JP2012198234A - 蛍光ナノスコピー方法 - Google Patents

Abstract

【課題】結果の研究およびコンピュータ解析のために、対象物を染色し、対象物を準備する方法を提供することにある。
【解決手段】・対象物を非蛍光体により染色し、
・生成プロセスで、前記非蛍光体の分子を、励起されると蛍光することのできる分子に修正し、
・励起プロセスで、前記修正された分子を励起し、これにより蛍光させ、
・記録プロセスで、
−前記染色された対象物をフレームごとに検出装置によって光学的にキャプチャし、
−前記フレーム中に蛍光する分子を少なくとも１つの検出装置によって、回折に依存する大きさを有するスポットとして記録し、
−前記記録されたフレームを記憶媒体に記憶し、
・前記生成プロセス、前記励起プロセス、および前記記録プロセスを周期的に繰り返すナノスコピー方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、科学研究用の装置、および光学蛍光顕微鏡に関する。そのような顕微鏡は、ガラスに固定された蛍光対象物の画像を得るために使われる。さらに本発明は、数ナノメートル（ｎｍ）もの解像度で対象物の画像を復元する、コンピュータ処理される蛍光顕微鏡の方法である。

光学顕微鏡は、対象物上の２つのスポットを、当該２つのスポット間の距離が回折限界よりも大きい場合に限って別個に示すことができる対物レンズを用いて対象物の拡大画像を形成することができることは周知である。この回折限界は、以下の式を使って計算することができる： ｒ＝０．６１λ／Ａ （１）、ここで、λは、アパーチャＡ＝ｎ＊ｓｉｎ（φ）の対物レンズによって集光された光の波長であり、ｎは、対象物スポットを囲む物質の屈折率であり、φは、対物レンズ軸と、対物レンズに入射して検出器で検出される限界光線（extreme rays）との間の角度である。昨今、種々異なるタイプの装置が、対物レンズを用いる蛍光顕微鏡に使用されている。強力なアークランプ、白熱灯、レーザまたは太陽光を、顕微鏡用の光源として使用することができる。照明領域内にあるすべての色素分子で、蛍光が開始する。この領域は、光を分割するダイクロイックミラーを用いて、対物レンズを通して照明される。そのようなダイクロイックミラーにより、励起光が対象物に入射し、蛍光光が検出器の方に反射される。第２のタイプの照明は、側方からレーザ光を送出することによって行われる。このレーザ光は対象物を、対象物ガラスの下または対象物ガラスを通して全反射角度で全面的に照明する。この場合、光は、ガラスとガラスよりも小さな屈折率の対象物との間の境界から、光の波長の０．３倍の深さにしか達しない。対象物蛍光光は、対物レンズによって集光される。対物レンズは、対象物の画像を視覚による観測のため、およびフォトマルチプライヤ、フォトグラフィックテープ、またはデジタルビデオカメラによる記録するために送る。既存の光学顕微鏡すべての主要な欠点は、当該顕微鏡が、隣接する２つのスポットを区別するのに限界を有しているということにある。この回折限界は、上述の式（１）に従って計算することができる。

最近、銀フィルムから作製されたスーパーレンズを用いる顕微鏡が開発された。フィルムの厚みは、５０ｎｍより小さく、つまり、相互にほぼ５０ｎｍの間隔にある２つのスポットの解像度を得ることができる（非特許文献１参照）。しかし、生物の対象物に、そのような顕微鏡を使用できるかどうかは不明である。この顕微鏡は、本発明の装置の解像度よりも数倍低い解像度しか有していない。

１ｎｍよりも良好な最大解像度を有する装置には、例えば、電子顕微鏡、トンネル顕微鏡、原子間力顕微鏡がある。それらは実際の利点のみならず、深刻な欠点も有している。例えば、それらの装置の設計および対象物を用いて作業する際の複雑さと高価さ；異なったタイプの分子を区別するための色画像を受け取るための機会の不足；そして通常、対象物の種々の部分の相互レイアウトを変化させる物質によって対象物を乾燥および処理する必要がある。原子間力顕微鏡およびトンネル顕微鏡により、対象物内部の構造体を検出することはできず、一度には１つのスポットしか検出することはできず、走査速度は、毎分１μｍ^２を越えることはできず、ニードルの端部は汚れやすく、汚れたニードル端部が対象物の表面に達してはならない。

対象物の蛍光が、ガラスファイバの先端上のピンホールを通して、レーザにより励起される装置もある。このファイバの先端は、光反射部、光拡散部の近傍に位置付けるように３方向での駆動により移動され、または、蛍光分子表面でカバーされる。このタイプの顕微鏡はレンズを用いず、普通の光学顕微鏡の解像度よりも１０倍良好な解像度の画像を得ることができる。これらの結果は、ガラスファイバの先端上のピンホールの直径が、光の波長よりも遙かに小さい場合に限って達成することができる。光は、光の波長よりも遙かに小さい深さで対象物上に照射される。実際には、ピンホールの外側から対象物によって補足された部分を除いて、すべての光がガラスファイバ内に戻る。ピンホールの近傍の対象物内で補足された蛍光、光拡散、および、反射光強度は、フォトマルチプライヤを用いて測定される。対象物表面の画像は、測定された光の強度およびガラスファイバ端部の座標データについての情報を収集するコンピュータによって復元される。このシステムの主要な欠点は；高価な高精度と、ガラスファイバの、対象物に対する移動に責任がある高速動作機構ユニットを用いる必要がある点；非常に高価で、複雑かつ複製が困難な、端部に直径が５０ｎｍより小さなピンホールを有するガラスファイバを製造する点；このピンホールは、汚れやすく、汚れたピンホールが対象物の表面に達してはならない点；光のほんの僅かな部分しか、光の波長よりも小さな直径のピンホールを通してファイバから放射することができない点；光がガラスファイバ端よりも強い場合、ガラスファイバ端が加熱され、破壊される点；ガラスファイバによってアクセス可能でない対象物の領域内の蛍光を検出することができない点；一度に１つのスポットしか検出することができず、表面走査速度が、毎分１μｍ^２を越えない点。

１つ以上の新規な顕微鏡タイプについて説明する。このタイプの顕微鏡は、同時に幾つかの光ビームを用いて対象物の表面をスキャンする。標準技術局National Institute of Standards and Technology （NIST）は、この顕微鏡を作り出す研究作業に５年間の間、助成金を出した（非特許文献２）４０ｎｍナノ粒子を、この方法を使って区別することができることが論文中に示されている。相互に４０ｎｍより小さな距離で配置された２つの別個の分子を区別するのに成功した著者は示されていない。呈示されている図面および説明から、この方法を用いて、どのようにして、２つの粒子間のｒ<０．６１λ／Ａより小さな距離の２つの粒子を区別することができるようになるのか明らかでない。我々の見解では、提案されている装置では、光の波長よりも遙かに短い距離に配置された対象物の細部の解像度に達することはできない。

普通の蛍光顕微鏡の方法（非特許文献３）は、本発明に類似した最も近い方法と見なせる。この方法の主要な技術思想は、直径１μｍの開口球体セルを持ったポリマーの光フィルムのサンプルは、蛍光ペプチドの非常に低い濃度で染色される。そのような濃度により、球体の中空内でブラウン運動で移動することができる、別個のペプチド分子を観測することができる。サンプルは、レーザビームを用いて対象物ガラスを通して照射される。照射角度は、全反射角に等しい。レーザは、ガラスの近傍のサンプルの１５０−２００μｍの層内に蛍光を励起する。同時に蛍光している分子によって染色された蛍光ペプチドの数十倍の分子の位置は、高感度ビデオカメラ（Roper Scientific, Cascade 512F ：ＣＣＤで製造されたエレクトロンマルチプライヤを備えている）によって、５００シーケンシャルフレームで検出された。各フレームは、コンピュータメモリに記録された。ほぼ直径０．５μｍの多数のスポットを含む各画像は、システムズーム値で乗算される。これらすべての画像は、各々加算された。その結果形成される画像は、普通の蛍光顕微鏡の解像度を超過しない解像度を有している。このシステムの主要な欠点は；検出されたスポットの中心の位置を計算する機会について、回折限界（式１参照）よりも高い解像度を持った、これらの各スポットに基づいて画像を形成する機会について、論文に情報がなく、対象物の構造体を選択的に染色するアプローチは、論文に記載されておらず、以下の問題を解決する記載もない。つまり、染色後、物質が、観測領域内に停滞している非蛍光ペプチド分子を検出する過程で色を失うという問題である。これにより、溶液が一層高い濃度となり、新たに蛍光する分子を置換することができない。これにより、５００以上のフレームの大きな量を得ることができない。これらの大きな量は、回折限界（式１参照）によって許容されるよりももっと高い解像度の画像を得るのに必要である。

生物的対象物、例えば、筋の研究は、記録器、すなわち眼、フォトまたはビデオカメラの面内の対物レンズを用いて対象物のズーム画像を形成する、普通の光学顕微鏡の解像度よりもずっと近くに位置している多数の異なったタイプの分子があるという事実によって特徴付けられる。顕微鏡の解像度（式１）の回折限界により、観測領域内のスポット全体を同時に観測する顕微鏡の解像度が制限され、光線を１スポットに集束（共焦点および別のタイプの走査光学顕微鏡）することによって対象物のスポット全体をシーケンシャルに観測する顕微鏡の解像度が制限される。このことが、なぜ、光学顕微鏡の利点および可視領域内で異なるタイプの分子を選択的に染色する方法を用いることにより、解像度を改善するように統一すれば、相互に１０〜２０ｎｍより近くに位置している分子を別個に良好に観測することができるようになるのか、という理由である。

N. Fang および X. Zhang, 「Imaging properties of a metamaterial superlens」, 2003年, App phys Let v. 82, 2, 161-163; Nicholas Fang, Zhaowei Liu, Ta-Jen Yen, and Xiang Zhang 「Regenerating evanescent waves from a silver superlens」, 2003年, OPTICS EXPRESS, Vol. 11, No. 7, 682-687 http://www.betterhumans.com/News/news.aspx?articIelD=2005-02-11-4, "Optical Microscopes Enter the Nano Age. Hybrid system being developed to image and measure features smaller than the wavelength of visible light" Erwen, A Sharonov, JH Ferns, RM Hochstrasser: Direct visualization of nanopatterns by single-molecule imaging. App Phys Let 2005, 86: 043102

本発明の課題は、結果の研究およびコンピュータ解析のために、対象物を染色し、対象物を準備する方法を提供することにある。

このコンピュータ解析により、２０ｎｍよりも高い解像度で対象物の画像を受け取ることができるようになる。これにより、蛍光顕微鏡を「ナノスコピー」にすることができる。

この課題は、請求項１に記載された蛍光ナノスコピー方法によって解決される。

さらに、これらの各フレームはすべて、検出されたスポットすべての中心位置を計算するために使われる（これらの各位置は、蛍光分子の実際の座標に相応している）。それから、染色された分子のすべての位置が３Ｄで復元される。解像度は、蛍光分子のサイズと同等である。対象物の種々の構造体を、異なる色で染色することができる。蛍光ナノスコピーは、蛍光顕微鏡で使われている標準モジュールに基づくことができる。本発明は、種々のモジュールを有している。すなわち、可視観測のための光学系およびデジタルビデオカメラに対象物の画像を伝送するための光学系を有している。ビデオカメラは、個別の蛍光分子の画像およびバックグランドノイズレベルの低いナノ粒子の画像を検出して、デジタル化することができる。システムの第２のモジュールは、画像を記録し、解析するためのコンピュータである。第３のコンポーネントは、対物レンズの反対側に配設されたサンプルホルダである。第４のコンポーネントは、サンプル蛍光の光を検出するための可変抑制カラーフィルタセットである。ナノスコピーは、サンプルホルダから離れて設置された２つの光源を備える必要がある。設置角度は、サンプルのスライス全体を十分な深さで、または１５０ｎｍ以下の層で照射することを保証できなければならない。この層内の蛍光分子は、全反射角度で照射された場合に境界を通る光波のエネルギを吸収することができる。観測対象物は、ＵＶ光パルスがブロッキング蛍光群を色素分子から分離した場合に限って蛍光を始めるかご型色素（caged dye）の飽和濃度の溶液内で予め染色する必要がある。余分な色素は、注意深く洗浄して取り除く必要がある。対象物をホールドするガラスおよびプリズムガラスを外したまま長時間の間、分子構造体を確実に安定化するのは、非常に困難である。このことは、新鮮な注入溶液内で正確に観測される対象物に該当する。このことが、なぜ、ナノスコピーの最良の解像度は、プリズムガラスから１５０ｎｍを超えない距離で配置された対象物の層の場合に限って得ることができるのかという理由である。これは、全反射角度で、境界面に入射した場合に光が到達する深さである。保存された非生体対象物を観測する場合には、数時間もの間、対象物を観測することができるのが通常である。ベースガラスの近傍に配置された種々の構造体は、ほぼ絶対的に移動しない。これらの構造体は、多重に安定して相互に結合し、ベースガラスと結合されているので、当該構造体の位置を保持する。これらの構造体は、８０％近い容積が、異なった塩の水溶液で満たされているという事実にも拘わらず、移動不可能である。ガラス端での隙間は、溶液が染色されるのを回避するために、（例えば、パラフィンで）密封封止してシーリングする必要がある。

３Ｄナノスコピーでは、対象物が全体的に静止していること、および対象物の部分が対物レンズに対して静止している必要がある。これは、なぜ、対象物が、かご型色素により染色して洗浄した後、脱水溶液で処理し、ポリマー非蛍光物質（例えばエポキシ）内に置かなければならないのかの理由である。数μｍ厚の対象物の顕微鏡切片は、３次元のすべてにおいて１０〜２０ｎｍの解像度で、対象物を３Ｄ復元するために使用することができる。固体物質内に含まれているそのような対象物は、普通の蛍光顕微鏡で行われるように照射することができる。改善に過ぎないが、付加的なフラッシュランプを、数百個の非蛍光分子を各フレーム内で蛍光するために使用するとよい。溶液内の対象物およびポリマーフィルム内の対象物の両方について、λ＜３６０ｎｍのＵＶフラッシュランプが周期的に、非蛍光色素で染色された対象物を照射し、その度に数百（数千もの）の非蛍光分子が、蛍光を阻止する特異的化学基の光分解によって蛍光分子に変わる。レーザは、コンスタントに対象物を照射し、蛍光分子の各々が数万倍の光量を数分の１秒で送出するような強度で、新たに形成された蛍光分子の蛍光を励起する。

分子は、バックグランドノイズレベルの低いデジタル化されたフレームで、当該分子の蛍光の記録後に色を失う。蛍光分子生成の周期、当該分子の励起、記録および色の喪失は、数万回繰り返すことができる。その度に、新たな蛍光分子が生成され、検出され、色を失う。変換されない非蛍光分子は、レーザ光を吸収しないので、色を失わない。数万個のフレームを、この方法を使って検出することができる。数百および数千もの蛍光分子を、各フレームで検出することができる。それにより、可視領域内に配置された構造体すべての表面を網羅する全部で数千万個もの蛍光分子の位置を計算することができるようになる。性質の異なる構造体を異なる色で染色するために、活性群の異なる色素を使ってもよい。活性群は、タンパク質、核酸、脂肪等に結合してもよい（提案の方法は、カラーナノスコピーと呼ぶ）。

ナノスコピー方法の第２の変形は、蛍光が非常に明るく、色を失いにくいナノ粒子のブラウン運動は、塩溶液で満たされた浸透膜を持った生物試料の殆どの体積内で可能であるという事実に基づいている。ナノ粒子は、フィコビリプロテイン（phycobiliprotein）分子または直径１０〜４０ｎｍの蛍光マイクロ球体によって提供される。この運動は、幾つかの組合わせ電極対によって給電された電流での電気泳動によって調整することができる。電流は分子の運動を種々の方向で方向付ける。そのようにして、各分子は、アクセス可能な容積すべてをスキャンする。同じ（または、光が照射された領域から変化された）数百個の蛍光分子が、相互に１〜２μｍより大きな距離で動いても各フレームで検出される。そして、数ｎｍの精度で蛍光分子の位置を（対応するスポットの中心座標として）計算することができる。すべてのフレームからの座標は、分子が長い時間周期に亘って現れることができる個所を見つけるために使うことができる。それにより、溶液で満たされた体積すべてが指示される。分子が存在することができない体積の部分は、起源の異なるペプチド、染色体、非損傷膜の部分等の高密度構造体で占有されているものと見なせる。分子位置の揺らぎは、スポットの大きさを少し拡張することがあるが、スポットの中心位置は、対象物内の分子の平均座標と見なすことができる。正電荷、負電荷の粒子、および、中性粒子は、対象物の種々の領域を訪れることがあるという点に注意する必要がある。これは、各分子が、バイオ構造の局所的な電荷と相互に作用するためであり、このことが、なぜこの方法が、対象物構造の表面電荷の研究にとって有益であり得るのかという理由である（提案された、この方法の名称は、モノクロームナノスコピー）。

提案された両方法は、ナノスコピーの解像度を数ｎｍにまで高めることができ、解像力（式１）に依存しないが、長時間の間、対象物の観測される部分内の構造体の固有の移動性には依存する。第２の要因は、ビデオデータ内のノイズと信号との比である。両ファクタは、本発明の方法の種々の変形によって調整することができる。例えば、何らかの明るく輝くキー蛍光粒子を対象物内に導入することができる。その際、置換した粒子の座標は、対象物と固く結合されたキー粒子の可視領域の移動を考慮して計算することができる。そのようなアプローチにより、数ｎｍの距離に配置された対象物の各部分を２Ｄ識別することができるようになる。

蛍光粒子の画像の幾つかのパラメータ（各スポットの直径および各スポットのセクションに沿った光度分布）は、顕微鏡の対物レンズの焦点面からの粒子の距離に応じて変えることができる。これは、なぜ、輝く粒子の第３の座標を計算するために、これらの各パラメータを計算することを提案するのかという理由である。２つのビデオカメラに対象物の画像を投影することが提案されている。これにより、第３の座標の定義の精度が改善される。光線は、対物レンズの後ろ側で２つの光線に分割される。ビデオカメラは、対象物の２つの隣接焦点面が、１つの対物レンズを通して当該ビデオカメラに投影されるように配置されている。各粒子ごとの光度分布は、異なったカメラによって検出された場合に異なるようになる。それは、第３の座標に依存してスケーリングすることができ、対象物の３Ｄ画像を形成するために使用される。

図３には、３Ｄナノスコピーの基礎が図示されている。ＣＣＤ上に投影される蛍光粒子のスポットの直径および強度は、粒子と対物レンズとの間の距離に依存している。異なった焦点面上に焦点が合わせられた２つのカメラは、直径の異なる１つの粒子と、当該直径に沿って異なる強度分布を示す。図の上側右隅の２つのダイアグラムは、カメラと蛍光粒子の位置とに依存する直径ならびに直径に沿った強度分布の相違を示す。

ナノスコピーは、何らかの場合、波長は異なるが励起状態は同じである複数の蛍光粒子によって形成される各スポットの中心を見つける際に助けとなることがある。そのことは、ダイクロイックミラーで光を分離することによって行うことができる。そのようなミラーは、１つの波長の光を一方のカメラに透過し、他の波長の光を他方のカメラに反射する。このようにして、本発明によると、タイプの異る複数の対象物分子の位置をナノ解像度で、同時に復元することができるようになる。これらの分子は、放射波長の異なる色素で染色される。これにより、蛍光粒子からの同時に観測されて別個に検出される各スポットの量を拡大することができる。これは、色の異なる対応の各スポットが干渉したとしても、各蛍光粒子からのスポットを異なる波長で観測することができるという事実に基づく。

ナノスコピー研究の前述の方法を、蛍光分子へのかご型の非蛍光分子の付加的な変化と結び付けると、非常に有益である。これは、蛍光を阻止する基を分離する化学反応または種々の物理作用を用いることによって行うことができる。そのような反応の例は、ＡＴＰ反応、エステラーゼ作用、過酸化、放射性の転換等である。そのような修正の結果として形成される蛍光分子は、レーザを用いて励起することができ、対象物構造の表面の座標を上述の方法により計算するのに有益であるビデオカメラで検出することができる。これらの座標は、ビデオフレーム上の適切なスポットの中心として計算することができる。それからこれらの画像は、以前に復元された対象物の画像上に「重ね合わせる」ことができる。これらは、対象物の反応活性群の位置を示す。そのような画像の解像度は、２０ｎｍより良好である。

当業者には、添付した特許請求の範囲に記載された本発明は、本発明の基本的な技術思想を逸脱しない限りで、異なった方法を用いて変形することができることは明らかである。

ナノスコピーでの装置の作動は、通常モードの蛍光顕微鏡を用いることによって変更することができる。このモードにより、対象物を現場で解像度（式１）により直接可視観測する機会が得られる。また、非常に高感度のデジタルビデオカメラを用いて画像を検出し、当該画像をコンピュータメモリに伝送する機会が得られる。その際、フレームが、幾何学的パラメータおよびフレームの種々の領域内の光強度を測定するために解析される。これは例えば、バイオルミネセンスおよびケモルミネッセンスでの研究で有益である。

各図面は、本発明のナノスコピー方法を実行するために蛍光顕微鏡を変更することができるやり方を示す図である。

本発明のナノスコピー方法を実行するために蛍光顕微鏡を変更することができるやり方を示す図 本発明のナノスコピー方法を実行するために蛍光顕微鏡を変更することができるやり方を示す図 ３Ｄナノスコピーの基礎を示す図

蛍光顕微鏡ナノスコピーは、図１および図２に示されているように１つ（図１）または２つの（図２）モノクロビデオカメラ（１）を備えている。これらのビデオカメラは、デジタル出力、およびモノクロビデオカメラのセンサ（ＣＣＤ）の反対側に配置された抑制カラーフィルタを有する。これらのカラーフィルタは、蛍光のみをカメラの方に通過させる。顕微鏡には、取り外し可能な分光プリズム（２）、１００倍ズームでアパーチャがＡ＝１．４の対物レンズ（３）が装着されている。対象物（４）は、切頭プリズム端の形状に斜角を付けられたガラス製の対象物ホルダ（５）に押し付けられている。装置には、プリズム面を通過する蛍光を励起するためのレンズ系を有するレーザ（６）、染色分子上に存在するブロッキング蛍光群を光分解するためのレンズ系を備えたＵＶ源が装着されている。それ以外の重要な部分は、デジタル化された画像を記録および処理するためのソフトウェアを備えたコンピュータ（８）である。このソフトウェアは、ＵＶパルスおよび電気泳動装置用のエネルギを供給する電力源の制御のために使われる。接眼レンズ（１０）（図１）は、視覚観測（９）に使われる。ユニットは、振動防止テーブル上に配置された防音キャビネット内に配置される。塩溶液が充填された対象物内を移動する蛍光性のナノ粒子の運動を方向付ける電気泳動電極に電力を供給する装置について、別個に説明する。

Ｐｈｏｔｏｍｅｒｔｉｅｓ社により製造された高感度カメラＣａｓｃａｄｅ １Ｋ、または、Ｔｈｅｔａ−ｓｙｓｔｅｍ社により製造されたカメラＳＩＳＩ ｔ２８５ＥＭを用いるナノスコピーで、画像を受信する場合を例として説明する。ＳＩＳＩ ｔ２８５ＥＭ型カメラには、ＣＣＤ結晶内に含まれている電子マルチプライヤを備えるテキサス・インスツルメント社製のＣＣＤ ＴＣ２８５ＳＰＤが装着されている。このカメラは、６３％までの量子効率を有しており、ほぼ８×８ｍｍの感光性の正方形上に、８μｍ幅の１００２本の線で１００４個の水平方向の活性スクエアピクセルを有している。対象物の画像が、１００倍の対物レンズおよびそのレンズ系を用いて、ビデオカメラのＣＣＤに直接投影される場合、レーザで照明される対象物上の正方形は、８０×８０μｍより僅かに大きくなければならない。各ＣＣＤピクセルは、８０×８０ｎｍの対象物の正方形に対応している。各照射粒子または分子は、５６０ｎｍに近い２ｒ＝１．２２λ／Ａの直径のスポットとして対象物上に見える。つまり、７個のピクセルに近い直径のＣＣＤの正方形に投影される。各フレーム内で無秩序に拡散している各粒子間の有利な距離は、２０００ｎｍ以上である。この場合、実際上、各粒子のすべてが別個に見える。この場合、少なくとも４０×４０＝１６００個のスポットを同時にＣＣＤに、各フレームで当該各スポットが別個に観測されるように投影することができる。

同時に蛍光する粒子の濃度を得るために種々の方法を使うことができる。まず第１の方法では、低濃度で明るく蛍光を発する粒子で対象物を染色することができる。こうすることにより、観測領域内で粒子をブラウン運動させることができ、粒子は付加的に電気泳動流で動くことができる。この電気泳動流は、各粒子を異なる方向に運動させるような複数の電極対によって達成される。第２の方法では、対象物が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、米国により製造された、５−カルボキシルフルオレセイン−ビス−（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）エステル、βアラニン−カルボキシルアミド、スクシニミヂルエステル（ＣＭＮＢケイジド・カルボキシフルオレセイン， ＳＥ）（5-carboxyfluorescein-bis-（5- carboxymetoxy-2-nitrobenzil） ester, beta-alanin-carboxylamid, suxynimidil ester （CMNB-caged carboxyfluorescein, SE））のような特殊な色素で染色することができる。波長３１０〜３６０ｎｍのＵＶフラッシュで（予め調整された露光で）の照明後、観測領域内ではこの非蛍光色素の約１０００〜１６００個の分子が、蛍光をブロックする特殊な基を失う。そのような分子は、青色光で照明された場合、緑光の数千個もの量子を生成することができる。この後、そのように分子は色を失う。対物レンズのアパーチャがＡ＝１．１〜１．３であれば、各蛍光粒子からの光の１０％以上がビデオカメラに伝達され、ＣＣＤの４０近いピクセルをカバーするスポットが形成される。スポットの中心での光の強さは、１００個の量子にも及ぶ。これは、（上述のカメラを用いた場合に）充分に満足のいく信号対ノイズ比であり、ビデオ信号を受信するのに充分な大きさである。

この信号対ノイズ比により、２０ｎｍより高い解像度でスポット中心の座標を計算することができる。この色素はレーザ光を吸収せず、蛍光をブロックする基が色素に結合する間に色を失う。それにより、以下のプロセスを数万回も繰り返すことができるようになる。まず始めにＣＣＤが、残留蛍光を有する対象物の画像を検出する。それから、画像がビデオカメラでデジタル化され、コンピュータに伝送される。それから、ＵＶフラッシュが、可視領域内で１０００〜１６００個の蛍光分子を生成し、レーザが、これらの分子内に蛍光を励起する。ＣＣＤは、蛍光分子および粒子の画像を検出し、この画像は残留蛍光上に重ね合わされる。画像はビデオカメラでデジタル化され、コンピュータに伝送され、コンピュータでは、残留蛍光を有する以前のフレームが、この画像から減算される。受信され減算されたフレームはコンピュータメモリ内に記憶される。さらにこのフレームは、スポットの中心の座標、およびスポットの平均直径と強度を計算するために解析される。それから対象物は、画像を検出せずに所定時間の間、レーザで照明され、既に検出された分子が最大で色を失うようにされる。それから全サイクルが繰り返される。すべての染色分子の座標が検出されるまで、各サイクルで新たな蛍光分子が生成され、検出され、それらは色を失う。分子試料は、前述の色素のみを生成しない。カンパニーは、要望により、そのような染料も生産する。化学薬品会社はそのような色素を要望に応じて製造し、"ｃａｇｉｎｇ ｋｉｔ"（Ｄ−２５１６）の個別制作用試薬セットを生産する。

実施例に示されているカメラは、毎秒１０フレームの周波数で個別の蛍光分子の画像を記録することができる。画像は、満足のいく信号対ノイズ比で記録される。例えば、数時間の間に４００００フレームを検出することができる。各フレームは、１６００までの分子画像を含む。その場合、検出される蛍光分子の座標の総量は６４００００００にも達することができ、観測される各個別の分子間の平均距離は僅か１０ｎｍである。これは、他のレンズ式顕微鏡の場合の１０倍である。分子画像のフレームは、圧縮せずに、または画質低下なしで圧縮してセーブされる。これは、分子の座標を一層精確に計算するために実行される。１回の実験で圧縮されない全フレームの情報の容量全体は、１０ギガバイトに達することがある。これは、最新のハードディスクドライブの容量を考慮すると、何ら問題ではない。各文献出典によると、スポットの中心を計算する種々のアルゴリズムについての情報が得られる。出願人は、スポットの中心の計算された座標のテーブルに基づいて、全画像の計算および復元を実行するためのコンピュータソフトウェアを制作した。

本発明は、蛍光顕微鏡の解像力を改善するために変えられる、蛍光着色剤を用いて染色された対象物の解析、従って、いわゆるナノスコピーに関している。本発明の方法は、個別蛍光分子およびナノ分子の画像を低ノイズで記録し、かつ、デジタル化するビデオカメラに試料画像を可視化および投影するための光学系と、画像を記録および処理するためのコンピュータと、対物レンズの前側に配置された試料ホルダーと、蛍光放射励起源と、試料蛍光光を分離するための、置換可能な抑制フィルタのセットを備えた顕微鏡を用いて実行される。本発明は、別個に蛍光された可視の分子とナノ分子が、異なった対象物部分内で周期的に形成され、レーザにより、前記分子およびナノ分子のオーバラップしない画像を記録するため、および、既に記録された蛍光分子をデカラーリングするために充分な、前記分子およびナノ分子の振動を生起し、その際、記録された個別分子およびナノ分子画像の１００００枚の画像が（直径が、顕微鏡倍率によって増倍された蛍光波長のオーダーであるステインの形式での）、個別の蛍光分子およびナノ分子の座標に相応する計算された多数のステイン中心座標に従って、ステインの中心の座標をサーチし、対象物の画像を形成するために、コンピュータにより処理される。前述の発明により、２０ｎｍより良好な解像力で、２次元および３次元画像を形成し、染色されたタンパク質、分子、核酸および脂質を異なった着色剤で染色することができるようになる。

Claims (24)

1. 対象物のナノスコピー方法において、
   ・対象物を非蛍光体により染色し、
   ・生成プロセスで、前記非蛍光体の分子を、励起されると蛍光することのできる分子に修正し、
   ・励起プロセスで、前記修正された分子を励起し、これにより蛍光させ、
   ・記録プロセスで、
   −前記染色された対象物をフレームごとに検出装置によって光学的にキャプチャし、
   −前記フレーム中に蛍光する分子を少なくとも１つの検出装置によって、回折に依存する大きさを有するスポットとして記録し、
   −前記記録されたフレームを記憶媒体に記憶し、
   ・前記生成プロセス、前記励起プロセス、および前記記録プロセスを周期的に繰り返すナノスコピー方法。
2. 前記キャプチャされたフレームは、当該フレーム中の他の分子の蛍光よりも弱い残留蛍光を有する分子を含み、該残留蛍光は、前記励起プロセス後のサイクル内で色喪失プロセスが生じた結果である、請求項１に記載の方法。
3. 前記キャプチャされたフレーム中に検出されたすべてのスポットの中心座標がコンピュータプログラムによって決定され、前記中心座標は、対象物を染色する分子の位置に関連しており、
   前記検出されたスポットの決定された座標が、回折限界よりも高い解像度で染色された対象物の提示を形成するために重ね合わされる、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記生成プロセスで、前記修正は、物理的影響または化学反応によって実行される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
5. 前記非蛍光体の分子の前記修正が、蛍光をブロックする化学群を光分解することによって実行される、請求項４に記載の方法。
6. 前記非蛍光体の分子の前記修正が、当該分子にＵＶ光パルスを照射することによって実行される、請求項４に記載の方法。
7. 前記励起プロセスで、前記修正された分子を照射し、蛍光させるためにレーザが使用される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
8. 前記レーザは、対物レンズを通してまたは対象物スライドを通して前記修正された分子を備える対象物を照射する、請求項７に記載の方法。
9. 前記レーザは、前記修正された分子を備える対象物を、全深度で照射するか、または全反射の角度で照射する、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記少なくとも１つの検出装置はカメラである、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
11. 前記カメラはビデオをキャプチャし、キャプチャされたフレームはビデオフレームである、請求項１０に記載の方法。
12. 複数のダイクロイックミラーと複数のカメラが、種々の波長で分子の蛍光を検出するために使用される、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 光を分割するプリズムと２つのカメラが、対象物の隣接する２つの平面がそれぞれのカメラの焦点内にあり、１つの対物レンズを通して前記カメラ上に投影されるように配置されている方法であって、
    前記各カメラが、各蛍光分子ごとに異なるスポットを検出し、
    コンピュータプログラムが、
    ・前記カメラにより検出されたスポットの強度分布間の差を使用して、前記蛍光分子の第３の座標を計算し、
    ・前記対象物の３Ｄ画像を形成するために使用される、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の方法。
14. 対象物のナノスコピー方法において、
    ・対象物が、色を失うことに耐性のある蛍光ナノ粒子または分子を含む液体試料中に配置され、
    ・前記蛍光ナノ粒子または分子が、蛍光のために励起され、
    ・少なくとも１つの検出装置により、蛍光するナノ粒子または分子が、回折に依存する大きさを有するスポットとして１つまたは複数のフレームに記録され、
    ・記録された１つまたは複数のフレームが記録装置に記録され、
    ・前記蛍光ナノ粒子または分子が、試料の一部内で運動し、
    ・蛍光するナノ粒子または分子の記録を繰り返す、ナノスコピー方法。
15. すべてのフレーム中で検出されたすべてのスポットの中心の座標がコンピュータプログラムによって決定され、
    前記決定された座標を重ね合わせることにより、前記対象物が復元され、
    これにより前記ナノ粒子または分子の大きさに対応する解像度で画像弁別が行われ、
    前記試料内の体積は、前記対象物を取り囲む液体により占有された体積からの対象物により占有されている、請求項１４に記載の方法。
16. 分子を種々の方向で電気泳動させるために電気泳動装置が使用され、該電気泳動装置は少なくとも２つの電極を有する、請求項１４または１５に記載の方法。
17. ・試料を可視化するための対物レンズを有し、１つの蛍光する分子および／または蛍光するナノ粒子を画像化する少なくとも１つの検出装置が装備された光学システムと、
    ・前記試料の蛍光光をピックアップするために、前記検出装置の前方に配置された交換可能なカラーフィルタセットと、
    ・物理的影響または化学反応により、励起されると蛍光することのできる分子に、前記試料の染色された非蛍光染色分子を周期的に変換するための生成コンポーネントと、
    ・前記試料内で前記分子の蛍光を励起する光源を含む励起コンポーネントと、
    ・前記検出装置から受信された画像を記録するための記録媒体と、
    を有する蛍光ナノスコピー装置。
18. コンピュータプログラムが、フレームキャプチャの照明と同期し、検出された分子および／またはナノ粒子の座標を計算し、画像を２Ｄまたは３Ｄで復元するために設けられている、請求項１７に記載の蛍光ナノスコピー装置。
19. 前記光学システムは、カメラおよび／またはビデオカメラを有する、請求項１７または１８に記載の蛍光ナノスコピー装置。
20. 前記光学システムは、光分割プリズムと２つのカメラを有し、当該光分割プリズムと２つのカメラは、前記対象物の隣接する２つの平面がそれぞれ各カメラの焦点内にあり、前記対物レンズを通して前記カメラに投影されるように配置されており、
    前記各カメラが、各蛍光分子ごとに異なるスポットを検出し、
    前記コンピュータプログラムは、前記カメラにより検出されたスポット間の差を使用して第３の座標を計算し、前記対象物の３Ｄ画像を形成する、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の蛍光ナノスコピー装置。
21. 分子を種々の方向で電気泳動させるための電気泳動装置を有し、該電気泳動装置は少なくとも２つの電極を有する、請求項１７から２０までのいずれか１項に記載の蛍光ナノスコピー装置。
22. 前記生成コンポーネントは、ＵＶ光源を有する、請求項１７から２１までのいずれか１項に記載の蛍光ナノスコピー装置。
23. 前記励起コンポーネントは、分子蛍光させるよう励起するレーザを有する、請求項１７から２１までのいずれか１項に記載の蛍光ナノスコピー装置。
24. 前記レーザは、対物レンズを通しておよび／またはスライドホルダを通して前記試料を照射する、請求項２３に記載の蛍光ナノスコピー装置。

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