CN108181282A - 一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法，该系统包括显微镜主体、照明模块、成像模块及三维纳米级样品锁定模块；照明模块用于实现三通道宽场及半全内反射照明，全内反射照明，且照明方式能够调节；由照明模块产生的照明光通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；样品发射出的荧光通过第一多色反射镜及前成像透镜后，由一块固定比例的分光镜进行分配，一部分分配到三维纳米级样品锁定模块中，剩余部分分配到成像模块中；三维纳米级样品锁定模块在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，成像模块将第一通道、第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上。

Description

一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法
技术领域
本发明涉及荧光定位显微技术领域，具体涉及一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法。
背景技术
自恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)于十八世纪七十年代提出光学成像分辨率极限的理论以来，人们一直在寻找各种各样的方法方式以求突破这一分辨率极限。目前，通过运用现代尖端技术，庄小威，埃里克·贝齐格(Eric Betzig)分别于2006年先后分别提出了随机光学重构显微技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM)和荧光定位显微技术(Photoactivation Laser Microscopy，PALM)，均实现了突破光学分辨率极限十倍的超分辨率成像。埃里克·贝齐格更是通过这一技术获得了2014年诺贝尔化学奖。目前荧光定位显微技术已经实现部分商业化，并且开始被用于基础生命科学，尤其是分子生物学以及生物化学的研究当中。通过这一技术，理论上来说研究人员可以以10到20纳米的横向分辨率和50纳米的纵向分辨率研究生物样品的细节结构。
但是使用这个原理应用到实际实验中时就产生了许多问题。
首先，样品漂移是一种普遍存在于超分辨率荧光定位显微镜的问题。这是指由于环境的不稳定，如气流、温度变化、噪音等等，会使样品在拍摄过程中发生几十至几百纳米的位移。尽管这一漂移现象普遍存在于显微系统中，由于一般显微镜的分辨率不足300纳米，且成像所需时间较短，漂移造成的现象并不明显。但是对于分辨率可达十几纳米的超分辨率显微镜而言，漂移会对成像造成严重的干扰。
其次，多通道超分辨率荧光显微镜的实现有困难，实现多通道若使用顺序成像的方法，就是多通道按照顺序，用不同波长的激光分别激发荧光染料进行成像，产生的问题是成像时间过长，效率低且样品漂移不好控制；超高成像激光强度强，在对一个通道成像时，对其他通道的错误激发会导致标记样品的荧光染料淬灭，导致标记不足影响成像质量；且不同通道之间会有一定程度的串扰，影响成像准确性。
另外，STORM及PALM成像要求荧光染料分子与成像缓冲液的成分组合进行配合，在较强激光的照射下可产生“闪烁”的效果，高质量的“闪烁”需要荧光分子在亮态的时间很短，但是放射出的光子数多，而不同的荧光染料分子可高质量“闪烁”时对缓冲液的成分要求是不同的，也就是说，越多通道的超分辨率成像，寻找荧光染料分子与成像缓冲液的成分配合就越困难。
现有技术解决样品XY漂移的方法为使用算法矫正漂移，或向样品中加入荧光颗粒，并在成像中记录这些颗粒的位移，随后从所得超分辨率图像中将这一位移减去。使用算法矫正漂移的缺点是对结构不清晰的样品算法无法使用，且只能矫正样品的线性漂移，对非线性漂移无能为力；使用荧光颗粒进行漂移矫正的缺陷是制备麻烦，无法确定荧光颗粒是否已经固定在样品中，另外，由于光漂白，荧光颗粒的荧光会随成像时间衰减，因此漂移的修正精度也会随时间变差。在纵向上，控制样品漂移的方法是用一束红外或紫外光通过反射干涉的方法求出位移，主动移动物镜补偿样品的位移，这种方法的缺陷是无法对深层细胞进行成像，且若样品辐射出红外或紫外光就会对锁定程序的运行造成影响。
现有技术中实现多通道通常是使用顺序成像的方法，就是多通道按照顺序，用不同波长的激光分别激发荧光染料进行成像。若使用顺序成像的方法，产生的问题是成像时间过长，效率低且样品漂移不好控制；超高成像激光强度强，在对一个通道成像时，对其他通道的错误激发会导致标记样品的荧光染料淬灭，导致标记不足影响成像质量；且不同通道之间会有一定程度的串扰，影响成像准确性。
中国发明专利(2014107873615：双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统)公开了一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法，该方法包括：使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将生物样品浸泡在成像缓冲液中；通过激光照射生物样品，分别产生与Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；根据第一通道闪烁荧光信号和第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像；将第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。上述成像技术理论上不会产生通道串扰，并且可大幅降低背景噪音，但该方法是基于双通道的生物显微成像技术，对生物样本更多结构的成像观察有着一定的局限性。
由以上分析可以看出，现有技术都无法实现高质量的三通道荧光定位超分辨率生物显微成像。
发明内容
本发明要解决的问题是：
1.三维纳米级稳定算法和系统，解决荧光定位超分辨率生物显微成像过程中在三维空间中的漂移问题；
2.采用三通道同时成像及算法去通道间串扰的方法，解决多通道荧光定位超分辨率生物显微成像时间过长，错误激发导致的荧光染料淬灭，及通道间串扰问题；
3.寻找出三种染料与缓冲液配方的合适配比，使三通道染料在缓冲液中都可以有平衡且高质量的“闪烁”性质。
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统及方法，采用三维纳米级稳定算法和系统，在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，解决样品漂移问题，可以达到XY方向2nm，Z方向20nm的锁定精度，且锁定过程中可以对细胞深处进行成像。同时采用三通道同时成像及算法去通道间串扰的方法，可以将成像时间缩短两倍，并且三个通道之间没有串扰。
为实现上述目的，本发明所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统包括物镜及成像透镜、照明模块、成像模块及三维纳米级样品锁定模块；所述的照明模块用于实现三通道宽场及半全内反射照明，全内反射照明，且照明方式能够调节；由照明模块产生的照明光通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；样品发射出的荧光通过第一多色反射镜及前成像透镜后，由一块分光镜进行分配，其中一部分分配到三维纳米级样品锁定模块中，另一部分分配到成像模块中；所述的三维纳米级样品锁定模块在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，所述的成像模块将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上。
所述的照明模块中的第一通道及第二通道激发的激光经过第一准直透镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；照明模块中的第三通道激发的激光经过第二准直透镜、反射镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上。
所述的三维纳米级样品锁定模块采用发光二极管作为明场光源，通过科勒照明光路照射在样品上，通过显微镜主体后一部分(例如20％)的明场光在锁定相机上成像，在所述的分配反射镜(例如20:80反射镜)与锁定相机之间设置有第四滤镜；所述的三维纳米级样品锁定模块利用与三通道照明光源不相同的发光二极管(例如455nm发光二极管)通过科勒照明光路为样品提供明场照明；物镜从样品处接受的光被分配分光镜(例如20:80分光镜)分配，其中一部分(例如20％)的光经过前成像透镜成像于锁定相机；锁定相机与计算机连接，当计算机的程序启动时，程序会先从锁定相机中抓取实时图像，程序会实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；所述的三维纳米级样品锁定模块还包括压电陶瓷平台，开始锁定时，锁定程序会通过压电陶瓷平台驱动控制压电陶瓷平台，在纵向上焦面上下进行扫描；在扫描时从锁定相机中抓取标定图像序列，并记录相应z值；锁定程序从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对空间相关性矩阵进行高斯拟合；求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移。
所述的成像模块包括矩形光阑、成像准直透镜、三个不同的光路、反射镜组、后成像透镜和EMCCD或sCMOS相机的探测器，三个不同的光路中的第一光路包括第一双色反射镜和第一滤镜；第二光路包括第二双色反射镜和第二滤镜；第三光路包括第三双色反射镜和第三滤镜。
标记样品结构的荧光染料受到激光激发产生的荧光由物镜采集，通过分配分光镜(例如20:80分光镜)进行配比，其中一部分(例如80％)进入到所述的成像模块的三通道荧光同时成像光路，到达成像模块的荧光首先通过一个矩形光阑对成像范围进行调节，并通过成像准直透镜对荧光进行准直，变为平行光，此时的荧光为三个通道的荧光混杂在一起，第一双色反射镜、第二双色反射镜和第三双色反射镜将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，每个通道的光路中都有一个滤镜，包括第一光路中的第一滤镜、第二光路中的第二滤镜和第三光路中的第三滤镜，第一滤镜、第二滤镜和第三滤镜用于滤除通道中的激发光，剩余的荧光部分通过反射镜组调节方向，并最终通过后成像透镜，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上。
在超分辨率成像过程中，第一通道，第二通道，及第三通道的照明光同时照射在样品上，当照明光强较强时，标记样品的三个通道的荧光染料会同时“闪烁”，经过成像模块，分别成像在探测器的不同部分，探测器会采集几千到几万张带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到计算机中，计算机通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，并将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。
所述的第一通道产生波长为500nm至600nm的激光作为照明光，所述的第二通道产生波长为600nm至700nm的激光作为照明光，所述的第三通道产生波长为700nm至760nm的激光作为照明光。
为了进一步消除通道间串扰对成像效果的影响，使用去串扰算法对成像结果进行优化，对每一种荧光染料测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光染料在各通道上的串扰的比例；由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；取该串扰矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于各通道的图像排成的列向量，得到去串扰图像；各通道的顺序对应串扰矩阵各列的顺序。
本发明所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统采用不同激发波长的荧光分子对生物样品进行三色标记，并将生物样品浸泡在成像缓冲液中；所采用的三类荧光分子为与波长为500nm至600nm的激光、波长为600nm至700nm的激光和波长为700nm至760nm的激光对应的、具有光切换性质的荧光分子。
所述成像缓冲液包含TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合或者包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合；所采用的三类荧光分子为CF568或Cy3B,Alexa 647或Cy5和Alexa750或Cy7；通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号，以及与所述CF568或Cy3B荧光分子对应的第三通道闪烁荧光信号。
本发明还提供一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统的显微方法，包括以下步骤：
所述的照明模块中的第一通道及第二通道激发的激光经过第一准直透镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；照明模块中的第三通道激发的激光经过第二准直透镜、反射镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；
所述的三维纳米级样品锁定模块用于实时细胞锁定，包括以下步骤：
第一步：所述的三维纳米级样品锁定模块利用与三通道照明光源不相同的发光二极管(例如455nm发光二极管)产生蓝光，通过科勒照明光路为样品提供明场照明；
第二步：物镜从样品处接受的光被分配分光镜(例如20:80分光镜)分配，其中一部分(例如20％)的光经过前成像透镜成像于锁定相机；
第三步：当计算机的程序启动时，程序会先从锁定相机中抓取实时图像；
第四步：程序会实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；
第五步：开始锁定时，锁定程序会通过压电陶瓷平台驱动控制压电陶瓷平台，在纵向上焦面上下进行扫描；在扫描时从锁定相机中抓取标定图像序列，并记录相应z值；
第六步：锁定程序从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；
第七步：对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对空间相关性矩阵进行高斯拟合；
第八步：求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；
第九步：锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；
第十步：对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；
第十一步：锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移；
第十二步：第八步至第十步循环至锁定结束；
标记样品结构的荧光染料受到激光激发产生的荧光由物镜采集，通过分配分光镜(例如20:80分光镜)进行配比，其中一部分(例如80％)进入到所述的成像模块的三通道荧光同时成像光路，到达成像模块的荧光首先通过一个矩形光阑对成像范围进行调节，并通过成像准直透镜对荧光进行准直，变为平行光，此时的荧光为三个通道的荧光混杂在一起，第一双色反射镜、第二双色反射镜和第三双色反射镜将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，每个通道的光路中都有一个滤镜，包括第一光路中的第一滤镜、第二光路中的第二滤镜和第三光路中的第三滤镜，第一滤镜、第二滤镜和第三滤镜用于滤除通道中的激发光，剩余的荧光部分通过反射镜组调节方向，并最终通过后成像透镜，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上；
为了进一步消除通道间串扰对成像效果的影响，使用去串扰算法对成像结果进行优化，对每一种荧光染料测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光染料在各通道上的串扰的比例；由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；取该串扰矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于各通道的图像排成的列向量，得到去串扰图像；各通道的顺序对应串扰矩阵各列的顺序。
本发明具有如下优点：本发明所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统与现有技术相比，采用三维纳米级稳定算法和系统，在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，解决样品漂移问题，可以达到XY方向2nm，Z方向20nm的锁定精度，且锁定过程中可以对细胞深处进行成像。采用三通道同时成像及算法去通道间串扰的方法，可以将成像时间缩短两倍，并且三个通道之间没有串扰。
本发明可以实现三通道xy方向20nm，z方向50nm分辨率；三通道同时成像，将成像时间缩短了两倍，通道间无串扰；成像过程中样品的漂移可以控制在xy方向2nm左右，z方向20nm左右。
本发明采用三维纳米级样品锁定系统，解决了成像过程中的样品漂移问题，且样品锁定过程中可以对细胞深处进行成像。
本发明将多通道超高分辨率荧光定位显微成像的成像方式进行改进，采用三通道同时成像方式，并且使用去串扰算法，使得成像时间缩短两倍，通道间无串扰。
本发明采用的荧光染料在本发明采用的缓冲液中实现平衡的、高质量的“闪烁效果”。
目前现有技术中其他三通道超高成像技术选用不同的激发波长，一般为488nm，561nm和647nm，因而其荧光分子的选择和成像缓冲液的配比也不同于本发明的技术。本发明的技术选择用500nm至600nm,600nm至700nm和700nm至760nm作为三通道的组合，以“具备闪烁性能”和“平衡三种荧光分子的光化学性能”为要求挑选了合适的荧光染料进行组合，并进行成像缓冲液的优化。搭配本发明的其他技术，确保实现三通道同时成像，并实现三通道xy方向20nm，z方向50nm分辨率。
附图说明
图1为本发明的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统的结构示意图。
图2为本发明的三维纳米级样品锁定模块的结构示意图。
图3为拟合峰值与z值的单调递减对应关系示意图。
图4为本发明的三通道同时成像示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统包括物镜及成像透镜、照明模块2、成像模块3及三维纳米级样品锁定模块4；所述的照明模块用于实现561nm、647nm及750nm三通道(即第一通道，第二通道，第三通道)，宽场及半全内反射照明，全内反射照明，且照明方式能够调节；由照明模块产生的照明光通过第一多色反射镜6反射，通过物镜5照射到样品51上；样品发射出的荧光通过第一多色反射镜6及前成像透镜7后，由一块20:80分光镜8(分配分光镜)进行分配，其中20％分配到三维纳米级样品锁定模块中，80％分配到成像模块中；所述的三维纳米级样品锁定模块在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，所述的成像模块将561nm通道，647nm通道和750nm通道(即第一通道，第二通道，第三通道)产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上。
所述的照明模块中的561nm通道及647nm通道21(即第一通道，第二通道)激发的激光经过第一准直透镜23、第二多色反射镜25和照明透镜27后，通过第一多色反射镜6反射，通过物镜5照射到样品上；照明模块中的750nm通道22(即第三通道)激发的激光经过第二准直透镜24、反射镜26、第二多色反射镜25和照明透镜27后，通过第一多色反射镜6反射，通过物镜5照射到样品上。
所述的三维纳米级样品锁定模块采用455nm发光二极管41(与三通道照明光源不相同的发光二极管)作为明场光源，通过科勒照明光路42照射在样品上，通过显微镜主体后20％的明场光在锁定相机10上成像，在所述的20:80分光镜8与锁定相机10之间设置有第四滤镜9；所述的三维纳米级样品锁定模块利用455nm发光二极管产生蓝光，通过科勒照明光路42为样品提供明场照明；物镜5从样品处接受的光被20:80分光镜8分配，其中20％的光经过前成像透镜成像于锁定相机10；锁定相机与计算机45连接，当计算机的程序启动时，程序会先从锁定相机中抓取实时图像，程序会实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；所述的三维纳米级样品锁定模块还包括压电陶瓷平台43，开始锁定时，锁定程序会通过压电陶瓷平台驱动44控制压电陶瓷平台，在纵向上焦面上下进行扫描(例如上下各1微米)；在扫描时从锁定相机中抓取标定图像序列，并记录相应z值；锁定程序从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对空间相关性矩阵进行高斯拟合；求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合(如图3所示)；锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移。
所述的成像模块包括矩形光阑30、成像准直透镜31、三个不同的光路、反射镜组38、后成像透镜39和EMCCD或sCMOS相机的探测器301，三个不同的光路中的第一光路包括第一双色反射镜32和第一滤镜35；第二光路包括第二双色反射镜33和第二滤镜36；第三光路包括第三双色反射镜34和第三滤镜37。
标记样品结构的荧光染料受到激光激发产生的荧光由物镜采集，通过20:80分光镜进行配比，其中80％进入到所述的成像模块的三通道荧光同时成像光路，到达成像模块的荧光首先通过一个矩形光阑对成像范围进行调节(对成像区域进行选择)，并通过成像准直透镜对荧光进行准直，变为平行光，此时的荧光为三个通道的荧光混杂在一起，第一双色反射镜32、第二双色反射镜33和第三双色反射镜34将561nm通道，647nm通道和750nm通道(即第一通道，第二通道，第三通道)产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，每个通道的光路中都有一个滤镜，包括第一光路中的第一滤镜35、第二光路中的第二滤镜36和第三光路中的第三滤镜37，第一滤镜35、第二滤镜36和第三滤镜37用于滤除通道中的激发光，剩余的荧光部分通过反射镜组调节方向，并最终通过后成像透镜，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上。
在超分辨率成像过程中，561nm通道，647nm通道，及750nm通道(即第一通道，第二通道，第三通道)的照明光同时照射在样品上，当照明光强较强时，标记样品的三个通道的荧光染料会同时“闪烁”，经过成像模块，分别成像在探测器的不同部分，探测器会采集几千到几万张带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到计算机中，计算机通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，并将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。
虽然上述优选实施例中，第一通道为561nm通道，第二通道为647nm通道，及第三通道为750nm通道，但是本领域技术人员可以理解，并不局限于上述数值。所述的第一通道可以产生波长为500nm至600nm的激光作为照明光，所述的第二通道可以产生波长为600nm至700nm的激光作为照明光，所述的第三通道可以产生波长为700nm至760nm的激光作为照明光。
为了进一步消除通道间串扰对成像效果的影响，使用了去串扰算法对成像结果进行优化，去串扰算法的原理为：1)对每一种荧光染料测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光染料在各通道上的串扰的比例。2)由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例。3)将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵。4)取该串扰矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵。5)将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于该列向量，得到去串扰图像。各通道的顺序应对应串扰矩阵各列的顺序。
本发明所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统采用不同激发波长的荧光分子对生物样品进行三色标记，并将生物样品浸泡在成像缓冲液中；所采用的三类荧光分子为与波长为500nm至600nm的激光、波长为600nm至700nm的激光和波长为700nm至760nm的激光对应的、具有光切换性质的荧光分子。
所述成像缓冲液包含TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合或者包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合；所采用的三类荧光分子为CF568或Cy3B,Alexa 647或Cy5和Alexa750或Cy7；通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号，以及与所述CF568或Cy3B荧光分子对应的第三通道闪烁荧光信号。
本发明采用的成像缓冲液提供了荧光分子用于超高分辨率成像的化学环境：(1)还原剂提供闪烁所需的化学基团；(2)除氧剂在成像过程中的光漂白大大减少。
本发明还提供一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统的显微方法，包括以下步骤：
所述的照明模块中的561nm通道及647nm通道激发的激光经过第一准直透镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；照明模块中的750nm通道激发的激光经过第二准直透镜、反射镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；
所述的三维纳米级样品锁定模块用于实时细胞锁定，包括以下步骤：
第一步：所述的三维纳米级样品锁定模块利用455nm发光二极管产生蓝光，通过科勒照明光路为样品提供明场照明；
第二步：物镜从样品处接受的光被20:80分光镜分配，其中20％的光经过前成像透镜成像于锁定相机；
第三步：当计算机的程序启动时，程序会先从锁定相机中抓取实时图像；
第四步：程序会实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；
第五步：开始锁定时，锁定程序会通过压电陶瓷平台驱动控制压电陶瓷平台，在纵向上焦面上下进行扫描；在扫描时从锁定相机中抓取标定图像序列，并记录相应z值；
第六步：锁定程序从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；
第七步：对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对空间相关性矩阵进行高斯拟合；
第八步：求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；
第九步：锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；
第十步：对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；
第十一步：锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移；
第十二步：第八步至第十步循环至锁定结束；
标记样品结构的荧光染料受到激光激发产生的荧光由物镜采集，通过20:80分光镜进行配比，其中80％进入到所述的成像模块的三通道荧光同时成像光路，到达成像模块的荧光首先通过一个矩形光阑对成像范围进行调节，并通过成像准直透镜对荧光进行准直，变为平行光，此时的荧光为三个通道的荧光混杂在一起，第一双色反射镜、第二双色反射镜和第三双色反射镜将561nm通道，647nm通道和750nm通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，每个通道的光路中都有一个滤镜，包括第一光路中的第一滤镜、第二光路中的第二滤镜和第三光路中的第三滤镜，第一滤镜、第二滤镜和第三滤镜用于滤除通道中的激发光，剩余的荧光部分通过反射镜组调节方向，并最终通过后成像透镜，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上；
为了进一步消除通道间串扰对成像效果的影响，使用去串扰算法对成像结果进行优化，对每一种荧光染料测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光染料在各通道上的串扰的比例；由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；取该串扰矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于各通道的图像排成的列向量，得到去串扰图像；各通道的顺序对应串扰矩阵各列的顺序。
上面对本发明优选实施方式作了详细说明，但是本发明不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，这些变化涉及本领域技术人员所熟知的相关技术，这些都落入本发明专利的保护范围。
不脱离本发明的构思和范围可以做出许多其他改变和改型。应当理解，本发明不限于特定的实施方式，本发明的范围由所附的权利要求限定。

Claims (10)

1.一种三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统包括物镜及成像透镜、照明模块、成像模块及三维纳米级样品锁定模块；所述的照明模块用于实现三通道宽场及半全内反射照明，全内反射照明，且照明方式能够调节；由照明模块产生的照明光通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；样品发射出的荧光通过第一多色反射镜及前成像透镜后，由一块分配反射镜进行分配，其中一部分分配到三维纳米级样品锁定模块中，另一部分分配到成像模块中；所述的三维纳米级样品锁定模块在超高图像拍摄过程中锁定样品位置，所述的成像模块将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上。
2.如权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的照明模块中的第一通道及第二通道激发的激光经过第一准直透镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；照明模块中的第三通道激发的激光经过第二准直透镜、反射镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上。
3.如权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的三维纳米级样品锁定模块采用与三通道照明光源不相同的发光二极管作为明场光源，通过科勒照明光路照射在样品上，通过显微镜主体后一部分的明场光在锁定相机上成像，在所述的分配反射镜与锁定相机之间设置有第四滤镜；所述的三维纳米级样品锁定模块利用与三通道照明光源不相同的发光二极管通过科勒照明光路为样品提供明场照明；物镜从样品处接受的光被分配分光镜分配，其中一部分的光经过前成像透镜成像于锁定相机；锁定相机与计算机连接，当计算机的程序启动时，程序会先从锁定相机中抓取实时图像，程序会实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；所述的三维纳米级样品锁定模块还包括压电陶瓷平台，开始锁定时，锁定程序会通过压电陶瓷平台驱动控制压电陶瓷平台，在纵向上焦面上下进行扫描；在扫描时从锁定相机中抓取标定图像序列，并记录相应z值；锁定程序从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对空间相关性矩阵进行高斯拟合；求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移。
4.如权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的成像模块包括矩形光阑、成像准直透镜、三个不同的光路、反射镜组、后成像透镜和EMCCD或sCMOS相机的探测器，三个不同的光路中的第一光路包括第一双色反射镜和第一滤镜；第二光路包括第二双色反射镜和第二滤镜；第三光路包括第三双色反射镜和第三滤镜。
5.如权利要求4所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，标记样品结构的荧光染料受到激光激发产生的荧光由物镜采集，通过分配反射镜进行配比，其中一部分进入到所述的成像模块的三通道荧光同时成像光路，到达成像模块的荧光首先通过一个矩形光阑对成像范围进行调节，并通过成像准直透镜对荧光进行准直，变为平行光，此时的荧光为三个通道的荧光混杂在一起，第一双色反射镜、第二双色反射镜和第三双色反射镜将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，每个通道的光路中都有一个滤镜，包括第一光路中的第一滤镜、第二光路中的第二滤镜和第三光路中的第三滤镜，第一滤镜、第二滤镜和第三滤镜用于滤除通道中的激发光，剩余的荧光部分通过反射镜组调节方向，并最终通过后成像透镜，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上；在超分辨率成像过程中，第一通道，第二通道，及第三通道的照明光同时照射在样品上，当照明光强较强时，标记样品的三个通道的荧光染料会同时“闪烁”，经过成像模块，分别成像在探测器的不同部分，探测器会采集几千到几万张带有荧光染料“闪烁”信号的原始图像，并传输到计算机中，计算机通过高斯拟合，找出每一张原始图像中每一个闪烁点的中心位置，并将所有原始图像的闪烁点中心位置叠加在一起，得到三个通道的超高分辨率图像。
6.如权利要求5所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的第一通道产生波长为500nm至600nm的激光作为照明光，所述的第二通道产生波长为600nm至700nm的激光作为照明光，所述的第三通道产生波长为700nm至760nm的激光作为照明光。
7.如权利要求6所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，为了进一步消除通道间串扰对成像效果的影响，使用去串扰算法对成像结果进行优化，对每一种荧光染料测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光染料在各通道上的串扰的比例；由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；取该串扰矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于各通道的图像排成的列向量，得到去串扰图像；各通道的顺序对应串扰矩阵各列的顺序。
8.如权利要求1所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统采用不同激发波长的荧光分子对生物样品进行三色标记，并将生物样品浸泡在成像缓冲液中；所采用的三类荧光分子为与权利要求6中的波长为500nm至600nm的激光、波长为600nm至700nm的激光和波长为700nm至760nm的激光对应的、具有光切换性质的荧光分子。
9.如权利要求8所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统，其特征在于，所采用的三类荧光分子为CF568或Cy3B,Alexa 647或Cy5和Alexa750或Cy7；通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号，以及与所述CF568或Cy3B荧光分子对应的第三通道闪烁荧光信号；所述成像缓冲液包含TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合或者包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。
10.如权利要求1至9任一项所述的三通道荧光定位超分辨率生物显微系统的显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
所述的照明模块中的第一通道及第二通道激发的激光经过第一准直透镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；照明模块中的第三通道激发的激光经过第二准直透镜、反射镜、第二多色反射镜和照明透镜后，通过第一多色反射镜反射，通过物镜照射到样品上；
所述的三维纳米级样品锁定模块用于实时细胞锁定，包括以下步骤：
第一步：所述的三维纳米级样品锁定模块利用发光二极管产生蓝光，通过科勒照明光路为样品提供明场照明；
第二步：物镜从样品处接受的光被分配分光镜分配，其中一部分的光经过前成像透镜成像于锁定相机；
第三步：当计算机的程序启动时，程序会先从锁定相机中抓取实时图像；
第四步：程序会实时计算出图象局域对比度，选取最优区域，以局域对比度之和最大的区域作为最优区域的位置；
第五步：开始锁定时，锁定程序会通过压电陶瓷平台驱动控制压电陶瓷平台，在纵向上焦面上下进行扫描；在扫描时从锁定相机中抓取标定图像序列，并记录相应z值；
第六步：锁定程序从标定图像序列最上端或最下端图像以最优区域位置截取固定大小的区域作为参照图像；
第七步：对序列的图像与参照图像求空间相关性矩阵，并对空间相关性矩阵进行高斯拟合；
第八步：求出拟合峰值与z值的单调递减对应关系并用多次函数近似拟合；
第九步：锁定程序随后从锁定相机中实时抓取样品的明场图像；
第十步：对实时图像与参照图像求空间相关性矩阵并进行高斯拟合，求出中心位置作为x，y平面上的偏移量，并通过拟合极值求出实时的z值；
第十一步：锁定程序随后通过驱动电路驱动压电陶瓷平台以补偿偏移；
第十二步：第八步至第十步循环至锁定结束；
标记样品结构的荧光染料受到激光激发产生的荧光由物镜采集，通过分配分光镜进行配比，其中一部分进入到所述的成像模块的三通道荧光同时成像光路，到达成像模块的荧光首先通过一个矩形光阑对成像范围进行调节，并通过成像准直透镜对荧光进行准直，变为平行光，此时的荧光为三个通道的荧光混杂在一起，第一双色反射镜、第二双色反射镜和第三双色反射镜将第一通道，第二通道和第三通道产生的不同波段的荧光分配到三个不同的光路中，每个通道的光路中都有一个滤镜，包括第一光路中的第一滤镜、第二光路中的第二滤镜和第三光路中的第三滤镜，第一滤镜、第二滤镜和第三滤镜用于滤除通道中的激发光，剩余的荧光部分通过反射镜组调节方向，并最终通过后成像透镜，将三个通道的荧光成像在探测器芯片的不同位置上；为了进一步消除通道间串扰对成像效果的影响，使用去串扰算法对成像结果进行优化，对每一种荧光染料测量其在三个通道上的荧光成像，对每一个通道上的亮度取平均，就是该荧光染料在各通道上的串扰的比例；由于荧光染料发出的光的量等于各通道接收的光的量的总和，对各通道上的串扰比例进行归一化，即为该荧光染料在各个通道上的分光比例；将每一单一荧光染料的串扰比例作为一个列向量，合并为一个矩阵，即为此荧光显微镜体系的串扰矩阵；取该串扰矩阵的逆矩阵，即为去串扰矩阵；将各通道的图像排成列向量，再将去串扰矩阵作用于各通道的图像排成的列向量，得到去串扰图像；各通道的顺序对应串扰矩阵各列的顺序。
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