WO2005036143A1 - 蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム - Google Patents

蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム Download PDF

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Kazuji Matsumoto
Masahiko Hirano
Masahiro Hara
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Hamamatsu Photonics K.K.
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Definitions

  • the present invention relates to quantification of the concentration of a fluorescent dye contained in a sample.
  • a filter set including a dichroic filter and a bandpass filter according to a fluorescent dye is used.
  • one filter set can be fixedly used.
  • two or more fluorescent dyes it is necessary to replace and use multiple filter sets during sample measurement.
  • Replacing the filter set changes the optical system slightly, which affects the accuracy of the quantification.
  • replacement of the filter set causes a difference in measurement time between different fluorescent dyes. This is not preferred for measuring live samples.
  • the above method has a point to be improved in terms of quantitative accuracy. If the peak wavelengths of multiple fluorescent dyes included in the sample are close to each other, the tails of the multiple fluorescent spectra overlap. In this case, even if a band-pass filter is used, it is not possible to extract only the wavelength component corresponding to a single fluorescent dye, and the fluorescent component passing through the filter is mixed with the wavelength component of another fluorescent dye. I will. This reduces the accuracy of the quantification of the fluorescent dye. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to accurately quantify the concentrations of a plurality of fluorescent dyes.
  • the present invention relates to a method for quantifying the concentration of a fluorescent dye in a sample.
  • the concentration of the first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye contained in the target sample is changed to the first-first-k-th (k is an integer of 2 or more) detection wavelength band.
  • Quantification is performed using an imaging device provided. Adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • a first-first m-th reference sample containing each of the first-first m-th fluorescent dye alone at a predetermined unit concentration is prepared, and the intensity of fluorescence emitted from each reference sample in each detection wavelength band is measured. Get.
  • a fluorescent image of the target sample is imaged in each detection wavelength band using an imaging device. Thereafter, the calculation represented by the following equation is executed to calculate the concentration c-c of the first-first m-th fluorescent dye at a certain site of the target sample.
  • J is a matrix of k X m, and the i-th row and j-th column component J of J (i is an integer of 1 or more and k or less, j is an integer of 1 or more and m or less) is the number of the fluorescence emitted from the j-th reference sample. i This is the measured intensity in the detection wavelength band.
  • the above-described imaging device may include a multi-band camera having the first to k-th detection wavelength bands.
  • the fluorescence image of each reference sample is imaged in each detection wavelength band using the multi-band camera, and the part of each reference sample that emits fluorescence is acquired. May be obtained from each fluorescence image. Concentration of the 1st-1st m-th fluorescent dye c
  • the value of the pixel obtained from the fluorescence image of the sample may be used as the component j of the system.
  • the fluorescence intensity of both the reference sample and the target sample can be measured using the same multi-band camera. Therefore, the concentration of the fluorescent dye can be easily determined.
  • the imaging device may include a multi-band camera having the first to k-th detection wavelength bands.
  • the spectral intensity of the fluorescence emitted from each reference sample is measured using a spectrometer, and the spectral intensity and each detection wavelength band of the multi-band camera are measured.
  • the measurement intensity of the fluorescence emitted from each reference sample in each detection wavelength band may be calculated.
  • the measurement intensity of the fluorescence emitted from the reference sample in each detection wavelength band can be obtained using a spectroscope instead of directly using an imaging device.
  • the present invention relates to a method for quantifying the concentration of a first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye contained in a target sample using an imaging device.
  • the imaging device has different first-to-first k-th (k is an integer of 2 or more) detection wavelength bands and first-first-q (q is an integer of 2 or more) sensitivity modes for setting different sensitivity characteristics of the imaging device And Adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • a first-first m-th reference sample containing each of the first-first m-th fluorescent dye alone at a predetermined unit concentration is prepared, and each detection wavelength band and each sensitivity mode of fluorescence emitted from each reference sample are prepared. Get the measured intensity at.
  • a fluorescence image of the target sample is captured in each detection wavelength band and each sensitivity mode using an imaging device. Thereafter, the calculation represented by the following equation is executed to obtain the concentration c of the first-first m-th fluorescent dye at a certain site of the target sample c
  • P (v is an integer of 1 or more and q or less) is a matrix of kX1
  • the i-th row component P of P (i is an integer of 1 or more and k or less) is the i-th row component using the imaging device.
  • J is a matrix of (k 'q) X m
  • the i-th row component L of the component matrix L of J (j is an integer from 1 to m) is the i-th detection wavelength band of the fluorescence that also emits the j-th reference sample force.
  • the measured intensity in the Vth sensitivity mode is a matrix of kX1
  • the above calculation formula is not affected by the overlap of the fluorescence spectra of a plurality of fluorescent dyes contained in the target sample. Therefore, according to this quantification method, the concentrations of a plurality of fluorescent dyes having overlapping fluorescent spectra can be determined with high accuracy.
  • the number of fluorescent dyes that can be quantified by this method is (number of detection wavelength bands) X (number of sensitivity modes). Therefore, the number of fluorescent dyes that can be quantified can be increased according to the number of sensitivity modes.
  • the present invention provides a method for measuring the concentration of a first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye contained in a target sample by different first-first k-th (k is 2 or more) Quantitation using an imaging device having a detection wavelength band of (integer). Adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • a first m-th reference sample containing each of the first m-th fluorescent dye alone at a predetermined unit concentration is prepared, and a first-first m-th fluorescent dye having a different wavelength spectrum is prepared.
  • each of the first-first r-th (r is an integer of 2 or more) excitation light to the first-first m-th reference sample, and measure the intensity of fluorescence emitted from each reference sample in each detection wavelength band. To get.
  • the target sample is irradiated with each excitation light, and a fluorescent image of the target sample is captured in each detection wavelength band using an imaging device. After that, the calculation represented by the following equation is executed to calculate the concentration c of the first-first m-th fluorescent dye at a certain site of the target sample.
  • Q u (u is an integer of 1 or more and r or less) is a matrix of k X 1
  • the i-th row component of Q (i is an integer of 1 or more and k or less) is used for irradiation of the u-th excitation light. Accordingly, it is the value of the pixel corresponding to the above site in the fluorescence image of the target sample imaged in the i-th detection wavelength band.
  • the above equation is not affected by the overlap of the fluorescence spectra of a plurality of fluorescent dyes contained in the target sample. Therefore, according to this quantification method, the concentrations of a plurality of fluorescent dyes having overlapping fluorescent spectra can be determined with high accuracy.
  • the number of fluorescent dyes that can be quantified by this method is (the number of detection wavelength bands) X (the number of types of excitation light). Therefore, the number of quantifiable fluorescent dyes can be increased according to the number of types of excitation light.
  • the imaging device converts the fluorescence image of the target sample into the first to k-th images.
  • the image processing apparatus may include one or more image sensors that generate an image signal in the detection wavelength band to generate the first-first k-th image signal, and an arithmetic circuit that receives the first-first k-th image signal.
  • the calculation circuit calculates the density c-c of the first-first m-th fluorescent pixel using the first-first k-th image signal.
  • the arithmetic circuit calculates the concentrations c-c at a plurality of portions of the target sample, and expresses the concentration distribution of the first to m-th fluorescent dyes.
  • the method may further include generating the first-first m-th image signal.
  • the imaging device calculates the concentration of the fluorescent dye using the fluorescence image signal of the target sample obtained by itself, and generates an image signal representing the concentration distribution. Therefore, this quantification method can promptly present quantification results.
  • the present invention relates to a system for quantifying the concentration of a first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye contained in a target sample.
  • This system includes a photodetector, an imaging device, and an arithmetic device.
  • the photodetector detects the fluorescence emitted from each of the first-first m-th reference samples containing each of the first-first m-th fluorescent dye alone at a predetermined unit concentration, and measures the intensity of the fluorescence.
  • the imaging device has different first to first k (k is an integer of 2 or more) detection wavelength bands, and captures a fluorescence image of the target sample in each detection wavelength band. Adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • the arithmetic unit calculates the concentration c-c of the first-first m-th fluorescent dye at a certain site of the target sample by executing the calculation represented by the following equation:
  • O-1 O is the fluorescence image of the target sample imaged at the 1st-1kth detection wavelength band.
  • J is a matrix of k X m
  • the i-th row and j-th column component J of J (i is an integer of 1 or more and k or less, j is an integer of 1 or more and m or less) is a j-th element measured by the photodetector. It is the intensity in the i-th detection wavelength band of the fluorescence that also emits the reference sample force.
  • the above equation is not affected by the overlap of the fluorescence spectra of a plurality of fluorescent dyes contained in the target sample. For this reason, according to this quantification system, the concentrations of a plurality of fluorescent dyes having overlapping fluorescent spectra can be accurately determined.
  • the photodetector and the imaging device may be a multiband camera having a first-first k-th (k is an integer of 2 or more) detection wavelength band.
  • the photodetector may capture a fluorescence image of each reference sample in each detection wavelength band, and acquire a value of a pixel indicating a part of each reference sample that emits fluorescence from each fluorescence image card.
  • the arithmetic device may use the value of the pixel acquired from the fluorescence image of the j-th reference sample captured in the i-th detection wavelength band as the component J of the matrix. In this case, the fluorescence intensity of both the reference sample and the target sample can be measured using the same multi-band camera. Therefore, the concentration of the fluorescent dye can be easily determined.
  • the photodetector may include a spectrometer that measures the spectral intensity of the fluorescence emitted from each reference sample.
  • the imaging device may include a multi-band camera having the first-first to k-th detection wavelength bands.
  • the arithmetic unit calculates the intensity of the fluorescence emitted from each reference sample in each detection wavelength band using the spectral intensity measured by the spectrometer and the sensitivity characteristics of the multi-band camera for each detection wavelength band. May be used as a component of the system IJ [[. As described above, the measurement intensity in each detection wavelength band of the fluorescence emitted from the reference sample can be obtained using a spectroscope instead of directly using the imaging device.
  • the present invention relates to a system for quantifying the concentration of a first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye contained in a target sample.
  • This system includes a photodetector, an imaging device, and an arithmetic device.
  • the photodetector detects the fluorescence emitted from each of the first-first m-th reference samples that individually includes each of the first-first m-th fluorescent dyes at a predetermined unit concentration, and measures the intensity of the fluorescence.
  • the imaging device has different 1st-1st k (k is an integer of 2 or more) detection wavelength bands and 1st-1st q (q is an integer of 2 or more) sensitivity modes for setting different sensitivity characteristics of the imaging device. And Adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • This imaging device captures a fluorescence image of a target sample in each detection wavelength band and each sensitivity characteristic.
  • the calculation device executes the calculation represented by the following formula to calculate the concentration c of the first-first m-th fluorescent dye at a certain site of the target sample.
  • P (v is an integer of 1 or more and q or less) is a matrix of kX1
  • the i-th row component P of P (i is an integer of 1 or more and k or less) is the i-th detection wavelength band and the This is the value of the pixel corresponding to the above site in the fluorescence image of the target sample captured in the V sensitivity mode.
  • J is a matrix of (k 'q) X m
  • the i-th row component L of J's component matrix L (j is an integer from 1 to m) is the j-th reference sample
  • the above formula is not affected by the overlap of the fluorescence spectra of a plurality of fluorescent dyes contained in the target sample. For this reason, according to this quantification system, the concentrations of a plurality of fluorescent dyes having overlapping fluorescent spectra can be accurately determined.
  • the number of fluorescent dyes that can be quantified by this system is (number of detection wavelength bands) X (number of sensitivity modes). Therefore, the number of quantifiable fluorescent dyes can be increased according to the number of sensitivity modes.
  • the present invention relates to a system for quantifying the concentration of a first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye contained in a target sample.
  • This system includes a light source, a light detector, an imaging device, and an arithmetic device.
  • the light source generates a first-first r-th (r is an integer of 2 or more) excitation light having different wavelengths and exciting all the first-first m-th fluorescent dyes.
  • the photodetector detects the intensity of the fluorescence emitted from each reference sample in response to the irradiation of each excitation light to the first-first m-th reference sample containing each of the first-first m-th fluorescent dye alone at a predetermined unit concentration. Measure.
  • the imaging device has different first-to-first k (k is an integer of 2 or more) detected wavelength bands. Adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • the imaging device is The fluorescence image of the target sample is captured in each detection wavelength band in response to the irradiation of each excitation light to one get sample.
  • the calculation device executes the calculation represented by the following equation to calculate the concentration c1 c of the first-first m-th fluorescent dye at a certain site of the target sample.
  • Q u (u is an integer of 1 or more and r or less) is a matrix of kX1
  • the i-th row component Q of Q u (i is an integer of 1 or more and k or less) is irradiated with the u-th excitation light.
  • I the value of the pixel corresponding to the above site in the fluorescence image of the target sample imaged in the i-th detection wavelength band in accordance with.
  • the above calculation formula is not affected by the overlap of the fluorescence spectra of a plurality of fluorescent dyes contained in the target sample. For this reason, according to this quantification system, the concentrations of a plurality of fluorescent dyes having overlapping fluorescent spectra can be accurately determined.
  • the number of fluorescent dyes that can be quantified by this system is (number of detection wavelength bands) X (number of types of excitation light). Therefore, the number of fluorescent dyes that can be quantified can be increased according to the number of types of excitation light.
  • the imaging device includes one or more imaging elements that capture the fluorescence image of the target sample in the first to kth detection wavelength bands and generate the first to kth image signals. And an arithmetic circuit as the arithmetic device described above.
  • the first-first k-th image signal is input to this arithmetic circuit.
  • the arithmetic circuit executes an arithmetic operation using the first-first to k-th image signals, calculates the concentrations c-c at a plurality of portions of the target sample, and calculates the first-first to m-th images.
  • a first-m-th image signal representing the concentration distribution of the fluorescent dye may be generated.
  • the imaging device calculates the concentration of the fluorescent dye using the fluorescence image signal of the target sample obtained by itself, and generates an image signal representing the concentration distribution. Therefore, this quantification system can promptly present quantification results.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a configuration of an example of a fluorescent dye quantification system.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a procedure for quantifying the concentration of a fluorescent dye.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining a second stage of quantification.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of a method of expressing a quantitative result.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a method of expressing a quantitative result.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a method of expressing a quantitative result.
  • FIG. 7 is a block diagram showing a configuration of another example of a fluorescent dye quantification system.
  • FIG. 8 is a diagram showing the relationship between the Ca 2+ concentration and the fluorescence intensity ratio.
  • FIG. 9 is a diagram showing sensitivity characteristics of a three-band camera.
  • FIG. 10 is a diagram showing spectral data obtained from a target sample in which AlexaFluor and Cascade Yellow are mixed.
  • FIG. 11 is a diagram showing spectroscopic data obtained from a target sample in which Fura2 and CascadeYellow are mixed.
  • FIG. 12 is a diagram showing spectral data measured through a band-pass filter from a target sample in which AlexaFluor and Cascade Yellow are mixed.
  • FIG. 13 is a diagram showing spectroscopic data obtained through a bandpass filter from a target sample in which Fura2 and CascadeYellow are mixed.
  • FIG. 14 is a graph showing the concentrations of Alexa Fluor and Cascade Yellow calculated in the first and second examples.
  • FIG. 15 shows Alexa Fluor and Cascade calculated in the third example and the comparative example. It is a figure which shows the density of Yellow.
  • FIG. 16 is a diagram showing the concentrations of Fura2 and Cascade Yellow calculated in the first and second examples.
  • FIG. 17 is a diagram showing the concentrations of Fura2 and Cascade Yellow calculated in Example 3 and Comparative Example.
  • FIG. 18 is a diagram showing measured fluorescence spectra of a reference sample and a target sample.
  • FIG. 19 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a target sample calculated using the concentration of the fluorescent dye obtained in the first example.
  • FIG. 20 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a target sample calculated using the concentration of the fluorescent dye obtained in the second example.
  • FIG. 21 is a block diagram showing a configuration of another example of a fluorescent dye quantification system.
  • FIG. 22 is a view showing various data concerning the quantification of a fluorescent dye.
  • FIG. 23 is a block diagram showing an electronic circuit mounted on the multi-band camera.
  • FIG. 24 is a photograph showing an image acquired in the eighth embodiment.
  • FIG. 25 is a photograph showing an image obtained in a comparative example.
  • FIG. 26 is a diagram showing sensitivity characteristics of a four-band camera.
  • FIG. 1 is a block diagram showing the configuration of the fluorescent dye quantification system of the present embodiment.
  • the quantification system 100 has a light source 10, a fluorescence microscope 20, a multiband camera 30, and a personal computer 40. A display device 42 and a printer 44 are connected to the computer 40.
  • the quantification system 100 quantifies the concentration of the fluorescent dye contained in the target sample.
  • the quantification system 100 can quantify the concentrations of up to three types of fluorescent dyes. In the present embodiment, it is already known what the fluorescent dye contained in the target sample is.
  • the light source 10 generates light for exciting the sample 1 and irradiates the sample 1 with the light.
  • the light source 10 includes a Xe lamp 10a that emits white light and a multicolor LED 10 Ob, and one of them is selectively used. Whether to use the Xe lamp 10a or the LEDlOb is controlled by the computer 40. In the present embodiment, the Xe lamp 10a is used.
  • the fluorescence microscope 20 acquires an optical image of the fluorescence emitted from the sample 1 by irradiation of light from the light source 10 at a predetermined magnification, and sends it to the multi-band camera 30.
  • the fluorescence microscope 20 has a band-pass filter 22 that receives light from the light source 10 and a band-pass filter 24 that receives fluorescence emitted from the sample 1.
  • the bandpass filter 22 is used to remove wavelength components unnecessary for exciting the fluorescent dye contained in the sample 1 from the light power of the light source 10.
  • the bandpass filter 24 is used to block light having a wavelength different from the fluorescence emitted from the fluorescent dye contained in the sample 1.
  • the multi-band camera 30 is an imaging device that receives an optical image of fluorescence from the fluorescence microscope 20 and generates electrical image data thereof.
  • the multi-band camera 30 has three different detection wavelength bands, and has sensitivity in these detection wavelength bands. These detection bands usually correspond to R (red), G (green) and B (blue).
  • these detection wavelength bands are referred to as an R wavelength band, a G wavelength band, and a B wavelength band. Adjacent detection wavelength bands partially overlap. That is, the R wavelength band and the G wavelength band partially overlap, and the G wavelength band and the B wavelength band also partially overlap.
  • the multi-band camera 30 includes three image pickup devices (for example, a CCD) corresponding to these detection wavelength bands and a color separation prism that separates the wavelength component of the input light into three detection wavelength bands and sends them to the corresponding image pickup devices. Is included.
  • the multiband camera 30 may include one image sensor (for example, a CCD) on which a color mosaic filter or the like is printed.
  • the multiband camera 30 detects a fluorescent image in each of the R, G, and B wavelength bands and generates R, G, and B outputs corresponding to those wavelength bands.
  • the R, G, and B outputs are the image data of the fluorescent images detected in the G and B wavelength bands, respectively. This image data has a value indicating the intensity of the fluorescence in each pixel. Each pixel corresponds to one site of sample 1.
  • the multi-band camera 30 has two operation modes. One is the High Light mode, which has standard sensitivity characteristics, and the other is the Low Light mode, in which the overall sensitivity is slightly higher than the standard. In the present embodiment, the camera 30 operates only in the High Light mode.
  • the computer 40 is a device that controls the quantitative determination of the fluorescent dye by the quantitative system 100.
  • the computer 40 sends a light source switching signal to the light source 10 and controls whether to use the Xe lamp 10a or the LED 10b.
  • the computer 40 also functions as an arithmetic device that calculates the concentration of each fluorescent dye in the target sample using the fluorescence image data of the target sample obtained by the multiband camera 30.
  • the computer 40 has a storage device for storing software for this control and calculation. This software may be read from the recording medium 46 into a storage device.
  • the computer 40 executes the above control and calculation according to the software.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the procedure of quantification. This quantification method is roughly divided into two stages. Steps S202 and S204 correspond to the first stage, and steps S206 to S212 correspond to the second stage.
  • a reference sample is created to acquire the basic data (step S202).
  • the reference sample is a sample containing each of the plurality of fluorescent dyes contained in the target sample alone. Therefore, the same number of reference samples are prepared as the number of fluorescent dyes in the target sample.
  • Each reference sample contains each fluorescent dye at a predetermined concentration. Hereinafter, this density is called a unit density. The unit concentration may be different for each reference sample.
  • the fluorescence image data of each reference sample is obtained using the quantitative system 100 (step S204).
  • White light is emitted from the Xe lamp 10a, passes through the bandpass filter 22, and irradiates the reference sample.
  • the fluorescent dye in the reference sample is excited and emits fluorescence.
  • the light transmitted through the bandpass filter 22 has a wavelength spectrum capable of exciting all the reference samples.
  • the multi-band camera 30 receives a fluorescence image of the reference sample via the fluorescence microscope 20, and converts the fluorescence image into image data.
  • Fluorescence image is the R, G and B wavelengths of the multiband camera 30 Detected in each of the bands. Therefore, the multi-band camera 30 generates three image data obtained in three detection wavelength bands for one reference sample. These image data are sent to the computer 40 and stored in a storage device in the computer 40. This is the basic data obtained for one reference sample. Similar measurements are made for all reference samples and basic data is stored. This concludes the first stage of quantification.
  • Each pixel of each basic data has a value indicating the fluorescence intensity measured using the multi-band camera 30.
  • Pixel values obtained in the R, G, and B wavelength bands are sometimes referred to as the R, G, and B values, respectively.
  • the concentration of each fluorescent dye in the target sample is calculated using the basic data.
  • the Xe lamp 10a also irradiates the target sample with light via the band-pass filter 22 to excite all fluorescent dyes in the target sample, and obtains a fluorescent image of the target sample (step S206).
  • the concentration of the fluorescent dye changes every moment in accordance with the activity state of the target sample, such as when the target sample is a living cell, it is necessary to continuously measure the change. It may be performed several times.
  • the intensity of the light emitted from the Xe lamp 10a is the same as when exciting the reference sample for acquiring the reference data.
  • the multi-band camera 30 receives a fluorescence image emitted from the sample 1 via the fluorescence microscope 20 and converts it into image data.
  • the fluorescent image is detected in each of the R, G, and B wavelength bands of the multiband camera 30. Therefore, as shown in FIG. 3, the multi-band camera 30 generates three image data 51-53 acquired in three detection wavelength bands for the target sample. These image data are sent to the computer 40.
  • these image data may be referred to as target data.
  • the computer 40 calculates the concentration of the fluorescent dye for each pixel using the target data acquired in step S206 and the basic data acquired in step S204 (step S208).
  • the quantification of the concentration of the fluorescent dye in one portion of the target sample will be described.
  • One part of the target sample corresponds to one pixel in the fluorescence image.
  • the target sample contains two types of fluorescent dyes Shall be. In this case, two types of reference samples are prepared in step S202.
  • the computer 40 obtains the concentrations c and c of the first and second fluorescent dyes at one site in the target sample by the calculation represented by the following equation. Note that this concentration c and c
  • 1 2 1 2 is the unit concentration described above, that is, the concentration of the first and second fluorescent dyes in the first and second reference samples. Therefore, the actual concentration of the first fluorescent dye is a value obtained by multiplying the unit concentration of the first fluorescent dye by c, and the actual concentration of the second fluorescent dye is obtained by adding c to the unit concentration of the second fluorescent dye. This is the value obtained by multiplication. This also applies to other embodiments described later.
  • the line indicates the basic data acquired in step S204.
  • step S204 was obtained in step S204 for the second reference sample containing only the second fluorescent dye.
  • R, G and B are steps tgt tgt tgt for the target sample
  • Equation (1) J T represents the transpose of the row IJ [[. The above equation will be described later in detail.
  • the computer 40 executes the calculation of the expression (1) for all the pixels, and obtains the concentrations of the first and second fluorescent dyes for each pixel. As a result, as shown in FIG. 3, the concentration distribution data 61 and 62 of the two fluorescent dyes are obtained.
  • the computer 40 generates image data for displaying a quantitative result using the density distribution data 61 and 62 (step S210).
  • This image data shows the concentration distribution of the two fluorescent dyes on the target sample.
  • This image data is sent to the display device 42.
  • an image 63 indicating the concentration distribution of the fluorescent dye on the target sample is displayed on the display device 42 together with the color bar 64. Is displayed (step S212).
  • the computer 40 can also print the density distribution image 63 and the color rubber 64 using the printer 44.
  • 1 2 tgt tgt and B are R, G and t t of the multiband camera 30 for one part of the target sample.
  • r, g, and b are sensitivity characteristics of the multiband camera 30 in the R, G, and B wavelength bands.
  • f-c is the intensity of fluorescence having a certain wavelength emitted from the first fluorescent dye in the target sample.
  • f -c is the intensity of the fluorescence having a certain wavelength that also emits the second fluorochrome force in the target sample. Since the addition theorem holds, the sum of the fluorescence intensities having a certain wavelength is (f-c + f-c)
  • the multiband camera 30 detects this fluorescence intensity in each of the R, G and B wavelength bands.
  • the R value obtained from the target sample is obtained by multiplying the total fluorescence intensity (fc + f-c) at each wavelength by the sensitivity characteristic r of the scale wavelength band, and Is integrated over all wavelengths.
  • the G value or ⁇ value obtained from the target sample is obtained by multiplying the total fluorescence intensity (f-c + f-c) by the sensitivity characteristic g or b in the 0 wavelength band or the B wavelength band.
  • the R, G, and B values of the fluorescence from the target sample are determined based on the fluorescence intensity at each wavelength and the sensitivity of the camera 30 corresponding to the wavelength. This is a value obtained by multiplying and integrating over all wavelengths.
  • An example of the sensitivity characteristics of the multi-band camera 30 is shown in FIG. This figure will be described later.
  • the R, G, and B values of the fluorescence of the target sample are calculated by multiplying the following matrix by the concentration matrix of the fluorescent dye.
  • the three components in the first column are measured using a multi-band camera 30 to measure the fluorescence intensity at the unit concentration of the first fluorescent dye.
  • R, G and B values obtained by This is equal to Rf, Gf and Bf described above obtained by measurement of the first reference sample.
  • the three components in the second column of the column are R, G, and B values obtained by measuring the fluorescence intensity of the second fluorescent dye at a unit concentration using the multiband camera 30. This corresponds to the Rf, Gf and Bf described above obtained from the measurement of the second reference sample.
  • equation (1) By transforming equation (5), the above equation (1) is obtained.
  • the computer 40 executes the calculation of the above equation (1) using the basic data J to calculate the concentrations c and c of the fluorescent dye in each pixel.
  • the target sample contains the first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye
  • the multi-band camera uses different first-first k-th (k is an integer of 2 or more). It has a detection wavelength band.
  • O-O is the first using a multi-band camera
  • J is a matrix of k X m.
  • the i-th row and j-th column component J of J (i is an integer of 1 or more and k or less, j is an integer of 1 or more and m or less) is the i This is the measured intensity in the detection wavelength band.
  • J is the same pixel value as o 1 -O in the fluorescence image of the j-th reference sample captured in the i-th detection wavelength band using the multi-band camera.
  • k J ij o 1—It is not necessary to have the same pixel value as ok.
  • the value of any one pixel corresponding to the site may be set to J, and this J may be commonly used in the quantitative calculation for all pixels. In this case, the pixel of J does not always coincide with the pixel of o1o.
  • FIG. 4 shows an example of the expression method.
  • the concentration distributions of the two fluorescent dyes contained in the target sample are expressed as monochrome images 71 and 72.
  • images 71 and 72 the concentration of the fluorescent dye depends on the brightness. expressed.
  • a monochrome bar 73 is displayed in addition to the density distribution.
  • the concentration distribution of each fluorescent dye may be displayed using a false color.
  • FIG. 5 will be described in more detail later.
  • the ratio of the concentrations of these fluorescent dyes may be calculated, and the density ratio distribution may be displayed as a monochrome image, or may be displayed using false colors.
  • the quantitative results may be expressed by plotting the concentrations of the fluorescent dyes in all the pixels in a three-dimensional color space.
  • Figure 6 shows an example of an expression method that uses a three-dimensional color space.
  • the fluorescent color density is plotted in the L * a * b * space that is a uniform color space.
  • the a * axis indicates the color corresponding to the first fluorescent dye
  • the b * axis indicates the color corresponding to the second fluorescent dye.
  • the L * axis indicates brightness.
  • the two-dimensional position in FIG. 6 indicates the concentration ratio of the two fluorescent dyes.
  • a filter for extracting a wavelength component used for exciting one fluorescent dye from output light of a light source and a filter for extracting a wavelength component corresponding to the fluorescent dye from fluorescence emitted from a sample that is, a filter set is used.
  • This filter set is prepared for each fluorescent dye and installed in a fluorescent microscope. For example, a filter set for observing mainly blue fluorescence with ultraviolet excitation, a filter set for observing mainly green fluorescence with blue excitation, and a filter set for observing mainly red fluorescence with green excitation are available. Is done.
  • the fluorescent images from each fluorescent dye are captured by a monochrome camera while appropriately switching these filter sets. The value of each pixel is treated as indicating the concentration of the fluorescent dye
  • the concentration of the fluorescent dye is calculated by using the calculation formula without being affected by the overlap of the fluorescent spectra of the fluorescent dye. For this reason, it is possible to accurately determine the concentration of the fluorescent dye regardless of whether or not the fluorescent spectra overlap. This is even more apparent by referring to the examples described below.
  • quantification is performed by acquiring a fluorescence image of the target sample using the multiband camera 30 without switching the filter set.
  • the method of the present embodiment can simultaneously determine the concentrations of a plurality of fluorescent dyes, and thus can be suitably used even when the target is a biological sample. Further, since the optical system is not changed during the quantification, the concentrations of a plurality of fluorescent dyes can be obtained with uniform accuracy. Therefore, the concentration of the fluorescent dye obtained by the method of the present embodiment is highly reliable.
  • the fluorescent dye quantification system 200 of the present embodiment has a spectroscope 35 in addition to the configuration of the quantification system 100 described above.
  • the spectroscope 35 is arranged so as to be able to receive the fluorescence image acquired by the fluorescence microscope 20.
  • the fluorescence microscope 20 may have an optical element for sending a fluorescence image to both the camera 30 and the spectroscope 35, for example, a mirror.
  • the spectroscope 35 may be installed in exchange for the camera 30.
  • This embodiment is different from the first embodiment in the method of acquiring the basic data in step S204 described above. That is, in the present embodiment, the basic data is acquired using the spectroscope 35 instead of the multiband camera 30. In this case, the same advantages as in the first embodiment can be obtained. Other quantification procedures in the present embodiment are the same as those in the first embodiment.
  • the basic data J obtained using the multi-band camera 30 is obtained by dividing the fluorescence from the reference sample in each of the R, G, and B wavelength bands of the multi-band camera 30 as shown in the above equation (2). This is a pixel value obtained by measurement. As shown in the above equation (6), these pixel values are obtained by multiplying the fluorescence intensity at each wavelength of the fluorescent dye under the unit concentration by the sensitivity characteristic of the camera 30 corresponding to that wavelength, and This is a value integrated over all wavelengths. This integral can be approximately rewritten as
  • ⁇ , 22,..., ⁇ represent spectral wavelength bands obtained by dividing the entire wavelength range by an arbitrary width.
  • ⁇ is an integer of 2 or more and represents the number of spectral wavelength bands.
  • r, g, and b (t is an integer of 1 ⁇ ) indicate the R, G, and B sensitivity characteristics of the multiband camera 30 at the spectral wavelength band t.
  • f and f are emitted from unit concentrations of the first and second fluorescent dyes
  • the fluorescence intensity of the first and second fluorescent dyes at a unit concentration in these spectral wavelength bands can be measured using the spectroscope 35.
  • the unit concentration of the first and second fluorescent dyes in the spectral wavelength band 1 ⁇ 2
  • the computer 40 stores the spectral sensitivity characteristics of the multi-band camera 30 corresponding to the first term on the right side of Expression (9) in the storage device.
  • the computer 40 executes the calculation of the above equation (9), and calculates the equation shown in the equation (9).
  • the computer 40 executes the calculations shown in Expressions (9) and (10) using the spectral data acquired by using the spectroscope 35 and the spectral sensitivity characteristics of the multi-band camera 30.
  • Calculate data J This basic data J is used commonly for calculating the fluorescent dye concentration in all pixels. Even in this case, the fluorescent dye concentration can be quantified with good accuracy.
  • the R, G, and B values of the multiband camera 30 are obtained by using the spectral data acquired by the spectroscope 35 and the sensitivity characteristics of the multiband camera 30. And can be calculated. More generally, the R, G, and B values of the multiband camera 30 and the R, G, and B values calculated using the spectral data of the spectrometer 35 are mutually converted using a constant a. be able to. Therefore, not only the reference sample but also the fluorescence from the target sample are measured by the spectrometer 35 to obtain the spectral data, and the spectral data force is also calculated as the R, G, and B values.
  • the concentration of the fluorescent dye can be obtained without using the camera 30.
  • the spectroscope 35 can acquire only spectral data of one portion in the sample at a time. For this reason, when obtaining the distribution of the fluorescent dye concentration, it is more efficient to capture the fluorescent image of the target sample using an imaging device such as the multiband camera 30.
  • the computer 40 calculates a spectral spectrum when the target sample contains a fluorescent dye corresponding to the used basic data.
  • the computer 40 compares the thus simulated spectroscopic spectrum with the spectroscopic spectrum of the target sample actually measured using the spectroscope, and determines whether or not the degree of fitting is equal to or greater than a predetermined threshold. Is determined.
  • the computer 40 specifies the fluorescent dye contained in the target sample by searching for a fluorescent dye that gives a simulated spectrum sufficiently close to the measured total according to such a determination algorithm. If the fluorescent dye is specified, the method of the first embodiment can calculate the concentration of the fluorescent dye on all pixels.
  • the present embodiment relates to quantification when there are four or more types of fluorescent dyes contained in the target sample. If the number of fluorescent dyes is four or more, increasing the number of detection wavelength bands of the multi-band camera according to the number of fluorescent dyes enables the quantification of fluorescent dyes up to the same number as the number of detection wavelength bands.In fact, NHK R & D (No. 52, 53-60, 1998), a four-band multi-camera can be obtained. It is difficult to devise an optical system to realize a 5-band or 6-band camera.
  • the multiband camera 30 has two sensitivity modes, a Low Light mode and a High Light mode. In Low Light mode, standard sensitivity characteristics are set for each detection wavelength band. All sensitivity is set slightly lower than Low Light mode. In both the Low Light mode and the High Light mode, adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • the multi-band camera 30 has two analog circuits having different gains in all detection wavelength bands. In the High Light mode, a circuit with low gain is used in all detection wavelength bands, and in the Low Light mode, a circuit with high gain is used in all detection wavelength bands.
  • the R, G and B values in the low light mode of the multiband camera 30 are set to R, G and
  • r, g and b are R, G and B in the Low Light mode of the multiband camera 30.
  • the six components in the first column of row 1 are the multiband camera obtained by measuring the fluorescence intensity of the first fluorescent dye at a unit concentration in the low light mode and high light mode of the multiband camera 30. R, G and B values of 30. Similarly, for the six components in the second to fifth columns of the column, the fluorescence intensity of the second to sixth fluorescent dyes at a unit concentration is measured in the low light mode and the high light mode of the multiband camera 30.
  • the R, G, and B values of the multiband camera 30 obtained as described above. Therefore, all the components of the system can be obtained by detecting the fluorescence emitted from the first and second reference samples in both the Low Light mode and the High Light mode of the multiband camera 30.
  • Equation (11) can be rewritten as follows.
  • the basic data ⁇ is obtained by measuring the fluorescence of the reference sample, and then the fluorescence from the target sample is detected in both the Low Light mode and the High Light mode of the multiband camera 30, and the obtained R, G
  • the concentrations of up to six types of fluorescent dyes can be calculated.
  • the ability to quantify up to six types of fluorescent dyes using a three-band camera If a four-band camera is used, up to eight types of fluorescent dyes can be quantified in the same manner. More generally, it is possible to quantify fluorescent dyes up to the number of detection wavelength bands of a multi-band camera multiplied by the number of sensitivity characteristics of the multi-band camera.
  • the target sample contains the first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye
  • the multi-band camera uses different first-first k-th (k is an integer of 2 or more). It has a detection wavelength band and a first-first q (q is an integer of 2 or more) sensitivity mode for setting different sensitivity characteristics to the first-first k-th detection wavelength band.
  • 1 k is a matrix of k
  • the i-th row component P of matrix P (V is an integer from 1 to q, i is an integer from 1 to k) was imaged using a multiband camera in the i-th detection wavelength band and V-sensitivity mode. This is the value of one pixel in the fluorescence image of the target sample.
  • J is a matrix of (k 'q) X m
  • the i-th row component L of the component matrix L of J (j is an integer of 1 to m) is the i-th detection wavelength band and the V-th sensitivity of the multiband camera. This is the same pixel value as P in the fluorescence image of the j-th reference sample captured in the mode.
  • the present embodiment relates to quantification when the number of types of fluorescent dyes contained in the target sample is four or more.
  • two types of sensitivity modes of the multi-band camera are prepared, thereby enabling the quantification of the fluorescent dye up to the number X2 of the detection wavelength bands.
  • the sample is excited using a plurality of types of excitation light having different wavelength spectra, thereby enabling the quantitative determination of the fluorescent dye up to the number of detection wavelength bands X the number of types of excitation light. I do.
  • a multi-color light source is used as a light source for exciting the sample.
  • Use luminous LED10Ob This LEDlOb can emit multiple types of output light with different dominant wavelengths. Each type of output light has a wavelength spectrum that can excite all fluorescent dyes contained in the target sample.
  • the basic data is obtained based on the fluorescence generated by irradiating the reference sample with each output light to excite the fluorescent dye.
  • the basic data may be obtained by capturing a fluorescence image using a multi-band camera as in the first embodiment, or may be calculated using spectral data of a spectroscope as in the second embodiment. You can.
  • the target data is also obtained by irradiating each target light of the LEDlOb to the target sample to excite the fluorescent dye, and capturing a fluorescent image using the camera 30. If the wavelength characteristics of the excitation light differ, the wavelength characteristics of the fluorescence emitted from the fluorescent dye also differ. Therefore, by acquiring basic data and target data while switching the dominant wavelength of the output light of the LED, the number of fluorescent dyes up to the number of detection wavelength bands of the multiband camera 30 multiplied by the number of types of excitation light is obtained. Can be determined. For example, if there are two wavelength characteristics of the excitation light, up to six types of fluorescent dyes can be quantified, and if there are three types of wavelength characteristics, up to nine types of fluorescent dyes can be quantified.
  • the computer 40 calculates the concentration of each fluorescent dye by executing the calculation represented by the following equation.
  • the target sample contains the first-first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye, and the multi-band camera uses different first-first k-th (k is an integer of 2 or more). It has a detection wavelength band.
  • Component matrix Q—Q is a matrix of k XI.
  • the i-th row component Q (i is an integer of 1 or more and k or less) of the (lower integer) is one pixel of the fluorescence image of the target sample imaged in the i-th detection wavelength band according to the irradiation of the U-th excitation light.
  • Value. J is a matrix of (k'r) Xm, and the i-th matrix of J's component matrix T
  • the row component T is the same pixel value as Q in the fluorescence image of the j-th reference sample captured in the i-th detection wavelength band of the multiband camera in response to the irradiation of the u-th excitation light.
  • the power of using the multicolor LED 101 as a light source may be replaced by a plurality of light sources (eg, LEDs) that emit light of different wavelength spectra.
  • a light source having a variable output wavelength may be used in place of the LED.
  • a light source 10c that extracts and emits a specific wavelength component from the Xe lamp using a monochromator, and a light source 10d that extracts and emits a specific wavelength component using the output filter of a Xe lamp using a wavelength filter. can be used.
  • This embodiment is different from the above embodiment in an optical device used for acquiring basic data and target data.
  • the ability to acquire basic data using a multi-band camera or a spectroscope In this embodiment, the basic data is acquired using a plurality of bandpass filters and a monochrome camera.
  • the ability to acquire target data using a multi-band camera In this embodiment, target data is acquired using a plurality of bandpass filters and a monochrome camera.
  • FIG. 7 is a block diagram showing the configuration of the fluorescent dye quantification system of the present embodiment.
  • This quantification system 300 has a configuration in which the multiband camera 30 in the quantification system 100 is replaced with a monochromatic camera 32.
  • a plurality of bandpass filters corresponding to a plurality of fluorescent dyes included in the target sample are used as the non-pass filter 24. These bandpass filters have different transmission wavelength bands. These transmission wavelength bands are completely separated and have no overlap.
  • the bandpass filter 24 for example, an interference filter can be used.
  • the fluorescent power of the target sample is also extracted from the fluorescent component of the target sample using the band-pass filter 24, and is detected by the monochrome camera 32. As a result, the fluorescent images of each fluorescent color are individually captured.
  • the fluorescence intensity measured using the monochrome camera 32 is used for the same quantitative calculation as in the above-described embodiment, whereby the concentration of each fluorescent dye is calculated. Further, in the present embodiment, even when acquiring basic data, the fluorescence of each reference sample force is detected by the monochrome camera 32 via each band-pass filter 24.
  • the first and second fluorescent dyes are included in the target sample, and the quantification of the concentration of the fluorescent dye in one portion of the target sample will be described. I do.
  • the first and second reference samples each containing the first and second fluorescent dyes alone are prepared.
  • the computer 40 calculates the concentration of the fluorescent dye in one portion of the target sample by performing the calculation represented by the following equation.
  • O is the value of one pixel in the fluorescence image of the target sample imaged through the filter 24 for the first fluorescent dye, and O is the image captured through the filter 24 for the second fluorescent dye.
  • J is the fluorescent dye for the first fluorescent dye.
  • J is the first reference sample imaged through the filter 24 for the second fluorescent dye
  • J is the filter for the first fluorescent dye.
  • J is the second reference sample imaged through the filter 24 for the second fluorescent dye
  • the target sample contains the first m-th (m is an integer of 2 or more) fluorescent dye, and the first m-th band-pass filter is prepared accordingly.
  • O (j is an integer of 1 or more and m or less) is the value of one pixel in the fluorescence image in the target sample imaged through the filter for the j-th fluorescent dye.
  • the i-th row and j-th column component J of the row system (where i is an integer of 1 or more and m or less) is the same pixel value as O in the fluorescent image of the i-th reference sample imaged through the filter for the j-th fluorescent dye. It is.
  • the fluorescence of the target sample is detected through a bandpass filter.
  • the quantitative accuracy of the method of the present embodiment is inferior to that of the above embodiment.
  • this method has higher quantitative accuracy than the conventional technology in which the fluorescence intensity detected through a bandpass filter is directly treated as the concentration of the fluorescent dye. This is because the above equation is not affected by the presence or absence of the overlap of the fluorescence vectors. The quantification accuracy superior to the prior art has been confirmed by experiments by the present inventors.
  • the present invention is applied to measurement of a physiological activity of a cell. That is, in the present embodiment, the target sample is a cell.
  • the target sample is a cell.
  • To measure the physiological activity of cells measure the amount and distribution of functional molecules by labeling functional molecules such as receptors and enzymes possessed by cells with a fluorescent dye and measuring the concentration of the fluorescent dye. can do.
  • label those molecules with a plurality of fluorescent dyes having different excitation wavelengths and fluorescence wavelengths and identify the molecules according to the fluorescent color.
  • the concentration of the fluorescent dye in the cells is quantified using the quantification system shown in FIG. 1 and according to the procedure shown in FIG.
  • the quantification system 100 of the present embodiment obtains the concentration of the fluorescent dye by calculation using the basic data acquired in advance and the R, G, and B values acquired by the multiband camera 30.
  • the basic data may be obtained by the method described in the above embodiment! /, Or the deviation method! /. Since there is no need to separate and detect fluorescence from multiple dyes, it is easy to identify molecules. Therefore, the quantification system 100 of the present embodiment is useful for measuring the biological activity of cells.
  • the optical path lengths in the samples when measuring the fluorescence from the reference sample and the target sample are equal. This is because if the optical path length changes, the fluorescence intensity changes even for samples with the same concentration.
  • the thickness of the cells containing the fluorescent dye that is, the optical path length
  • the reference sample is a solution of a fluorescent dye
  • the solution sample has a constant optical path length over the entire field of view. Therefore, when measuring specific cells, a solution sample may not be used as a reference sample.
  • the microscope to be used has a confocal optical system
  • the microscope can use a solution sample as a reference sample in order to acquire a fluorescent image with a fixed optical path length.
  • the following methods can be considered as a method for correcting the cell thickness. For example, when measuring the concentration distribution of fluorescent dyes F1 and F2 contained in cells, a fluorescent dye F3 that uniformly stains the whole cell is given to cells in addition to these dyes (Calcein, CellTracker, etc.).
  • the components containing the thickness of the cells are included.
  • the concentration distribution of each dye is determined. This house Since the dye F3 is distributed at a uniform concentration throughout the cell, the concentration distribution obtained is proportional to the distribution of the cell thickness. Correct the difference in cell thickness by dividing the calculated density of each pixel of F1 and F2 by this value, using the density of each dye F3 at each pixel as a coefficient of the cell thickness of each pixel. The obtained concentration distribution can be obtained.
  • the reference sample is a cell
  • Some fluorescent dyes have weak fluorescence when used alone, and emit strong fluorescence only when bound to specific molecules in cells.
  • many dyes for staining nucleic acids such as DAPI
  • DAPI dyes for staining nucleic acids
  • fluorescent proteins such as GFP
  • the ability to produce fluorescent dyes inside cells by introducing genes into cells makes it difficult to prepare dye samples outside cells.
  • solution samples cannot be used as reference samples.
  • the cells stained with the fluorescent dye emit fluorescence, and basic data is obtained from the region. An image of the cell is obtained, and the average value of the fluorescence intensity in the region selected from the images is used as the fluorescence intensity for the reference concentration. This value is assigned as the fluorescence intensity with respect to the reference density for all pixels.
  • the same optical system (filter, dichroic mirror, lens, etc.) used for quantification can be used to detect the fluorescence.
  • shading information can be given to the image of the reference sample (an image in which all pixels have the same fluorescence intensity). The following calculation methods are conceivable.
  • a method may be considered in which the shading of the image of the target sample is corrected and an image in which the same fluorescence intensity is given to all pixels is used as an image of the reference sample.
  • the following methods can be considered as an arithmetic method for correcting the shading of the image of the target sample.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • a fluorescent molecule that provides excitation energy is called a donor
  • a fluorescent molecule that receives excitation energy is called an acceptor.
  • Donor and ac Septa are created by providing a fluorescent dye to a molecule.
  • FRET fluorescence intensity of the donor decreases and the fluorescence intensity of the receptor increases. Therefore, FRET measurement is often performed as follows.
  • the target sample is irradiated with light of a wavelength that excites the donor, and the fluorescence emitted from the target sample is detected.
  • the fluorescence from the sample is separated into the wavelength range of the fluorescence of the donor and the wavelength range of the fluorescence of the receptor using a band-pass filter.
  • the fluorescence intensities of the acceptor and the donor are separately measured, and the ratio of the fluorescence intensity of the acceptor Z donor is calculated. FRET can be analyzed using this fluorescence intensity ratio.
  • FRET is measured according to the procedure shown in FIG. 2 using the quantitative system shown in FIG.
  • a donor reference sample containing a fluorescent dye for a donor alone at a predetermined unit concentration and an acceptor reference sample containing a fluorescent dye for an acceptor alone at a predetermined unit concentration are prepared (step S202). These reference samples are excited, the intensity of fluorescence from each fluorescent dye is measured in each of the R, G, and B wavelength bands, and the obtained measured intensity is stored as basic data (step S204).
  • the multiband camera 30 may be used, or the spectroscope 35 may be used.
  • step S206 is used to measure the change in the amount of FRET in the target sample every moment according to the activity state of the target sample, such as when the target sample is a living cell. May be performed several times consecutively.
  • concentrations of the fluorescent dye for the donor and the fluorescent dye for the acceptor are calculated according to the above equation (1) (step S208), and an image showing the concentration distribution of these dyes is displayed on the display device 42 (step S210). And S212).
  • a Cameleon solution (14 ⁇ g / ml) containing Ca 2+ is used as a target sample.
  • Cameleon has a fluorescent dye CFP and an acceptor in its molecule. Fluorescent dye YFP. Cameleon also contains a site for binding Ca 2+ between these fluorescent dyes.
  • Ca 2+ binds to Cameleon, the structure of the molecule changes and the CFP force FRET to YFP becomes conspicuous accordingly.
  • the fluorescence of CFP decreases and the fluorescence of YFP increases.
  • the fluorescence intensity ratio of YFPZCFP increases accordingly.
  • the concentration of CFP and YFP is quantified while changing the concentration of Ca 2+ in the target sample stepwise, and the concentrations are multiplied by the fluorescence intensity per unit concentration to obtain CFP and YFP. Calculate the fluorescence intensity of YFP. Then, the fluorescence intensity ratio of YFPZCFP is calculated using these fluorescence intensities.
  • FIG. 8 shows the relationship between the Ca 2+ concentration in the target sample and the fluorescence intensity ratio calculated in the present embodiment.
  • FIG. 8 also shows the fluorescence intensity ratio obtained by the conventional method.
  • the fluorescence from the target sample is detected by the multiband camera 30, and the G value of the multiband camera 30 is regarded as the fluorescence intensity of YFP and the B value is regarded as the fluorescence intensity of CFP, and the GZB ratio is calculated.
  • a diamond indicates the fluorescence intensity ratio obtained by the conventional method
  • a square indicates the fluorescence intensity ratio based on the basic data acquired using the multiband camera 30, and
  • a triangle indicates the fluorescence intensity ratio using the spectroscope 35. The fluorescence intensity ratio based on the acquired basic data is shown.
  • the fluorescence intensity ratio obtained by the method of the present embodiment changes more than the fluorescence intensity ratio obtained by the conventional method according to the change in the Ca 2+ concentration. This is advantageous when detecting subtle changes in Ca 2+ concentration.
  • the fluorescence of CFP is also detected. Therefore, in the G wavelength band, the fluorescence intensity of YFP increases by FRET, while the fluorescence of CFP decreases. As a result, it is considered that the increase in the G value of the camera 30 was suppressed, and the change in the fluorescence intensity ratio was suppressed accordingly.
  • the fluorescence intensity is calculated using a calculation formula that is not affected by the mixture of the fluorescence, the fluorescence intensity ratio changes with high sensitivity according to the change in the Ca 2+ concentration.
  • the quantitative results are displayed using the expression method shown in FIG.
  • the concentration information of the fluorescent dye is displayed using a false color.
  • the first And the concentration distribution of the second fluorescent dye are displayed as images 81 and 82.
  • the concentration of the fluorescent dye is represented by luminance. Since FRET analysis generally evaluates the amount of FRET based on the intensity ratio of these two fluorochromes, that is, the concentration ratio, the distribution of the calculated fluorescence intensity ratio is shown using false colors in Image 83. . Further, by associating the fluorescence intensity ratio with the Ca 2+ concentration as shown in the graph of FIG. 8, the value of the fluorescence intensity ratio can be converted to the value of the Ca 2+ concentration.
  • Image 84 shows the distribution of Ca 2+ concentration using false colors. In these images 81-84, a color bar 85 is also displayed.
  • the method of the present embodiment is much simpler than the method of Gordon et al. This is because the method of Gordon et al. Measures fluorescence nine times, whereas the method of the present embodiment requires only three times of fluorescence measurement. As described above, when the quantification method of the present invention is applied to FRET, the fluorescence intensity ratio of the ceptor Z donor can be obtained easily and quickly.
  • FIG. 9 shows the spectral sensitivity characteristics of the camera 30.
  • Camera 30 has two types of sensitivity, Law Light mode and High Light mode. Mode.
  • FIG. 9 shows the sensitivity characteristics in the solid light Law Light mode, and the dashed lines show the sensitivity characteristics in the High Light mode.
  • the R, G, and B values in the low light mode were used for quantitative calculation.
  • the three types of fluorescent dyes used were Alexa Fluor350, Fura2, and Cascade Yellow.
  • the present inventors prepared three types of solutions obtained by mixing two of these at an appropriate concentration as target samples. All three types of dye solutions have the same absorption wavelength in the same wavelength band (350-440 nm). When the dye solution is irradiated with light in this wavelength band to excite the dye, the solutions emit fluorescence having different spectra from each other.
  • the non-pass filter 22 has a transmission wavelength band equal to this wavelength band, and extracts the component in this wavelength band from the white light of the Xe lamp 10a to generate excitation light.
  • a reference sample was prepared.
  • the unit concentration of each fluorescent dye was determined so that an appropriate fluorescence intensity was obtained according to the sensitivity of the camera 30, and a solution containing each fluorescent dye alone at that unit concentration was prepared.
  • the three types of solutions thus obtained are the reference samples.
  • a target sample in which two kinds of reference samples are mixed at an appropriate ratio is prepared, and the target sample is irradiated with excitation light.
  • a fluorescent image of the target sample is captured using the camera 30 to obtain image data.
  • the pixel value of this image data is the target data.
  • the computer 40 calculated the density distribution of the two fluorescent dyes in the target sample by executing the calculation represented by the above equation (1) for each pixel using the basic data and the target data.
  • the present inventor also obtained basic data and target data using a spectroscope 35 instead of the camera 30.
  • a spectroscope 35 PMA-ll (c7473 manufactured by Hamamatsu Photonics KK) was used. , BTCCD 200-950 nm).
  • the computer 40 performed a 5 point (5 nm) smoo thing processing on the spectral data acquired by the spectroscope 35.
  • FIG. 10 shows spectroscopic data obtained from a target sample in which the fluorescent dyes Alexa Fluor and Cascade Yellow were mixed at various ratios. The interval between peak wavelengths of fluorescence emitted from these dyes is relatively wide, about lOnm.
  • FIG. 11 shows spectral data obtained from target samples in which the fluorescent dyes Fura2 and Cascade Yellow were mixed at various ratios. The interval between the peak wavelengths of the fluorescence generated by these dyes is relatively narrow, about 30 nm. As described above, these spectral data have been subjected to smoothing processing.
  • the computer 40 executed the calculations shown in the above equations (9), (10) and (1) using the spectral data obtained from the reference sample and the target sample to calculate the dye concentration.
  • Reference sample force By multiplying the acquired spectral data of all spectral wavelength bands by the sensitivity characteristics shown in Fig. 9, add the results, and then multiply by the correction coefficient a shown in equation (10) to obtain the basic data. Data J was calculated.
  • the target sample force is obtained by multiplying the acquired spectral data of all the spectral wavelength bands by the sensitivity characteristics shown in FIG. 9 and then adding the result, and then multiplying by the correction coefficient a to obtain the target data R and G. And B were calculated. This performance
  • the spectral data at 300-780nm in 5nm increments was used.
  • the spectrometer 35 can measure only one site in the sample.
  • the numerical value calculated by the computer 40 indicates the dye concentration at the measurement site.
  • the present inventor also quantified the concentration of the fluorescent dye according to the method of the fifth embodiment.
  • the intensity of the fluorescence emitted from the reference sample and the target sample was measured through a band-pass filter.
  • Three bandpass filters were used according to the fluorescence spectra of the three fluorescent dyes.
  • the first bandpass filter has a center wavelength of 440 nm and a band width of 21 nm.
  • the second bandpass filter has a center wavelength of 510 nm and a bandwidth of 23 nm.
  • the third bandpass filter has a center wavelength of 546 nm and a bandwidth of 10 nm. have.
  • the fluorescence transmitted through the bandpass filter was detected using a monochrome camera.
  • the computer 40 performed the calculations shown in the above equations (22) and (23) using the pixel values of the fluorescent light image captured by the monochrome camera. As a result, the concentrations of the two fluorescent dyes in the target sample were calculated.
  • the fluorescence intensity was measured using the same spectroscope as that used in the second example. Specifically, the fluorescence intensity was measured at lnm intervals using a spectrometer, and the fluorescence intensity was calculated by integrating the fluorescence intensities in all the wavelength bands.
  • FIG. 12 shows spectral data obtained by measuring the force of a target sample obtained by mixing the fluorescent dyes Alexa Fluor and Cascade Yellow in various ratios through a bandpass filter.
  • FIG. 13 shows spectral data obtained by measuring the power of a target sample obtained by mixing the fluorescent dyes Fura2 and Cascade Yellow at various ratios through a bandpass filter.
  • the present inventor extracted the fluorescence of each dye using a fluorescence bandpass filter that generates a target sample, and photographed the fluorescence with a monochrome camera.
  • the used bandpass filter is the same as that of the third embodiment.
  • the concentrations c and c of the two fluorescent dyes in the target sample were calculated according to the following equation (conventional equation).
  • Sample SI and Sample S2 are the fluorescence intensities extracted from the fluorescence of the target sample using a bandpass filter
  • Kijyun SI and Kijyun S2 are the It is the intensity of the emitted fluorescence.
  • the intensity of the fluorescence measured through the bandpass filter is treated as the concentration of each fluorescent dye.
  • FIG. 14 shows the concentrations of Alexa Fluor and Cascade Yellow calculated in the first and second examples.
  • FIG. 15 shows the concentrations of Alexa Fluor and Cascade Yellow calculated in the third example and the comparative example.
  • the horizontal axis indicates the mixing ratio of the dye, and the vertical axis indicates the concentration of the dye. Concentrations are shown with unit density of each dye as 1.
  • the unit concentration of Alexa Fluor is 2 ⁇ (micromolar) and the unit concentration of Cascade Yellow is 1 ⁇ .
  • Fig. 14 diamonds indicate the concentration of Alexa Fluor calculated in the first example, squares indicate the concentration of Alexa Fluor calculated in the second example, and triangles indicate the concentrations calculated in the first example.
  • X indicates the concentration of Cascade Yellow, and X indicates the concentration of Cascade Yellow calculated in the second embodiment.
  • diamonds indicate the concentration of Alexa Fluor calculated in the third example, squares indicate the concentration of Alexa Fluor calculated in the comparative example, and triangles indicate the concentration of Cascade Yellow calculated in the third example.
  • X indicates the concentration of Cascade Yellow calculated in the comparative example.
  • the dashed line indicates the actual concentration of Alexa Fluor in the target sample, and the dashed line indicates the actual concentration of Cascade Yellow in the target sample.
  • FIG. 16 shows the concentrations of Fura2 and Cascade Yellow calculated in the first and second examples.
  • FIG. 17 shows the concentrations of Fura2 and Cascade Yellow calculated in the third example and the comparative example.
  • the horizontal axis indicates the mixing ratio of the dye, and the vertical axis indicates the concentration of the dye.
  • the density is displayed with the unit density of each color element as 1.
  • the unit concentration of Fura2 is 4 M and Cascade
  • the unit concentration of Yellow is 0.8 ⁇ .
  • the rhombus indicates the concentration of Fura2 calculated in the first example
  • the square indicates the concentration of Fura2 calculated in the second example
  • the triangle indicates the cascade calculated in the first example.
  • X indicates the concentration of Cascade Yellow calculated in the second embodiment.
  • a diamond indicates the concentration of Fura2 calculated in the third example
  • a square indicates the concentration of Fura2 calculated in the comparative example
  • a triangle indicates the concentration of Cascade Yellow calculated in the third example.
  • X indicate the concentration of Cascade Yellow calculated in the comparative example.
  • the dashed line indicates the actual concentration of Fura2 in the target sample
  • the dashed line indicates the actual concentration of Cascade Yellow in the target sample.
  • the quantification accuracy of Fura2 and Cascade Yellow which emit fluorescence with a relatively narrow center wavelength, is significantly different between the example and the comparative example. This is because the overlap of the fluorescence spectra between these dyes is large.
  • the dye concentration can be quantified with high accuracy without being affected by the overlap of the fluorescence spectra.
  • the fluorescence from the sample is detected through a band-pass filter.
  • FIG. 17 shows that even in this case, a higher quantification accuracy than the comparative example can be obtained. This is due to the difference between the equations (22) and (23) used in the third embodiment and the equations (26.1) and (26.2) used in the comparative example.
  • the comparative power of FIGS. 16 and 17 in the first and second embodiments in which fluorescence is detected without passing through a bandpass filter, it is possible to obtain an even higher quantitative accuracy than in the third embodiment. Can be.
  • the adjacent detection wavelength bands overlap in the first and second embodiments and cover the entire wavelength band to be evaluated, whereas the adjacent detection wavelength bands in the third embodiment are different. Since the data is not overlapped, and only the data of the wavelength band at a part of the spot is handled, it does not cover the entire evaluation wavelength band of the target sample, which may be considered to be due to the lack of data. it can.
  • the method in the first embodiment that is, the measurement using a multi-band camera, is equivalent to the sensitivity function of the camera for spectral data in a wavelength range of a certain arbitrary width to be measured. Fluorescence intensity is determined by multiplying the above characteristics. Therefore, measurement using a camera basically obtains the same information as when data was collected over the entire wavelength range, as in the measurement using a spectroscope. Therefore, even if a camera is used, quantification can be performed with the same accuracy as that of spectroscopy.
  • FIG. 18 shows the fluorescence spectra of a reference sample containing Fura2, a reference sample containing Cascade Yellow, and a target sample containing Fura2 and Cascade Yellow.
  • the unit concentration of Fura2 is 4 ⁇
  • the unit concentration of Cascade Yellow is 0.8 ⁇ .
  • Fura2 and Cascade Yellow are mixed at a ratio of 0.6: 1.4.
  • the results of actually measuring the target sample using a spectrometer are shown as target vectors in Fig. 18.
  • the spectral intensity can be simulated by multiplying the calculated concentration by the fluorescence spectrum of the corresponding reference sample (hereinafter referred to as “reference vector”) and summing the two.
  • FIG. 19 and FIG. 20 show simulation spectra calculated in this manner.
  • the accuracy of the calculation itself can be confirmed.
  • the reference spectrum and target The cut spectra are slightly different from those obtained by the spectrometer method. For this reason, it is natural that a difference occurs between the fluorescence spectrum obtained by the simulation calculation in the camera system and the fluorescence spectrum obtained by the simulation calculation in the spectroscope system. Therefore, the deviation between the actually measured target spectrum and the fluorescence spectrum obtained by the simulation calculation does not directly reflect the accuracy of the camera system and the spectroscope system. However, since the accuracy of the outline can be confirmed, this method was adopted.
  • the measured fluorescence spectrum and the fluorescence spectrum calculated using the quantification results of the first and second examples have extremely close shapes. Have. Therefore, it can be seen that the first and second examples can quantify the concentration of the fluorescent dye with excellent accuracy.
  • FIG. 21 is a block diagram showing a configuration of the fluorescent dye quantification system of the present embodiment.
  • This quantitative system 800 has a configuration in which the multiband camera 30 in the quantitative system 100 of the first embodiment is replaced with a multiband camera 30a.
  • a logic circuit provided in the multi-band camera 30a executes the calculation of the above equation (7).
  • FIG. 22 shows various data related to the quantification of the present embodiment.
  • the multiband camera 30a has three detection wavelength bands, that is, an R wavelength band, a G wavelength band, and a B wavelength band.
  • FIG. 22 (a) shows the sensitivity characteristics of the multiband camera 30a. As shown in this figure, adjacent detection wavelength bands partially overlap.
  • the multi-band camera 30a includes three image sensors corresponding to these detection wavelength bands, and a color separation prism that separates the wavelength component of the input light into three detection wavelength bands and sends the wavelength components to the corresponding image sensors. .
  • FIG. 23 is a block diagram showing a signal processing circuit mounted on the multi-band camera 30a.
  • the signal processing circuit 31 includes, in addition to the three image pickup devices 101 to 103 described above, an amplifier 111 to 113, an A / D converter 121 to 123, a logic circuit 130 for quantitative calculation, a timing adjustment circuit 141 to 143, an interface Including a circuit 150, a drive circuit 160, a timing generation circuit 162, and a control circuit 164.
  • the imaging elements 101 to 103 are driven by the driving circuit 160, and capture fluorescence images of the target sample in the R, G, and B wavelength bands, respectively, to generate three image signals. These image signals are amplified by the amplifiers 111-113, digitally converted by the AZD converters 121-123, and input to the logic circuit 130 for quantitative calculation.
  • the logic circuit 130 executes the calculation represented by the above equation (7) using these image signals, and calculates the concentration of the fluorescent dye in the target sample for each pixel.
  • the matrix Ci T 'J) — in equation (7) is referred to as “reference data M”.
  • the reference data M is input from the computer 40 to the logic circuit 130 via the interface circuit 150.
  • the reference data M may be stored in a storage device provided in the multi-band camera 30a.
  • the logic circuit 130 assigns a value corresponding to the density calculated for each pixel to the pixel, and generates an image signal representing the density distribution of each fluorescent dye in the target sample.
  • These image signals are one of the R, G, and B outputs of the multiband camera 30a.
  • the timing generation circuit 162 supplies a clock signal to the AZD converters 121 to 123, the logic circuit 130, the timing adjustment circuits 141 to 143, the drive circuit 160, and the control circuit 164.
  • the control circuit 164 receives an instruction from the computer 40 through the external interface circuit 150, and controls the operation of the logic circuit 130 according to the instruction. For example, the control circuit 164 can inhibit the operation of the equation (7) by the logic circuit 130 and output the image data itself acquired in the R, G, and B wavelength bands from the multi-band camera 30a.
  • the R, G and B outputs are synchronized by the timing adjustment circuits 141 and 143 and sent from the external interface circuit 150 to the computer 40.
  • the computer 40 displays an image for displaying a quantitative result on the display device 42 using the R, G, and B outputs of the multiband camera 30a. For example, as shown in FIG. 3, an image 63 in which the R, G, and B outputs are superimposed may be displayed together with a color bar 64, or, as shown in FIG. 4, the R, G, and B outputs may be separated. And may be displayed as separate images. Computer 40 can print these images using printer 44.
  • Figure 22 (b) shows the target sample and the first and second samples.
  • 4 shows a fluorescence spectrum of a second fluorescent dye.
  • This target sample was obtained by staining Hela cells with two types of fluorescent dyes, DAPI and MitoTracker Green.
  • DAPI stains cell nuclei and MitoTracker Green stains mitochondria.
  • the fluorescence spectrum of DAPI has a peak near 460 nm, and the fluorescence spectrum of MitoTracker Green has a peak near 515 nm.
  • a reference sample is prepared and basic data is obtained. Specifically, Hela cells are stained with DAPI only and MitoTracker Green only to create first and second reference samples. These reference samples are irradiated with excitation light through a bandpass filter 22 having a transmission wavelength band of 405 ⁇ 5 nm.
  • FIG. 22 (c) shows the fluorescence spectrum of the first reference sample
  • FIG. 22 (d) shows the fluorescence spectrum of the second reference sample.
  • the optical image of the fluorescence emitted from the reference sample is captured by the multi-band camera 30a through the band-pass filter 24 having a transmission wavelength band of 420 nm or more.
  • the imaging devices 101 to 103 in the multi-band camera 30a generate three image data obtained in three detection wavelength bands for one reference sample.
  • the computer 40 sends a command to the control circuit 164 to prohibit the arithmetic operation of the equation (7) by the logic circuit 130 and output these image data to the multi-band camera 30a. These image data are sent to the computer 40 and stored in a storage device in the computer 40. Similar measurements are performed for all reference samples, and the image data is saved.
  • FIG. 22 (f) shows the R, G, and B values of one pixel, that is, Rf, Gf, and Bf, obtained from the first reference sample.
  • Rf 19.980
  • Gf 121.939
  • Bf 252.900
  • Fig. 22 (g) shows the R, G, and B values of one pixel obtained from the second reference sample, that is, Rf, Gf
  • the computer 40 obtains the reference data ⁇ , that is, the matrix ( J T 'J) _1 ' J T is calculated.
  • the calculated reference data is stored in a storage device in the computer 40.
  • this reference data M is used in common in the calculation of equation (7) for all pixels. This concludes the first stage of quantification.
  • FIG. 22 (e) shows the R, G, and B values of one pixel in the fluorescence image of the target sample, that is, R, G, and B.
  • the computer 40 sends a command to the control circuit 164, and permits the logic circuit 130 to perform the operation of Expression (7) (actually, Expression (1)).
  • the logic circuit 130 is also supplied with reference data M from the computer 40. Using the reference data M, the logic circuit 130 calculates the density (c) of the DAPI and MitoTracker Green by executing the calculation of the equation (1) for each pixel.
  • FIG. 22H shows the densities c and c calculated for the pixels having the R, G, and B values shown in FIG. 22E.
  • the unit of these concentration values is the concentration of the fluorescent dye in the corresponding reference sample.
  • the logic circuit 130 assigns values corresponding to the densities cl and c2 calculated for each pixel to the pixel, and generates two image signals indicating the density distribution of DAPI and MitoTracker Green in the target sample. .
  • These image signals are output from the logic circuit 130 as any of the R, G, and B signals. Therefore, the density distributions of DAPI and MitoTracker Green are sent from the multiband camera 30a to the computer 40 as image data of different colors.
  • These image signals may be separated from each other and transmitted to the computer 40, or may be converted into a single composite signal and transmitted to the force computer 40.
  • the computer 40 uses these image signals to display an image representing the quantitative result on the display device 42.
  • Fig. 24 shows a quantitative result image of the present embodiment, where (a) is an output image of the multi-band camera 30a, and (b) is a concentration distribution of DAPI separated from the output image.
  • Image (c) Is a density distribution image of MitoTracker Green separated from the output image.
  • These originals are color images. Here we show the images converted to black and white. Only the nucleus is displayed in the DAPI image, and only the mitochondria is displayed in the MitoTracker Green image.
  • the quantification system of the present embodiment can clearly display two structures in a cell in real time.
  • FIG. 25 shows a quantitative result image of this comparative example, where (a) is an output image of a three-band camera, and (b) and (c) are B wavelength regions extracted from the output image and It is a fluorescence image in a G wavelength region. These are also original color images, but here are images converted to black and white. DAPI fluorescence is detected in both B and G wavelength regions, depending on the distribution of the fluorescence beaule of the dye used.
  • hardware in the multi-band camera 30a performs quantitative calculation instead of software operating on the personal computer 40, and generates an image signal representing a density distribution using the calculation result. Therefore, the density distribution image can be displayed more quickly than when the density distribution image is generated by software processing. As a result, the user can immediately confirm the quantification result after imaging the target sample.
  • the technique of the present embodiment can be applied to any of the above embodiments using a multi-band camera. Further, as in the second embodiment, acquisition of basic data from the reference sample may be performed using the spectroscope 35.
  • an imaging device having R, G, and B wavelength bands as detection wavelength bands is mainly used. Used in However, the imaging device used in the present invention may have any other detection wavelength band.
  • Equation (1) is an equation in a case where the system is not regular.
  • the reason why the system is non-regular is that the number of fluorescent dyes and the number of detection wavelength bands contained in the target sample are identical.
  • the system since there are three detection wavelength bands, the system is regular if the target sample contains three types of fluorescent pigments.
  • equation (1) can be rewritten in the following simple form.
  • a four-band camera having the sensitivity characteristics shown in Fig. 26 may be used.
  • This four-band camera also has two sensitivity modes, a Low Light mode and a High Light mode. Therefore, as described in the third embodiment, up to eight types of fluorescent dyes can be quantified. As shown in FIG. 26, this four-band camera has sensitivity in the near infrared region. Therefore, this four-band camera is useful for quantification of a fluorescent dye having an emission region in the near infrared region.
  • the multi-band camera 30a used in the eighth embodiment has a single image sensor on which a color mosaic filter or the like is printed instead of a force having a color separation prism and a plurality of image sensors. You can do it.
  • the method and the quantification system of the present invention can accurately quantify the concentrations of a plurality of fluorochromes having overlapping fluorescence spectra.

Abstract

　ターゲット試料（１）中に含まれる複数の蛍光色素の濃度を撮像装置（３０）を用いて定量する。この撮像装置は、複数の検出波長帯を有する。複数の蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む複数の基準試料を用意し、各基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度を取得する。撮像装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。基準試料およびターゲット試料から取得した蛍光強度を用いて演算を実行することにより、ターゲット試料中の各蛍光色素の濃度を算出する。

Description

明 細 書
蛍光色素の濃度を定量する方法およびシステム
技術分野
[0001] この発明は、試料中に含まれる蛍光色素の濃度の定量に関する。
背景技術
[0002] 試料中に含まれる蛍光色素の濃度を定量する一つの方法が、 W. T. Mason編、「 Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity」、未国、 Academic Press, 1993年、 204— 215頁の Gary R. Bright, 「Multiparameter Imaging of Cellular Function]に記載されている。この方法では、ダイクロイツクフィルタを用いて 白色光から蛍光色素の励起に必要な波長成分を抽出し、その波長成分を試料に照 射して蛍光を発生させる。この蛍光をバンドパスフィルタを介してモノクロカメラで検出 し、その強度を測定する。バンドパスフィルタは、試料中に含まれる蛍光色素に対応 する波長成分のみをカメラで受光するために使用される。試料中の蛍光色素から発 する蛍光の強度はその蛍光色素の濃度に比例するため、こうして測定された蛍光強 度が蛍光色素の濃度として扱われる。
[0003] この方法では、蛍光色素に応じたダイクロイツクフィルタおよびバンドパスフィルタか らなるフィルタセットが使用される。試料に含まれる蛍光色素が一種類のときは、一つ のフィルタセットを固定的に使用することができる。しかし、蛍光色素が 2種類以上の ときは、試料の測定中に複数のフィルタセットを取り替えて使用する必要がある。フィ ルタセットの取り替えは光学系をわずかに変化させるため、定量の精度に影響を与え る。また、フィルタセットの取り替えによって、異なる蛍光色素間で測定時間に差が生 じる。これは、生きている試料の測定には好ましくない。
[0004] 上記の方法は、定量精度の面でも改善すべき点がある。試料に含まれる複数の蛍 光色素のピーク波長が接近して!/、る場合、複数の蛍光スペクトルの裾同士が重なり 合う。この場合、バンドパスフィルタを使用しても単一の蛍光色素に応じた波長成分 のみを蛍光力 抽出することができず、フィルタを通過した蛍光には別の蛍光色素の 波長成分が混入してしまう。これは、蛍光色素の定量の精度を低下させる。 発明の開示
[0005] 本発明は、複数の蛍光色素の濃度を精度良く定量することを目的とする。
[0006] 一つの側面において、本発明は、試料中の蛍光色素の濃度を定量する方法に関 する。この方法は、ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍 光色素の濃度を、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯を有する撮像 装置を用いて定量する。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。この方法で は、第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基準 試料を用意し、各基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度を取得す る。また、撮像装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。 この後、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における第 1一 第 m蛍光色素の濃度 c一 c を算出する。
[数 1]
一
Figure imgf000004_0001
ここで、 O
1一 Oは、前記第 1
k 一第 k検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画 像において上記部位に対応する画素の値である。 Jは k X mの行列であり、 Jの第 i行 第 j列成分 J (iは 1以上 k以下の整数、 jは 1以上 m以下の整数）は、第 j基準試料から 発する蛍光の第 i検出波長帯での測定強度である。
[0007] 上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重 なりに影響されない。このため、この定量方法によれば、重なり合う蛍光スペクトルを 有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。
[0008] 上記の撮像装置は、第 1一第 k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでい てもよい。基準試料から発する蛍光の各検出波長帯での測定強度の取得は、そのマ ルチバンドカメラを用いて各基準試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像し、各基準 試料中の蛍光を発する部位を表示する画素の値を各蛍光画像から取得してもよい。 第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
1一 c の算出は、第 i検出波長帯で撮像された第 j基準 m
試料の蛍光画像カゝら取得された画素の値を行歹 の成分 jとして使用してもよい。こ の場合、基準試料およびターゲット試料の双方の蛍光強度を同じマルチバンドカメラ を用いて測定できる。したがって、蛍光色素の濃度を簡易に定量できる。
[0009] 撮像装置は、第 1一第 k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んでいてもよ い。基準試料力 発する蛍光の各検出波長帯での測定強度を取得することは、各基 準試料から発する蛍光の分光強度を分光器を用いて測定し、分光強度とマルチバン ドカメラの各検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各基準試料から発する蛍光 の各検出波長帯での測定強度を算出してもよい。このように、基準試料から発する蛍 光の各検出波長帯での測定強度は、撮像装置を使用して直接取得する代わりに、 分光器を使用して取得することも可能である。
[0010] 別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上 の整数)の蛍光色素の濃度を撮像装置を用いて定量する方法に関する。撮像装置 は、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯と、撮像装置の異なる感度特 性を設定する第 1一第 q (qは 2以上の整数)の感度モードとを有している。隣り合う検 出波長帯は、部分的に重なっている。この方法では、第 1一第 m蛍光色素の各々を 所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基準試料を用意し、各基準試料から発 する蛍光の各検出波長帯および各感度モードでの測定強度を取得する。また、撮像 装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯および各感度モードで撮像 する。この後、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のある部位における 第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
1一 c を算出する。
m
[数 2]
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
ここで、 P (vは 1以上 q以下の整数）は k X 1の行列であり、 Pの第 i行成分 P (iは 1以 上 k以下の整数)は、撮像装置を用いて第 i検出波長帯および第 V感度モードで撮像 されたターゲット試料の蛍光画像にぉ 、て上記部位に対応する画素の値である。 J は (k' q) X mの行列であり、 Jの成分行列 L (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成分 L は、第 j基準試料力も発する蛍光の第 i検出波長帯および第 V感度モードでの測定 強度である。
[0011] 上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重 なりに影響されない。このため、この定量方法によれば、重なり合う蛍光スペクトルを 有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、この方法によって定量可能な 蛍光色素の数は (検出波長帯の数） X (感度モードの数)である。したがって、感度モ ードの数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。
[0012] さらに別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波 長帯を有する撮像装置を用いて定量する方法に関する。隣り合う検出波長帯は、部 分的に重なっている。この方法では、第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度 で単独で含む第 1一第 mの基準試料を用意し、異なる波長スペクトルを有し第 1一第 m蛍光色素をすベて励起する第 1一第 r (rは 2以上の整数)の励起光の各々を第 1一 第 m基準試料に照射し、各基準試料力 発する蛍光の各検出波長帯での測定強度 を取得する。また、各励起光をターゲット試料に照射し、撮像装置を用いてターゲット 試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。この後、次の式で示される演算を実行 - して、ターゲット試料のある部位における第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
1一 c を算出す m
る。
[数 3]
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
ここで、 Qu(uは 1以上 r以下の整数）は k X 1の行列であり、 Qの第 i行成分 Q (iは 1 以上 k以下の整数）は、第 u励起光の照射に応じて第 i検出波長帯で撮像されたター ゲット試料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。 J
2は (k'r) X mの行列であり、 Jの成分行列 T (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成分 T は、第 u
2 U] iu] 励起光の照射に応じて第 j基準試料から発する蛍光の第 i検出波長帯での測定強度 である。
[0013] 上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重 なりに影響されない。このため、この定量方法によれば、重なり合う蛍光スペクトルを 有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、この方法によって定量可能な 蛍光色素の数は (検出波長帯の数） X (励起光の種類の数)である。したがって、励 起光の種類の数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。
[0014] 本発明の定量方法において、撮像装置は、ターゲット試料の蛍光画像を第 1一第 k 検出波長帯で撮像して第 1一第 kの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、第 1一第 kの画像信号が入力される演算回路とを含んでいてもよい。第 1一第 m蛍光色 素の濃度 c一 c の算出は、演算回路が第 1一第 kの画像信号を用いて演算を実行
1 m
する処理を含んでいてもよい。この定量方法は、演算回路に、ターゲット試料の複数 の部位における濃度 c一 c を算出させ、第 1一第 mの蛍光色素の濃度分布を表す
1 m
第 1一第 mの画像信号を生成させることを更に備えていてもよい。この定量方法では 、撮像装置が、自身の取得したターゲット試料の蛍光画像信号を用いて蛍光色素の 濃度を算出し、濃度分布を表す画像信号を生成する。したがって、この定量方法は、 定量結果を迅速に提示することができる。
別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上 の整数)の蛍光色素の濃度を定量するシステムに関する。このシステムは、光検出器 、撮像装置および演算装置を備えている。光検出器は、第 1一第 m蛍光色素の各々 を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基準試料の各々から発する蛍光を検 出し、その蛍光の強度を測定する。撮像装置は、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数 )の検出波長帯を有し、ターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯で撮像する。隣り 合う検出波長帯は、部分的に重なっている。演算装置は、次の式で示される演算を 実行して、ターゲット試料のある部位における第 1一第 m蛍光色素の濃度 c一 c を算 出する
画
一
Figure imgf000008_0001
ここで、 O一 Oは、第 1一第 k検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像に
1 k
ぉ 、て上記部位に対応する画素の値である。 Jは k X mの行列であり、 Jの第 i行第 j列 成分 J (iは 1以上 k以下の整数、 jは 1以上 m以下の整数）は、光検出器によって測定 された第 j基準試料力も発する蛍光の第 i検出波長帯での強度である。 [0016] 上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重 なりに影響されない。このため、この定量システムによれば、重なり合う蛍光スペクトル を有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。
[0017] 光検出器および撮像装置は、第 1一第 k (kは 2以上の整数)検出波長帯を有するマ ルチバンドカメラであってもよい。光検出器は、各検出波長帯にて各基準試料の蛍 光画像を撮像し、各基準試料中の蛍光を発する部位を表示する画素の値を各蛍光 画像カゝら取得してもよい。演算装置は、第 i検出波長帯で撮像された第 j基準試料の 蛍光画像から取得された前記画素の値を行歹 の成分 Jとして使用してもよい。この 場合、基準試料およびターゲット試料の双方の蛍光強度を同じマルチバンドカメラを 用いて測定できる。したがって、蛍光色素の濃度を簡易に定量できる。
[0018] 光検出器は、各基準試料から発する蛍光の分光強度を測定する分光器を含んで いてもよい。撮像装置は、第 1一第 k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含ん でいてもよい。演算装置は、分光器によって測定される分光強度とマルチバンドカメ ラの各検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各基準試料から発する蛍光の各 検出波長帯での強度を算出し、算出された強度を行歹 IJ [[の各成分として使用してもよ い。このように、基準試料力 発する蛍光の各検出波長帯での測定強度は、撮像装 置を使用して直接取得する代わりに、分光器を使用して取得することも可能である。
[0019] さらに別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を定量するシステムに関する。このシステムは、光 検出器、撮像装置および演算装置を備えている。光検出器は、第 1一第 m蛍光色素 の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基準試料の各々から発する蛍 光を検出し、その蛍光の強度を測定する。撮像装置は、異なる第 1一第 k (kは 2以上 の整数)の検出波長帯と、撮像装置の異なる感度特性を設定する第 1一第 q (qは 2以 上の整数)の感度モードとを有している。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なって いる。この撮像装置は、ターゲット試料の蛍光画像を各検出波長帯および各感度特 性で撮像する。演算装置は、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のあ る部位における第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
1一 c を算出する。
m
[数 5]
Figure imgf000010_0001
L L 2 ...
Figure imgf000010_0002
ここで、 P (vは 1以上 q以下の整数）は k X 1の行列であり、 Pの第 i行成分 P (iは 1以 上 k以下の整数）は、第 i検出波長帯および第 V感度モードで撮像されたターゲット試 料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。 Jは (k' q) X mの行列 であり、 Jの成分行列 L (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成分 L は、第 j基準試料
1
力 発する蛍光の第 i検出波長帯および第 V感度モードで測定された強度である。
[0020] 上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重 なりに影響されない。このため、この定量システムによれば、重なり合う蛍光スペクトル を有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、このシステムによって定量 可能な蛍光色素の数は (検出波長帯の数） X (感度モードの数)である。したがって、 感度モードの数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。
[0021] さらに別の側面において、本発明は、ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を定量するシステムに関する。このシステムは、光 源、光検出器、撮像装置および演算装置を備えている。光源は、異なる波長スぺタト ルを有し第 1一第 m蛍光色素をすベて励起する第 1一第 r (rは 2以上の整数)の励起 光を生成する。光検出器は、第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独 で含む第 1一第 mの基準試料への各励起光の照射に応じて各基準試料から発する 蛍光の強度を測定する。撮像装置は、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波 長帯を有している。隣り合う検出波長帯は、部分的に重なっている。撮像装置は、タ 一ゲット試料への各励起光の照射に応じてターゲット試料の蛍光画像を各検出波長 帯で撮像する。演算装置は、次の式で示される演算を実行して、ターゲット試料のあ る部位における第 1一第 m蛍光色素の濃度 c一 c を算出する。
1 m
[数 6]
厂ゾ ·
Figure imgf000011_0001
0 ¾ O？f…
Figure imgf000011_0002
ここで、 Qu(uは 1以上 r以下の整数）は k X 1の行列であり、 Quの第 i行成分 Q (iは 1 以上 k以下の整数）は、第 u励起光の照射に応じて第 i検出波長帯で撮像されたター ゲット試料の蛍光画像において上記部位に対応する画素の値である。 J
2は (k'r) X mの行列であり、 Jの成分行列 T (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成分 T は、第 u
2 U] iu] 励起光の第 j基準試料への照射に応じて第 i検出波長帯で測定された蛍光の強度で ある。
[0022] 上記の計算式は、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素の蛍光スペクトルの重 なりに影響されない。このため、この定量システムによれば、重なり合う蛍光スペクトル を有する複数の蛍光色素の濃度が精度よく求まる。また、このシステムによって定量 可能な蛍光色素の数は (検出波長帯の数） X (励起光の種類の数)である。したがつ て、励起光の種類の数に応じて定量可能な蛍光色素の数を増やすことができる。
[0023] 本発明の定量システムにおいて、撮像装置は、ターゲット試料の蛍光画像を第 1一 第 k検出波長帯で撮像して第 1一第 kの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と 、上記の演算装置としての演算回路と、を含んでいてもよい。第 1一第 kの画像信号 は、この演算回路に入力される。演算回路は、第 1一第 kの画像信号を用いて演算を 実行し、ターゲット試料の複数の部位における濃度 c一 c を算出して、第 1一第 mの
1 m
蛍光色素の濃度分布を表す第 1一第 mの画像信号を生成してもよい。この定量シス テムでは、撮像装置が、自身の取得したターゲット試料の蛍光画像信号を用いて蛍 光色素の濃度を算出し、濃度分布を表す画像信号を生成する。したがって、この定 量システムは、定量結果を迅速に提示することができる。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は蛍光色素定量システムの一例の構成を示すブロック図である。
[図 2]図 2は蛍光色素の濃度を定量する手順を示すフローチャートである。
[図 3]図 3は定量の第 2段階を説明するための図である。
[図 4]図 4は定量結果の表現方法の例を示す図である。
[図 5]図 5は定量結果の表現方法の例を示す図である。
[図 6]図 6は定量結果の表現方法の例を示す図である。
[図 7]図 7は蛍光色素定量システムの他の例の構成を示すブロック図である。
[図 8]図 8は Ca2+の濃度と蛍光強度比との関係を示す図である。
[図 9]図 9は 3バンドカメラの感度特性を示す図である。
[図 10]図 10は AlexaFluorおよび Cascade Yellowを混合したターゲット試料から取得し た分光データを示す図である。
[図 11]図 11は Fura2および CascadeYellowを混合したターゲット試料から取得した分 光データを示す図である。
[図 12]図 12は AlexaFluorおよび Cascade Yellowを混合したターゲット試料からバンド パスフィルタを通して測定した分光データを示す図である。
[図 13]図 13は Fura2および CascadeYellowを混合したターゲット試料からバンドパスフ ィルタを通して取得した分光データを示す図である。
[図 14]図 14は第 1および第 2実施例で算出された Alexa Fluorおよび Cascade Yellow の濃度を示す図である。
[図 15]図 15は第 3実施例および比較例で算出された Alexa Fluorおよび Cascade Yellowの濃度を示す図である。
[図 16]図 16は第 1および第 2実施例で算出された Fura2および Cascade Yellowの濃 度を示す図である。
[図 17]図 17は第 3実施例および比較例で算出された Fura2および Cascade Yellowの 濃度を示す図である。
[図 18]図 18は基準試料およびターゲット試料の実測の蛍光スペクトルを示す図であ る。
[図 19]図 19は第 1実施例で得られた蛍光色素の濃度を用いて算出されたターゲット 試料の蛍光スペクトルを示す図である。
[図 20]図 20は第 2実施例で得られた蛍光色素の濃度を用いて算出されたターゲット 試料の蛍光スペクトルを示す図である。
[図 21]図 21は蛍光色素定量システムの他の例の構成を示すブロック図である。
[図 22]図 22は蛍光色素の定量に関する種々のデータを示す図である。
[図 23]図 23はマルチバンドカメラに搭載された電子回路を示すブロック図である。
[図 24]図 24は第 8実施形態で取得した画像を示す写真である。
[図 25]図 25は比較例で取得した画像を示す写真である。
[図 26]図 26は 4バンドカメラの感度特性を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、添付図面を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。なお、図面 の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
[0026] 第 1実施形態
図 1は、本実施形態の蛍光色素定量システムの構成を示すブロック図である。定量 システム 100は、光源 10、蛍光顕微鏡 20、マルチバンドカメラ 30およびパーソナル コンピュータ 40を有する。コンピュータ 40には、ディスプレイ装置 42およびプリンタ 4 4が接続されている。定量システム 100は、ターゲット試料に含まれる蛍光色素の濃 度を定量する。定量システム 100は、 3種類までの蛍光色素の濃度を定量できる。な お、本実施形態では、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が何であるかはあら力じめ 分かっている。 [0027] 光源 10は、試料 1を励起するための光を生成し、試料 1に照射する。光源 10は、白 色光を発する Xeランプ 10aおよび多色発光型の LEDlObを有しており、いずれか一 方が選択的に使用される。 Xeランプ 10aおよび LEDlObのいずれを使用するかは、 コンピュータ 40によって制御される。本実施形態では、 Xeランプ 10aが使用される。
[0028] 蛍光顕微鏡 20は、光源 10からの光の照射によって試料 1から発する蛍光の光学像 を所定の倍率で取得し、それをマルチバンドカメラ 30に送る。蛍光顕微鏡 20は、光 源 10からの光を受け取るバンドパスフィルタ 22と、試料 1から発する蛍光を受け取る バンドパスフィルタ 24とを有している。バンドパスフィルタ 22は、試料 1に含まれる蛍 光色素の励起に不要な波長成分を光源 10の光力も除去するために使用される。バ ンドパスフィルタ 24は、試料 1に含まれる蛍光色素から発する蛍光と異なる波長の光 を遮断するために使用される。これら一対のフィルタ 22および 24は、フィルタセットと 呼ばれることがある。
[0029] マルチバンドカメラ 30は、蛍光顕微鏡 20から蛍光の光学像を受け取り、その電気 的な画像データを生成する撮像装置である。本実施形態では、マルチバンドカメラ 3 0は、異なる三つの検出波長帯を有しており、これらの検出波長帯に感度を有してい る。これらの検出波長帯は、通常、 R (赤）、 G (緑)および B (青）に対応している。以下 では、これらの検出波長帯を R波長帯、 G波長帯および B波長帯と呼ぶ。隣り合う検 出波長帯は、部分的に重なっている。すなわち、 R波長帯と G波長帯は部分的に重 なっており、 G波長帯と B波長帯も部分的に重なっている。マルチバンドカメラ 30は、 これらの検出波長帯に対応する三つの撮像素子 (例えば CCD)と、入力光の波長成 分を三つの検出波長帯に分離して、対応する撮像素子に送る色分解プリズムを含ん でいる。このほかに、マルチバンドカメラ 30は、カラーモザイクフィルタ等が印刷され た一つの撮像素子（例えば CCD)を含んでいてもよい。マルチバンドカメラ 30は、 R、 Gおよび B波長帯の各々で蛍光像を検出し、それらの波長帯に対応した R、 Gおよび B出力を生成する。 R、 Gおよび B出力は、それぞれ Gおよび B波長帯で検出され た蛍光像の画像データである。この画像データは、蛍光の強度を示す値を各画素に おいて有している。各画素は、試料 1の一つの部位に対応する。
[0030] 後で詳細に説明するように、マルチバンドカメラ 30は、二つの動作モードを有する。 一つは、標準の感度特性を有する High Lightモードであり、もう一つは、全感度が標 準よりもわずかに高い Low Lightモードである。本実施形態では、カメラ 30は High Lightモードでのみ動作する。
[0031] コンピュータ 40は、定量システム 100による蛍光色素の定量を制御する装置である 。コンピュータ 40は、光源 10に光源切替信号を送信し、 Xeランプ 10aと LEDlObの いずれを使用するかを制御する。また、コンピュータ 40は、マルチバンドカメラ 30によ つて取得されたターゲット試料の蛍光画像データを用いてターゲット試料中の各蛍光 色素の濃度を算出する演算装置としても機能する。コンピュータ 40は、この制御およ び演算のためのソフトウェアを格納する記憶装置を有して 、る。このソフトウェアは、 記録媒体 46から記憶装置に読み込まれてもよい。コンピュータ 40は、このソフトゥェ ァにしたがって上記の制御および演算を実行する。
[0032] 以下では、図 2を参照しながら、定量システム 100を用いてターゲット試料中の蛍光 色素の濃度を定量する方法を説明する。図 2は、定量の手順を示すフローチャートで ある。この定量方法は、大きく 2段階に分かれている。第 1の段階にはステップ S202 および S204が該当し、第 2の段階にはステップ S206— S212が該当する。
[0033] 第 1段階では、定量の基礎となるデータを取得する。まず、この基礎データを取得 するために基準試料を作成する (ステップ S202)。基準試料は、ターゲット試料に含 まれる複数の蛍光色素の各々を単独で含む試料である。したがって、基準試料は、 ターゲット試料中の蛍光色素と同数だけ作成される。各基準試料は、各蛍光色素を 所定の濃度で含んでいる。以下では、この濃度を単位濃度と呼ぶ。単位濃度は、基 準試料ごとに異なって 、てもよ 、。
[0034] 次に、定量システム 100を用いて各基準試料の蛍光画像データを取得する (ステツ プ S204)。 Xeランプ 10aから白色光が放出され、バンドパスフィルタ 22を透過して基 準試料に照射される。これにより、基準試料中の蛍光色素が励起され、蛍光が発する 。バンドパスフィルタ 22を透過した光は、すべての基準試料を励起することの可能な 波長スペクトルを有して 、る。
[0035] マルチバンドカメラ 30は、蛍光顕微鏡 20を介して基準試料の蛍光像を受け取り、 それを画像データに変換する。蛍光像はマルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび B波長 帯の各々で検出される。したがって、マルチバンドカメラ 30は、一つの基準試料に対 して、三つの検出波長帯で取得された三つの画像データを生成する。これらの画像 データは、コンピュータ 40に送られ、コンピュータ 40内の記憶装置に保存される。こ れがーつの基準試料にっ 、て取得された基礎データである。すべての基準試料に ついて同様の測定が行われ、基礎データが保存される。こうして定量の第 1段階が終 了する。
[0036] 各基礎データの各画素は、マルチバンドカメラ 30を用いて測定された蛍光強度を 示す値を有している。 R、 Gおよび B波長帯で取得された画素値は、それぞれ R値、 G 値および B値と呼ばれることがある。
[0037] 以下では、図 3を参照しながら定量の第 2段階を説明する。第 2段階では、基礎デ ータを用いてターゲット試料中の各蛍光色素の濃度を算出する。まず、 Xeランプ 10a 力もバンドパスフィルタ 22を介してターゲット試料に光を照射してターゲット試料中の すべての蛍光色素を励起し、ターゲット試料の蛍光画像を取得する (ステップ S206) 。このステップは、ターゲット試料が生きている細胞の場合など、ターゲット試料の活 動状態に応じて蛍光色素の濃度が時々刻々と変化するような場合には、その変化を 測定するために連続的に複数回行ってもよい。 Xeランプ 10aから発する光の強度は 、基準データの取得のために基準試料を励起するときと同じである。マルチバンド力 メラ 30は、試料 1から発する蛍光像を蛍光顕微鏡 20を介して受け取り、画像データ に変換する。蛍光像はマルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび B波長帯の各々で検出さ れる。したがって、図 3に示されるように、マルチバンドカメラ 30は、ターゲット試料に 対して三つの検出波長帯で取得された三つの画像データ 51— 53を生成する。これ らの画像データはコンピュータ 40に送られる。以下では、これらの画像データをター ゲットデータと呼ぶことがある。
[0038] 次に、コンピュータ 40は、ステップ S206で取得したターゲットデータとステップ S20 4で取得した基礎データとを用いて、蛍光色素の濃度を画素ごとに算出する (ステツ プ S208)。以下では、この定量計算の理解を容易にするため、ターゲット試料の一 部位における蛍光色素の濃度の定量を説明する。ターゲット試料の一部位は、蛍光 画像中の一画素に対応する。ターゲット試料には、 2種類の蛍光色素が含まれている ものとする。この場合、ステップ S 202において基準試料も 2種類用意される。
コンピュータ 40は、以下の式で示される演算によりターゲット試料中の一部位にお ける第 1および第 2蛍光色素の濃度 cおよび cを求める。なお、この濃度 cおよび c
1 2 1 2 は、上述した単位濃度、すなわち第 1および第 2基準試料における第 1および第 2蛍 光色素の濃度を単位としている。したがって、第 1蛍光色素の実際の濃度は、第 1蛍 光色素の単位濃度に cを乗算した値であり、第 2蛍光色素の実際の濃度は、第 2蛍 光色素の単位濃度に cを乗算した値である。このことは、後述する他の実施形態でも
2
同じである。
[数 7]
=( ゾ广厂
Figure imgf000017_0001
B ここで、行歹 はステップ S204で取得した基礎データを示す。行歹 IJ [[の第 1列における Rf 、 Gf および Bf は、第 1蛍光色素のみを含む第 1の基準試料に^ついてステップ S
- 204にて取得された R、 Gおよび B値である。行歹 IJ [[の第 2列における Rf 、 Gf および
2 2
Bf は、第 2蛍光色素のみを含む第 2の基準試料についてステップ S 204にて取得さ
2
れた R、 Gおよび B値である。 R 、G および B は、ターゲット試料についてステップ tgt tgt tgt
S206にて取得された R、 Gおよび B値である。（1)式において JTは行歹 IJ [[の転置行列 を表す。上記の式は後で詳しく説明する。
[0040] コンピュータ 40は、すべての画素について（1)式の演算を実行し、第 1および第 2 蛍光色素の濃度を画素ごとに求める。これにより、図 3に示されるように、二つの蛍光 色素の濃度分布データ 61および 62が得られる。
[0041] 次に、コンピュータ 40は、これらの濃度分布データ 61および 62を用いて定量結果 表示用の画像データを生成する (ステップ S210)。この画像データは、二つの蛍光 色素のターゲット試料上における濃度分布を示す。この画像データは、ディスプレイ 装置 42に送られる。これにより、図 3に示されるように、蛍光色素のターゲット試料上 における濃度分布を示す画像 63がカラーバー 64とともにディスプレイ装置 42上に表 示される（ステップ S212)。なお、コンピュータ 40は、この濃度分布画像 63および力 ラーバー 64をプリンタ 44を用いて印刷することもできる。
[0042] 以下では、上記（1)および (2)式を詳しく説明する。ターゲット試料中の蛍光色素か ら発する蛍光の強度は、その蛍光色素の濃度に比例して増加する。これらの色素か ら発する蛍光については、加法定理が成り立つ。したがって、ある一つの画素におい てマルチバンドカメラ 30によって取得される R、 Gおよび B値は、次の式で表される。
[数 8]
Figure imgf000018_0001
Btgt = ; - c! + - c) - b? - dZ (3.3) ここで、 f および f は単位濃度の第 1および第 2蛍光色素から発する蛍光の強度であ
1 2
り、 cおよび cは第 1および第 2蛍光色素のターゲット試料中の濃度である。 R 、 G
1 2 tgt tgt および B は、ターゲット試料の一部位に対するマルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび t t
B値である。 r、 gおよび bは、 R、 Gおよび B波長帯におけるマルチバンドカメラ 30の感 度特性である。ノラメータ f および f ならびに!:、 gおよび bに付された添字えは、これ
1 2
らのパラメータが波長の関数であることを示す。
[0043] f -c は、ターゲット試料中の第 1蛍光色素から発する、ある一つの波長を有する 蛍光の強度である。同様に、 f -c は、ターゲット試料中の第 2蛍光色素力も発する 、ある一つの波長を有する蛍光の強度である。加法定理が成立することから、ある一 つの波長を有する蛍光の強度の合計は (f -c +f -c )
1 λ 1 λ 2 λ 2 λ である。マルチバンド力 メラ 30は、この蛍光強度を R、 Gおよび B波長帯の各々で検出する。 (3. 1)式に示さ れるように、ターゲット試料から取得された R値は、各波長における総蛍光強度 (f · c +f -c )に尺波長帯の感度特性 r を乗算し、それを全波長にわたって積分し たものである。同様に、ターゲット試料から取得された G値または Β値は、総蛍光強度 (f -c +f -c )に0波長帯または B波長帯の感度特性 g または b を乗算し、そ
1 λ 1 λ 2 λ 2 λ X X れを全波長にわたって積分したものである。このように、ターゲット試料からの蛍光の R、 Gおよび B値は、各波長での蛍光強度とその波長に対応するカメラ 30の感度とを 掛け合わせ、それを全波長にわたって積分した値である。マルチバンドカメラ 30の感 度特性の一例は、図 9に示されている。この図については後述する。
(3. 1)一（3. 3)式を一つの行列式に書き直すと、次のようになる。
[数 9]
二 (4)
Figure imgf000019_0001
(4)式をさらに書き直すと、次のようになる。
[数 10]
' 2え ' え
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000019_0004
(5)式に示されるように、ターゲット試料の蛍光の R、 Gおよび B値は、以下に示す行 歹 に蛍光色素の濃度行列を掛けることにより算出される。
[数 11]
Figure imgf000019_0003
J2 2义
1^ - b - dZ \ f2, b3 ' c! 行歹 IJ [[の第 1列における三つの成分は、第 1蛍光色素の単位濃度下における蛍光 強度をマルチバンドカメラ 30を用いて測定することにより得られる R、 Gおよび B値で ある。これは、第 1基準試料の測定により得られる上述の Rf 、 Gf および Bf に等しい 。同様に、行歹 の第 2列における三つの成分は、第 2蛍光色素の単位濃度下におけ る蛍光強度をマルチバンドカメラ 30を用いて測定することにより得られる R、 Gおよび B値であり、これは、第 2基準試料の測定により得られる上述の Rf 、 Gf および Bf に
2 2 2 等しい。したがって、行歹 のすベての成分は、これらの基準試料から発する蛍光を マルチバンドカメラ 30で測定することにより求めることができる。つまり、行歹 はステツ プ S204で取得される基礎データと等価である。
[0046] (5)式を変形すると、上記の（1)式が得られる。コンピュータ 40は、基礎データ Jを 用いて上記（1)式の演算を実行し、各画素における蛍光色素の濃度 cおよび cを算
1 2 出する。ターゲット試料の一部位に含まれる蛍光色素の濃度は、このようにして定量 される。
[0047] 上記（1)および (2)式をより一般的な形に書き直すと、次のようになる。
[数 12]
Figure imgf000020_0001
ここで、ターゲット試料には、第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素が含まれて おり、マルチバンドカメラは、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯を有 しているものとする。 O一 Oは、マルチバンドカメラを用いて第 1
1 k 一第 k検出波長帯で 撮像されたターゲット試料の蛍光画像中のある一画素の値である。 Jは k X mの行列 であり、 Jの第 i行第 j列成分 J (iは 1以上 k以下の整数、 jは 1以上 m以下の整数）は、 第 j基準試料力も発する蛍光の第 i検出波長帯での測定強度である。
[0048] 本実施形態では、 Jは、マルチバンドカメラを用いて第 i検出波長帯で撮像された第 j基準試料の蛍光画像において o 1— Oと同じ画素の値である。ただし、 が
k J ij o 1— o k と同じ画素の値である必要は必ずしもない。例えば、基準試料が特定の部位でのみ 蛍光を発する場合は、その部位に対応する任意の一つの画素の値を Jとし、すべて の画素に対する定量演算においてこの Jを共通に使用してもよい。この場合、 Jの画 素は o 1 oの画素と必ずしも一致しない。
k
[0049] 次に、定量結果の表現方法について説明する。定量結果の表現方法はさまざまで あるが、以下では具体例をいくつか挙げる。図 4は、表現方法の一例を示している。こ の方法は、ターゲット試料に含まれる二つの蛍光色素の濃度分布をモノクロ画像 71 および 72として表現する。画像 71および 72では、蛍光色素の濃度が輝度によって 表される。各画像内には、濃度分布のほかにモノクロバー 73も表示される。また、図 5 に示されるように、各蛍光色素の濃度分布を偽カラーを用いて表示してもよい。図 5 については、後でより詳細に説明する。二つの蛍光色素の分布の違いを明示したい ときは、これらの蛍光色素の濃度の比を算出し、濃度比分布をモノクロ画像として表 示し、あるいは偽カラーを用いて表示してもよい。
[0050] このほかに、すべての画素における蛍光色素の濃度を色彩 3次元空間内にプロット することにより定量結果を表現してもよい。図 6は、色彩 3次元空間を利用する表現方 法の一例を示している。この例では、均等色空間である L * a * b *空間内に蛍光色 素濃度がプロットされる。図 6において a *軸は第 1の蛍光色素に対応した色味を示し 、 b *軸は第 2の蛍光色素に対応した色味を示す。また、 L *軸は明るさを示す。図 6 における 2次元位置は、二つの蛍光色素の濃度比を示す。
[0051] 以下では、本実施形態の利点を従来技術との対比により説明する。従来技術では 、光源の出力光から一つの蛍光色素の励起に使用する波長成分を抽出するフィルタ と、試料から発する蛍光からその蛍光色素に対応する波長成分を抽出するフィルタ の組み合わせ、すなわちフィルタセットを使用する。このフィルタセットは、各蛍光色 素に対して用意され、蛍光顕微鏡内に設置される。例えば、紫外励起で主に青色蛍 光を観察するためのフィルタセット、青色励起で主に緑色蛍光を観察するためのフィ ルタセット、および緑色励起で主に赤色蛍光を観察するためのフィルタセットが用意 される。これらのフィルタセットを適宜切り替えながら、モノクロカメラで各蛍光色素か らの蛍光画像を撮像する。各画素の値が蛍光色素の濃度を示すものとして扱われる
[0052] しかし、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルが重なり合って!/、る場合には、これらの色 素からの蛍光をバンドパスフィルタで完全に分離することはできない。したがって、蛍 光スペクトルの重なりが大きいときには、定量の精度が低い。また、フィルタセットを切 り替えながら繰り返し蛍光画像を取得する必要がある。このため、複数の蛍光色素の 濃度を同時に定量できない。これは、ターゲットが生物試料である場合に問題となる 。さらに、フィルタセットの切り替えの際に光学系にわずかな変化が生じ、それにより 複数の蛍光色素間で定量の精度に差が出るおそれがある。 [0053] これに対し、本実施形態は、蛍光色素の蛍光スペクトルの重なりに影響されな!ヽ計 算式を用いて蛍光色素の濃度を算出する。このため、蛍光スペクトルの重なりの有無 にかかわらず、蛍光色素の濃度を精度よく求めることができる。これは、後述する実施 例を参照することにより、いっそう明ら力となる。
[0054] また、本実施形態は、フィルタセットを切り替えることなくマルチバンドカメラ 30を用 いてターゲット試料の蛍光画像を取得することにより定量を行う。このため、本実施形 態の方法は、複数の蛍光色素の濃度を同時に求めることができ、したがって、ターゲ ットが生物試料である場合にも好適に使用できる。さらに、定量中に光学系を変更し ないので、複数の蛍光色素の濃度を均一の精度で求めることができる。したがって、 本実施形態の方法により得られる蛍光色素の濃度は信頼性が高い。
[0055] 第 2実施形態
図 1に示されるように、本実施形態の蛍光色素定量システム 200は、上記の定量シ ステム 100の構成に加えて分光器 35を有している。分光器 35は、蛍光顕微鏡 20に よって取得された蛍光像を受光できるように配置されている。蛍光顕微鏡 20は、カメ ラ 30と分光器 35の双方に蛍光像を送るための光学素子、例えばノヽーフミラーを有し ていてもよい。あるいは、分光器 35は、カメラ 30との交換で設置されてもよい。
[0056] 本実施形態は、上記のステップ S204における基礎データの取得方法が第 1実施 形態と異なっている。すなわち、本実施形態では、マルチバンドカメラ 30ではなく分 光器 35を用いて基礎データを取得する。この場合でも、第 1実施形態と同様の利点 が得られる。本実施形態における他の定量手順は第 1実施形態と同様である。
[0057] マルチバンドカメラ 30を用いて取得される基礎データ Jは、上記（2)式に示されるよ うに、基準試料からの蛍光をマルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび B波長帯の各々で 測定することにより得られる画素値である。上記（6)式に示されるように、これらの画 素値は、単位濃度下における蛍光色素の各波長での蛍光強度とその波長に対応す るカメラ 30の感度特性とを掛け合わせ、それを全波長にわたって積分した値である。 この積分は近似的に次のように書き直せる。
[数 13] — ， -
— ··· λ n f 112
S 13 ^113 f2,s (9) 一 ... ■■■ b A3n _ - 一 f ί λ n -
=Js
ここで、 λΐ、え 2、…え ηは、任意の幅で全波長域を分割して得られる分光波長帯を 表す。 ηは 2以上の整数であり、分光波長帯の数を表している。 r 、g および b (t は 1一 ηの整数）は、分光波長帯え tでのマルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび B感度 特性を示している。 f および f は、単位濃度の第 1および第 2蛍光色素から発す
l t 2Xt
る蛍光の分光波長帯え tにおける強度を示している。（9)式では、 R、 Gおよび B感度 特性ならびに第 1および第 2蛍光色素の単位濃度下での蛍光強度が、各分光波長 帯にお 、て一定の値を有するものとみなされて 、る。
[0058] これらの分光波長帯における第 1および第 2蛍光色素の単位濃度下での蛍光強度 は、分光器 35を用いて測定することができる。すなわち、第 1および第 2基準試料か ら発する蛍光を分光器 35を用いて検出すれば、分光波長帯え 1、 λ2、 ·'·ληにお ける第 1および第 2蛍光色素の単位濃度下での蛍光強度 f 、f 、···ί および f
111 1X2 Ιλη 2
、 f 、 · · 'f が取得される。これが（9)式の右辺第 2項に示される分光データであ る。
[0059] 本実施形態では、コンピュータ 40は、（9)式の右辺第 1項に相当するマルチバンド カメラ 30の分光感度特性を記憶装置に格納している。コンピュータ 40は、分光器 35 を用いて各基準試料力も分光データを取得すると、上記 (9)式の演算を実行し、 (9) 式に示される行歹 sを算出する。
[0060] この行歹 sと基礎データである行歹 とは、理想的には一致する。しかし、実際には 、マルチバンドカメラ 30と分光器 35とを関係づけるためには、較正のための係数およ び関係の誤差を軽減するための係数が必要である。このため、行歹 ^Jsにその係数 の表記が必要となる。そのため、 Jijsの関係は、次のように表される。
[数 14] J = a js (10) ここで、 aは補正用の定数である。定数 aは、 Xeランプ 10aからの白色光を NDフィル タを介してマルチバンドカメラ 30および分光器 35の各々で検出し、測定された光強 度の比を算出することにより決定される。
[0061] このように、コンピュータ 40は、分光器 35を用いて取得した分光データとマルチバ ンドカメラ 30の分光感度特性とを用いて（9)および（10)式に示される演算を実行し、 基礎データ Jを算出する。この基礎データ Jは、すべての画素における蛍光色素濃度 の算出に共通して使用される。この場合でも良好な精度で蛍光色素濃度を定量する ことができる。
[0062] (9)式および（10)式に示されるように、マルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび B値は 、分光器 35によって取得される分光データとマルチバンドカメラ 30の感度特性を用 いて算出することができる。より一般的に述べると、マルチバンドカメラ 30の R、 Gおよ び B値と分光器 35の分光データを用いて算出される R、 Gおよび B値とは定数 aを用 いて相互に変換することができる。したがって、基準試料だけでなくターゲット試料か らの蛍光も分光器 35で測定して分光データを取得し、その分光データ力も R、 Gおよ び B値を算出し、上記（1)式の計算を行えば、カメラ 30を使用せずとも蛍光色素の濃 度を求めることができる。ただし、分光器 35は一度に試料中の一部位の分光データ しか取得できない。このため、蛍光色素濃度の分布を求める場合は、マルチバンド力 メラ 30のような撮像装置を用いてターゲット試料の蛍光画像を撮像するほうが効率が よい。
[0063] 上記の説明では、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が何であるかはあら力じめ分 力つているものとされている。しかし、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が分かって いなくても、蛍光色素の種類を特定し、そのうえで濃度を定量することが可能である。 この場合は、基礎データとして、様々な既知の蛍光色素の分光スペクトルがあらかじ め測定され、あるいは公開されている分光スペクトルがあら力じめ取得される。この基 礎データは、コンピュータ 40内の記憶装置に格納される。コンピュータ 40は、分光器 を用いてターゲット試料の一部位力 取得した分光データと一つ以上の任意の蛍光 色素の基礎データを使用して、上記（1)式の計算を行う。次に、コンピュータ 40は、 算出した濃度値を用いて、使用した基礎データに対応する蛍光色素をターゲット試 料が含んでいるとしたときの分光スペクトルを算出する。コンピュータ 40は、こうしてシ ミュレートされた分光スぺ外ルを、分光器を用いて実際に測定されたターゲット試料 の分光スペクトルと比較し、その Fitting度合 、が所定のしき 、値以上であるか否かを 判定する。コンピュータ 40は、このような判定アルゴリズムにしたがって実測のスぺタト ルに十分に近いシミュレートスペクトルを与える蛍光色素を探すことにより、ターゲット 試料に含まれる蛍光色素を特定する。また、蛍光色素が特定されれば、第 1実施形 態の方法によって、全画素上における蛍光色素の濃度を算出することが可能である
[0064] また、基礎データとして、既知のスペクトルを用意しておかなくても、ターゲット試料 群の測定系の中で、主成分分析を行い、その結果の主成分スペクトルを基準スぺタト ルとして計算し、濃度計算を行うこともできる。即ち、上記の様にあたりをつける目的 の、前準備した基礎データを有さなくても、試料群のなかから、成分的に主成分と考 えられる理想的な基準スペクトルを形づくり、それを基にした定量計算も可能である。 このため、例えば、試料自身が有する蛍光発光物質の成分定量も可能である。また、 これと上記との組み合わせ計算も可能である。
[0065] 第 3実施形態
本実施形態は、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が 4種類以上のときの定量に関 する。蛍光色素が 4種類以上の場合、マルチバンドカメラの検出波長帯の数を蛍光 色素の数に応じて増やしていけば、検出波長帯と同数までの蛍光色素を定量できる o実際、「NHK技研 R&D」（No. 52、 53— 60頁、 1998年）に記載される光学系 を使用すれば、 4バンドのマルチカメラを得ることはできる。し力し、 5バンドや 6バンド のカメラを実現するための光学系を考案することは難し 、。
[0066] そこで、本実施形態では、第 1および第 2実施形態と同様に 3バンドのカメラ 30を使 用して 4種類以上の蛍光色素を定量する。上述のように、マルチバンドカメラ 30は、 Low Lightモードおよび High Lightモードという二つの感度モードを有する。 Low Light モードは各検出波長帯に標準の感度特性を設定し、 High Lightモードは各検出波長 帯に Low Lightモードよりも全感度がわずかに咼ぃ感度特性を設定する。 Low Light モードおよび High Lightモードの双方において、隣り合う検出波長帯は部分的に重 なっている。このマルチバンドカメラ 30は、すべての検出波長帯において異なるゲイ ンを有する二つのアナログ回路を有している。 High Lightモードでは全検出波長帯に おいてゲインの低い回路が使用され、 Low Lightモードでは全検出波長帯において ゲインの高い回路が使用される。
[0067] マルチバンドカメラ 30の Low Lightモードでの R、 Gおよび B値を R 、 G および
tgt-l tgt-l
B とし、 High Lightモードでの R、 Gおよび B値を R 、G および B とすると、 tgt-l tgt-h tgt-h tgt-h 次の式が成り立つ。
[数 15]
Figure imgf000026_0001
ここで、 r、 gおよび bは、マルチバンドカメラ 30の Low Lightモードにおける R、 Gおよ
1 1 1
び B波長帯の感度特性であり、 r、 gおよび bは、マルチバンドカメラ 30の High
h h h
Lightモードにおける R、 Gおよび B波長帯の感度特性である。
[0068] (11)式の右辺第 1項の 6 X 6行列が本実施形態における基礎データ ^である。すな わち、以下の式が成り立つ。
[数 16]
Figure imgf000026_0002
行歹1 の第 1列における六つの成分は、第 1蛍光色素の単位濃度下における蛍光強 度をマルチバンドカメラ 30の Low Lightモードおよび High Lightモードにて測定するこ とにより得られるマルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび B値である。同様に、行歹 の第 2—第 5列における六つの成分は、第 2—第 6蛍光色素の単位濃度下における蛍光 強度をマルチバンドカメラ 30の Low Lightモードおよび High Lightモードにて測定す ることにより得られるマルチバンドカメラ 30の R、 Gおよび B値である。したがって、行 歹 のすベての成分は、第 1および第 2基準試料力 発する蛍光をマルチバンドカメ ラ 30の Low Lightモードおよび High Lightモードの双方で検出することにより求めるこ とがでさる。
[0069] (11)式は、次のように書き直すことができる。
[数 17]
Figure imgf000027_0001
したがって、基準試料力もの蛍光を測定することにより基礎データ ^を取得し、その後 、ターゲット試料からの蛍光をマルチバンドカメラ 30の Low Lightモードおよび High Lightモードの双方で検出し、得られる R、 Gおよび B値を（13)式に代入することによ り、 6種類までの蛍光色素の濃度を算出することができる。
[0070] この実施形態では 3バンドのカメラを使用して 6種類までの蛍光色素を定量する力 4バンドのカメラを使用すれば、同様の手法により 8種類までの蛍光色素を定量でき る。より一般的に述べると、マルチバンドカメラの検出波長帯の数にマルチバンドカメ ラの感度特性の数を乗じた数までの蛍光色素を定量することが可能である。
[0071] 上記（13)および（12)式をより一般的な形に書き直すと、次のようになる。
[数 18]
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
ここで、ターゲット試料には、第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素が含まれて おり、マルチバンドカメラは、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯と、 第 1一第 k検出波長帯に対して異なる感度特性を設定する第 1一第 q (qは 2以上の 整数）の感度モードとを有しているものとする。成分行列 P— P X l
1 kは k の行列である
。行列 Pの第 i行成分 P (Vは 1以上 q以下の整数、 iは 1以上 k以下の整数）は、マル チバンドカメラを用いて第 i検出波長帯および第 V感度モードで撮像されたターゲット 試料の蛍光画像における一つの画素の値である。 Jは（k' q) X mの行列であり、 Jの 成分行列 L (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成分 L は、マルチバンドカメラの第 i 検出波長帯および第 V感度モードで撮像された第 j基準試料の蛍光画像において P と同じ画素の値である。
[0072] 第 4実施形態
本実施形態は、第 3実施形態と同様に、ターゲット試料に含まれる蛍光色素が 4種 類以上のときの定量に関する。第 3実施形態では、マルチバンドカメラの感度モード を 2種類用意し、それにより検出波長帯の数 X 2までの蛍光色素の定量を可能にす る。これに対し、本実施形態では、異なる波長スペクトルを有する複数の種類の励起 光を用いて試料を励起し、それにより検出波長帯の数 X励起光の種類数までの蛍光 色素の定量を可能にする。
[0073] より具体的に述べると、本実施形態では、試料を励起するための光源として、多色 発光型 LEDlObを使用する。この LEDlObは、異なる主波長を有する複数の種類の 出力光を放出することができる。いずれの種類の出力光も、ターゲット試料に含まれ るすべての蛍光色素を励起可能な波長スペクトルを有している。基礎データは、各出 力光を基準試料に照射して蛍光色素を励起することにより発生する蛍光に基づいて 取得される。基礎データは、第 1実施形態のようにマルチバンドカメラを用いて蛍光 画像を撮像することにより取得してもよいし、第 2実施形態のように分光器の分光デ ータを用いて算出してもよ 、。
[0074] 同様に、ターゲットデータも、 LEDlObの各出力光をターゲット試料に照射して蛍 光色素を励起し、カメラ 30を用いて蛍光画像を撮像することにより取得される。励起 光の波長特性が異なれば、蛍光色素から発する蛍光の波長特性も異なる。したがつ て、 LEDlObの出力光の主波長を切り替えながら基礎データおよびターゲットデータ を取得することにより、マルチバンドカメラ 30の検出波長帯の数に励起光の種類数を 乗じた数までの蛍光色素の定量が可能になる。例えば、励起光の波長特性が 2種類 あれば 6種類までの蛍光色素を定量することができ、波長特性が 3種類あれば 9種類 までの蛍光色素を定量することができる。
[0075] 一般的には、コンピュータ 40は、次の式で示される演算を実行して各蛍光色素の 濃度を算出する。
[数 19]
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
ここで、ターゲット試料には、第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素が含まれて おり、マルチバンドカメラは、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯を有 しているものとする。成分行列 Q— Qは k X Iの行列である。行列 Q (uは 1以上 r以 l k u
下の整数)の第 i行成分 Q (iは 1以上 k以下の整数）は、第 U励起光の照射に応じて 第 i検出波長帯で撮像されたターゲット試料の蛍光画像における一つの画素の値で ある。 Jは (k'r) X mの行列であり、 Jの成分行列 T (jは 1以上 m以下の整数)の第 i
2 2 uj
行成分 T は、第 u励起光の照射に応じてマルチバンドカメラの第 i検出波長帯で撮 像された第 j基準試料の蛍光画像において Q と同じ画素の値である。
[0076] なお、本実施形態では多色発光型 LEDlObを光源として使用する力 この代わり に、異なる波長スペクトルの光を発する複数の光源 (LEDなど）を使用してもよい。ま た、 LEDlObの代わりに、出力波長が可変の光源を使用してもよい。例えば、 Xeラン プの出力光力もモノクロメータを用いて特定の波長成分を抽出し放射する光源 10c や、 Xeランプの出力光力 波長フィルタを用いて特定の波長成分を抽出し放射する 光源 10dを使用することができる。
[0077] 第 5実施形態
本実施形態は、基礎データおよびターゲットデータの取得に使用する光学装置が 上記実施形態と異なる。上記実施形態では、マルチバンドカメラまたは分光器を用い て基礎データを取得する力 本実施形態では、複数のバンドパスフィルタとモノクロ力 メラを用いて基礎データを取得する。また、上記実施形態ではマルチバンドカメラを 用いてターゲットデータを取得する力 本実施形態では、複数のバンドパスフィルタと モノクロカメラを用いてターゲットデータを取得する。
[0078] 図 7は、本実施形態の蛍光色素定量システムの構成を示すブロック図である。この 定量システム 300は、上記の定量システム 100におけるマルチバンドカメラ 30をモノ クロカメラ 32で置き換えた構成を有している。また、本実施形態では、ノ ンドパスフィ ルタ 24として、ターゲット試料に含まれる複数の蛍光色素に対応した複数のバンドパ スフィルタが使用される。これらのバンドパスフィルタは、互いに異なる透過波長帯を 有している。これらの透過波長帯は完全に分離しており、重なりを有さない。バンドパ スフィルタ 24としては、例えば干渉フィルタを使用することができる。 [0079] 本実施形態では、バンドパスフィルタ 24を用いてターゲット試料の蛍光力も各蛍光 色素の蛍光成分を抽出し、それをモノクロカメラ 32で検出する。これにより、各蛍光色 素の蛍光画像が個別に撮像される。モノクロカメラ 32を用いて測定された蛍光強度 は上記実施形態と同様の定量計算に使用され、それにより各蛍光色素の濃度が算 出される。また、本実施形態では、基礎データを取得する際にも各基準試料力 の蛍 光を各バンドパスフィルタ 24を介してモノクロカメラ 32で検出する。
[0080] 以下では、定量計算の理解を容易にするため、ターゲット試料中に第 1および第 2 の蛍光色素が含まれて 、るとし、ターゲット試料の一部位における蛍光色素の濃度 の定量を説明する。この場合、上記実施形態と同様に、第 1および第 2蛍光色素の各 々を単独で含む第 1および第 2の基準試料が用意される。コンピュータ 40は、以下の 式で示される演算を行ってターゲット試料の一部位における蛍光色素の濃度を求め る。
[数 20]
Figure imgf000031_0001
ここで、 Oは第 1蛍光色素用のフィルタ 24を通して撮像されたターゲット試料の蛍光 画像中のある一画素の値であり、 Oは第 2蛍光色素用のフィルタ 24を通して撮像さ
2
れたターゲット試料の蛍光画像中の同じ画素の値である。 J は第 1蛍光色素用のフ
11
ィルタ 24を通して撮像された第 1基準試料の蛍光画像において Oおよび Oと同じ画
1 2 素の値である。 J は第 2蛍光色素用のフィルタ 24を通して撮像された第 1基準試料
12
の蛍光画像において oおよび Oと同じ画素の値である。 J は第 1蛍光色素用のフィ
1 2 21
ルタ 24を通して撮像された第 2基準試料の蛍光画像において Oおよび Oと同じ画
1 2 素の値である。 J は第 2蛍光色素用のフィルタ 24を通して撮像された第 2基準試料
22
の蛍光画像において oおよび oと同じ画素の値である。
1 2
[0081] 上記（22)式および（23)式を一般化すると、次のようになる。
[数 21] _
Figure imgf000032_0001
ここで、ターゲット試料には第 1 第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素が含まれてお り、これに応じて第 1 第 mのバンドパスフィルタが用意されるものとする。 Oは (jは 1 以上 m以下の整数）は、第 j蛍光色素用のフィルタを通して撮像されるターゲット試料 中の蛍光画像中のある一画素の値である。行歹 の第 i行第 j列成分 J (iは 1以上 m以 下の整数）は、第 j蛍光色素用のフィルタを通して撮像されたる第 i基準試料の蛍光画 像において Oと同じ画素の値である。
[0082] 本実施形態の方法は、ターゲット試料力もの蛍光をバンドパスフィルタを通して検出 する。このため、複数の蛍光色素の蛍光スペクトルが大きく重なり合つている場合は、 本実施形態の方法の定量精度は上記実施形態に比べると劣る。しかし、この方法は 、バンドパスフィルタを通して検出した蛍光強度を直接蛍光色素の濃度として扱う従 来技術に比べると、より高い定量精度を有している。これは、上記の計算式が蛍光ス ベクトルの重なりの有無に影響されな 、ためである。従来技術よりも優れた定量精度 は、本発明者による実験によっても確かめられている。
[0083] 第 6実施形態
本実施形態は、本発明を細胞の生理的活性の測定に応用する。すなわち、本実施 形態ではターゲット試料が細胞である。細胞の生理的活性を測定するために、細胞 がもつ受容体や酵素などの機能性分子を蛍光色素で標識し、蛍光色素の濃度を定 量することにより、機能性分子の量や分布を測定することができる。同一の細胞内に 存在する複数の種類の分子を同時に測定する場合は、それらの分子を励起波長お よび蛍光波長の異なる複数の蛍光色素で標識し、蛍光色にしたがって分子を識別す る。
[0084] この場合、各蛍光色素からの蛍光をバンドパスフィルタを用いて抽出および検出し 、蛍光強度を求めることが考えられる。しかし、これらの色素の蛍光スペクトルが大きく 重なる場合は、複数の色素からの蛍光をフィルタで分離しきれな 、ために分子の識 別が困難である。
[0085] これに対し、本実施形態は、図 1に示す定量システムを用い、図 2に示す手順にし たがって細胞中の蛍光色素の濃度を定量する。本実施形態の定量システム 100は、 事前に取得した基礎データとマルチバンドカメラ 30によって取得された R、 Gおよび B 値を用いて計算により蛍光色素の濃度を求める。基礎データは、上記実施形態に関 して述べた!/、ずれの方法で取得してもよ!/、。複数の色素からの蛍光を分離して検出 する必要がないので、分子の識別が容易である。したがって、本実施形態の定量シ ステム 100は、細胞の生理活性の測定に有用である。
[0086] 以下では、ターゲット試料が細胞のときに考慮すべき事項を説明する。
[0087] 第 1に、細胞の厚さを補正することが好ましい場合がある。本発明の方法で蛍光色 素の濃度を定量するためには、基準試料およびターゲット試料からの蛍光を測定す るときの試料中の光路長が等しいことが好ましい。光路長が変わると同じ濃度の試料 でも蛍光強度が変わるためである。ターゲット試料が細胞のとき、蛍光色素を含んだ 細胞の厚さ、すなわち光路長はせいぜい 10 mほどである。基準試料が蛍光色素 の溶液である場合、このようなオーダーの厚さの溶液試料を精度よく作成することは 困難である。また仮にできたとしても、一つの細胞内にはその形状に応じて厚みの分 布があり、これは個々の細胞で異なる。これに対し、溶液試料では全視野にわたって 一定の光路長となる。したがって、特定の細胞を測定する場合、溶液試料を基準試 料として使用できないことがある。
[0088] 使用される顕微鏡が共焦点の光学系をもっていれば、その顕微鏡は一定の光路長 の蛍光像を取得するため、溶液試料を基準試料として使用できる。共焦点の光学系 をもたな ヽ顕微鏡の場合、細胞の厚みの補正法としては次のようなものが考えられる 。例えば、細胞内に含まれる F1および F2という蛍光色素の濃度分布を測定する場 合、これらの色素に加えて細胞全体を均一に染色する蛍光色素 F3を細胞に与える (Calcein, CellTrackerなど)。これらの三つの色素で染色した細胞をターゲット試料と し、これら三つの色素を単独に含む色素溶液を基準試料として測定して本発明の方 法で計算を行うと、細胞の厚みの成分を含んだ各色素の濃度分布が求まる。このうち 色素 F3は細胞全体にわたって均一の濃度で分布しているため、求められた濃度分 布は細胞の厚みの分布と比例する。色素 F3の各画素での濃度を各画素の細胞の厚 みの係数として用い、算出された F1および F2の各画素の濃度をこの値で除算するこ とにより、細胞の厚みの違 、を補正した濃度分布を得ることができる。
[0089] この場合、基準試料とした溶液試料の光路長を正確に知ることが困難なため、蛍光 色素の濃度の絶対値を得ることはできない。しかし、細胞内の色素の濃度の分布を 正確に把握するうえで、この補正は有用である。
[0090] 第 2に、基準試料が細胞であるとき、シェーディング補正を行うことが好ま 、場合 がある。蛍光色素によっては、色素単独では蛍光が微弱で、細胞内の特定の分子と 結合したときにのみ強い蛍光を発するものがある。例えば DAPIなど、核酸を染色す るための色素にはそのようなものが多い。また、 GFPなどの蛍光蛋白質に関しては、 遺伝子を細胞に導入することで細胞内で蛍光色素を作ることはできる力 細胞外で の色素試料の作製は困難である。そのような色素に関しては、溶液試料を基準試料 として使うことができない。このような蛍光色素を定量する場合、その蛍光色素を用い て染色した細胞にぉ 、て蛍光を発して 、る領域から基礎データを取得する。細胞の 画像を取得し、その中から選択した領域内の蛍光強度の平均値を基準濃度に対す る蛍光強度として使用する。この値を全画素についての基準濃度に対する蛍光強度 として割り当てる。
[0091] 通常、蛍光顕微鏡における励起光の照明は視野全体にわたって均一ではない。こ のため、溶液試料のように均一に色素が分布する試料からの蛍光を蛍光顕微鏡で観 察すると、励起光の強さに応じて画像内に蛍光が強い部分と弱い部分が生じてしまう 。この現象はシェーディングと呼ばれる。各画素の基準濃度の値はこのシエーデイン グの情報を含んだものでなくてはならない。基準試料として溶液試料を使用した場合 は、このシェーディングの情報を含んだデータを得ることができる。しかし、細胞試料 を使い、その一部の領域力 基準データを取得する場合は、シェーディングの情報 を得ることができない。
[0092] このような場合、シェーディングのデータを得るために、定量で使用するものと同じ 光学系（フィルタ、ダイクロイツクミラー、レンズなど）を使用して蛍光を検出可能な蛍 光色素の溶液から蛍光画像を取得する。これをシェーディング画像として使用し、画 素ごとに演算を行うことで、基準試料の画像 (全画素に同じ蛍光強度が与えられた画 像）にシェーディングの情報を与えることができる。そのための演算方法としては、次 のようなものが考えられる。
[0093] I =1 X I /\
RC S R S-MAX
I
RC：シェーディング情報が与えられた基準試料画像の輝度
I
R：元の基準試料画像の輝度
I
S：シェーディング画像の輝度
I
S-MAX：シェーディング画像の輝度の最大値
[0094] あるいは、ターゲット試料の画像のシェーディングを補正し、基準試料の画像として 全画素に同じ蛍光強度が与えられた画像をそのまま使用する方法も考えられる。この 場合、ターゲット試料の画像のシェーディングを補正するための演算方法として、次 のようなものが考えられる。
[0095] I =1 X I /\
TC T S-MAX S
I
TC：シェーディングが補正されたターゲット試料画像の輝度
I
T：元のターゲット試料画像の輝度
I
S：シェーディング画像の輝度
I
S-MAX：シェーディング画像の輝度の最大値
[0096] 上記の演算で得られた基準試料画像またはターゲット試料画像を用いて上記（1) 式に示される計算を行うことにより、シェーディングの影響が補正された蛍光色素の 濃度分布画像を得ることができる。この場合、基準試料とした溶液試料の光路長を正 確に知ることが困難なため、蛍光色素の濃度の絶対値を得ることはできない。しかし、 細胞内の色素の濃度の分布を正確に把握するうえで、この補正は有用である。
[0097] 第 7実施形態
本実施形態は、本発 を FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)の測 定に応用する。 FRETは、ある蛍光分子に対して与えられた励起エネルギーが別の 蛍光分子に移動する現象である。励起エネルギーを与える蛍光分子はドナーと呼ば れ、励起エネルギーを受け取る蛍光分子はァクセプタと呼ばれる。ドナーおよびァク セプタは、分子に蛍光色素を与えることにより生成される。
[0098] FRETが発生すると、ドナーの蛍光強度が低下し、ァクセプタの蛍光強度が増加す る。そのため、 FRETの測定は次のように行われることが多い。ドナーを励起する波 長の光をターゲット試料に照射し、ターゲット試料から発する蛍光を検出する。このと き、試料からの蛍光をバンドパスフィルタを用いてドナーの蛍光の波長域およびァク セプタの蛍光の波長域に分光する。これにより、ァクセプタおよびドナーの蛍光強度 を別個に測定し、ァクセプタ Zドナーの蛍光強度の比を算出する。この蛍光強度比 を用いて FRETを解析することができる。
[0099] し力し、 FRETと!、う現象の性質上、ドナーとァクセプタの蛍光スペクトルは大きくは 離れておらず、その一部が重なり合うことが多い。そのため、バンドパスフィルタでは 互いに蛍光を完全に分離できず、 FRET測定の精度が低下してしまう。
[0100] 本発明は、このような FRET測定の問題点を解決することができる。本実施形態は 、図 1に示す定量システムを用い、図 2に示す手順にしたがって FRETを測定する。 まず、ドナー用の蛍光色素を所定の単位濃度で単独で含むドナー基準試料および ァクセプタ用の蛍光色素を所定の単位濃度で単独で含むァクセプタ基準試料を用 意する (ステップ S 202)。これらの基準試料を励起し、各蛍光色素からの蛍光の強度 を R、 Gおよび B波長帯の各々で測定し、得られた測定強度を基礎データとして保存 する（ステップ S204)。蛍光強度の測定には、マルチバンドカメラ 30を使用してもよい し、分光器 35を使用してもよい。この後、ターゲット試料中のドナーを励起し、ターゲ ット試料力も発するドナー蛍光およびァクセプタ蛍光をマルチバンドカメラ 30を用い て検出する（ステップ S 206)。このステップ S206は、ターゲット試料が生きている細 胞の場合など、ターゲット試料の活動状態に応じてターゲット試料内の FRET量が時 々刻々と変化するような場合には、その変化を測定するために連続的に複数回行つ てもよい。この後、上記の（1)式にしたがってドナー用蛍光色素およびァクセプタ用 蛍光色素の濃度を算出し (ステップ S208)、これらの色素の濃度分布を示す画像を ディスプレイ装置 42上に表示する（ステップ S210および S212)。
[0101] 本実施形態では Ca2+を含む Cameleon溶液（14 μ g/ml)をターゲット試料として 使用する。 Cameleonは、その分子内にドナーとしての蛍光色素 CFPとァクセプタと しての蛍光色素 YFPを含んでいる。また Cameleonは、これらの蛍光色素の間に Ca 2+と結合する部位も含んでいる。 Cameleonに Ca2+が結合すると、分子の構造が変 化し、それに応じて CFP力 YFPへの FRETが顕著となる。その結果、 CFPの蛍光 が低下し、 YFPの蛍光が増加する。 Ca2+濃度が高まると、それに応じて YFPZCFP の蛍光強度比も高まる。
[0102] 本実施形態では、ターゲット試料中の Ca2+の濃度を段階的に変えながら CFPおよ び YFPの濃度を定量し、その濃度に単位濃度当たりの蛍光強度を乗算して CFPお よび YFPの蛍光強度を算出する。そして、これらの蛍光強度を用いて YFPZCFPの 蛍光強度比を算出する。
[0103] 図 8は、ターゲット試料中の Ca2+の濃度と本実施形態で算出された蛍光強度比と の関係を示している。本実施形態との比較のため、図 8には、従来の方法で求められ た蛍光強度比も示されている。この方法では、ターゲット試料からの蛍光をマルチバ ンドカメラ 30で検出し、マルチバンドカメラ 30の G値を YFPの蛍光強度、 B値を CFP の蛍光強度とみなして GZBの比を計算する。図 8において、菱形は従来の方法によ り求められた蛍光強度比を示し、四角はマルチバンドカメラ 30を用いて取得した基礎 データに基づく蛍光強度比を示し、三角は分光器 35を用いて取得した基礎データ に基づく蛍光強度比を示して ヽる。
[0104] 図 8に示されるように、本実施形態の方法で取得した蛍光強度比は、 Ca2+の濃度 変化に応じて、従来法で取得した蛍光強度比よりも大きく変化する。このことは Ca2+ 濃度の微妙な変化を検出するときに有利である。従来法にぉ ヽて YFPの蛍光を測 定するカメラ 30の G波長帯では、 CFPの蛍光も検出される。したがって、 G波長帯で は、 FRETにより YFPの蛍光強度が増加する一方で CFPの蛍光が減少する。これに よりカメラ 30の G値の増加が抑えられ、それに応じて蛍光強度比の変化が抑えられて いると考えられる。これに対し、本実施形態の方法では、蛍光の混在に影響されない 計算式を用いて蛍光強度を算出するので、 Ca2+の濃度変化に応じて蛍光強度比が 感度よく変化する。
[0105] 本実施形態では、図 5に示される表現方法を用いて定量結果が表示される。この方 法では、蛍光色素の濃度情報が偽カラーを用いて表示される。具体的には、第 1お よび第 2の蛍光色素の濃度分布が画像 81および 82として表示される。これらの画像 81および 82では、蛍光色素の濃度が輝度によって表される。 FRET解析では一般 的にこれら二つの蛍光色素の強度比、すなわち濃度比によって FRETの量が評価さ れるため、画像 83では、算出された蛍光強度比の分布が偽カラーを用いて示されて いる。さらに、蛍光強度比を図 8のグラフのように Ca2+濃度と関連づけることで、蛍光 強度比の値を Ca2+濃度の値に変換することもできる。画像 84では Ca2+濃度の分布 が偽カラーを用いて示されている。これらの画像 81— 84内には、カラーバー 85も表 示される。
[0106] 以下では、本実施形態の利点を従来技術との対比により説明する。本実施形態と 同様に主に演算によって蛍光強度比を求める方法としては、 Gerald W. Gordonらに よる 文1' quantitative fluorescence Resonance Energy t ransfer Measurements Using Fluorescence MicroscopyJ (Biophysical Journal、 ^¾ 4卷、 2702一 2713頁、 1 998年 5月）に開示されるものが知られている。この方法は、本実施形態と同様に 3種 類の試料を用意する。また、この方法では、 3種類のバンドパスフィルタ、すなわちド ナーを励起してドナーの蛍光を測定するためのフィルタ、ァクセプタを励起してァクセ プタの蛍光を測定するためのフィルタ、およびドナーを励起してァクセプタの蛍光を 測定するためのフィルタが使用される。この方法は、これらの試料とフィルタを組み合 わせで 9個の測定値を取得し、数学的な演算によって FRETの値を求める。
[0107] しかし、本実施形態の方法は、 Gordonらの方法よりも 、つそう簡便である。なぜなら 、 Gordonらの方法では蛍光を 9回測定するのに対し、本実施形態の方法では蛍光測 定の回数が 3回で済むからである。このように、本発明の定量方法を FRETに応用す ると、ァクセプタ Zドナーの蛍光強度比を簡易かつ迅速に取得することができる。
[0108] 第 1実施例
以下では、幾つかの実施例を挙げて本発明を更に説明する。本発明者は、図 1に 示される定量システム 100を使用し、第 1実施形態の方法にしたがって蛍光色素の 定量を行った。マルチバンドカメラ 30としては、浜松ホトニタス社製 3板式カラーカメラ ORCA-3CCD C7780を使用した。図 9は、カメラ 30の分光感度特性を示している。す でに述べたように、カメラ 30は Law Lightモードと High Lightモードという 2種類の感度 モードを有している。図 9における実線力Law Lightモードにおける感度特性を示し、 波線が High Lightモードにおける感度特性を示している。本実施例では、 Low Light モードでの R、 Gおよび B値を定量計算に使用した。
[0109] 使用した蛍光色素は、 Alexa Fluor350、 Fura2および Cascade Yellowの 3種類である 。本発明者は、これらのうち二つを適当な濃度で混合した 3種類の溶液をターゲット 試料として調製した。これら 3種類の色素溶液は、すべて吸収波長が同一波長帯 (3 50— 440nm)にある。この波長帯の光をこれらの色素溶液に照射して色素を励起す ると、これらの溶液は互いに異なるスペクトルを有する蛍光を発する。ノンドパスフィ ルタ 22はこの波長帯に等しい透過波長帯を有しており、 Xeランプ 10aの白色光から この波長帯の成分を抽出して励起光を生成する。
[0110] 以下では、具体的な定量手順を説明する。まず、基準試料を調製した。カメラ 30の 感度に応じて適正な蛍光強度が得られるように各蛍光色素の単位濃度を決め、その 単位濃度で各蛍光色素を単独で含む溶液を調製した。こうして得られる 3種類の溶 液が基準試料である。
[0111] 次に、これらの基準試料を用いて基礎データを取得した。具体的には、各基準試 料を励起し、各基準試料カゝら発する蛍光画像をカメラ 30を用いて撮像した。この撮 像は、露光 30msecおよび Gain=Lowの条件下で行った。カメラ 30の R、 Gおよび B 波長帯で取得された画像データはコンピュータ 40の記憶装置内に保存された。これ らの画像データの画素値が、定量計算で使用される基礎データである。
[0112] 次いで、 2種類の基準試料を適当な割合で混合したターゲット試料を作成し、この ターゲット試料に励起光を照射する。ターゲット試料の蛍光画像をカメラ 30を用いて 撮像し、画像データを取得する。この画像データの画素値がターゲットデータである 。コンピュータ 40は、基礎データとターゲットデータを使用し、上記（1)式に示される 演算を画素ごとに実行して、ターゲット試料中における二つの蛍光色素の濃度分布 を算出した。
[0113] 第 2実施例
本発明者は、カメラ 30の代わりに分光器 35を用いて基礎データおよびターゲットデ ータを取得することも行った。分光器 35としては、浜松ホトニタス社製 PMA-l l (c7473 、 BTCCD 200-950nm)を用いた。分光器 35を用いた基準試料からの蛍光の測定は 、光源モードで sZn= 18、 Gain= Middle,波長間隔 = lnmの条件下で行った。コ ンピュータ 40は、分光器 35によって取得された分光データに 5point (5nm)の smoo thing処理を施した。
[0114] 参考のため、ターゲット試料から取得した分光データを図 10および図 11に示す。
図 10は、蛍光色素 Alexa Fluorおよび Cascade Yellowを様々な比率で混合したター ゲット試料から取得した分光データを示して 、る。これらの色素から発する蛍光のピ ーク波長の間隔は比較的広ぐ約 l lOnmである。図 11は、蛍光色素 Fura2および Cascade Yellowを様々な比率で混合したターゲット試料から取得した分光データを示 している。これらの色素力 発する蛍光のピーク波長の間隔は比較的狭ぐ約 30nm である。上述のように、これらの分光データには smoothing処理が施されている。
[0115] コンピュータ 40は、基準試料およびターゲット試料力 取得した分光データを用い て上記（9)、（10)および（1)式に示される演算を実行し、色素の濃度を算出した。基 準試料力 取得したすべての分光波長帯の分光データに図 9に示される感度特性を 乗算してから加算し、さらに（10)式に示される補正用の係数 aを乗算することにより、 基礎データ Jが算出された。同様に、ターゲット試料力も取得したすべての分光波長 帯の分光データに図 9に示される感度特性を乗算してから加算し、さらに補正用の係 数 aを乗算することにより、ターゲットデータ R 、G および B が算出された。この演
tgt tgt tgt
算には、 smoothing処理された 300— 780nmにおける 5nm刻みの分光データが使 用された。分光器 35は試料中の一部位のみを測定できる。コンピュータ 40によって 算出された数値は、その測定部位における色素濃度を示している。
[0116] 第 3実施例
本発明者は、第 5実施形態の方法にしたがって蛍光色素の濃度を定量することも 行った。この実施例では、基準試料およびターゲット試料から発する蛍光の強度をバ ンドパスフィルタを通して測定した。 3種類の蛍光色素の蛍光スペクトルに応じて三つ のバンドパスフィルタを使用した。第 1のバンドパスフィルタは、中心波長 440nmとバ ンド幅 21nmを有している。第 2のバンドパスフィルタは、中心波長 510nmとバンド幅 23nmを有している。第 3のバンドパスフィルタは、中心波長 546nmとバンド幅 10nm を有している。
[0117] バンドパスフィルタを透過した蛍光はモノクロカメラを用いて検出した。モノクロカメラ としては、浜松ホトニタス社製モノクロデジタルカメラ ORCA-Πを使用した。蛍光画像 の撮影は、露光 30msec、 Gain = Low,ビユング 4 * 4の条件下で行った。
[0118] コンピュータ 40は、モノクロカメラによって撮像された蛍光画像の画素値を用いて上 記（22)および（23)式に示される演算を行った。これにより、ターゲット試料中の二つ の蛍光色素の濃度が算出された。
[0119] また、参考までに、第 2実施例で使用したものと同じ分光器を使用して蛍光強度を 測定した。具体的には、分光器を用いて lnm刻みの蛍光強度を測定し、すべての分 光波長帯における蛍光強度を積算することにより蛍光強度を算出した。
[0120] 図 12は、蛍光色素 Alexa Fluorおよび Cascade Yellowを様々な比率で混合したター ゲット試料力もバンドパスフィルタを通して測定した分光データを示している。また、図 13は、蛍光色素 Fura2および Cascade Yellowを様々な比率で混合したターゲット試料 力もバンドパスフィルタを通して測定した分光データを示している。
[0121] 比較例
本発明者は、上記実施例との比較のため、ターゲット試料力 発する蛍光力 バン ドバスフィルタを用いて各色素の蛍光を抽出し、その蛍光をモノクロカメラで撮影した 。使用したバンドパスフィルタは、第 3実施例と同じである。モノクロカメラとしては、浜 松ホトニタス社製モノクロデジタルカメラ ORCA-Πを使用した。蛍光画像の撮像は、露 光 30msec、 Gain = Low,ビニング 4水 4の条件下で行った。
[0122] この例では、次の式 (従来式）にしたがってターゲット試料中の二つの蛍光色素の 濃度 cおよび cを算出した。
[数 22]
Figure imgf000041_0001
ここで、 Sample SIおよび Sample S2は、ターゲット試料の蛍光からバンドパスフィルタ を用いて抽出された蛍光の強度であり、 Kijyun SIおよび Kijyun S2は、基準試料から 発する蛍光の強度である。これらの式から明らかなように、本例では、バンドパスフィ ルタを通して測定された蛍光の強度を各蛍光色素の濃度として扱っている。
[0123] 濃度計算結果
まず、図 14および図 15を参照しながら、蛍光スペクトルの重なりが少ない Alexa Fluorおよび Cascade Yellowの定量結果を説明する。図 14は、第 1および第 2実施例 で算出された Alexa Fluorおよび Cascade Yellowの濃度を示している。図 15は、第 3 実施例および比較例で算出された Alexa Fluorおよび Cascade Yellowの濃度を示して いる。これらの図において、横軸は色素の混合比を示し、縦軸は色素の濃度を示し ている。濃度は各色素の単位濃度を 1として表示されている。 Alexa Fluorの単位濃度 は 2 μ Μ (マイクロモル）であり、 Cascade Yellowの単位濃度は 1 μ Μである。
[0124] 図 14において菱形は第 1実施例で算出された Alexa Fluorの濃度を示し、四角は第 2実施例で算出された Alexa Fluorの濃度を示し、三角は第 1実施例で算出された Cascade Yellowの濃度を示し、 Xは第 2実施例で算出された Cascade Yellowの濃度 を示している。図 15において菱形は第 3実施例で算出された Alexa Fluorの濃度を示 し、四角は比較例で算出された Alexa Fluorの濃度を示し、三角は第 3実施例で算出 された Cascade Yellowの濃度を示し、 Xは比較例で算出された Cascade Yellowの濃 度を示している。また、これらの図において、一点鎖線はターゲット試料における Alexa Fluorの実際の濃度を示し、波線はターゲット試料における Cascade Yellowの 実際の濃度を示している。
[0125] 図 14と図 15を比較すると分力るように、中心波長の間隔が比較的広い Alexa Fluor および Cascade Yellowの定量精度は、実施例と比較例とでほとんど変わらない。これ は、これらの色素間で蛍光スペクトルの重なりが小さいためである。
[0126] 次に、図 16および図 17を参照しながら、蛍光スペクトルの重なりが大きい Fura2お よび Cascade Yellowの定量結果を説明する。図 16は、第 1および第 2実施例で算出 された Fura2および Cascade Yellowの濃度を示している。図 17は、第 3実施例および 比較例で算出された Fura2および Cascade Yellowの濃度を示している。これらの図に おいて、横軸は色素の混合比を示し、縦軸は色素の濃度を示している。濃度は各色 素の単位濃度を 1として表示されている。 Fura2の単位濃度は 4 Mであり、 Cascade Yellowの単位濃度は 0. 8 μ Μである。
[0127] 図 16において菱形は第 1実施例で算出された Fura2の濃度を示し、四角は第 2実 施例で算出された Fura2の濃度を示し、三角は第 1実施例で算出された Cascade Yellowの濃度を示し、 Xは第 2実施例で算出された Cascade Yellowの濃度を示して いる。図 17において菱形は第 3実施例で算出された Fura2の濃度を示し、四角は比 較例で算出された Fura2の濃度を示し、三角は第 3実施例で算出された Cascade Yellowの濃度を示し、 Xは比較例で算出された Cascade Yellowの濃度を示している。 また、これらの図において、一点鎖線はターゲット試料における Fura2の実際の濃度 を示し、波線はターゲット試料における Cascade Yellowの実際の濃度を示している。
[0128] 図 16と図 17を比較すると分力るように、中心波長の間隔が比較的狭い蛍光を発す る Fura2および Cascade Yellowの定量精度は、実施例と比較例とで大きく異なってい る。これは、これらの色素間で蛍光スペクトルの重なりが大きいためである。比較例の 方法では、一方の色素の蛍光が他方の色素の蛍光に混在したまま検出されるので、 定量の精度が大きく低下する。これに対し、実施例の方法では、蛍光スペクトルの重 なりに影響されることなぐ高い精度で色素濃度を定量することができる。
[0129] 第 3実施例では、比較例と同じように、バンドパスフィルタを通して試料からの蛍光 を検出する。この場合でも比較例より優れた定量精度を得られることが図 17から分か る。これは、第 3実施例で使用する計算式 (22)および (23)式と比較例で使用する（ 26. 1)および（26. 2)式との違いに起因する。ただし、図 16と図 17の比較力も分か るように、バンドパスフィルタを介さずに蛍光を検出する第 1および第 2実施例では、 第 3実施例よりもさらに優れた定量精度を得ることができる。この原因は、第 1および 第 2の実施例では隣接する検出波長帯が重なっており、かつ評価を行う全波長帯を カバーしているのに対し、第 3実施例では隣接する検出波長帯が重なっておらず、ま たスポット的に一部位の波長帯域のみのデータを扱っているため、ターゲットサンプ ルの評価波長帯全域をカバーしておらず、データ欠如があることによるものと考える ことができる。
[0130] また、図 14および図 16から明らかなように、蛍光強度をカメラで測定しても、蛍光強 度を分光器で測定し分光データを用いて計算を行った場合と遜色のな!、定量精度 を得ることができる。これ力も明らかなように、第 1実施例における手法、すなわちマル チバンドカメラを用いた測定は、測定しょうとする、ある任意幅の波長域での分光デ ータに、カメラの感度関数と同等の特性を掛け合わせて蛍光強度を求める。したがつ て、カメラを用いた測定は、基本的には分光器を用いた測定のように全波長域にわ たってデータを採取したときと同等の情報を取得している。そのため、カメラを用いて も分光と同等の精度の定量を行うことができる。
[0131] また、この実験結果では、カメラによる測定結果と分光器による測定結果に差が生 じている。しかし、本発明者らは、この差の最大の原因が光による色素のダメージに 応じた蛍光強度の減少にあることを解明した。すなわち、分光測定では測定時間が 長すぎ、色素の光量低下が大きすぎた。その後は、分光測定の時間を短くすることで 、カメラによる測定結果と分光器による測定結果とがほぼ合致した。
[0132] 以下では、図 18—図 20を参照しながら、第 1および第 2実施例による定量の精度 を確認する。図 18は、 Fura2を含む基準試料、 Cascade Yellowを含む基準試料、なら びに Fura2および Cascade Yellowを含むターゲット試料の蛍光スペクトルを示して!/、る 。 Fura2の単位濃度は 4 μ Μであり、 Cascade Yellowの単位濃度は 0. 8 μ Μである。 ターゲット試料では、 Fura2および Cascade Yellowが 0. 6 : 1. 4の比率で混合されて いる。実際に分光器を用 、てターゲット試料を測定した結果を図 18中のターゲットス ベクトルとして示す。
[0133] 第 1実施例のカメラ方式での定量計算結果は、 Fra2:CaY=0. 571 : 1. 4005であり 、第 2実施例の分光器方式での定量計算結果は、 Fra2:CaY=0. 528 : 1. 434であ つた。この算出された濃度を対応する基準試料の蛍光スペクトル (以下では、「基準ス ベクトル」と呼ぶ）にそれぞれ掛け合わせて両者の和をとれば、分光強度をシミュレ一 トできる。図 19および図 20は、このようにして計算されたシミュレーションスペクトルを 示している。
[0134] 分光器方式では、基準スペクトルおよびターゲットスペクトルが実際に測定される。
このため、基準スペクトルを用いてシミュレーション計算を行い、得られた蛍光スぺタト ルとターゲットスペクトルとを比較することにより、計算そのものの精度が確認できる。 一方、カメラ系を厳密に考えると、カメラ方式で得られる基準スペクトルおよびターゲ ットスペクトルは分光器方式で得られるそれらとは微妙に違う。このため、カメラ方式 でのシミュレーション計算により得られる蛍光スペクトルと、分光器方式でのシミュレ一 シヨン計算により得られる蛍光スペクトルとで違いが生ずるのは当然である。したがつ て、実際に測定されたターゲットスペクトルとシミュレーショ計算により得られた蛍光ス ベクトルとの偏差量が、そのままカメラ方式および分光器方式の精度を反映するわけ ではない。しかし、概略の精度は確認できるため、この手法を採用することにした。
[0135] 図 18と図 19および図 20とを比較すると明らかなように、実測の蛍光スペクトルと第 1および第 2実施例の定量結果を用いて計算された蛍光スペクトルとは極めて近い形 状を有している。したがって、第 1および第 2実施例は優れた精度で蛍光色素の濃度 を定量できることが分かる。
[0136] 第 8実施形態
以下では、本発明の別の実施形態を説明する。図 21は、本実施形態の蛍光色素 定量システムの構成を示すブロック図である。この定量システム 800は、第 1実施形 態の定量システム 100におけるマルチバンドカメラ 30をマルチバンドカメラ 30aに置 き換えた構成を有している。本実施形態では、パーソナルコンピュータ 40の代わりに 、マルチバンドカメラ 30a内に設けられた論理回路が上記（7)式の演算を実行する。
[0137] 図 22は、本実施形態の定量に関連する種々のデータを示している。第 1実施形態 と同様に、マルチバンドカメラ 30aは、三つの検出波長帯、すなわち R波長帯、 G波 長帯および B波長帯を有している。図 22 (a)は、マルチバンドカメラ 30aの感度特性 を示している。この図に示されるように、隣り合う検出波長帯は、部分的に重なり合つ ている。マルチバンドカメラ 30aは、これらの検出波長帯に対応する三つの撮像素子 と、入力光の波長成分を三つの検出波長帯に分離して、対応する撮像素子に送る色 分解プリズムを含んで 、る。
[0138] 図 23は、マルチバンドカメラ 30aに搭載された信号処理回路を示すブロック図であ る。信号処理回路 31は、上述した三つの撮像素子 101— 103に加えて、増幅器 11 1一 113、 A/Dコンバータ 121— 123、定量演算用の論理回路 130、タイミング調 整回路 141一 143、インタフェース回路 150、駆動回路 160、タイミング発生回路 16 2および制御回路 164を含んで 、る。 [0139] 撮像素子 101— 103は、駆動回路 160によって駆動され、ターゲット試料の蛍光像 をそれぞれ R、 Gおよび B波長帯で撮像し、三つの画像信号を生成する。これらの画 像信号は、増幅器 111一 113によって増幅され、 AZDコンバータ 121— 123によつ てディジタルィ匕されて、定量演算用の論路回路 130に入力される。
[0140] 論路回路 130は、これらの画像信号を用いて上記（7)式に示される演算を実行し、 ターゲット試料中の蛍光色素の濃度を画素ごとに計算する。以下では、（7)式におけ る行列 CiT'J)— を「基準データ M」と表記する。本実施形態では、この基準データ Mは、コンピュータ 40からインタフェース回路 150を介して論路回路 130に入力され る。ただし、この代わりに、マルチバンドカメラ 30a内に設けられた記憶装置に基準デ ータ Mが格納されていてもよい。論理回路 130は、各画素に対して算出した濃度に 応じた値をその画素に割り当てて、ターゲット試料における各蛍光色素の濃度分布 を表す画像信号を生成する。これらの画像信号は、マルチバンドカメラ 30aの R、 Gお よび B出力のいずれかとなる。
[0141] タイミング発生回路 162は、 AZDコンバータ 121— 123、論理回路 130、タイミング 調整回路 141一 143、駆動回路 160および制御回路 164にクロック信号を供給する 。制御回路 164は、外部インタフェース回路 150を通じてコンピュータ 40から命令を 受け取り、その命令に応じて論理回路 130の動作を制御する。例えば、制御回路 16 4は、論理回路 130による（7)式の演算を禁止して、 R、 Gおよび B波長帯で取得した 画像データそのものをマルチバンドカメラ 30aから出力させることもできる。 R、 Gおよ び B出力は、タイミング調整回路 141一 143によって同期され、外部インタフェース回 路 150からコンピュータ 40に送られる。
[0142] コンピュータ 40は、マルチバンドカメラ 30aの R、 Gおよび B出力を用いて定量結果 表示用の画像をディスプレイ装置 42上に表示する。例えば、図 3に示されるように、 R 、 Gおよび B出力を重ね合わせた画像 63をカラーバー 64とともに表示してもよいし、 図 4に示されるように、 R、 Gおよび B出力を分離して別個の画像として表示してもよい 。コンピュータ 40は、これらの画像をプリンタ 44を用いて印刷することができる。
[0143] 以下では、定量システム 800を用いてターゲット試料中の蛍光色素の濃度を定量 する方法を具体例を挙げて説明する。図 22 (b)は、ターゲット試料、ならびに第 1お よび第 2蛍光色素の蛍光スペクトルを示す。このターゲット試料は、 Hela細胞を 2種類 の蛍光色素、 DAPIおよび MitoTracker Greenで染色することにより得たものである。 DAPIは細胞の核、 MitoTracker Greenはミトコンドリアをそれぞれ染色する。 DAPIの 蛍光スペクトルは 460nm付近に、 MitoTracker Greenの蛍光スペクトルは 515nm付 近に、それぞれピークを有する。
[0144] まず、第 1実施形態と同様に、基準試料を用意し、基礎データを取得する。具体的 には、 Hela細胞を DAPIのみ、また MitoTracker Greenのみで染色して、第 1および第 2の基準試料を作成する。これらの基準試料には、 405 ± 5nmの透過波長帯を有す るバンドパスフィルタ 22を通して励起光が照射される。図 22 (c)は、第 1基準試料の 蛍光スペクトルを示し、図 22 (d)は、第 2基準試料の蛍光スペクトルを示している。
[0145] 基準試料力 発する蛍光の光学像は、 420nm以上の透過波長帯を有するバンド パスフィルタ 24を通してマルチバンドカメラ 30aにより撮像される。マルチバンドカメラ 30a中の撮像素子 101— 103は、一つの基準試料に対して、三つの検出波長帯で 取得された三つの画像データを生成する。コンピュータ 40は、制御回路 164に命令 を送って論路回路 130による（7)式の演算を禁止し、これらの画像データをマルチバ ンドカメラ 30aに出力させる。これらの画像データは、コンピュータ 40に送られ、コンビ ユータ 40内の記憶装置に保存される。すべての基準試料について同様の測定が行 われ、画像データが保存される。
[0146] 本実施形態の基準試料では、核やミトコンドリアの分布に応じて蛍光色素が点在す る。このため、基準試料の各蛍光画像から、基準試料中の蛍光を発する部位を表示 する任意の一画素の値を取得し、基礎データとして使用する。図 22 (f)は、第 1基準 試料から取得した、ある一画素の R、 Gおよび B値、すなわち Rf 、 Gf および Bf を示 している。ここで、 Rf = 19. 980、 Gf = 121. 939、 Bf = 252. 900である。図 22 ( g)は、第 2基準試料から取得した、ある一画素の R、 Gおよび B値、すなわち Rf 、 Gf
2 2 および Bf を示している。ここで、 Rf = 17. 536、 Gf = 164. 062、 Bf =8. 926で
2 2 2 2
ある。これらの値が基準試料力 取得された基礎データであり、（2)式に示される行 歹 中の各成分に等しい。
[0147] コンピュータ 40は、こうして取得した行歹 IJ [[を用いて、基準データ Μ、すなわち行列（ JT 'J) _1 'JTを算出する。算出された基準データはコンピュータ 40内の記憶装置に格 納される。後述するように、この基準データ Mは、すべての画素に対する（7)式の演 算に共通して使用される。こうして定量の第 1段階が終了する。
[0148] 次に、バンドパスフィルタ 22を介してターゲット試料に励起光を照射し、ターゲット 試料カゝら発する蛍光の画像をマルチバンドカメラ 30aで撮像する。この結果、論理回 路 130には、 R、 Gおよび B波長帯で撮像された蛍光画像を表す三つの画像信号が 入力される。図 22 (e)は、ターゲット試料の蛍光画像のある一画素の R、 Gおよび B値 、すなわち R 、G および B を示している。ここで、 R = 24. 605、 G = 182. 1
tgt tgt tgt tgt tgt
10、 B = 192. 145である。
tgt
[0149] コンピュータ 40は、制御回路 164に命令を送り、論理回路 130による（7)式 (実際 には（1)式)の演算を許可する。論路回路 130には、コンピュータ 40から基準データ Mも供給される。論路回路 130は、この基準データ Mを用いて、各画素に対して（1) 式の演算を実行し、 DAPIおよび MitoTracker Greenの濃度 cおよび cを算出する。
1 2
図 22 (h)は、図 22 (e)に示される R、 Gおよび B値を有する画素に対して算出された 濃度 cおよび cを示している。ここで、 c = 0. 74、 c = 0. 56である。上記実施形態
1 2 1 2
と同様に、これらの濃度値の単位は、対応する基準試料中の蛍光色素の濃度である
[0150] 論路回路 130は、各画素に対して算出した濃度 c lおよび c2に応じた値をその画素 に割り当てて、ターゲット試料における DAPIおよび MitoTracker Greenの濃度分布を 示す二つの画像信号を生成する。これらの画像信号は、 R、 Gおよび B信号のいずれ 力として論理回路 130から出力される。したがって、 DAPIおよび MitoTracker Green の濃度分布は、異なる色の画像データとしてマルチバンドカメラ 30aからコンピュータ 40に送られる。これらの画像信号は、互いに分離されてコンピュータ 40に送信されて よいし、単一のコンポジット信号に変換されて力 コンピュータ 40に送信されてもよい 。コンピュータ 40は、これらの画像信号を用いて、定量結果を表す画像をディスプレ ィ装置 42上に表示する。
[0151] 図 24は、本実施形態の定量結果画像を示しており、ここで、（a)はマルチバンドカメ ラ 30aの出力画像、（b)はその出力画像から分離された DAPIの濃度分布画像、 (c) はその出力画像カゝら分離された MitoTracker Greenの濃度分布画像である。これらの オリジナルはカラー画像である力 ここでは白黒に変換した画像を示す。 DAPIの画 像では核のみが、 MitoTracker Greenの画像ではミトコンドリアのみが表示されている 。このように、本実施形態の定量システムは、細胞における二つの構造体をリアルタイ ムで明確に分離して表示することができる。
[0152] 比較のため、本発明者らは、上記（1)式の演算を行わない 3バンドカメラを用いてタ 一ゲット試料の蛍光画像を取得した。図 25は、この比較例の定量結果画像を示して おり、ここで、（a)は 3バンドカメラの出力画像であり、（b)および (c)はその出力画像 から抽出した B波長域および G波長域の蛍光画像である。これらもオリジナルはカラ 一画像であるが、ここでは白黒に変換した画像を示す。使用した色素の蛍光スぺタト ルの分布に応じて、 DAPIの蛍光は Bおよび G波長域の両方で検出され、
MitoTracker Greenの蛍光はそのほとんどが G領域で検出される。このため、 B波長 域の画像には DAPIで染色された核の像しか現れな ヽが、 G波長域の画像には MitoTracker Greenで染色されたミトコンドリアの像と DAPIで染色された核の像が重な つて現れてしまう。
[0153] 本実施形態では、パーソナルコンピュータ 40上で動作するソフトウェアの代わりに マルチバンドカメラ 30a内のハードウェアが定量演算を行 、、その演算結果を用いて 濃度分布を表す画像信号を生成する。このため、ソフトウエア処理によって濃度分布 画像を生成する場合に比べて、濃度分布画像を迅速に表示することが可能である。 この結果、ユーザは、ターゲット試料の撮像後、定量の結果をすぐに確認することが できる。
[0154] 本実施形態の手法は、マルチバンドカメラを使用する上記実施形態のいずれにも 応用することができる。また、第 2実施形態のように、基準試料からの基礎データの取 得を分光器 35を用いて行ってもょ 、。
[0155] 以上、本発明をその実施形態に基づいて詳細に説明した。しかし、本発明は上記 実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で様々 な変形が可能である。
[0156] 上記実施形態では、 R、 Gおよび B波長帯を検出波長帯として有する撮像装置が主 に使用されている。しかし、本発明で使用される撮像装置は、他の任意の検出波長 帯を有していてもよい。
[0157] 上記（1)式は、行歹 が正則でな 、場合の式である。行歹 が正則でな 、のは、ター ゲット試料に含まれる蛍光色素の数と検出波長帯の数が一致して 、な 、からである。 第 1実施形態では三つの検出波長帯があるので、ターゲット試料に含まれる蛍光色 素が 3種類であれば、行歹 は正則となる。この場合、（1)式は次のような簡単な形に 書き直される。
[数 23]
Figure imgf000050_0001
[0158] 上記実施形態で使用される 3バンドカメラの代わりに、図 26に示される感度特性を 有する 4バンドカメラを使用してもよい。この 4バンドカメラも Low Lightモードと High Lightモードという二つの感度モードを有している。したがって、第 3実施形態で説明 したように、 8種類までの蛍光色素を定量することが可能となる。また、図 26に示され るように、この 4バンドカメラは近赤外領域に感度を有している。したがって、この 4バ ンドカメラは、近赤外領域に発光領域を持つ蛍光色素の定量に有用である。
[0159] 第 8実施形態で使用されるマルチバンドカメラ 30aは、色分解プリズムと複数の撮像 素子を有している力 これらの代わりにカラーモザイクフィルタ等が印刷された一つの 撮像素子を有して 、てもよ 、。
産業上の利用可能性
[0160] 本発明の方法および定量システムは、重なり合う蛍光スペクトルを有する複数の蛍 光色素の濃度を精度良く定量することができる。

Claims

請求の範囲
[1] ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を、 異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量 する方法であって、
隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
前記第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基 準試料を用意し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強 度を取得することと、
前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮 像することと、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c一 c を算出すること
1 m
を備える方法。
[数 24]
C2
一 c m
Figure imgf000051_0001
ここで、 O一 Oは、前記第 1一第 k検出波長帯で撮像された前記ターゲット試料の蛍
1 k
光画像において前記部位に対応する画素の値である。 Jは k X mの行列であり、 Jの第 i行第 j列成分 J (iは 1以上 k以下の整数、 jは 1以上 m以下の整数）は、前記第 j基準 試料力も発する蛍光の前記第 i検出波長帯での前記測定強度である。
[2] 前記撮像装置は、前記第 1一第 k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んで おり、
各前記基準試料力 発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度の取得は、前 記マルチバンドカメラを用いて各前記基準試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で 撮像し、各前記基準試料中の蛍光を発する部位を表示する一つの画素の値を各蛍 光画像から取得し、
前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c一 c の算出は、前記第 i検出波長帯で撮像され
1 m
た前記第 j基準試料の蛍光画像力 取得された前記画素の値を前記行歹 の成分 j として使用する
請求項 1に記載の方法。
[3] 前記撮像装置は、前記第 1一第 k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んで おり、
各前記基準試料力 発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度の取得は、各 前記基準試料から発する蛍光の分光強度を分光器を用いて測定し、前記分光強度 と前記マルチバンドカメラの各前記検出波長帯に対する感度特性とを用いて、各前 記基準試料力 発する蛍光の各前記検出波長帯での前記測定強度を算出する 請求項 1に記載の方法。
[4] ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を撮 像装置を用いて定量する方法であって、
前記撮像装置は、異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯と、前記撮像 装置の異なる感度特性を設定する第 1一第 q (qは 2以上の整数)の感度モードとを有 しており、
隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
前記第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基 準試料を用意し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯および各前 記感度モードでの測定強度を取得することと、
前記撮像装置を用いて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯およ び各前記感度モードで撮像することと、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c一 c を算出すること
1 m
を備える方法。
[数 25]
Figure imgf000053_0001
L： .
ゾ1
Figure imgf000053_0002
ここで、 P (vは 1以上 q以下の整数）は k X 1の行列であり、 Pの第 i行成分 P (iは 1以 上 k以下の整数)は、前記撮像装置を用いて前記第 i検出波長帯および前記第 V感 度モードで撮像された前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する 画素の値である。 Jは（k' q) X mの行列であり、 Jの成分行列 L (jは 1以上 m以下の
1 1
整数)の第 i行成分 L は、前記第 j基準試料から発する蛍光の前記第 i検出波長帯お よび前記第 V感度モードでの前記測定強度である。
ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を、 異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯を有する撮像装置を用いて定量 する方法であって、
隣り合う前記検出波長帯は、部分的に重なっており、
前記第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基 準試料を用意し、異なる波長スペクトルを有し前記第 1一第 m蛍光色素をすベて励 起する第 1一第 r (rは 2以上の整数)の励起光の各々を前記第 1一第 m基準試料に 照射し、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯での測定強度を取得 することと、
各前記励起光を前記ターゲット試料に照射し、前記撮像装置を用いて前記ターゲ ット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯で撮像することと、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
を備える方法。
[数 26]
Figure imgf000054_0001
T、
Figure imgf000054_0002
ここで、 Qu(uは 1以上 r以下の整数）は k X 1の行列であり、 Quの第 i行成分 Q (iは 1 以上 k以下の整数)は、前記第 u励起光の照射に応じて前記第 i検出波長帯で撮像さ れた前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。 Jは (k'r) X mの行列であり、 Jの成分行列 T (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成
2 2 uj
分 T は、前記第 u励起光の照射に応じて前記第 j基準試料から発する蛍光の前記 第 i検出波長帯での前記測定強度である。
前記撮像装置は、前記ターゲット試料の蛍光画像を前記第 1一第 k検出波長帯で 撮像して第 1一第 kの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、前記第 1一第 kの 画像信号が入力される演算回路と、を含んでおり、
前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c一 c の算出は、前記演算回路が前記第 1一第 k
1 m
の画像信号を用いて前記演算を実行する処理を含んでおり、
前記演算回路に、前記ターゲット試料の複数の部位における前記濃度 c c
1一 mを算 出させ、第 1一第 mの蛍光色素の濃度分布を表す第 1一第 mの画像信号を生成させ ることを更に備える請求項 1一 5のいずれかに記載の方法。 [7] ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を定 量するシステムであって、
前記第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基 準試料の各々力 発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する光検出器と、 異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯を有し、前記ターゲット試料の蛍 光画像を各前記検出波長帯で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長 帯が部分的に重なっている撮像装置と、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
1一 c を算出する演算装置と、
m
を備える蛍光色素濃度定量システム。
[数 27]
Figure imgf000055_0001
ここで、 O された前記ターゲット試料の蛍
1一 Oは、前記第 1
k 一第 k検出波長帯で撮像
光画像において前記部位に対応する画素の値である。 Jは k X mの行列であり、 Jの第 i行第 j列成分 J (iは 1以上 k以下の整数、 jは 1以上 m以下の整数）は、前記光検出器 によって測定された前記第 j基準試料から発する蛍光の前記第 i検出波長帯での強 度である。
[8] 前記光検出器および前記撮像装置は、前記第 1一第 k検出波長帯を有するマルチ バンドカメラであり、
前記光検出器は、各前記検出波長帯にて各前記基準試料の蛍光画像を撮像し、 各前記基準試料中の蛍光を発する部位を表示する一つの画素の値を各蛍光画像か ら取得し、
前記演算装置は、前記第 i検出波長帯で撮像された前記第 j基準試料の蛍光画像 カゝら取得された前記画素の値を前記行歹 の成分 jとして使用する 請求項 7に記載の定量システム。
[9] 前記光検出器は、各前記基準試料から発する蛍光の分光強度を測定する分光器 を含んでおり、
前記撮像装置は、前記第 1一第 k検出波長帯を有するマルチバンドカメラを含んで おり、
前記演算装置は、前記分光強度と前記マルチバンドカメラの各前記検出波長帯に 対する感度特性とを用いて、各前記基準試料から発する蛍光の各前記検出波長帯 での強度を算出し、算出された強度を前記行歹 の各成分として使用する 請求項 7に記載の定量システム。
[10] ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を定 量するシステムであって、
前記第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基 準試料の各々力 発する蛍光を検出し、その蛍光の強度を測定する光検出器と、 異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯と前記撮像装置の異なる感度特 性を設定する第 1一第 q (qは 2以上の整数)の感度モードとを有し、前記ターゲット試 料の蛍光画像を各前記検出波長帯および各前記感度特性で撮像する撮像装置で あって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮像装置と、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
1一 c を算出する演算装置と、
m
を備える蛍光色素濃度定量システム。
[数 28]
ゾ—
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000057_0002
ここで、 P (vは 1以上 q以下の整数）は k X 1の行列であり、 Pの第 i行成分 P (iは 1以 上 k以下の整数)は、前記第 i検出波長帯および前記第 V感度モードで撮像された前 記ターゲット試料の蛍光画像にぉ 、て前記部位に対応する画素の値である。 Jは (k
•q) X mの行列であり、 Jの成分行列 L (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成分 L は
1
、前記第 j基準試料から発する蛍光の前記第 i検出波長帯および前記第 V感度モード で測定された強度である。
ターゲット試料中に含まれる第 1一第 m (mは 2以上の整数)の蛍光色素の濃度を定 量するシステムであって、
異なる波長スペクトルを有し前記第 1一第 m蛍光色素をすベて励起する第 1一第 r ( rは 2以上の整数)の励起光を生成する光源と、
前記第 1一第 m蛍光色素の各々を所定の単位濃度で単独で含む第 1一第 mの基 準試料への各前記励起光の照射に応じて各前記基準試料から発する蛍光の強度を 測定する光検出器と、
異なる第 1一第 k (kは 2以上の整数)の検出波長帯を有し、前記ターゲット試料への 各前記励起光の照射に応じて前記ターゲット試料の蛍光画像を各前記検出波長帯 で撮像する撮像装置であって、隣り合う前記検出波長帯が部分的に重なっている撮 像装置と、
次の式で示される演算を実行して、前記ターゲット試料のある部位における前記第 1一第 m蛍光色素の濃度 c
1一 c を算出する演算装置と、
m
を備える蛍光色素濃度定量システム。
[数 29]
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000058_0002
ここで、 Qu(uは 1以上 r以下の整数）は k X 1の行列であり、 Quの第 i行成分 Q (iは 1 以上 k以下の整数)は、前記第 u励起光の照射に応じて前記第 i検出波長帯で撮像さ れた前記ターゲット試料の蛍光画像において前記部位に対応する画素の値である。
Jは (k'r) X mの行列であり、 Jの成分行列 T (jは 1以上 m以下の整数)の第 i行成
2 2 uj
分 T は、前記第 u励起光の前記第 j基準試料への照射に応じて前記第 i検出波長帯 で測定された蛍光の強度である。
[12] 前記撮像装置は、前記ターゲット試料の蛍光画像を前記第 1一第 k検出波長帯で 撮像して第 1一第 kの画像信号を生成する一つ以上の撮像素子と、前記第 1一第 kの 画像信号が入力される、前記演算装置としての演算回路と、を含んでおり、
前記演算回路は、前記第 1一第 kの画像信号を用いて前記演算を実行し、前記タ 一ゲット試料の複数の部位における前記濃度 c 出して、第 1
1一 c を算
m 一第 mの蛍光 色素の濃度分布を表す第 1一第 mの画像信号を生成する、請求項 7— 11のいずれ かに記載の定量システム。
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