CN104482880A - 激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于光学精密成像测试技术领域，涉及一种激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置。本发明的核心思想是将分光瞳激光差动共焦探测技术和激光受激发射损耗成像技术有机融合，集成了分光瞳差动共焦探测技术的高分辨、高散射抑制特性，通过激光差动共焦技术提高轴向分辨能力，通过受激发射损耗显微技术改善横向分辨能力，继而提高系统的空间分辨力和抗样品散射能力。该装置包括激发激光系统、第一双色镜、四分之一波片、测量物镜、样品、扫描工作台、淬灭激光系统、光束整形系统、第二双色镜、分光瞳差动共焦探测系统及数据处理模块。本发明具有高空间分辨、高散射样品抑制的三维超分辨成像与检测能力，在微纳米技术领域具有广泛的应用前景。

Description

激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置

技术领域

本发明属于光学精密成像测试技术领域，涉及一种激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置，可用于微纳米技术领域纳米级几何参数的三维超分辨成像与检测。

技术背景

共焦显微术由于具有独特的纵向层析成像能力，以及便于与超分辨技术相结合的优势，使得其在高分辨光学显微探测领域中独树一帜，在纳米级成像与检测中发挥着极其重要的作用。

目前，在改善共焦显微成像分辨力的研究方面，出现了差动共焦显微术、双轴共焦显微术、共焦干涉显微术、4π共焦显微术和受激发射损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED)等。但这些方法存在诸多局限和不足，如：差动共焦显微术的轴向分辨力可达纳米量级，但其横向分辨力较共焦显微术没有任何改善；双轴共焦显微术的轴向分辨力有所提高，但是以牺牲了一部分横向分辨能力为代价的，其空间分辨力改善不明显；4π共焦显微法仅改善了轴向分辨能力，对横向分辨力的改善没有贡献；双光束共焦自干涉显微法的横向分辨力相对普通共焦显微术的横向分辨力改善了38％，对轴向分辨能力和层析能力毫无改善；STED显微成像技术使共焦显微成像的横向分辨能力改善了10余倍，但其主要集中在横向分辨力的改善方面。

上述各测量原理及方法的局限，迫使人们在传统的光学测量原理基础上利用新方法、新技术来突破衍射极限，实现光学远场三维超分辨(高空间分辨)成像检测。

近年来，国、内外在实现共焦显微的三维成像研究方面发展迅速，例如，中国发明专利“具有高空间分辨率的差动共焦扫描检测方法”(专利号：200410006359.6)，其提出了超分辨差动共焦检测方法，使系统轴向分辨力达到纳米级，并显著提高了环境抗干扰能力，中国发明专利“超分辨激光偏振差动共焦成像方法与装置”(专利号：200410006359.6)，其提出通过径向偏振光与光瞳滤波技术相结合，改善横向分辨力；通过轴向偏置的双探测器系统差动相减探测技术，改善轴向分辨力，继而显著改善系统空间分辨力和层析成像能力，其同样使系统轴向分辨力达到纳米级，并显著提高了环境抗干扰能力。遗憾的是，专利“具有高空间分辨率的差动共焦扫描检测方法”和“超分辨激光偏振差动共焦成像方法与装置”尽管使轴向分辨力达到纳米量级，但其横向分辨力只能突破经典衍射横向分辨力30％左右，限制了其在高横向分辨力要求领域的应用。

基于此，本发明提出另一种全新的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法，其通过分光瞳激光差动共焦技术提高轴向分辨能力，通过受激发射损耗显微技术改善横向分辨能力，继而达到空间分辨力的大幅改善。

发明内容

本发明的目的是为了突破光学衍射极限，提出激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置，以期为纳米成像检测领域空间分辨能力的改善提供全新的技术途径。本发明通过位于焦平面位置的探测系统的分光瞳差动相减探测技术，显著改善轴向分辨力，通过受激发射损耗显微技术改善横向分辨能力，继而大幅改善共焦显微系统的空间分辨能力和层析成像能力。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

本发明激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法，包括以下步骤：

1.在测量物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳；激发激光系统发出的波长为λ₁的激发平行光束经第一双向分色镜反射，再透过第二双色镜和四分之一波片入射到测量物镜上，经照明光瞳由测量物镜聚焦到被测样品，被测样品反射的带有样品信息的光(或激发的荧光)经测量物镜的收集光瞳、四分之一波片、第二双色镜和第一双色镜后进入分光瞳激光差动共焦探测系统；分光瞳激光差动共焦探测系统利用探测器横向偏移能够使分光瞳激光共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性，采用单光路、单探测器分割焦斑差动探测方法，实现对被测样品表面形貌信息的探测，具体过程为：对分光瞳差动共焦探测系统所获得的探测光斑进行分割处理，得到探测区域A和探测区域B的两个信号；当对两个探测区域的信号进行差动相减处理时，能够进行高空间分辨的三维层析成像；

2.对被测样品进行轴向扫描定焦，探测区域A和探测区域B分别测得反映被测样品表面形貌信息的强度响应信号I₁(x,y,z)和I₂(x,y,z)，并经分光瞳差动共焦探测系统相减得到差动响应F(x,y,z)的曲线；

3.轴向移动被测样品，使被测样品处于激光差动共焦特性曲线零点附近对应的聚焦焦斑；此时，淬灭激光系统发出的波长为λ₂的平行光束经光束整形系统整形，该整形光束经第二双色镜反射，再透过四分之一波片和测量物镜的照明光瞳聚焦在焦点附近生成环形光斑；

4.利用波长为λ₂的环形光斑对波长为λ₁的测量系统的聚焦焦斑进行淬灭，进而得到光斑尺寸与环形光斑中空尺寸对应的尺寸极小的淬灭聚焦光斑。

5.利用淬灭聚焦光斑发出的带有样品信息的光束进行分光瞳差动共焦探测得到差动响应F(x,y,z)，即可重构被测样品的表面三维形貌及微观尺度。

本发明提供了一种三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，包括激发激光系统、第一双色镜、四分之一波片、测量物镜、样品、扫描工作台、淬灭激光系统、光束整形系统、第二双色镜、分光瞳差动共焦探测系统及数据处理模块；其中第一双色镜放置在激发激光光束产生系统出射方向，光束整形系统、第二双色镜放置在淬灭激光系统出射方向，第二双色镜、四分之一波片、测量物镜、样品、扫描工作台依次放置在第一双色镜反射方向，分光瞳差动共焦探测系统位于第一双色镜和第二双色镜的透射光方向，分光瞳差动共焦探测系统包括数据处理模块，用于处理分光瞳差动共焦探测系统采集到的数据；分光瞳差动共焦探测系统包括激发激光系统、第一双色镜、四分之一波片、测量物镜、照明光瞳、收集光瞳、聚光镜、图像采集系统和扫描工作台。

其中，在测量物镜的光瞳面上放置照明光瞳和收集光瞳，照明光瞳和测量物镜依次位于第一双色镜和第二双色镜反射光方向上，照明光瞳与激发光束同轴；分光瞳激光差动共焦探测系统位于第一双色镜和第二双色镜的透射方向上；被测样品固定在三维扫描装置的载物台上。

本发明的装置中，淬灭激光系统可以是连续光源，也可以是脉冲光源。

本发明的装置中，光束整形系统可以是环形光整形系统，例如环形光瞳滤波器、圆环形位相分布的二元光学衍射器件等，将淬灭激光束整形成环形激光束；也可以是位相调制系统，如位相片、微透镜阵列或液晶空间光调制器等，将淬灭激光束聚焦成环形光斑。

特别的，可以通过设置探测区域A和探测区域B的位置参数以匹配不同反射率的样品，从而扩展其应用领域。

特别的，在本发明方法中，所述照明光瞳和收集光瞳可以是环形、圆形、D形或者其他形状。

本发明的装置中，分光瞳差动共焦探测系统包括数据处理模块，用于处理位置信息，完成样品三维重构。

本发明所述的测量装置，包括主控计算机和机电控制装置；主控计算机通过探测器获取差动共焦响应信号，通过控制机电控制装置来调节样品的位置，实现样品的三维扫描移动。

有益效果

本发明对比已有技术具有以下创新点：

1.一种激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法；将激光受激发射损耗显微技术与分光瞳差动共焦技术有机融合，利用受激发射损耗显微技术显著改善横向分辨力，利用分光瞳差动共焦技术显著改善轴向分辨力，从而达到提高共焦显微系统空间分辨力的目的；

2.通过设计光束整形系统，可控制环形光斑的尺寸，根据样品测试需求控制系统横向分辨力；

3.可以通过改变照明光瞳和收集光瞳的尺寸、形状，改变系统的轴向分辨力；

4.利用分光瞳差动共焦系统轴向响应曲线的过零点与焦点位置精确对应这一特性，通过零点触发来精确捕获激发光斑焦点位置的样品信息，实现高空间分辨的绝对探测，克服由于探测时间过长而产生的系统漂移；

5.本发明由于采用斜入射的探测光路，抗散射能力强，克服了现有共焦显微成像技术无法抑制焦面散射光干扰的缺点，提高了荧光信号探测的信噪比。

6.利用差动共焦响应曲线线性区域对应不同聚焦光斑尺寸的特性，对聚焦光斑位置进行精确调控，进而控制测量聚焦光斑的尺寸，便于对不同测试需求的样品进行测试与分析，即实现测量聚焦光斑尺寸可调。

7.由于采用单光路分割焦斑差动探测实现样品成像探测，既大幅简化传统差动共焦显微系统的光路结构，又保留了激光差动共焦系统和原有分光瞳共焦系统的优势。

本发明对比已有技术具有以下显著优点：

1.受激发射损耗显微技术与分光瞳差动共焦技术的有机融合，可显著改善分光瞳差动共焦显微成像系统的横向分辨力；

2.差动工作方式显著改善了受激发射损耗显微系统轴向响应特性的线性，使焦点处对应的轴向响应特性曲线线性最佳、灵敏度最高，可显著改善受激发射损耗显微系统的轴向成像能力；

3.单光路、单探测器分割焦斑差动探测方式可有效抑制共模噪声，提高探测信号的信噪比，大幅简化探测光路系统，消除因两探测器离轴放置不对称、探测器响应特性不一致等引起的误差，改善了共焦系统的离焦特性，显著改善系统抗干扰能力。

4.可实现量程范围与分辨能力的有效兼顾，通过设置在焦斑上所取两个微小区域的参数，以匹配不同反射率的被测样品，应用范围得到扩展；

5.采用分割焦斑的横向差动共焦方式，便于系统根据需求更换不同NA值的物镜，调节方便。

附图说明

图1为本发明受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法示意图；

图2为环形光束整形系统的受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法示意图；

图3为本发明受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置实施例示意图；

图4为采用位相调制系统的受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置示意图；

其中：1-激发激光系统、2-第一双色镜、3-四分之一波片、4-测量物镜、5-照明光瞳、6-收集光瞳、7-被测样品、8-聚焦焦斑、9-分光瞳差动共焦探测系统、10-聚光镜、11-图像采集系统、12-探测区域A、13-探测区域B、14-分光瞳差动共焦曲线、15-淬灭激光系统、16-光束整形系统、17-第二双色镜、18-环形光斑、19-淬灭聚焦光斑、20-环形光束整形系统、21-环形光束、22-位相调制系统、23-扫描工作台、24-主控计算机

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明将激光受激发射损耗显微技术与分光瞳差动共焦技术相融合，其基本思想是：利用激光受激发射损耗显微技术压缩聚焦焦斑，改善横向分辨力；利用探测器横向偏置的分光瞳差动相减探测技术，改善轴向分辨力，改善了共焦显微系统空间分辨力和层析成像能力。

实施例1

如图1所示，激光受激发射损耗显微三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法，其测试步骤如下：

首先，从激发激光系统1发出的波长为λ₁的平行光束经第一双色镜2反射后，透过第二双色镜17、四分之一波片3和照明光瞳5，经测量物镜4聚焦在被测样品7表面，被测样品7反射的带有样品信息的光(或激发的荧光)透过测量物镜4的收集光瞳6、四分之一波片3、第二双色镜17和第一双色镜2，进入分光瞳差动共焦探测系统9；分光瞳差动共焦探测系统9中依次放置聚光镜10、图像采集系统11，且在图像采集系统上设置了探测区域12(即探测区域A)和探测区域13(即探测区域B)两个探测器；

然后，对被测样品7进行轴向扫描定焦，探测区域12和探测区域13分别测得反映被测样品表面形貌信息的强度响应信号I₁(x,y,z)和I₂(x,y,z)，并经分光瞳差动共焦探测系统9得到差动响应F(x,y,z)的分光瞳差动共焦曲线14；

再次对被测样品7进行轴向扫描，使被测样品7处于分光瞳差动共焦曲线14零点附近，对应聚焦焦斑8；此时，从淬灭激光系统15发出的波长为λ₂的平行光束经光束整形系统16对光束进行调制(整形为环形光束或相位调制光束)，调制后光束经第二双色镜17反射后透过四分之一波片3，经测量物镜4、照明光瞳5聚焦为环形光斑18；

而后，利用波长为λ₂的环形光斑18对波长为λ₁的测量系统的聚焦焦斑8进行淬灭，得到光斑尺寸与环形光斑18中空尺寸对应的尺寸极小的淬灭聚焦光斑19。

最后，利用淬灭聚焦光斑19发出的带有样品信息的光束进行轴向分光瞳差动共焦探测得到差动响应F(x,y,z)，即可重构被测样品的表面三维形貌及微观尺度。

实施例2

如图2所示，将实施例1中的光束整形系统16替换为环形光束整形系统20即可构成采用环形光束整形系统的受激发射损耗分光瞳三维超分辨差动共焦成像方法与装置，环形光束整形系统20可以是环形光瞳滤波器、圆环形位相分布的二元光学衍射器件等，将淬灭激光束整形成环形光束21。

图2中，照明光瞳可以是圆形光瞳、D形光瞳或其他形状的光瞳；也可以是环形光瞳，直接替代环形光束整形系统，将入射光束整形为环形光束。

其余测量方法与实施例1相同。

实施例3

如图3所示，激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置实施例示意图，其原理为：

首先，将被测样品7放置于扫描工作台23上，扫描工作台23采用宏-微结合方式，在x-y宏工作台上集成基于压电陶瓷驱动器PZT和电容传感器构成的微位移二维工作台，启动主控计算机24中的测量软件。

激发激光系统1发出的平行光束经第一双色镜2反射，透过第二双色镜17、四分之一波片3和照明光瞳5，经测量物镜4聚焦到被测样品7，被测样品7反射的带有样品信息的光(或激发的荧光)透过收集光瞳6、测量物镜4、四分之一波片3、第二双色镜17和第一双色镜2，进入分光瞳差动共焦探测系统9；分光瞳差动探测共焦系统9中依次放置聚光镜10、图像采集系统11，且在图像采集系统上设置了探测区域12(即探测区域A)和探测区域13(即探测区域B)两个探测器；

而后，被测样品7在扫描工作台23驱动下进行轴向扫描定焦，被测样品7反射的带有样品信息的光(或激发的荧光)被分光瞳差动共焦探测系统中图像采集系统11的探测区域12和探测区域13接收探测，分别测得反映被测样品表面形貌信息的强度响应信号I₁(x,y,z)和I₂(x,y,z)，并经分光瞳差动共焦探测系统9得到差动响应F(x,y,z)的分光瞳差动共焦曲线14；

再次，轴向移动被测样品7，使被测样品7处于分光瞳激光差动共焦曲线14零点附近，对应聚焦焦斑8；此时，淬灭激光系统15发出的平行光束经环形光束整形系统20整形为环形光束21，该环形光束经第二双色镜17反射、透过四分之一波片3、照明光瞳5和测量物镜4聚焦在焦点附近，生成环形光斑18；

然后，利用环形光斑18对聚焦光斑8进行淬灭，进而得到光斑尺寸与环形光斑18中空尺寸对应的尺寸极小的淬灭聚焦光斑19。

最后，利用淬灭聚焦光斑19发出的带有样品信息的光束进行轴向分光瞳差动共焦探测得到分光瞳差动响应F(x,y,z)，即可重构被测样品的表面三维形貌及微观尺度。

实施例4

如图4所示，为采用位相调制系统的受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置实施例示意图。将实施例3中的环形光束整形系统20替换为图4中的位相调制系统22，即可构成采用位相调制系统的受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置实施例4。与实施例3所不同的是，入射到测量物镜4的照明光瞳5上的整形光束不是环形光束，经测量物镜4聚焦后才生成环形光斑18，然后，利用环形光斑18对聚焦光斑8进行淬灭，进而得到光斑尺寸与环形光斑18中空尺寸对应的尺寸极小的淬灭聚焦光斑19。其余测量方法与装置与实施例3相同。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像方法与装置，其特征在于：

1)在测量物镜(4)的光瞳面上放置照明光瞳(5)和收集光瞳(6)；激发激光系统(1)发出的波长为λ₁的激发平行光束经第一双向分色镜(2)反射，在透过第二双色镜(17)和四分之一波片(3)入射，经照明光瞳(5)由测量物镜(4)聚焦在被测样品(7)，被测样品(7)反射的带有样品信息的光(或激发的荧光)测量物镜(4)的收集光瞳(6)、四分之一波片(3)、第二双色镜(17)和第一双色镜(2)，进入分光瞳差动共焦探测系统(9)；分光瞳差动共焦探测系统(9)利用探测器横向偏移能够使分光瞳激光共焦显微系统的轴向响应特性曲线产生相移的特性，采用单光路、单探测器分割焦斑差动探测方法，实现对被测样品(7)表面形貌信息的探测，具体过程为：对分光瞳激光差动共焦探测系统所获得的探测光斑进行分割处理，得到探测区域A(12)和探测区域B(13)；当对两个探测区域(12)和(13)的信号进行差动相减处理时，能够进行高空间分辨的三维层析成像；

2)对被测样品(7)进行轴向扫描定焦，探测区域A(12)和探测区域B(13)分别测得反映被测样品表面形貌信息的强度响应信号I₁(x,y,z)和I₂(x,y,z)，并经分光瞳差动共焦探测系统(9)得到差动响应F(x,y,z)的分光瞳差动共焦曲线(14)；

3)轴向移动被测样品(7)，使被测样品(7)处于分光瞳差动共焦曲线零点附近，对应聚焦焦斑(8)；此时，淬灭激光系统(15)发出的波长为λ₂的平行光束经光束整形系统(16)整形，该整形光束经第二双色镜(17)反射，再透过四分之一波片(3)和测量物镜(4)的照明光瞳(5)聚焦在焦点附近生成环形光斑(18)；

4)利用波长为λ₂的聚焦环形光斑(18)对波长为λ₁的测量系统的聚焦焦斑(8)进行淬灭，进而得到光斑尺寸与环形光斑(18)中空尺寸对应的尺寸极小的淬灭聚焦光斑(19)。

5)利用淬灭聚焦光斑(19)发出的带有样品信息的光束进行分光瞳差动共焦探测得到差动响应F(x,y,z)，即可重构被测样品的表面三维形貌及微观尺度。

2.一种激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：包括激发激光系统(1)、第一双色镜(2)、四分之一波片(3)、测量物镜(4)、扫描工作台(23)、淬灭激光系统(15)、光束整形系统(16)、第二双色镜(17)、分光瞳差动共焦探测系统(9)；其中第一双色镜(2)放置在激发激光系统出射方向(1)，光束整形系统(16)、第二双色镜(17)放置在淬灭激光系统(15)出射方向，第二双色镜(17)、四分之一波片(3)、测量物镜(4)、被测样品(7)、扫描工作台(23)依次放置在第一双色镜(2)反射方向，分光瞳差动共焦探测系统位于第一双色镜(2)和第二双色镜(17)的透射光方向，分光瞳差动共焦探测系统(9)包括数据处理模块，用于处理差动共焦探测系统采集到的数据；分光瞳差动共焦探测系统包括激发激光系统(1)、第一双色镜(2)、四分之一波片(3)、测量物镜(4)、照明光瞳(5)、收集光瞳(6)、激光镜(10)、图像采集系统(11)、扫描工作台(23)。

3.根据权利要求2所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：在测量物镜(4)的光瞳面上放置照明光瞳(5)和收集光瞳(6)，照明光瞳(5)和测量物镜(4)依次位于第一双色镜(2)和第二双色镜(17)反射光方向上，照明光瞳(5)与激发光束同轴；分光瞳差动共焦探测系统(9)位于第一双色镜(2)和第二双色镜(17)的透射方向上；被测样品(7)固定在扫描工作台(23)上。

4.根据权利要求2所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：淬灭激光系统可以是连续光源，也可以是脉冲光源。

5.根据权利要求2所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：光束整形系统(16)是环形光整形系统，将淬灭激光束整形成环形激光束；或是位相调制系统，将淬灭激光束聚焦成环形焦斑。

6.根据权利要求4所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：所述环形光整形系统包括环形光瞳滤波器、圆环形位相分布的二元光学衍射器件。

7.根据权利要求4所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：所述位相调制系统包括位相片、微透镜阵列或液晶空间光调制器。

8.根据权利要求2所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：还包括可以通过设置探测区域A(12)和探测区域B(13)的位置参数以匹配不同反射率的样品，从而扩展其应用领域。

9.根据权利要求2所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：照明光瞳和收集光瞳可以是环形、圆形、D形或者其他形状。

10.根据权利要求2所述的激光受激发射损耗三维超分辨分光瞳差动共焦成像装置，其特征在于：分光瞳差动共焦探测系统(9)包括数据处理模块，用于处理位置信息，完成样品三维重构。