CN106094189A - 多通道荧光显微的复合显微系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多通道荧光显微的复合显微系统，属于显微镜技术领域，它包括显微镜主体、成像模块，复合照明模块，通过控制系统控制机械转镜改变复合照明模块的光路，由机械转镜选择与成像模块匹配的经过不同方式调制的光照进入显微镜主体中，对样品进行照明。该装置具有四种功能，分别为双色荧光定位显微功能、结构光照明显微功能、光漂白后荧光恢复功能，明场成像功能，在生物实验中既可以根据样品样品的特点及对成像的要求选择合适的方法对样品进行高空间分辨率或高时间分辨率成像，又可以对同一样品的同一位置进行不同方式的成像，解决了单一显微方法成像结果片面性的问题。

Description

多通道荧光显微的复合显微系统
技术领域
本发明属于显微镜技术领域，特别涉及一种多通道荧光显微的复合显微系统。
背景技术
生物显微技术在生命科学技术的研究中起着举足轻重的作用，且随着研究生命过程的发展及细化，生物显微技术遇到了越来越多的挑战。第一个挑战为对所研究样品中观察内容的尺度越来越小，细胞的尺寸为十微米量级，细胞器如线粒体叶绿体的尺寸为微米量级，细胞内的囊泡尺寸在几百到几十个纳米的量级，蛋白质的尺寸则大部分小于50纳米，要看清楚这些尺度上的生命结构，就对荧光显微镜的空间分辨率提出了很高的要求。第二个挑战为对生命过程的实时观察，也就是活样品成像，因为生命活动的时间尺度在秒或毫秒量级，荧光显微镜的时间分辨率越高，就可以观察到越细致的生命活动过程。另外，荧光显微系统中使用的照明光的强度也对生命活动过程及可观察时间的长短有着重要的影响，照明光强度过高，不仅会影响样品的生物活性，甚至会杀死样品，对样品的结构产生不可逆的影响；荧光显微镜所观察的生物样品大多需要荧光分子或荧光蛋白质标记，照明光强太高也会使特异性标记的荧光物质产生不可逆的淬灭效应，这样就缩短了观察时间。要得到高空间分辨率，高时间分辨率，低照明光强度的荧光显微系统一直为科研的终极目标。庄小威、埃里克贝奇格(Eric Bezig)分别于2006年先后提出了荧光定位显微技术，打破了恩斯特阿贝(Ernst Abbe)于十八世纪七十年代提出的光学成像分辨率理论，可以突破200nm的分辨率极限，将光学显微镜的空间分辨率提高到20nm的范围。然而这种方法需要用较强的激光对样品进行较长时间的照射成像，这样就不适合进行活样品成像。结构光照明显微技术主要由美国Janelia Farm的Mats Gustafsson研发，这种方法可以使用低强度照明光实现高空间分辨率(约100nm)，高信噪比的成像，且成像时间远远小于荧光定位显微技术，所以非常适合进行活样品成像。光漂白后恢复技术为研究活细胞生理状态下分子运动信息的重要方法。在生命科学实验过程中，对不同的生物样品成像需要选择不同的荧光显微镜，这就使得研究的成本大大提升；另外，若需要对同一样品的同一位置进行不同尺度的成像，就需要在实验过程中更换显微镜系统，并找到相同的位置，这在操作上是很难做到的。
发明内容
本发明的目的是针对现有的上述问题，提供一种具有四种功能，分别为双色荧光定位显微功能、结构光照明显微功能、光漂白后荧光恢复功能，明场成像功能的具有多通道双色荧光定位显微功能的复合显微系统。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，它包括：
显微镜主体，包括样品台、物镜、光路光学元件；
成像模块；
复合照明模块，包括光源和以下子模块：
明场光照明子模块，光源通过明场光照明子模块照射样品；
双色荧光定位照明子模块，可在普通宽场荧光显微照明模式、半全内反射照明模式和全内反射照明模式中连续调节，以获取不同厚度的样品空间分辨率双通道同时成像结果；
结构光照明子模块，光源通过结构光照明子模块进行调制后照射样品；
光漂白后荧光恢复功能照明子模块，通过编辑空间光调制器的调制图案，使得光源可以在所观测样品的某一区域形成高强度的聚焦点，使得标记该区域的荧光分子淬灭；
机械转镜，通过控制系统控制机械转镜改变复合照明模块的光路，由机械转镜选择与成像模块匹配的经过不同方式调制的光照进入显微镜主体中，对样品进行照明。
所述的照明模块包括单模光纤激光。
所述成像模块与照明模块相对应，包括以下子模块：
明场成像子模块，光源通过明场光照明子模块照射样品后映射在明场成像子模块上，凸显样品的轮廓和状态获以此取所得信息；
结构光照明成像子模块，光源通过结构光照明子模块中的可编程空间光调制器周期性调制激发光场，形成高准确的照明光条纹，之后通过对照明光条纹与样品结构相互作用产生的荧光混频图像进行后续频谱分析重构，以获得超分辨率成像结果；
双色荧光定位成像子模块，可获取不同厚度的样品高空间分辨率双通道同时成像结果；
光漂白后荧光恢复成像子模块，通过记录样品荧光淬灭处荧光恢复的时间来获取所得信息。
所述单模光纤激光提供波长为405nm、488nm、561nm、647nm、750nm的激光照明。
所述单模光纤激光位于显微镜主体的后部接口接入。
所述显微镜主体为基本的倒置荧光显微镜结构。
所述复合显微系统还包括拍摄的SCMOS或EMCCD相机。
所述双色荧光定位照明子模块和明场光照明子模块处于第一照明系统中，结构光照明子模块和光漂白后荧光恢复功能照明子模块处于第二照明系统中，所述第一照明系统、第二照明系统的照明模块由机械转镜调控。
与现有技术相比，该装置具有四种功能，分别为双色荧光定位显微功能、结构光照明显微功能、光漂白后荧光恢复功能，明场成像功能。在生物实验中既可以根据样品样品的特点及对成像的要求选择合适的方法对样品进行高空间分辨率或高时间分辨率成像，又可以对同一样品的同一位置进行不同方式的成像，解决了单一显微方法成像结果片面性的问题。在同一显微系统中加入不同功能的模块，降低了科研成本，提升仪器利用率。
附图说明
图1是本发明的模块关系示意图。
图2是实施例1的复合照明模块的具体光路图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
图1所示本发明中包括显微镜主体、SCMOS或EMCCD相机、复合照明模块，所述复合照明模块包括光源和明场光照明子模块、双色荧光定位照明子模块、结构光照明子模块、光漂白后荧光恢复功能照明子模块。所述光源经各照明子模块进入显微镜主体中，并照射在样品上。所述的样品选择映射在明场成像子模块、双色荧光定位成像子模块、结构光照明成像子模块及光漂白后荧光恢复成像子模块上。图2中双色荧光定位照明子模块和明场光照明子模块处于第一照明系统1中，结构光照明子模块和光漂白后荧光恢复功能照明子模块处于第二照明系统2中，所述第一照明系统1、第二照明系统2的照明模块由机械转镜1-3及机械转镜1-4调控。通过控制系统控制机械转镜1-3及机械转镜1-4改变复合照明模块的光路，由机械转镜1-3及机械转镜1-4选择与四种成像模块匹配的经过不同方式调制的光照进入显微镜主体中，对样品进行照明。
图2所示，机械转镜1-3可以选择(将全反射镜、50:50分光镜、或全透镜)镜片放入到光路中，通过调节机械转镜1-3，将其放入到光路中，可以将双色荧光定位成像模块的激光导入到第二成像系统中(全反射镜)，或导入明场成像模块及第二成像系统中(50:50分光镜)，而通过调节机械转镜1-4可以选择一种模块中的照明光进入到显微镜主体里。双色荧光定位成像模块及明场成像模块中由单模光纤激光1-1及单模光纤激光1-2发出的激光先通过透镜2-1及透镜2-3进行准直，经过分色镜2-2、分色镜2-4，并经过反光镜2-5反射进入中继透镜2-6及中继透镜2-8再进入到显微镜主体中，机械转镜1-3和中继透镜2-8之间设有可改变角度的反射镜2-7。
通过调节单模光纤激光1-1及单模光纤激光1-2端口的位置可以对样品样品进行宽场照明、半全内反射照明、全内反射照明中照明方法的选择，这在荧光定位显微成像中非常重要。在结构光照明成像模块中，单模光纤激光1-1及单模光纤激光1-2端口需位于宽场照明位置，从单模光纤激光1-1及单模光纤激光1-2端口发出的点光源经过中继透镜2-6汇聚在准直透镜3-2的后焦平面上，通过准直透镜3-2即成为平行光。偏振分光晶体3-3及半波片3-4的作用为调节入射光的偏振方向，使其与空间光调制器3-5所需要的偏振方向相同，通过计算机可编程的空间光调制器3-5上显示的条纹间距、密度及方向，可以调制照明光得到不同的结构光照明，如成像仅需提高信噪比，对空间分辨率没有太高要求，这种情况使用一个方向、较为稀疏的条纹结构光即可，这样可简化解调算法，使时间分辨率变高；若成像对空间分辨率的要求较高，则需要使用密度较高的条纹结构光，当结构光的密度与显微镜系统的分辨率极限相同时，即可获得结构光照明的最大空间分辨率，为显微镜系统分辨率极限的一半，并且这种情况下需要使用0o、45o、90o、135o四个方向的条纹结构光对样品进行照明成像，以获得xy方向相同的空间分辨率提升。空间光调制器上的条纹会经过聚焦透镜3-6汇聚在光遮罩3-9的位置，光遮罩3-9可以挡掉没有被调制的光成分，增强结构光的调制深度。光束进一步通过中继透镜3-12、中继透镜3-14及显微镜主体中的透镜成像在样品样品的焦平面上，当可编程的空间光调制器上的调制图案发生变化时，无需改变任何光学器件的位置即可在样品焦平面上产生条纹密度不同，方向不同的结构光照明。光漂白后荧光恢复成像模块需要在样品样品上实现一个聚焦光束的照明，这同时可以通过可编程的空间光调制器上的图案来实现，同时这种方法也可以准确调节这个聚焦光束在样品样品上的位置。图2中3-1、3-7、3-8、3-10、3-11、3-13均为改变光束方向的反光镜。
例如若需要追踪细胞分裂的过程，并研究分裂过程中某个时间节点处某两种蛋白质的相对位置关系，就可首先使用明场成像功能，大尺度地快速挑选某个健康的细胞；之后使用结构光照明显微成像功能对该细胞进行超分辨率快速的成像，追踪其分裂的过程，并判断此细胞所处的生命阶段；在达到需要的时间节点时使用双色荧光定位显微成像功能，对这两种蛋白质进行成像，若使用单一功能的荧光显微镜系统几乎不可能对同一细胞进行如此多角度多方位的观察。
实施例2
复合显微系统的成像模式为：明场成像(高时间分辨率，大视野)；双色荧光定位成像(高空间分辨率xy方向20nm，y方向50nm)；结构光照明成像(高空间分辨率xy方向100nm，y方向500nm；高时间分辨率约360ms每帧，成像范围2048*2048像素；高信噪比)；光漂白后荧光恢复成像；明场及双色荧光定位同时成像；明场及结构光照明同时成像；明场及光漂白后荧光恢复同时成像。这六种成像模式可以通过软件进行便捷的选择。

Claims (9)

1.一种多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，它包括：
显微镜主体，包括样品台、物镜、光路光学元件；
成像模块；
复合照明模块，包括光源和以下子模块：
明场光照明子模块，光源通过明场光照明子模块照射样品；
双色荧光定位照明子模块，可在普通宽场荧光显微照明模式、半全内反射照明模式和全内反射照明模式中连续调节，以获取不同厚度的样品空间分辨率双通道同时成像结果；
结构光照明子模块，光源通过结构光照明子模块进行调制后照射样品；
光漂白后荧光恢复功能照明子模块，通过编辑空间光调制器的调制图案，使得光源可以在所观测样品的某一区域形成高强度的聚焦点，使得标记该区域的荧光分子淬灭；
机械转镜，通过控制系统控制机械转镜改变复合照明模块的光路，由机械转镜选择与成像模块匹配的经过不同方式调制的光照进入显微镜主体中，对样品进行照明。
2.根据权利要求1所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述的照明模块包括单模光纤激光。
3.根据权利要求2所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述单模光纤激光提供波长为405nm、488nm、561nm、647nm、750nm的激光照明。
4.根据权利要求2或3所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述单模光纤激光位于显微镜主体的后部接口接入。
5.根据权利要求2或3所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述成像模块与照明模块相对应，包括以下子模块：
明场成像子模块，光源通过明场光照明子模块照射样品后映射在明场成像子模块上，凸显样品的轮廓和状态获以此取所得信息；
结构光照明成像子模块，光源通过结构光照明子模块中的可编程空间光调制器周期性调制激发光场，形成高准确的照明光条纹，之后通过对照明光条纹与样品结构相互作用产生的荧光混频图像进行后续频谱分析重构，以获得超分辨率成像结果；
双色荧光定位成像子模块，可获取不同厚度的样品高空间分辨率双通道同时成像结果；
光漂白后荧光恢复成像子模块，通过记录样品荧光淬灭处荧光恢复的时间来获取所得信息。
6.根据权利要求1所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述成像模块与照明模块相对应，包括以下子模块：
明场成像子模块，光源通过明场光照明子模块照射样品后映射在明场成像子模块上，凸显样品的轮廓和状态获以此取所得信息；
结构光照明成像子模块，光源通过结构光照明子模块中的可编程空间光调制器周期性调制激发光场，形成高准确的照明光条纹，之后通过对照明光条纹与样品结构相互作用产生的荧光混频图像进行后续频谱分析重构，以获得超分辨率成像结果；
双色荧光定位成像子模块，可获取不同厚度的样品高空间分辨率双通道同时成像结果；
光漂白后荧光恢复成像子模块，通过记录样品荧光淬灭处荧光恢复的时间来获取所得信息。
7.根据权利要求1或2或3所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述显微镜主体为基本的倒置荧光显微镜结构。
8.根据权利要求1或2或3所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述复合显微系统还包括拍摄的SCMOS或EMCCD相机。
9.根据权利要求1或6所述的多通道荧光显微的复合显微系统，其特征在于，所述双色荧光定位照明子模块和明场光照明子模块处于第一照明系统中，结构光照明子模块和光漂白后荧光恢复功能照明子模块处于第二照明系统中，所述第一照明系统、第二照明系统的照明模块由机械转镜调控。
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