JP2015064462A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】被検物の深さ方向の分解能を向上させた共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】共焦点顕微鏡１５０は、光源からの光束を用いて第１の共焦点絞りの少なくとも一部を均一に照明する照明光学系と、第１の共焦点絞りを通過した光束を被検物へ集光する第１の集光光学系と、被検物からの光束を第２の共焦点絞りへ集光する第２の集光光学系と、第２の共焦点絞りを通過する光束を検出する検出手段と、第１の集光光学系または第２の集光光学系の少なくとも一方に設けられ、第１の集光光学系または第２の集光光学系の少なくとも一方に設けられ、光軸を含む第１の領域の透過率が第１の領域の周囲の第２の領域の透過率よりも低い光量調整手段とを有する。【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関する。

病気の診断や研究において、生体試料などの厚みのある被検物を厚さ方向（深さ方向）の構造まで含めて観察することが求められている。厚みのある物体を通常の顕微鏡で観察すると、焦平面以外の面からの光がボケ像として焦平面に重畳してしまう。このため、厚み方向の構造を正確に観察することは困難である。

そこで従来から、共焦点顕微鏡が用いられている。共焦点顕微鏡はピンホールを用い、このピンホールを通過した光だけが検出される。このため、観察に必要な光量を十分に確保するには、ピンホールはある程度の大きさが必要となる。しかし、ピンホールを拡大すると、分解能が低下する。非特許文献１には、共焦点顕微鏡の集光光学系の瞳を輪帯形状にすることにより、深さ方向の分解能を向上させる構成が開示されている。特許文献１には、集光光学系の瞳位置に輪帯マスクを配置することにより、焦点深度を可変にする手法が開示されている。

また、マルチピンホールアレイを用いて深さ方向の分解能を変化させる共焦点顕微鏡が知られている。特許文献２には、コリメートレンズの開口数を変化させることにより、深さ方向の分解能を可変する構成が開示されている。

特開平２−２４７６０５号公報 国際公開２００２／０６８９０３号

Ｍ．Ｇｕ，"Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ"，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１９９６，ｐ．４７−ｐ．１４９

しかしながら、光量を確保するためにピンホールを拡大すると、深さ方向の分解能が低下する。一方、マルチピンホールアレイを採用すると、照明光強度の均一性を保つためケーラー照明が必要となる。この場合、有限サイズのピンホールが部分的にコヒーレント照明されることになり、ピンホール面上での照明光の空間コヒーレンスが分解能に与える影響が無視できない。このため、ピンホール面での空間コヒーレンスを定量的に考慮した上で、分解能を向上させる必要がある。

そこで本発明は、被検物の深さ方向の分解能を向上させた共焦点顕微鏡を提供することができる。

本発明の一側面としての共焦点顕微鏡は、光源からの光束を用いて第１の共焦点絞りの少なくとも一部を均一に照明する照明光学系と、前記第１の共焦点絞りを通過した光束を被検物へ集光する第１の集光光学系と、前記被検物からの光束を第２の共焦点絞りへ集光する第２の集光光学系と、前記第２の共焦点絞りを通過する光束を検出する検出手段と、前記第１の集光光学系または前記第２の集光光学系の少なくとも一方に設けられ、前記第１の集光光学系または前記第２の集光光学系の少なくとも一方に設けられ、光軸を含む第１の領域の透過率が第１の領域の周囲の第２の領域の透過率よりも低い光量調整手段とを有する。

本発明の他の目的及び特徴は、以下の実施例において説明される。

本発明によれば、被検物の深さ方向の分解能を向上させた共焦点顕微鏡を提供することができる。

第１の実施形態における共焦点顕微鏡の概略構成図である。 第２の実施形態における共焦点顕微鏡の概略構成図である。 第３の実施形態における共焦点顕微鏡の概略構成図である。 各実施形態におけるフィルタの構成図である。 第１の実施形態において、深さ方向のスキャン位置に対する像強度分布（光強度分布）である。 第１の実施形態において、ＨＷＨＭのσ依存性を示す図である。 第１の実施形態において、ＨＷＨＭのＰ_ｉｎ２依存性を示す図である。 第２の実施形態において、ＨＷＨＭのσ_ｉｎ依存性を示す図である。 第３の実施形態において、ＨＷＨＭのσ_ｉｎ依存性を示す図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。各図において、同一の部材については同一の参照番号を付し、重複する説明は省略する。

［第１の実施形態］
まず、本発明の第１の実施形態における共焦点顕微鏡について説明する。図１は、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０（共焦点光学顕微鏡）の概略構成図である。図１において、１００は照明光学系である。照明光学系１００には、ＬＥＤ光源またはハロゲン光源などを有する光源１、リレーレンズ２、および、コリメートレンズ３が設けられている。照明光学系１００は、光源１からの光束を用いて後述の共焦点絞り４（第１の共焦点絞り）の少なくとも一部を均一に照明する。

照明光学系１００の後方（照明光学系１００と後述の集光光学系１０１との間）には、共焦点絞り４が配置されている。共焦点絞り４は、例えば、ニポウディスクなどの複数のピンホールを配置して構成されたマルチピンホールアレイを有する。複数のピンホールを配置することにより、一度の撮影で複数の個所の情報が得られるため、高速な画像取得が可能となる。

共焦点絞り４の後方（図１中の下側）には、集光光学系１０１（第１の集光光学系）が配置されている。集光光学系１０１には、コリメートレンズ５、ダイクロイックミラー６、および、対物レンズ７が設けられている。集光光学系１０１は、共焦点絞り４を通過した光束を被検物８へ集光する。図１では、共焦点絞り４を通過する光束のうち、１つのピンホールを通過する光束が実線で示されている。被検物８は、例えば、蛍光物質で染色された生体試料である。図１では、簡単のため被検物８として点状の物体を示しているが、実際には生体試料など、ある大きさを有する試料である。被検物８は、集光光学系１０１により集光された光束により励起され、蛍光を発する。被検物８は、三次元方向に微動可能なステージ９の上に載置されている。このように、本実施形態の共焦点顕微鏡１５０は、蛍光を発する被検物８に関する情報を取得可能に構成されている。

ダイクロイックミラー６の側方（図１中の右側）には、結像レンズ１１が配置されている。対物レンズ７、ダイクロイックミラー６、フィルタ１０、および、結像レンズ１１により、集光光学系１０２（第２の集光光学系）が構成される。ダイクロイックミラー６は、被検物８から出射した蛍光のみを反射する。これにより、励起光を除去して被検物８からの蛍光のみを検出することが可能となる。集光光学系１０２は、被検物８からの光束を後述の共焦点絞り１２（第２の共焦点絞り）へ集光する。

集光光学系１０２には、フィルタ１０（光量調整手段）が配置されている。好ましくは、フィルタ１０は集光光学系１０２の瞳位置またはその近傍に配置されている。また好ましくは、フィルタ１０は、ダイクロイックミラー６と結像レンズ１１との間に配置されている。図４（Ａ）は、本実施形態におけるフィルタ１０の構成図である。フィルタ１０は、円形状の遮光部１０ａ（第１の領域）を光軸中心に配置して構成されている。遮光部１０ａの半径（大きさ）を、集光光学系１０２の瞳の半径を１とした場合、遮光部１０ａの半径（大きさ）をＰ_ｉｎ２とする。本実施形態において、好ましくは、半径Ｐ_ｉｎ２は０．６以下に設定されている。

また遮光部１０ａの周囲には、透過部１０ｂが設けられている。透過部１０ｂは光軸を中心として円環形状であることが好ましい。このような構成により、フィルタ１０は、対物レンズ７でコリメートされた蛍光を輪帯光束に変換する。このように本実施形態において、集光光学系１０２に設けられたフィルタ１０は、光軸を含む第１の領域（遮光部１０ａ）の透過率が第１の領域の周囲の第２の領域（透過部１０ｂ）の透過率よりも低い。

このように、フィルタ１０の遮光部１０ａは、光軸を中心とした所定の半径（半径Ｐ_ｉｎ２）を有する円形状である。また、フィルタ１０の透過部１０ｂは、光軸を中心とした遮光部１０ａの周囲の円環形状である。そして遮光部１０ａの半径Ｐ_ｉｎ２は、集光光学系１０１の開口数の３／５以下（０．６倍以下）であることが好ましい。すなわち、遮光部１０ａの半径Ｐ_ｉｎ２は、光軸を中心とした透過部１０ｂの外周の半径の３／５以下（０．６倍以下）であることが好ましい。これらの点は、後述のフィルタ１６についても同様である。

結像レンズ１１の後方（図１中の右側）には、共焦点絞り１２および光検出器１３（検出手段）が配置されている。共焦点絞り１２は、共焦点絞り４と同一形状であり、共焦点絞り４と共役な位置に配置されている。光検出器１３は、例えばＣＣＤやＣＭＯＳなどの光電変換素子を備えて構成されており、共焦点絞り１２を通過する光束を検出する。光検出器１３には、コンピュータ１４が接続されている。光検出器１３により検出された光信号は、コンピュータ１４により取り込まれ、コンピュータ１４の内部メモリなどの記憶手段に保存される。

続いて、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０の動作について説明する。光源１から出射した光は、照明光学系１００により平行光束となり、共焦点絞り４をケーラー照明する。ケーラー照明を行うことにより、共焦点絞り４の各ピンホールが均一な強度（光強度）で照明される。その結果、得られる画像の照度ムラを低減することができる。

共焦点絞り４を通過した光束は、集光光学系１０１により、被検物８に集光される。この光により被検物８（の内部）に設けられた蛍光物質が励起され、蛍光が発せられる。被検物８から発せられた蛍光は、集光光学系１０２により、共焦点絞り１２へ集光される。このとき、フィルタ１０により光束が輪帯状に変換される。共焦点絞り１２により被検物８の集光位置から発せられた蛍光のみが、光検出器１３に到達することができ、集光位置以外からの光は除去される。これにより、被検物８の１点の像を取得することができる。

共焦点絞り１２を通過した光束は、光検出器１３により電気信号へ変換される。この電気信号はコンピュータ１４へ送られて保存される。また被検物８は、微動可能なステージ９により三次元スキャンされる。スキャン位置のそれぞれに対して、前述の検出を行うことにより、コンピュータ１４は被検物８の三次元像を得ることができる。得られた三次元像は、図示されていないモニタ（表示手段）に表示される。

本実施形態の共焦点顕微鏡１５０によれば、被検物８の蛍光物質の分布を立体的に観察することができる。また本実施形態では、ケーラー照明された共焦点絞り４を通過する光束により励起された被検物８からの蛍光を輪帯光へ変換することにより、深さ方向の分解能を向上させることができる。

続いて、本実施形態の効果を説明する式を導出する。まず、共焦点絞り４および共焦点絞り１２のピンホールの大きさが無限小の場合において、共焦点顕微鏡１５０に対する三次元結像式を考える。非特許文献１より、共焦点顕微鏡１５０に対する三次元結像式は、以下の式（１）のように表される。

式（１）において、Ｉ_ｃｏｌ１（ｘ，ｙ，ｚ）は集光光学系１０１の点像強度分布関数ＩＰＳＦ（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）である。Ｉ_ｃｏｌ２（ｘ，ｙ，ｚ）は、集光光学系１０２のＩＰＳＦである。ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）は、被検物８の発光効率の空間分布である。ｘ_ｓ，ｙ_ｓ，ｚ_ｓは、被検物８のスキャン位置である。
は、ｘ，ｙ，ｚの全ての変数に対する畳み込み積分を示す記号である。

実際には、共焦点絞り４および共焦点絞り１２のピンホールは、有限の大きさを有するため、照明光学系１００の影響を受ける。そこで、照明光学系１００の影響を取り込むため、照明光学系１００の有効光源ｓ_０（ξ，η）を、以下の式（２）で表されるように定義する。

式（２）において、σはコリメートレンズ５の開口数ＮＡ_１に対するコリメートレンズ３の開口数ＮＡ_ｉの比である。すなわちσは、照明光学系１００における共焦点絞り４の側の開口数ＮＡ_ｉと、集光光学系１０１における共焦点絞り４の側の開口数ＮＡ_１との比である。ξ_０，η_０は、有効光源面でのｘｙ座標である。図１に示されるように、共焦点絞り４は、有効光源ｓ_０（ξ，η）によりケーラー照明されている。その結果、集光光学系１０１の点像強度分布関数ＩＰＳＦが変化する。ここで、集光光学系１０１の点像振幅分布関数ＡＰＳＦ（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）をｈ_ｃｏｌ１（ｘ，ｙ，ｚ）、共焦点絞り４の透過率分布をＳ（ｘ，ｙ）とする。このとき、集光光学系１０１のＩＰＳＦ（Ｉ’_ｃｏｌ１（ｘ，ｙ，ｚ））は、以下の式（３）のように表される。

また、共焦点絞り１２のピンホールも有限の大きさを有する。このため、共焦点絞り１２に対する透過率分布をＤ（ｘ，ｙ）とすると、非引用文献１より集光光学系１０２のＩＰＳＦ（Ｉ’_ｃｏｌ２（ｘ，ｙ，ｚ））は、以下の式（４）のように表される。

式（３）および式（４）を用いて修正されたＩＰＳＦから、共焦点顕微鏡１５０の三次元結像式は、以下の式（５）のように表される。

式（５）を用いることにより、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０による三次元像が求められる。

本実施形態では、集光光学系１０２の瞳面にフィルタ１０が配置されている。このため、集光光学系１０２の瞳関数Ｐ_ｃｏｌ２（ξ，η）は、以下の式（６）のように定義される。

式（６）において、ξ，ηは瞳面でのｘｙ座標である。

続いて、図５を参照して、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０により得られる像強度分布について説明する。図５は、大きさが無限に小さい蛍光体（被検物８）を観察した場合の深さ方向のスキャン位置ｚ_ｓに対する像強度分布（光強度分布）である。図５において、横軸はスキャン位置ｚ_ｓ、縦軸は強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をそれぞれ示している。物体（被検物８）は、ｚ_ｓ＝０に存在する。本実施形態において、波長は５７４ｎｍ、対物レンズ７の開口数ＮＡ_２は０．７、共焦点絞り４および共焦点絞り１２における１つのピンホールの直径は１．４μｍである。簡単のため、倍率は１倍、すなわちＮＡ_１＝ＮＡ_２である。また、σは１である。

本実施形態において、深さ方向の分解能を定量的に評価するため、ＨＷＨＭ（Ｈａｌｆ Ｗｉｄｔｈ ｏｆ Ｈａｌｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ）という値を定義する。ＨＷＨＭは、検出強度がｚ_ｓ＝０の値から半減する位置に関する量（ｚ_ｓ＝０の位置と検出強度が半減する位置との間の距離）であり、図５中の矢印で示される距離に相当する。ＨＷＨＭの値が小さいほど、より細かいものを見分けることができる、すなわち分解能が高いということになる。

図６は、ＨＷＨＭのσ依存性を示す図である。図６において、横軸はσ、縦軸はＨＷＨＭをそれぞれ示している。図６に示されるように、遮光部１０ａの半径Ｐ_ｉｎ２の値に依存せず（Ｐ_ｉｎ２＝０、０．４のいずれの場合でも）、σが０．３より大きくなると、σが０のときよりもＨＷＨＭが小さくなる。そしてその効果（減少量）が顕著になるのは、σが０．３より大きい場合である。また、遮光部１０ａの半径Ｐ_ｉｎ２を０から０．４へ変化させると、σの全ての値に対してＨＷＨＭが減少する。このように、中央遮蔽を行う（すなわち、輪帯照明を行う）ことにより、深さ方向の分解能を向上させることができる。本実施形態において、好ましくは、σは０．３≦σ≦１の範囲に設定される。

続いて、この効果を評価するため、遮光部１０ａの半径Ｐ_ｉｎ２に応じたＨＷＨＭの変化について説明する。図７は、ＨＷＨＭのＰ_ｉｎ２依存性を示す図である。図７において、横軸は遮光部１０ａの半径Ｐ_ｉｎ２、縦軸はＨＷＨＭ［μｍ］を示している。また、σは１である。図７に示されるように、遮光部１０ａの半径Ｐ_ｉｎ２が０から０．６の間の範囲（０＜Ｐ_ｉｎ２≦０．６）において、Ｐ_ｉｎ２が０のときよりもＨＷＨＭが小さくなっている。このように、中央遮蔽を行うと（輪帯照明を行うと）、深さ方向の分解能を向上させることができる。

なお本実施形態において、フィルタ１０は集光光学系１０２の瞳位置に配置されているが、これに限定されるものではない。例えば、フィルタ１０を集光光学系１０１に配置してもよい。すなわち本実施形態において、フィルタ１０は、集光光学系１０１または集光光学系１０２の少なくとも一方に設けられる。好ましくは、フィルタ１０は、集光光学系１０１または集光光学系１０２の少なくとも一方の瞳位置または瞳位置と共役な位置（または、その近傍）に配置されている。また好ましくは、フィルタ１０が集光光学系１０１に設けられる場合、フィルタ１０は、コリメートレンズ５とダイクロイックミラー６との間に配置される。

［第２の実施形態］
次に、本発明の第２の実施形態における共焦点顕微鏡について説明する。図２は、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０ａ（共焦点光学顕微鏡）の概略構成図である。なお図２において、図１と同一の部分には同一の符号を付し、それらの詳細な説明については省略する。

本実施形態の共焦点顕微鏡１５０ａは、第１の実施形態の共焦点顕微鏡１５０の照明光学系１００に代えて、フィルタ１５（第２の光量調整手段）を含む照明光学系１００ａを備えている点で、共焦点顕微鏡１５０とは異なる。好ましくは、フィルタ１５は、集光光学系１０１および集光光学系１０２の瞳位置と共役な位置に配置されている。また好ましくは、フィルタ１５は、リレーレンズ２とコリメートレンズ３との間に配置されている。共焦点顕微鏡１５０ａの他の構成は、共焦点顕微鏡１５０と同様である。

図４（Ｂ）は、フィルタ１５の構成図である。フィルタ１５は、円形状の遮光部１５ａ（第３の領域）を光軸の中心に配置して構成されている。コリメートレンズ５の開口数ＮＡ_１に対するコリメートレンズ３の開口数ＮＡ_ｉの比をσ、遮光部１５ａの半径（大きさ）をσ_ｉｎ（第２の半径）とする。図４（Ｂ）中の白い領域（第４の領域）は、光（光束）の通過する領域（透過部１５ｂ）であり、中央の黒い領域は光を遮光する素子（遮光部１５ａ）、灰色の領域はコリメートレンズ３とコリメートレンズ５の開口数の大きさの違いを示している。

本実施形態において、遮光部１５ａの半径σ_ｉｎは０．８以下（０＜σ_ｉｎ≦０．８）に設定されることが好ましい。すなわち遮光部の半径σ_ｉｎは、集光光学系１０１の開口数の４／５以下（０．８倍以下）であることが好ましい。このような構成を有するフィルタ１５を配置することにより、光源１からの光束が輪帯形状となる。このように本実施形態において、照明光学系１００に設けられたフィルタ１５は、光軸を含む第３の領域（遮光部１５ａ）の透過率が第３の領域の周囲の第４の領域（透過部１５ｂ）の透過率よりも低い。好ましくは、フィルタ１５は、照明光学系１００の瞳位置または瞳位置と共役な位置（または、その近傍）に配置されている。

フィルタ１５により、照明光学系１００ａの有効光源の形状は、以下の式（７）のように定義される（変更される）

続いて、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０ａの動作について説明する。光源１から出射した光束の形状は、リレーレンズ２およびフィルタ１５を介して輪帯形状に変換される。変換された輪帯光束は、コリメートレンズ３により共焦点絞り４をケーラー照明する。照明光束の形状が変化すると、共焦点絞り４上での照明光の空間コヒーレンスが変化する。その結果、共焦点顕微鏡１５０ａの分解能が変化する。この場合、本実施形態では、照明光束を輪帯光束へ変換することにより、深さ方向分解能を向上させることができる。

図８は、ＨＷＨＭのσ_ｉｎ依存性を示す図である。図８において、横軸はσ_ｉｎ、縦軸はＨＷＨＭをそれぞれ示している。ここで、σ_ｉｎはフィルタ１５により遮蔽される領域の開口数をコリメートレンズの開口数ＮＡ_１で割って得られた値である。算出条件は、第１の実施形態と同様であり、Ｐ_ｉｎ２は０．４、σは１である。図８より、σ_ｉｎが０から０．８の間の範囲（０＜σ_ｉｎ≦０．８）では、σ_ｉｎが０のときよりもＨＷＨＭが小さくなっている。すなわち、０＜σ_ｉｎ≦０．８の範囲に設定することにより、ＨＷＨＭを減少させる効果が得られる。

［第３の実施形態］
次に、本発明の第３の実施形態における共焦点顕微鏡について説明する。図３は、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０ｂ（共焦点光学顕微鏡）の概略構成図である。なお図３において、図１または図２と同一の部分には同一の符号を付し、それらの詳細な説明については省略する。

本実施形態の共焦点顕微鏡１５０ｂは、第２の実施形態の共焦点顕微鏡１５０ａの集光光学系１０１に代えて、フィルタ１６（光量調整手段）を含む集光光学系１０１ａを備えている点で、共焦点顕微鏡１５０ａとは異なる。フィルタ１６は、集光光学系１０１ａおよび集光光学系１０２の瞳位置と共役な位置に配置されている。好ましくは、フィルタ１６は、コリメートレンズ５とダイクロイックミラー６との間に配置されている。共焦点顕微鏡１５０ｂの他の構成は、共焦点顕微鏡１５０ａと同様である。

図４（Ｃ）は、フィルタ１６の構成図である。フィルタ１６は、フィルタ１０と同様に、円形の遮光部１６ａを光軸中心に配置して構成されている。集光光学系１０１の瞳の半径を１、遮光部１６ａの半径（大きさ）はＰ_ｉｎ１とする場合、遮光部１６ａの半径Ｐ_ｉｎ１を０．６以下（０＜Ｐ_ｉｎ１≦０．６）に設定することが好ましい。また遮光部１６ａの周囲には、透過部１６ｂが設けられている。透過部１６ｂは光軸を中心として円環状であることが好ましい。フィルタ１６を配置することにより、共焦点スリット４を通過した光束は輪帯光束へ変換される。このように本実施形態において、集光光学系１０１に設けられたフィルタ１６は、光軸を含む第１の領域（遮光部１６ａ）の透過率が第１の領域の周囲の第２の領域（透過部１６ｂ）の透過率よりも低い。

フィルタ１６により、集光光学系１０１の瞳関数Ｐ_ｃｏｌ１（ξ，η）は、以下の式（８）のように定義（変更）される。

続いて、本実施形態における共焦点顕微鏡１５０ｂの動作について説明する。共焦点絞り４を通過した光束の形状は、コリメートレンズ５およびフィルタ１６を介して輪帯形状に変換される。変換された輪帯光束は、対物レンズ７により被検物８へ集光され、被検物８の蛍光色素を励起する。このとき本実施形態では、照明光束を輪帯光束へ変換することにより、深さ方向の分解能を向上させることができる。

図９は、ＨＷＨＭのσ_ｉｎ依存性を示す図である。図９において、白丸はＰ_ｉｎ１が０．２の場合、黒丸はＰ_ｉｎ１が０すなわちフィルタ１６を配置していない場合をそれぞれ示している。また本実施形態において、Ｐ_ｉｎ２は０．４、σは１である。図９より、σ_ｉｎが０から０．８の間の範囲（０＜σ_ｉｎ≦０．８）において、集光光学系１０１ａにフィルタ１６を配置した場合（Ｐ_ｉｎ１＝０．２）のほうが、フィルタ１６を配置しない場合（Ｐ_ｉｎ１＝０）に比べて、ＨＷＨＭが小さくなっている。

各実施形態において、フィルタ１０、１５、１６の形状は、それぞれ輪帯形状であるが、これに限定されるものではなく、輪帯以外の形状を有するフィルタを配置してもよい。光軸中心の近傍に任意の形状で光を減衰させる素子（部材）が配置されれば、同様な効果が得られる。また、各実施形態において、コリメートレンズ５と対物レンズ７との間にダイクロイックミラー６を配置しているが、これに限定されるものではない。例えば、ダイクロイックミラー６をコリメートレンズ３と共焦点絞り４との間に配置してもよい。この場合、共焦点絞り１２を省略することが可能である。また本実施形態では、被検物８からの蛍光を観察する場合について説明しているが、これに限定されるものではない。各実施形態の効果は、被検物８からの反射光または透過光を観察する場合でも同様に得られる。

各実施形態の共焦点顕微鏡によれば、生体試料の観察やＬＳＩ表面の形状観察などを行う場合において、被検物の深さ方向の構造を高精度に観察することが可能となる。このため各実施形態によれば、被検物の深さ方向の分解能を向上させた共焦点顕微鏡を提供することができる。

以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。

４…共焦点絞り
１０…フィルタ
１２…共焦点絞り
１３…光検出器
１００…照明光学系
１０１…集光光学系
１０２…集光光学系

Claims (15)

1. 光源からの光束を用いて第１の共焦点絞りの少なくとも一部を均一に照明する照明光学系と、
   前記第１の共焦点絞りを通過した光束を被検物へ集光する第１の集光光学系と、
   前記被検物からの光束を第２の共焦点絞りへ集光する第２の集光光学系と、
   前記第２の共焦点絞りを通過する光束を検出する検出手段と、
   前記第１の集光光学系または前記第２の集光光学系の少なくとも一方に設けられ、光軸を含む第１の領域の透過率が第１の領域の周囲の第２の領域の透過率よりも低い光量調整手段と、を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記光量調整手段は、前記第１の集光光学系または前記第２の集光光学系の少なくとも一方の瞳位置または該瞳位置と共役な位置に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記照明光学系に設けられ、前記光軸を含む第３の領域の透過率が該第３の領域の周囲の第４の領域の透過率よりも低い第２の光量調整手段を更に有することを特徴とする請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記第２の光量調整手段は、前記照明光学系の瞳位置または該瞳位置と共役な位置に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記光量調整手段の前記第１の領域は、前記光軸を中心とした所定の半径を有する円形状であり、
   前記所定の半径は、前記第１の集光光学系または前記第２の集光光学系の開口数の３／５以下であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
6. 前記光量調整手段の前記第１の領域は、前記光軸を中心とした所定の半径を有する円形状であり、前記第２の領域は、該光軸を中心とした該第１の領域の周囲の円環形状であり、
   前記第１の領域の前記所定の半径は、前記光軸を中心とした前記第２の領域の外周の半径の３／５以下であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
7. 前記照明光学系における前記第１の共焦点絞りの側の開口数と、前記第１の集光光学系における該第１の共焦点絞りの側の開口数との比をσとするとき、０．３≦σ≦１の範囲を満たすことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
8. 前記第２の光量調整手段の前記第３の領域は、前記光軸を中心とした第２の半径を有する円形状であり、
   前記第２の半径は、前記第１の集光光学系の開口数の４／５以下であることを特徴とする請求項３または４に記載の共焦点顕微鏡。
9. 前記第１の共焦点絞りは、複数のピンホールを配置して構成されたマルチピンホールアレイを有し、
   前記照明光学系は、前記第１の共焦点絞りをケーラー照明するように構成されていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
10. 前記第１の集光光学系は、コリメートレンズ、ダイクロイックミラー、および、対物レンズを備えて構成されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
11. 前記光量調整手段は、前記コリメートレンズと前記ダイクロイックミラーとの間に配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の共焦点顕微鏡。
12. 前記第２の集光光学系は、対物レンズ、ダイクロイックミラー、および、結像レンズを備えて構成されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
13. 前記光量調整手段は、前記ダイクロイックミラーと前記結像レンズとの間に配置されていることを特徴とする請求項１２に記載の共焦点顕微鏡。
14. 前記照明光学系は、リレーレンズおよびコリメートレンズを備えて構成されており、
    前記第２の光量調整手段は、前記リレーレンズと前記コリメートレンズとの間に配置されていることを特徴とする請求項３または４に記載の共焦点顕微鏡。
15. 前記共焦点顕微鏡は、前記第１の集光光学系により集光された光束により蛍光を発する前記被検物に関する情報を取得可能に構成されていることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。