピンホール像１８−２〜１８−６の強度分布の図示を省略した。

先ず、図６（Ａ）に示すとおり、観察対象面Ｐにおけるプローブ３００の中心座標（＝サンプリング座標）が（ｘ，ｙ）であるとき、主ピンホール２１−０でサンプリングされる蛍光信号Ｉ_０（ｘ，ｙ）は、主ピンホール像１８−０の強度分布と励起光スポット１００による放射ＰＳＦとの積に相当する領域（斜線部）に感度を有する。

一方、図６（Ｂ）に示すとおり観察対象面Ｐにおけるプローブ３００の中心座標（＝サンプリング座標）が（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）であるとき、副ピンホール２１−１でサンプリングされる蛍光信号Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）は、副ピンホール像１８−１の強度分布と励起光スポット１００による放射ＰＳＦとの積に相当する領域（斜線部）に感度を有する。

ここで、上述した蛍光信号Ｉ_０（ｘ，ｙ）から上述した蛍光信号Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）に応じた値を差し引いてできる以下の差分蛍光信号ΔＩ_１（ｘ，ｙ）を考える。

ΔＩ_１（ｘ，ｙ）＝Ｉ_０（ｘ，ｙ）−α・Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ） …（３）
なお、αは減算係数であって０＜α≦１である。

この差分蛍光信号ΔＩ_１（ｘ，ｙ）は、図６（Ａ）斜線部から図６（Ｂ）斜線部に応じた値を差し引いた領域、すなわち、図６（Ｃ）に示すとおり、サンプリング座標（ｘ，ｙ）の近傍における小さな領域（斜線部）にのみ感度を有する。この差分蛍光信号ΔＩ_１（ｘ，ｙ）の点応答関数は、プローブ内座標（ｕ，ｖ）を用いて以下の式（４）で表される。

ＰＳＦ_ｅｆｆ ^１（ｕ，ｖ）＝ＰＳＦ_ｄｅｔ ^０（ｕ，ｖ）−α・ＰＳＦ_ｄｅｔ ^１（ｕ，ｖ） …（４）
なお、ここでは差分蛍光信号ΔＩ_ｉ（ｘ，ｙ）の点応答関数をＰＳＦ_ｅｆｆ ^ｉ（ｕ，ｖ）と表している。

また、以上の副ピンホール像１８−１及び蛍光信号Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）に関する説明は、副ピンホール像１８−２及び蛍光信号Ｉ_２（ｘ，ｙ−２Δｙ）にも同様に当てはまる。また、副ピンホール像１８−１及び蛍光信号Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）に関する説明は、副ピンホール像１８−３及び蛍光信号Ｉ_３（ｘ−Δｘ，ｙ−Δｙ）にも同様に当てはまる。また、副ピンホール像１８−１及び蛍光信号Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）に関する説明は、副ピンホール像１８−４及び蛍光信号Ｉ_４（ｘ−Δｘ，ｙ＋Δｙ）にも同様に当てはまる。また、副ピンホール像１８−１及び蛍光信号Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）に関する説明は、副ピンホール像１８−５及び蛍光信号Ｉ_５（ｘ，ｙ＋２Δｙ）にも同様に当てはまる。また、副ピンホール像１８−１及び蛍光信号Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）に関する説明は、副ピンホール像１８−６及び蛍光信号Ｉ_６（ｘ＋Δｘ，ｙ＋Δｙ）にも同様に当てはまる（図６（Ｄ）を参照。）。

さらに、以上のサンプリング座標（ｘ，ｙ）についての説明は、他のサンプリング座標についても同様に当てはまる。

そこで、本実施形態の演算装置４０は、フレームメモリＭ_０の蛍光画像Ｉ_０（ｘ，ｙ）、フレームメモリＭ_１の蛍光画像Ｉ_１（ｘ，ｙ）、フレームメモリＭ_２の蛍光画像Ｉ_２（ｘ，ｙ）、フレームメモリＭ_３の蛍光画像Ｉ_３（ｘ，ｙ）、フレームメモリＭ_４の蛍光画像Ｉ_４（ｘ，ｙ）、フレームメモリＭ_５の蛍光画像Ｉ_５（ｘ，ｙ）、フレームメモリＭ_６の蛍光画像Ｉ_６（ｘ，ｙ）を以下の式（５）に当てはめることにより、差分蛍光画像ΔＩ（ｘ，ｙ）を生成し、その差分蛍光画像ΔＩ（ｘ，ｙ）を試料１８の超解像画像として不図示の画像表示装置へ表示する。

ΔＩ（ｘ，ｙ）＝Ｉ_０（ｘ，ｙ）−α・｛Ｉ_１（ｘ＋Δｘ，ｙ−Δｙ）＋Ｉ_２（ｘ，ｙ−２Δｙ）＋Ｉ_３（ｘ−Δｘ，ｙ−Δｙ）＋Ｉ_４（ｘ−Δｘ，ｙ＋Δｙ）＋Ｉ_５（ｘ，ｙ＋２Δｙ）＋Ｉ_６（ｘ＋Δｘ，ｙ＋Δｙ）｝ …（５）
この差分蛍光画像ΔＩ（ｘ，ｙ）は、図６（Ｄ）に示すとおり、サンプリング座標（ｘ，ｙ）の近傍における極めて小さい領域（斜線部）にのみ感度を有する。この差分蛍光画像ΔＩ（ｘ，ｙ）の点応答関数は、プローブ内座標（ｕ，ｖ）を用いて以下の式（６）で表される。

ＰＳＦ_ｅｆｆ（ｕ，ｖ）＝ＰＳＦ_ｄｅｔ ^０（ｕ，ｖ）−α・｛ＰＳＦ_ｄｅｔ ^１（ｕ，ｖ）＋ＰＳＦ_ｄｅｔ ^２（ｕ，ｖ）＋ＰＳＦ_ｄｅｔ ^３（ｕ，ｖ）＋ＰＳＦ_ｄｅｔ ^４（ｕ，ｖ）＋ＰＳＦ_ｄｅｔ ^５（ｕ，ｖ）＋ＰＳＦ_ｄｅｔ ^６（ｕ，ｖ）｝ …（６）
なお、ここでは差分蛍光画像ΔＩ（ｘ，ｙ）の点応答関数をＰＳＦ_ｅｆｆ（ｕ，ｖ）と表している。

この点応答関数ＰＳＦ_ｅｆｆ（ｕ，ｖ）は、本実施形態の実効ＰＳＦに相当する。この実効ＰＳＦと観察対象面Ｐにおける蛍光物質の密度分布とのコンボリューションが、本実施形態の超解像画像である。よって、本実施形態では、この実効ＰＳＦの分布域が狭いほど超解像効果が高まる。

次に、本実施形態の実効ＰＳＦを説明する。

図７において「方向Ａ」は、主ピンホール像と副ピンホール像との配列方向（図４の符号Ａを参照）における実効ＰＳＦであり、「方向Ｂ」は、主ピンホール像と副ピンホール像との非配列方向（図４の符号Ｂを参照）における実効ＰＳＦであり、「通常」は、従来（副ピンホールを有しない場合）の実効ＰＳＦである。なお、図７のデータはピンホール径を無限小と仮定した場合のシミュレーション結果である。

図７によると、本実施形態の方向Ａにおける実効ＰＳＦの分布域が最も狭く、本実施形態の方向Ｂにおける実効ＰＳＦの分布域は次に狭く、何れの場合も従来の実効ＰＳＦの分布域よりも狭いことがわかる。つまり、本実施形態によれば、方向Ａ、Ｂの何れに亘っても超解像効果が得られていることがわかる。

次に、飽和因子Ｓについて説明する。

図８は、飽和因子Ｓと放射ＰＳＦとの関係を示す図である。

図８に示すとおり、飽和因子Ｓが大きいときほど放射ＰＳＦのピークが平坦化される。この平坦化の程度が大きいほど本実施形態の超解像効果は高まる。

但し、飽和因子Ｓを大きくするためには励起光の強度を高める必要があるため、その分だけ試料１８の退色は激しくなる。よって、本実施形態の制御装置３９は、飽和因子Ｓの値をユーザに指定させ、その値に応じてレーザ光源１１のパワーを設定する。

したがって、本実施形態のユーザは、解像度と試料ダメージとのバランスを任意に設定することができる。

次に、減算係数αについて説明する。

図９は、減算係数αと実効ＰＳＦとの関係を示す図である。図９に示すとおり減算係数αの値によっては、実効ＰＳＦの周辺部に負のリップルが発生する虞がある。仮に、実効ＰＳＦに負のリップルが発生すると、最終画像である超解像画像にアーティファクトの発生する虞がある。このため本実施形態では、実効ＰＳＦにおける負のリップルが抑えられ、かつ、実効ＰＳＦの分布域がなるべく狭くなるような値が、減算係数αの最適値である。図９の例では、減算係数αの最適値は０．２５である。

また、前述したとおり放射ＰＳＦのカーブは、飽和因子Ｓの値に依存するので、減算係数αの最適値も、飽和因子Ｓの値に依存する。このため、本実施形態の演算装置４０は、ユーザが指定した飽和因子Ｓの値に応じて減算係数αを設定する必要がある。但し、飽和因子Ｓの値が決まれば最適な減算係数αの値も一義的に決まる。

そこで、本実施形態の演算装置４０は、様々な飽和因子Ｓの値と、それら値の各々に最適な減算係数αの値との対応関係を、テーブルなどの形式で予め記憶しておけばよい。この対応関係に基づけば、ユーザによる飽和因子Ｓの変更に依らず演算装置４０が減算係数αを最適な値に維持できる。
［実施形態の補足］
なお、本実施形態では、ピンホールマスク２１に形成される副ピンホールの個数を「６」としたが、６以外の数としてもよい。何れの場合も、副ピンホールが２以上である場合は、２以上の副ピンホールが主ピンホールの周りに均等に配置されることが望ましい。均等に配置すれば、観察対象面Ｐにおける実効ＰＳＦの分布を、等方的な分布に近づけることができる。

また、本実施形態では、透過型のピンホールマスク２１を使用したが、透過型のピンホールマスク２１の代わりに反射型のピンホールマスクを使用してもよい。反射型のピンホールマスクは、透過型ピンホール（微少孔）の代わりに反射型ピンホール（微少ミラー）が形成されたマスクである。

また、本実施形態では、「１種類の励起光で１種類の蛍光物質を励起する場合」を想定したが、「１種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を同時励起する場合」や、「波長の異なる複数種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を同時励起する場合」や、「波長の異なる複数種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を順次励起する場合」などにも本発明は適用が可能である。

なお、可視化すべき蛍光物質が複数種類である場合、すなわち「１種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を同時励起する場合」、「波長の異なる複数種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を同時励起する場合」、「波長の異なる複数種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を順次励起する場合」には、試料１８で発生した波長の異なる複数の蛍光を個別に検出し、上述した蛍光画像Ｉ_０、…、Ｉ_６を波長ごとに取得し、上述した差分蛍光画像ΔＩを波長ごとに算出すればよい。

また、使用される励起光が１種類である場合、すなわち「１種類の励起光で１種類の蛍光物質を励起する場合」又は「１種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を同時励起する場合」には、図１のフィルタ１３は非必須である。

一方、複数種類の励起光で順次励起を行う場合、すなわち「波長の異なる複数種類の励起光で蛍光波長の異なる複数種類の蛍光物質を順次励起する場合」には、図１のフィルタ１３は必須となる。

また、本実施形態では、観察対象面Ｐをプローブ３００で走査する方式として光スキャン方式を採用したが、光スキャン方式の代わりにステージスキャン方式を採用してもよい。

また、本実施形態では、反射型の共焦点顕微鏡装置を説明したが、透過型の共焦点顕微鏡にも本発明は適用可能である。因みに、透過型の場合は、試料１８を挟み２つの対物レンズが対向して配置される。

また、本実施形態では、観察対象となる光を、励起光に応じて試料１８で発生した蛍光（自然放出光）としたが、試料１８で発生した他の光としてもよい。観察対象となる光は、例えば、照明光に応じて試料１８で発生した散乱光や、励起光に応じて試料１８で発生した誘導放出光などであってもよい。

また、本実施形態では、主ピンホールのサイズと副ピンホールのサイズとを同じにしたが、主ピンホールのサイズと副ピンホールのサイズとを異ならせたり、敢えて収差を与えたりすることで、例えば主ピンホール像のサイズを副ピンホール像のサイズより大きくしてもよい。このように、主ピンホール像と副ピンホール像とのサイズ関係を適切に調整すれば、実効ＰＳＦカーブに発生する負のリップルを抑えることも可能である。

また、本実施形態では、主ピンホール像の中心から副ピンホールの中心までの距離をエアリーディスク半径ａに一致させたが、励起光スポットを点光源像とみなせない場合などには、主ピンホール像の中心から副ピンホールの中心までの距離をエアリーディスク半径ａから敢えて外した方がよいこともある。
［実施形態の作用効果］
本実施形態の共焦点顕微鏡装置は、観察対象面（Ｐ）に照明光（励起光など）を集光する照明光学系（コリメートレンズ１２、リレーレンズ１６、対物レンズ１７）と、前記観察対象面における前記照明光の集光点から射出した観察光（蛍光、散乱光、誘導放出光など）を集光する観察光学系（対物レンズ１７、リレーレンズ１６、集光レンズ２０）と、前記観察光学系（対物レンズ１７、リレーレンズ１６、集光レンズ２０）に関して前記集光点と共役な位置に主ピンホールを配置すると共に、前記共役な位置から外れた位置に副ピンホールを配置したマスク部（ピンホールマスク２１）と、前記主ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す主強度信号（蛍光信号Ｉ_０）と、前記副ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す副強度信号（蛍光信号Ｉ_１〜Ｉ_６）とを個別に生成する検出部（光検出器２３−０〜２３−６）と、前記観察対象面（Ｐ）に前記観察光学系（対物レンズ１７、リレーレンズ１６、集光レンズ２０）が形成する前記主ピンホールの像である主ピンホール像（１８−０）と、前記観察対象面（Ｐ）に前記観察光学系が形成する前記副ピンホールの像である副ピンホール像（１８−１〜１８−６）と、前記観察対象面（Ｐ）に前記照明光学系（コリメートレンズ１２、リレーレンズ１６、対物レンズ１７）が形成する前記照明光の集光点とからなるプローブ（３００）で前記観察対象面（Ｐ）を走査する走査部（ガルバノスキャナ１５）と、前記観察対象面（Ｐ）の観察対象点に前記主ピンホール像（１８−０）が位置しているときに生成された前記主強度信号（蛍光信号Ｉ_０）から、前記観察対象点に前記副ピンホール像（１８−１〜１８−６）が位置しているときに生成された前記副強度信号（蛍光信号Ｉ_１〜Ｉ_６）に応じた値を減算することにより、前記主ピンホール像（１８−０）より小さい領域を射出元とした前記観察光（蛍光）の強度信号（差分蛍光信号ΔＩ）を生成する演算部（演算装置４０）とを備える。

したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置は、前記主ピンホール像（１８−０）より小さい領域に相当する解像度で前記観察対象面を観察すること（超解像観察すること）ができる。

なお、前記照明光（励起光など）の強度は、前記照明光の集光点における前記観察光（蛍光、散乱光、誘導放出光など）の発生量が飽和するような高さに設定される。

また、前記プローブ（３００）における前記主ピンホール像（１８−０）の中心から前記副ピンホール像（１８−１〜１８−６）の中心までの距離は、エアリーディスク半径（ａ）に一致する。

したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置は、超解像効果を確実に得ることができる。

また、前記観察対象面（Ｐ）における前記プローブ（３００）の走査ピッチは、前記プローブ（３００）の幅よりも細かく設定される。

具体的に、前記観察対象面（Ｐ）における前記プローブ（３００）の走査ピッチは、前記プローブにおける前記主ピンホール像から前記副ピンホール像までの配列ピッチ（Δｘ，Δｙ）と同じに設定される。

したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置は、前記観察対象面（Ｐ）を前記プローブ（３００）で効率的に走査することができる。

また、前記飽和の程度（飽和因子Ｓ）は、ユーザが決定することが可能であり、前記副強度信号（蛍光信号Ｉ_１〜Ｉ_６）と前記減算する値との比である減算係数（α）は、前記飽和の程度（飽和因子Ｓ）に応じた値に設定される。

したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置は、超解像度の調整が可能であると共に、その調整に依らず実効ＰＳＦの形状を良好に維持することができる。因みに、実効ＰＳＦの形状が不適切であり、例えば負のリップルが発生していると、共焦点顕微鏡装置の生成する超解像画像にアーティファクトの発生する虞がある。

また、前記マスク部（ピンホールマスク２１）には、複数の前記副ピンホール（２１−１〜２１−６）が前記主ピンホール（２１−０）の周りに等間隔で配列されている。

したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡は、実効ＰＳＦを等方的な分布に近づけることができる。

また、前記照明光（励起光）の波長は、前記観察対象面（Ｐ）に存在する蛍光物質の励起波長と同じであり、前記検出部（光検出器２３−０〜２３−６）の検出波長は、励起中の前記蛍光物質から発生する蛍光の波長と同じであってもよい。

この場合、前記観察対象面の蛍光観察を超解像度で行うことができる。

１１…レーザ光源、７…光ファイバ、１２…コリメートレンズ、１３…フィルタ、１４…ダイクロイックミラー、１５…ガルバノスキャナ、１６…リレーレンズ、１７…対物レンズ、１８…試料、１９…フィルタ、２０…集光レンズ、２１…ピンホールマスク、２２−０〜２２−６…光ファイバ、光検出器２３−０〜２３−６、３９…制御装置、４０…演算装置

Claims (9)

1. 観察対象面に照明光を集光する照明光学系と、
   前記観察対象面における前記照明光の集光点から射出した観察光を集光する観察光学系と、
   前記観察光学系に関して前記集光点と共役な位置に主ピンホールを配置すると共に、前記共役な位置から外れた位置に副ピンホールを配置したマスク部と、
   前記主ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す主強度信号と、前記副ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す副強度信号とを個別に生成する検出部と、
   前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記主ピンホールの像である主ピンホール像と、前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記副ピンホールの像である副ピンホール像と、前記観察対象面に前記照明光学系が形成する前記照明光の集光点とからなるプローブで前記観察対象面を走査する走査部と、
   前記観察対象面の観察対象点に前記主ピンホール像が位置しているときに生成された前記主強度信号から、前記観察対象点に前記副ピンホール像が位置しているときに生成された前記副強度信号に応じた値を減算することにより、前記主ピンホール像より小さい領域を射出元とした前記観察光の強度信号を生成する演算部と、
   を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記照明光の強度は、前記照明光の集光点における前記観察光の発生量が飽和するような高さに設定される
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
3. 請求項１又は請求項２に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記プローブにおける前記主ピンホール像の中心から前記副ピンホール像の中心までの距離は、エアリーディスク半径に一致する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
4. 請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記観察対象面における前記プローブの走査ピッチは、前記プローブの幅よりも細かく設定される
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
5. 請求項４に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記観察対象面における前記プローブの走査ピッチは、前記プローブにおける前記主ピンホール像から前記副ピンホール像までの配列ピッチと同じに設定される
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
6. 請求項２に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記飽和の程度は、ユーザが決定することが可能であり、
   前記副強度信号と前記減算する値との比である減算係数は、前記飽和の程度に応じた値に設定される
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
7. 請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記マスク部には、複数の前記副ピンホールが前記主ピンホールの周りに等間隔で配列されている
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
8. 請求項１〜請求項７の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記照明光の波長は、
   前記観察対象面に存在する蛍光物質の励起波長と同じであり、
   前記検出部の検出波長は、
   励起中の前記蛍光物質から発生する蛍光の波長と同じである
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
9. 観察対象面に照明光を照明光学系で集光し、
   前記観察対象面における前記照明光の集光点から射出した観察光を観察光学系で集光し、
   前記観察光学系に関して前記集光点と共役な位置に主ピンホールを配置すると共に、前記共役な位置から外れた位置に副ピンホールを配置し、
   前記主ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す主強度信号と、前記副ピンホールを通過した前記観察光の強度を示す副強度信号とを個別に生成し、
   前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記主ピンホールの像である主ピンホール像と、前記観察対象面に前記観察光学系が形成する前記副ピンホールの像である副ピンホール像と、前記観察対象面に前記照明光学系が形成する前記照明光の集光点とからなるプローブで前記観察対象面を走査し、
   前記観察対象面の観察対象点に前記主ピンホール像が位置しているときに生成された前記主強度信号から、前記観察対象点に前記副ピンホール像が位置しているときに生成された前記副強度信号に応じた値を減算することにより、前記主ピンホール像より小さい領域を射出元とした前記観察光の強度信号を生成する
   ことを特徴とする共焦点観察方法。

Images