CN111044498B - 一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统 - Google Patents

一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统 Download PDF

Info

Publication number
CN111044498B
CN111044498B CN201911365462.2A CN201911365462A CN111044498B CN 111044498 B CN111044498 B CN 111044498B CN 201911365462 A CN201911365462 A CN 201911365462A CN 111044498 B CN111044498 B CN 111044498B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescent
color
fluorescence
fluorescent probe
channel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911365462.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111044498A (zh
Inventor
黄振立
王钰洁
商明涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Huazhong University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong University of Science and Technology filed Critical Huazhong University of Science and Technology
Priority to CN201911365462.2A priority Critical patent/CN111044498B/zh
Publication of CN111044498A publication Critical patent/CN111044498A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111044498B publication Critical patent/CN111044498B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Abstract

本发明公开了一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统，属于超分辨定位成像领域，识别方法包括：控制生物结构中的荧光探针稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集稀疏荧光信号，对于每一个荧光信号区域，计算各颜色通道下的颜色响应率，并根据波长依赖的荧光响应率识别不同发射波长的荧光探针类型；成像方法包括：利用不同的荧光探针对生物结构进行标记；利用荧光探针识别方法识别荧光探针类型，同时确定荧光探针发光的中心位置；利用同样的方法，获得多幅已完成荧光探针识别与定位的荧光图像以重建得到生物结构的超分辨图像。本发明能够有效解决现有的超分辨定位成像方法中存在的光学系统复杂、后期数据处理困难的问题。

Description

一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统
技术领域
本发明属于超分辨定位成像领域，更具体地，涉及一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统。
背景技术
一直以来，光学显微镜的成像分辨率都受限于衍射极限，无法用于观察纳米尺度的生物结构或者蛋白质大分子的相互作用。直到20世纪90年代，科学家们发展了从本质上突破衍射极限的超分辨定位成像技术。超分辨定位成像技术利用荧光探针标记生物结构，然后用物理或化学的方法控制荧光探针稀疏发光，最后用弱光相机采集荧光探针信号，从而得到荧光图；重复采集几千甚至几万幅荧光图，利用定位算法从荧光探针的稀疏图像中获取所有荧光探针的空间位置信息，最终重建出具有纳米分辨率的生物结构的超分辨图像。
基于单分子定位的超分辨定位成像技术凭借其简单的成像系统和温和的成像条件在生物医学研究等领域得到了普遍的应用；为了提高实用性，科学家们提出了多色超分辨定位成像技术，使得在纳米尺度研究不同生物结构之间空间位置和功能的相互关系成为可能。
目前的多色超分辨定位成像方法一般是利用单色弱光相机实现的，由于现有的单色弱光相机不具有分辨颜色的能力，这些方法都会造成成像过程或成像质量的一些牺牲。其中，基于不同照明光源顺序激发的多色成像方法只能顺序采集不同的荧光探针，这就造成了成像时间的加倍，而且需要后续不同探针图像的配准；基于滤色片分光的多色成像利用分光镜将不同发射光谱荧光探针发出的混合荧光分为透射和反射光束分别探测，探测光路的数量必须跟荧光探针的数量匹配，增加了系统的复杂性，后期也需要进行不同探测光路图像的匹配；基于棱镜或光栅分光的多色成像利用光谱成像的原理，将复色的荧光信号按照波长在空间上展开，然后根据不同波长荧光信号的位置确定荧光探针的类别，这类方法能够同时成像多种荧光探针，但是需要在探测光路的合适位置加入棱镜或光栅，并且需要对两套数据进行处理(一套数据用于得到位置信息，另一套数据用于得到颜色信息)，同样增加了系统的复杂性和后期数据处理的困难。总的来说，现有的多色超分辨定位成像方法存在光学系统复杂，且后期数据处理困难的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷和改进需求，本发明提供了一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统，旨在解决现有的超分辨定位成像方法中存在的光学系统复杂、后期数据处理困难的问题。
为实现上述目的，按照本发明的第一方面，提供了一种荧光探针识别方法，包括：
(S1)控制由不同荧光探针标记的生物结构中的荧光探针稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集荧光探针信号，从而得到一幅荧光图像；
弱光彩色相机的感光元件包含黑白通道和颜色通道，黑白通道用于对荧光信号进行检测，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制；单个荧光探针在荧光图像中对应的荧光信号区域同时覆盖多个黑白通道和多个颜色通道，并且在单个荧光信号区域内，黑白通道均匀分布；
(S2)对于荧光图像中的每一个荧光信号区域，计算荧光信号在各颜色通道下的颜色响应率，并根据弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率识别不同发射波长的荧光探针类型；
其中，颜色响应率为该颜色通道相对于黑白通道的相对量子效率；波长依赖的荧光响应率为所述弱光彩色相机在不同波长下的颜色响应率。
本发明提供的荧光探针识别方法，通过颜色调制的方法同时识别多种荧光探针的类型，在此过程中无需额外增加光学器件，因此，本发明能够在不增加光学系统复杂性的情况下，同时识别被标记的生物结构中的多种荧光探针类型。
进一步地，对于任意一个荧光信号区域，计算荧光探针光信号在各通道下的颜色响应率，包括：
根据荧光信号区域内各通道(包括颜色通道和黑白通道)的光信号强度得到经过颜色调制后的点扩散函数PSF1；
根据点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2；
根据点扩散函数PSF1和点扩散函数PSF2计算荧光探针光信号在各通道下的颜色响应率；
根据弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率识别荧光探针类型。
本发明提供的荧光探针识别方法，利用弱光彩色相机颜色通道的感光元件对荧光信号的波长依赖响应，即在某个波长下，颜色通道感光元件的响应与黑白通道感光元件的响应存在一个比例关系，并通过不同波长下通道响应比例关系的不同识别发射波长分布不同的荧光探针类型。因此，本发明仅通过颜色调制就能够同时识别多种荧光探针的类别。
进一步地，波长以来的荧光响应率的获取方法包括：
(S21)利用已知发射波长的单色荧光探针对生物结构进行标记；
(S22)控制单色荧光探针进行稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集单色荧光探针信号，从而得到一幅单色荧光图像；
(S23)对于单色荧光图像中的每一个荧光信号区域，计算荧光信号在各通道下的颜色响应率，从而得到该荧光探针所对应的颜色响应率特征；
(S24)对于用于标记生物结构的每一种荧光探针，分别执行步骤(S21)～(S23)，以得到每一种荧光探针在彩色相机中各通道下的颜色响应率，从而得到波长依赖的荧光响应率。
本发明所提供的荧光探针识别方法，在识别荧光探针类型之前，对用于标记生物结构的荧光探针分别进行单色成像，得到不同种类荧光探针对应的通道响应率；在识别荧光探针类型的过程中，获得荧光探针的通道响应率之后，与各种荧光探针所对应的通道响应率进行比对，即可确定荧光探针的类型。
进一步地，根据点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2，包括：
通过感光元件的通道分布提取出黑白通道的信号；
基于黑白通道的信号分布进行拟合得到点扩散函数PSF2的参数；
依据所得参数得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2。
进一步地，在探测波长范围内，颜色通道在不同波长下具有不同的颜色响应率。
本发明所提供的荧光探针识别方法，所使用的弱光彩色相机中，颜色通道在不同波长下具有不同的响应比例，因此在识别荧光探针类型的过程中，能够较为准确地识别不同类型的荧光探针。
进一步地，颜色通道具体包括：红色通道、绿色通道、蓝色通道和近红外通道。
按照本发明的第二方面，提供了一种基于本发明第一方面提供的荧光探针识别方法的多色超分辨定位成像方法，包括：
(T1)利用不同的荧光探针对生物结构进行标记；
(T2)执行步骤(S1)～(S2)，以识别荧光探针类型，在识别荧光探针类型的同时确定荧光探针发光的中心位置，以完成荧光探针的定位；
(T3)重复执行步骤(T2)多次，以获得多幅荧光图像，同时识别各荧光探针的类别并定位；
(T4)利用已完成荧光探针识别与定位的多幅荧光图像重建得到所述生物结构的超分辨图像。
本发明所提供的多色超分辨定位成像方法，通过颜色调制的方式完成不同荧光探针的识别，无需额外增加光学器件，并在识别荧光探针类型的同时实现荧光探针定位。因此，本发明能够在不增加光学系统复杂性，也不增加成像时间的情况下，实现多色超分辨定位成像，从而有效解决现有的超分辨定位成像方法中存在的光学系统复杂、后期数据处理困难的问题。
进一步地，对于任意一个荧光信号区域，确定荧光探针发光的中心位置，包括：
根据荧光信号区域内各通道的光信号强度得到经过颜色调制后的点扩散函数PSF1；
根据点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2；
根据点扩散函数PSF2确定荧光信号区域内光信号强度最大的位置，将该位置确定为荧光探针发光的中心位置，从而完成荧光探针的定位。
本发明提供的多色超分辨定位成像方法，利用一幅荧光图像即可对多种荧光探针成像，同时完成荧光探针的定位，因此，本发明相对于其他多色超分辨定位成像，能够明显简化成像和数据处理的过程，缩短成像时间，并且相对于单色超分辨定位成像，不会增加成像时间。
按照本发明的第三方面，提供了一种多色超分辨定位成像系统，包括：标记模块、荧光图像采集模块、荧光探针识别模块、荧光探针定位模块、超分辨重建模块以及弱光彩色相机；
弱光彩色相机用于采集荧光探针信号强度，以得到荧光图像；弱光彩色相机的感光元件包含黑白通道和颜色通道，黑白通道用于对荧光信号进行检测，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制；单个荧光探针在荧光图像中对应的荧光信号区域同时覆盖多个黑白通道和多个颜色通道，并且在单个荧光信号区域内，黑白通道均匀分布；
标记模块，用于利用不同的荧光探针对生物结构进行标记；
荧光图像采集模块，用于被标记的生物结构中的荧光探针稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集稀疏荧光信号，从而得到一幅荧光图像；
荧光探针识别模块，用于计算荧光信号区域内荧光探针光信号在各通道下的颜色响应比，并根据弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率识别不同发射波长的荧光探针类型；
荧光探针定位模块，用于确定荧光信号区域内荧光探针发光的中心位置，从而完成荧光探针的定位；
超分辨重建模块，用于根据多幅已完成荧光探针识别和定位的荧光图像，重建得到生物结构的超分辨图像；
其中，颜色响应率为该颜色通道相对于黑白通道的相对量子效率；波长依赖的荧光响应率为所述弱光彩色相机在不同波长下的颜色响应率。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案，在荧光探针识别过程中无需额外增加光学器件，而是通过颜色调制的方法同时对多种荧光探针进行成像，并在识别荧光探针类型的同时实现荧光探针定位，因此，本发明能够在不增加光学系统复杂性，也不增加成像时间的情况下，实现多色超分辨定位成像，从而有效解决现有的超分辨定位成像方法中存在的光学系统复杂、后期数据处理困难的问题。
附图说明
图1为本发明实施例提供的弱光彩色相机中黑白通道与颜色通道排布的局部示意图；
图2为本发明实施例提供的不同颜色通道对应的通道响应比例示意图；
图3为本发明实施例提供的经弱光彩色相机颜色调制的单分子图像；
图4为本发明实施例提供的多色超分辨定位成像方法示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
在本发明中，本发明及附图中的术语“第一”、“第二”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。
在详细解释本发明的技术方案之前，先对本发明中所使用的弱光彩色相机进行简单介绍。
在荧光成像领域，单分子的荧光信号通常在几百至几千个光子，并且要覆盖多个像素，所以单个像素探测到的光可能只能几个到几百个光子，所以称之弱光。一般情况下，弱光探测器量子效率较高且噪声要控制地很低才能保证灵敏度足够探测如此低的信号。
不同于传统的弱光单色相机，本发明中，弱光彩色相机具有颜色分辨能力，具体地，弱光彩色相机的感光元件包含黑白通道和颜色通道，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制；单个荧光探针在荧光图像中对应的荧光信号区域同时覆盖多个黑白通道和多个颜色通道，并且在单个荧光信号区域内，黑白通道均匀分布，黑白通道用于用于对荧光信号进行检测，并定位获取单个荧光探针的位置信息，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制，并识别单个荧光探针的类型；通常情况下，每个通道用于探测一个像素的光强信息；弱光彩色相机中，不同颜色通道的感光元件对荧光信号的波长依赖响应不同；在某个波长下，颜色通道感光元件的响应与黑白通道感光元件的响应存在一个比例关系，通过不同波长下通道响应比例关系的不同即可识别发射波长分布不同的分子类型；在本发明中，引入了颜色响应率和波长依赖的荧光响应率的概念，颜色响应率为该颜色通道相对于黑白通道的相对量子效率；波长依赖的荧光响应率为所述弱光彩色相机在不同波长下的颜色响应率；
为了便于区分不同类型的荧光探针，在探测波长范围内，颜色通道在不同波长下具有不同的颜色响应率，以保证能够准确识别荧光探针的类型；
图1所示为一种黑白通道(W)与颜色通道排布的局部示意图，其中颜色通道具体包括：红色通道(R)、绿色通道(G)、蓝色通道(B)和近红外通道(NIR)；在图(1)所示的局部结构的大小为4×4，其中，黑白通道均匀分布，颜色通道也均匀分布，具体地，第一行通道的排布具体为R-W-G-W，第二行通道的排布具体为W-NIR-W-NIR，第三行通道的排布具体为G-W-B-W，第四行通道的排布具体为W-NIR-W-NIR；
不同波长下各颜色通道的颜色响应率(该通道相对于黑白通道的相对量子效率)如图2所示；
应当理解的是，上述通道排布示意图仅为示例性的描述，不应理解为对本发明的唯一限定。
基于图2所示的各颜色通道的颜色件响应率，可以得到单分子信号分布图像如图3所示。
基于上述弱光彩色相机，本发明所提供的荧光探针识别方法，包括：
(S1)控制由不同荧光探针标记的生物结构中的荧光探针稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集荧光探针信号，从而得到一幅荧光图像；
弱光彩色相机的感光元件包含黑白通道和颜色通道，黑白通道用于对荧光信号进行检测，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制；单个荧光探针在荧光图像中对应的荧光信号区域同时覆盖多个黑白通道和多个颜色通道，并且在单个荧光信号区域内，黑白通道均匀分布；
(S2)对于荧光图像中的每一个荧光信号区域，计算荧光探针信号在各通道下的颜色响应率，并根据弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率识别荧光探针类型；
其中，通道的颜色响应率为该通道相对于黑白通道的相对量子效率；波长依赖的荧光响应率为所述弱光彩色相机在不同波长下的颜色响应率。
在一个可选的实施方式中，对于任意一个荧光信号区域，计算荧光探针光信号在各通道(包括颜色通道和黑白通道)下的响应比例，包括：
根据荧光信号区域内各通道的光信号强度得到经过颜色调制后的点扩散函数PSF1；点扩散函数的模型是已知的，获取强度等参数后，即可得到相应的点扩散函数；
根据点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2；
根据点扩散函数PSF1和点扩散函数PSF2计算荧光探针光信号在各通道下的响应比例；
根据弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率特征来确定荧光信号的波长范围，从而识别荧光探针类型；
可选地，荧光波长与通道响应比例的对应关系的获取方法包括：
(S21)利用已知发射波长的单色荧光探针对生物结构进行标记；
(S22)控制单色荧光探针控制荧光探针稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集单色荧光探针信号，从而得到一幅单色荧光图像；
(S23)对于单色荧光图像中的每一个荧光信号区域，计算单色荧光探针光信号在各通道下的颜色响应率，从而得到该荧光探针所对应的颜色响应率特征；
(S24)对于用于标记生物结构的每一种荧光探针，分别执行步骤(S21)～(S23)，以得到每一种荧光探针的波长与通道响应比例的对应关系，从而得到波长依赖的荧光响应率；
可选地，根据点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2，包括：
通过感光元件的通道分布提取出黑白通道的信号；
基于黑白通道的信号分布进行拟合得到点扩散函数PSF2的参数；
依据所得参数得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2。基于上述荧光探针识别方法，本发明提供的多色超分辨定位成像方法，如图4所示，包括：
(T1)利用不同的荧光探针对生物结构进行标记；
(T2)执行步骤(S1)～(S2)，以识别荧光探针类型，在识别荧光探针类型的同时确定荧光探针发光的中心位置，以完成荧光探针的定位；
在一个可选的实施方式中，对于任意一个荧光信号区域，确定荧光探针发光的中心位置，包括：
根据荧光信号区域内各通道的光信号强度得到经过颜色调制后的点扩散函数PSF1；
根据点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2；
根据点扩散函数PSF2确定荧光信号区域内光信号强度最大的位置，将该位置确定为荧光探针发光的中心位置，从而完成荧光探针的定位；
(T3)重复执行步骤(T2)多次，以获得多幅荧光图像，同时识别各荧光探针的类别并定位；具体获取荧光图像的数量，即步骤(T2)的重复执行次数，可根据超分辨重建需求确定，通常情况下，为几千甚至几万幅；
(T4)利用已完成荧光探针识别与定位的多幅荧光图像重建得到所述生物结构的超分辨图像。
上述多色超分辨定位成像方法，在成像过程中无需额外增加光学器件，而是通过颜色调制的方法同时对多种荧光探针进行成像，并在识别荧光探针类型的同时实现荧光探针定位，因此，上述多色超分辨定位成像方法不会增加光学系统的复杂性，相对于其他多色超分辨定位成像，能够明显简化成像和数据处理的过程，缩短成像时间，并且相对于单色超分辨定位成像，不会增加成像时间。总的来说，上述多色超分辨定位成像方法，能够在不增加光学系统复杂性，也不增加成像时间的情况下，实现多色超分辨定位成像，从而有效解决现有的超分辨定位成像方法中存在的光学系统复杂、后期数据处理困难的问题。
本发明还提供了一种多色超分辨定位成像系统，包括：标记模块、荧光图像采集模块、荧光探针识别模块、荧光探针定位模块、超分辨重建模块以及弱光彩色相机；
弱光彩色相机用于采集荧光探针信号，以得到荧光图像；弱光彩色相机的感光元件包含黑白通道和颜色通道，黑白通道用于对荧光信号进行检测，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制；单个荧光探针在荧光图像中对应的荧光信号区域同时覆盖多个黑白通道和多个颜色通道，并且在单个荧光信号区域内，黑白通道均匀分布；
标记模块，用于利用不同的荧光探针对生物结构进行标记；
荧光图像采集模块，用于控制被标记的生物结构中的荧光探针稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集稀疏荧光信号，从而得到一幅荧光图像；
荧光探针识别模块，用于计算荧光信号区域内荧光探针光信号在各通道下的颜色响应率，并根据所述弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率识别不同发射波长的荧光探针类型；
荧光探针定位模块，用于确定荧光信号区域内荧光探针发光的中心位置，从而完成荧光探针的定位；
超分辨重建模块，用于根据多幅已完成荧光探针识别和定位的荧光图像，重建得到生物结构的超分辨图像；
其中，颜色响应率为该颜色通道相对于黑白通道的相对量子效率；波长依赖的荧光响应率为所述弱光彩色相机在不同波长下的颜色响应率；
在本发明实施例中，各模块的具体实施方式可参考上述方法实施例中的描述，在此将不作复述。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种荧光探针识别方法，其特征在于，包括：
(S1)控制由不同荧光探针标记的生物结构中的荧光探针稀疏发光，并利用弱光彩色相机采集稀疏荧光信号，从而得到一幅荧光图像；
所述弱光彩色相机的感光元件包含黑白通道和颜色通道，黑白通道用于对荧光信号进行检测，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制；单个荧光探针在所述荧光图像中对应的荧光信号区域同时覆盖多个黑白通道和多个颜色通道，并且在单个荧光信号区域内，黑白通道均匀分布；
(S2)对于所述荧光图像中的每一个荧光信号区域，计算荧光信号在各颜色通道下的颜色响应率，并根据所述弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率识别不同发射波长的荧光探针类型；
其中，颜色响应率为该颜色通道相对于黑白通道的相对量子效率；波长依赖的荧光响应率为所述弱光彩色相机在不同波长下的颜色响应率；
对于任意一个荧光信号区域，计算荧光信号在各通道下的颜色响应率，包括：
根据荧光信号区域内各通道的信号强度得到经过颜色调制后的点扩散函数PSF1；
根据所述点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2；
根据所述点扩散函数PSF1和所述点扩散函数PSF2计算荧光信号在各颜色通道下的颜色响应率；
根据所述弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率特征来确定荧光信号的波长范围，从而识别荧光探针类型；
波长依赖的荧光响应率的获取方法包括：
(S21)利用已知发射波长的单色荧光探针对生物结构进行标记；
(S22)控制单色荧光探针进行稀疏发光，并利用所述弱光彩色相机采集单色荧光探针信号，从而得到一幅单色荧光图像；
(S23)对于单色荧光图像中的每一个荧光信号区域，计算荧光信号在各颜色通道下的颜色响应率，从而得到该荧光探针所对应的颜色响应率特征；
(S24)对于用于标记生物结构的每一种荧光探针，分别执行步骤(S21)～(S23)，以得到每一种荧光探针在各颜色通道下的颜色响应率，从而得到波长依赖的荧光响应率。
2.如权利要求1所述的荧光探针识别方法，其特征在于，根据所述点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2，包括：
通过感光元件的通道分布提取出黑白通道的信号；
基于黑白通道的信号分布进行拟合得到点扩散函数PSF2的参数；
依据所得参数得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2。
3.如权利要求1或2所述的荧光探针识别方法，其特征在于，在探测波长范围内，颜色通道在不同波长下具有不同的颜色响应率。
4.如权利要求3所述的荧光探针识别方法，其特征在于，颜色通道具体包括：红色通道、绿色通道、蓝色通道和近红外通道。
5.一种基于权利要求1-4任一项所述的荧光探针识别方法的多色超分辨定位成像方法，其特征在于，包括：
(T1)利用不同的荧光探针对生物结构进行标记；
(T2)执行步骤(S1)～(S2)，以识别荧光探针类型，在识别荧光探针类型的同时确定荧光探针发光的中心位置，以完成荧光探针的定位；
(T3)重复执行步骤(T2)多次，以获得多幅荧光图像，同时识别各荧光探针的类别并定位；
(T4)利用已完成荧光探针识别与定位的多幅荧光图像重建得到所述生物结构的超分辨图像。
6.如权利要求5所述的多色超分辨定位成像方法，其特征在于，对于任意一个荧光信号区域，确定荧光探针发光的中心位置，包括：
根据荧光信号区域内各通道的光信号强度得到经过颜色调制后的点扩散函数PSF1；
根据所述点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2；
根据所述点扩散函数PSF2确定荧光信号区域内光信号强度最大的位置，将该位置确定为荧光探针发光的中心位置，从而完成荧光探针的定位。
7.一种多色超分辨定位成像系统，其特征在于，包括：标记模块、荧光图像采集模块、荧光探针识别模块、荧光探针定位模块、超分辨重建模块以及弱光彩色相机；
所述弱光彩色相机用于采集荧光探针信号，以得到荧光图像；所述弱光彩色相机的感光元件包含黑白通道和颜色通道，黑白通道用于对荧光信号进行检测，颜色通道用于对荧光信号进行相应的颜色调制；单个荧光探针在所述荧光图像中对应的荧光信号区域同时覆盖多个黑白通道和多个颜色通道，并且在单个荧光信号区域内，黑白通道均匀分布；
所述标记模块，用于利用不同的荧光探针对生物结构进行标记；
所述荧光图像采集模块，用于控制被标记的生物结构中的荧光探针稀疏发光，并利用所述弱光彩色相机采集稀疏荧光信号，从而得到一幅荧光图像；
所述荧光探针识别模块，用于计算荧光信号区域内荧光探针光信号在各通道下的颜色响应率，并根据所述弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率识别不同发射波长的荧光探针类型；
所述荧光探针定位模块，用于确定荧光信号区域内荧光探针发光的中心位置，从而完成荧光探针的定位；
所述超分辨重建模块，用于根据多幅已完成荧光探针识别和定位的荧光图像，重建得到所述生物结构的超分辨图像；
其中，颜色响应率为该颜色通道相对于黑白通道的相对量子效率；波长依赖的荧光响应率为所述弱光彩色相机在不同波长下的颜色响应率；
所述荧光探针识别模块计算荧光信号区域内荧光探针光信号在各通道下的颜色响应率，包括：根据荧光信号区域内各通道的信号强度得到经过颜色调制后的点扩散函数PSF1；根据所述点扩散函数PSF1拟合得到未经颜色调制的点扩散函数PSF2；根据所述点扩散函数PSF1和所述点扩散函数PSF2计算荧光信号在各颜色通道下的颜色响应率；根据所述弱光彩色相机的波长依赖的荧光响应率特征来确定荧光信号的波长范围，从而识别荧光探针类型；
波长依赖的荧光响应率的获取方法包括：
(S21)利用已知发射波长的单色荧光探针对生物结构进行标记；
(S22)控制单色荧光探针进行稀疏发光，并利用所述弱光彩色相机采集单色荧光探针信号，从而得到一幅单色荧光图像；
(S23)对于单色荧光图像中的每一个荧光信号区域，计算荧光信号在各颜色通道下的颜色响应率，从而得到该荧光探针所对应的颜色响应率特征；
(S24)对于用于标记生物结构的每一种荧光探针，分别执行步骤(S21)～(S23)，以得到每一种荧光探针在各颜色通道下的颜色响应率，从而得到波长依赖的荧光响应率。
CN201911365462.2A 2019-12-26 2019-12-26 一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统 Active CN111044498B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911365462.2A CN111044498B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911365462.2A CN111044498B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111044498A CN111044498A (zh) 2020-04-21
CN111044498B true CN111044498B (zh) 2021-05-18

Family

ID=70240227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911365462.2A Active CN111044498B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111044498B (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999050648A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-07 Packard Instrument Company, Inc. Improvements in and relating to biomedical assays
WO2003046208A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Mj Bioworks Incorporated Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
EP2451487A1 (en) * 2009-07-09 2012-05-16 F. Hoffmann-La Roche AG In vivi tumor vasculature imaging
CN102288589B (zh) * 2011-06-23 2013-05-08 深圳大学 单个荧光探针的定位方法、装置及超分辨成像方法、系统
CN104062272B (zh) * 2014-04-08 2016-08-17 华中科技大学 一种适用于高速连续超分辨定位成像方法及系统
WO2017174998A1 (en) * 2016-04-06 2017-10-12 The University Court Of The University Of Edinburgh Endoscopic imaging apparatus and method

Also Published As

Publication number Publication date
CN111044498A (zh) 2020-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11307398B2 (en) Method for generating and analyzing an overview contrast image
US9286504B2 (en) Methods and systems for image data processing
AU2008261935B2 (en) Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods
US9569828B2 (en) Method and apparatus for the imaging of a labeled biological sample
US20230257807A1 (en) Efficient nucleic acid testing and gene sequencing method
US20210199585A1 (en) Fluorescence observation apparatus and fluorescence observation method
US10900902B2 (en) Method for simultaneous spectrally resolved detection or imaging of items in multiple flowing streams
CA2445960A1 (en) Method and apparatus for labeling and analyzing cellular components
JP2005526255A (ja) 試料検査のための方法および装置
JP2006138875A (ja) 照明された試料の波長に依存する特徴的な特性値を光学的に把握するための方法および装置構成
WO2005036143A1 (ja) 蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム
CN108139578A (zh) 分辨至少两个光谱范围的高分辨率扫描显微术
US8817115B1 (en) Spatial alignment of image data from a multichannel detector using a reference image
Jeffet et al. Multimodal single-molecule microscopy with continuously controlled spectral resolution
JPH11211668A (ja) 欠陥検査方法および欠陥検査装置
CN111044498B (zh) 一种荧光探针识别方法、多色超分辨定位成像方法及系统
Dimitriadis et al. Spectral and temporal multiplexing for multispectral fluorescence and reflectance imaging using two color sensors
SE537103C2 (sv) System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer
US20240035971A1 (en) System and method for fluorescence lifetime imaging
US20230417671A1 (en) Biological sample analysis system, information processing device, information processing method, and biological sample analysis method
KR20130042791A (ko) 형광 영상을 촬영하는 장치 및 방법
Di Caprio et al. Hyperspectral microscopy of flowing cells
CN112379242A (zh) 芯片失效点定位方法、装置及系统
WO2022249583A1 (ja) 情報処理装置、生体試料観察システム及び画像生成方法
US11971355B2 (en) Fluorescence observation apparatus and fluorescence observation method

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant