JP3872856B2 - 蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ケージド試薬解除用光源装置を有する蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生体機能を調査するためのケージドカルシウム、ケージドＡＴＰに代表されるケージド試薬の解除用光源装置を有する顕微鏡が知られている。
ところで、生体反応に関する物質を添加しその作用機能を調査するには、拡散の影響を無視できるように細胞や組織の任意の場所にケージド試薬を加えることが行われている。
【０００３】
このようなケージド試薬は、紫外線を照射することにより活性化され、本来の性質を示す物質で、例えばケージドカルシウムにおいては、カルシウムイオンがケージド基に囲われていて、可視領域の光を当てても変化しないが、紫外域の光を当てるとケージド基が外れてカルシウムイオンを遊離し、これにより細胞または組織内の特定の場所のカルシウムイオンの濃度を上昇させることによって、カルシウムイオンのみの変化によって引き起こされる生体の反応を調査することなどに使われる。
【０００４】
このようにして、生体の特定の機能を断定するのにケージド試薬は有効な手段として多く用いられている。
しかして、従来、ケージド試薬解除用光源装置を有する蛍光顕微鏡として図１２に示すように構成したものがある。
【０００５】
この場合、落射観察・測光光源装置１の落射照明用光源２から出射された光を、集光レンズ３を通して干渉フィルタ４により励起光として波長を制限し、さらに視野絞り５を通したのち、レンズ５１を介してダイクロイックミラー６で反射させて、対物レンズ７より標本８面を照射し、この標本８からの反射光または蛍光をダイクロイックミラー６を透過させ全反射ミラー９で光路を変え、接眼レンズ１０に結像するようにして、標本８の観察像を接眼部１１で確認可能にしている。一方、透過観察用光源装置１２の透過照明用光源１３から出射された光を標本８面を照射することで、標本８の透過像を接眼部１１に結像できるようにもしている。そして、ケージド試薬の解除、つまりケージド試薬に対し集中してエネルギーを与え、カルシウムイオンを遊離させるための光源として、標本８に斜め上方にファイバー１４を配置していて、このファイバー１４より導光された紫外線フラッシュ光を標本８面に照射するようにしている。
【０００６】
なお、１５は、ケージド試薬解除にともなうカルシウムイオンの変化量を蛍光強度から測定するためのフォトディテクタやビデオカメラなどの光電変換装置である。
【０００７】
ところが、このようにファイバー１４からの紫外線フラッシュ光を、いきなり標本８面に照射する構成では、標本８面上のフラッシュ光の照射したい範囲を設定できないばかりか、照明範囲の確認も困難であり、このため、フラッシュ光の照明範囲を微小な範囲に絞り込むことは難しかった。
【０００８】
そこで、従来、この種の蛍光顕微鏡の他の例として、特開平６−１６０７２４号公報に開示された構成のものが考えられている。この蛍光顕微鏡は、図１２と同一部分には同符号を付した図１３に示すように、落射観察・測光光源装置１とともに、さらに紫外線フラッシュ光専用光源１６、集光レンズ１７、バンドパスフィルタ１８、フラッシュ光照射範囲を規定する視野絞り１９および視野絞り照明用光源２０を有するケージド試薬解除用光源装置２１を有し、これらケージド試薬解除用光源装置２１のフラッシュ光専用光源１６と視野絞り照明用光源２０からのそれぞれの光が、ダイクロイックミラー２２により落射観察・測光光源装置１の落射照明用光源２と同軸になるように構成している。
【０００９】
このような構成によれば、視野絞り１９の視野絞りによる視野内に、紫外線フラッシュ光専用光源１６からのフラッシュ光の照明範囲を設定でき、この視野絞りを照明する光源２０が、紫外線フラッシュ光専用光源１６の光路上に配置されることで、標本８面上にフラッシュ光照明範囲を結像して接眼部１１で確認できるようになる。また、視野絞り１９を任意の位置に移動することで、フラッシュ光の照射位置を任意に設定できるようにもなる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このように構成したものは、紫外線フラッシュ光を標本８面に照射する場合、まずフラッシュ光の照明範囲と位置を決定しなければならないが、この照明範囲と位置は、視野絞り１９の視野絞りにより行われる。このため、照明用光源２０を点灯して視野絞り１９を照明し、標本８上に投影された視野絞り像を接眼部１１で観察しながら、視野絞り１９による視野絞り像の位置と大きさを設定するが、この時、紫外線フラッシュ光のみを透過させるバンドパスフィルタ１８を光路から外しておく必要がある。
【００１１】
ところが、ケージド試薬解除用光源装置２１では、照明用光源２０とフラッシュ光専用光源１６とが同一光路上に配置されているため、視野絞りの設定中に誤ってフラッシュ光専用光源１６が発光されると、目に有害な紫外線光が標本８上に照射される。この時、標本８と接眼レンズ１０との間には、ダイクロイックミラー６が配置されるため、紫外線は除去できるが、波長特性の異なるダイクロイックミラーもしくはハーフミラーが誤って挿入されていると、紫外線が完全に除去できないという問題があった。
【００１２】
また、照明用光源２０と視野絞り１９との間に紫外線フラッシュ光専用光源１６が存在するため、照明用光源２０からの光は紫外線フラッシュ光専用光源１６に遮られ、視野絞り１９を十分に照明できず、さらに、この視野絞り１９による視野絞り像は、ダイクロイックミラー６で反射させて、標本８面に投影し、この標本８からの反射光を接眼部１１で確認するようになるが、この時、ダイクロイックミラー６でのロスは大きなものになるため、標本８面に投影される紫外線フラッシュ光の視野絞り像が暗くなり確認が困難になるという問題もあった。
【００１３】
さらに、標本８は、落射観察・測光光源装置１により視野全体を照明され、標本８上のフラッシュ光照明範囲は照明用光源２０および視野絞り１９により照明される。この場合、光源２からの照明は、干渉フィルタ４を通した特定の波長光からなるため、標本８は、蛍光観察と同じ状態で照明されることになる。ところで、ケージド試薬の使用目的が、細胞や組織の特定の位置の状態を観察することから考えると、視野絞り１９での範囲や位置の設定は、視野全体を観察しながら行うことが必要である。ところが、視野絞り１９の調整のため長時間視野全体を照明するような蛍光観察では、時間とともに蛍光が褪色するという問題があり、このため、視野絞り１９での位置設定中に蛍光の褪色が進むと、位置設定そのものが困難になり、また、視野絞り１９での位置設定ができたとしても、その後の観察や測光ができなくなるという問題があった。
【００１４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、有害な紫外線を確実に排除でき、しかもケージド試薬解除用光源による照明範囲を精度よく設定できる蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
請求項1記載の発明は、標本のケージド試薬を解除するためのケージド試薬解除用光源と，このケージド試薬解除用光源による前記標本上の照明範囲を確認するための照明用光源と、前記ケージド試薬解除用光源または前記照明用光源により照明され前記標本面上の前記ケージド試薬解除用光源の照明範囲を設定する絞り手段と、
前記照明用光源による前記絞り手段の照明中に前記ケージド試薬解除用光源の照明光をしゃ断する光しゃ断手段と、透過照明用光源と、を具備し、この透過照明用光源により照明される前記標本の透過像と、前記光しゃ断手段により前記ケージド試薬解除用光源の照明光をしゃ断した状態で、前記絞り手段を介して設定された前記照明用光源による前記ケージド試薬解除用光源の前記標本上の照明範囲とを重ね合わせて観察可能にしている。
【００１７】
請求項２記載の発明は、請求項1記載において、さらに観察照明用光源、この観察照明用光源からの光が入射され且つ出射側を環状に形成されたファイバ、このファイバより出射した光を集光して標本面を照明する光学系を有し、前記絞り手段を通った前記ケージド試薬解除用光源または前記照明用光源からの光を、前記ファイバを通る前記観察照明用光源からの光と同軸的に導光するようにしている。
【００１９】
本発明によれば、標本の透過像と、絞り手段を介して設定された照明用光源によるケージド試薬解除用光源の標本上の照明範囲とを重ね合わせて観察できるので、標本の観察像を確認しながら標本上でのケージド試薬解除用光源の照明範囲を精度よく設定することができる。
【００２０】
本発明によれば、観察照明用光源の光によりファイバを通して標本面を照明できるので、標本の観察像に一様な明るさが得られ、精度の高い標本観察を行うことができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
（第１の実施の形態）
図１および図２は、本発明が適用されるケージド試薬解除用光源装置を有する顕微鏡の概略構成を示すもので、図１２と同一部分には、同符号を付している。
【００２２】
この場合、落射観察・測光光源装置１は、図１２に示す視野絞り５に代えてシャッタ３０を設け、このシャッタ３０を通した照明光をファイバ束３１の入射端に入射するようにしている。
【００２３】
ここで、ファイバ束３１は、図３に示すように入射側が棒状で、各ファイバの出射端を環状に配置して環状出射面とし、さらに出射側端部の側面に穴部３１１を形成し、この穴部３１１から環状出射面の中心軸を通る紫外線フラッシュ光専用光源１６からの光と、ファイバ束３１を通る照明用光源２からの光が同軸的に導光されるようにしている。
【００２４】
そして、このようなファイバ束３１の環状出射端面より出射した光は、リング状レンズ３２で集光し、ダイクロイックミラー６で反射して、対物レンズ７により標本８面を均一照明できるようにしている。
【００２５】
また、ケージド試薬解除用光源装置２１は、バンドパスフィルタ１８と視野絞り１９の間に紫外線フラッシュ光専用光源１６からのフラッシュ光を遮光する機能を有する可倒式全反射ミラー３３を挿入可能にし、さらに、照明用光源３４、バンドパスフィルタ３５、集光レンズ３６を有するフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７を有していて、このフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４からの照明光を可倒式全反射ミラー３３での全反射により視野絞り１９側に照射できるようにしている。
【００２６】
この場合、フラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７に用いられる照明用光源３４は、ハロゲン灯などの可視光光源、もしくはＬＥＤなどとし、人体に有害な紫外光を発しないものとする。また、バンドパスフィルタ１８と視野絞り１９の間の光路に可倒式全反射ミラー３３が挿入されない図１に示す場合は、光路上にダイクロイックミラー６が配置され、可倒式全反射ミラー３３が光路中から退避された図２に示す場合は、ダイクロイックミラー６に代わってハーフミラー３８が選択配置されるようになっている。
【００２７】
なお、上述の標本８に用いられるケージドカルシウム（Nitr5)のようなケージド試薬は、紫外光に反応し活性化する物質であるので、通常の蛍光観察の際に紫外光を照射してしまうと、ケージド基が解除してしまい、正確な観察、測定ができなくなるおそれがある。そこで、可視光で励起でき、蛍光観察を行える試薬として、例えば、細胞にカルシウム指示薬fluo-3を導入して観察、測定を行うようにしている。
【００２８】
しかして、このような構成において、まず、標本８の観察を行う。この場合、図１において、落射観察・測光光源装置１の落射照明用光源２を点灯すると、この光源２から発せられた光は、集光レンズ３を透過し、干渉フィルタ４により励起光として波長を限定され、シャッタ３０を通ってファイバ束３１入射端に入射される。
【００２９】
そして、このファイバ束３１の環状出射面より出射された光は、リング状レンズ３２により集光され、ダイクロイックミラー６で反射され、対物レンズ７により標本８面を照射する。
【００３０】
標本８面を均一に照明するためには、リング状のレンズ３２を最適に設定することによって可能となる。
標本８面に照射された光は、この標本８面で反射され、もしくは標本８からの蛍光がダイクロイックミラー６を透過して全反射ミラー９に与えられ、ここで光路を変えられ、接眼レンズ１０を通して接眼部１１に結像される。これにより、落射観察・測光光源装置１により照明された標本８の観察像が接眼部１１で確認できることになる。
【００３１】
この場合、具体的には、落射観察・測光光源装置１の干渉フィルタ４を490nm付近に、ダイクロイックミラー６を505nm 付近に設定して照明すると、標本８の細胞内に遊離しているカルシウムイオンにfluo-3が結合しているため、fluo-3の蛍光波長530nm 付近であるので、この蛍光像は、ダイクロイックミラー６を透過して接眼部１１で確認することができる。
【００３２】
なお、透過観察用光源装置１２の透過照明用光源１３より発せられる光を標本８面に照射し、ここでの透過光を対物レンズ７を介して接眼レンズ１０で結像させることで、この時の透過光による位相差、微分干渉などにより細胞の位置確認もできる。
【００３３】
次に、細胞内のケージド試薬の解除範囲を決定するためのフラッシュ光照明範囲を確認する。
この場合、図２に示すように、ケージド試薬解除用光源装置２１のバンドパスフィルタ１８と視野絞り１９の間の光路中に可倒式全反射ミラー３３を挿入する。
【００３４】
この状態で、フラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４を点灯すると、この照明用光源３４から発せられた光は、バンドパスフィルタ３５、集光レンズ３６を通り、可倒式全反射ミラー３３に送られ、ここでの全反射により、光路を変えて、視野絞り１９に照射される。
【００３５】
そして、この視野絞り１９を通過した光は、ファイバ束３１の中心軸に沿ってダイクロイックミラー６に代わって選択配置されたハーフミラー３８に入射され、ここで標本８と反対側に偏向され、さらに全反射ミラー９で光路が偏向され、接眼レンズ１０で結像される。
【００３６】
また、これと同時に、透過観察用光源装置１２の透過照明用光源１３より光が発せられ、この透過照明用光源１３の光は、標本８面を照明するとともに、この標本８を透過され、この透過像がハーフミラー３８を透過し、全反射ミラー９で偏向され接眼レンズ１０で結像される。
【００３７】
これにより、接眼部１１において、標本８の透過像に対して視野絞り１９の開口像がフラッシュ光照明範囲として重ね表示されるようになり、実際に標本８にフラッシュ光を照明する際の範囲を確認することができるようになる。つまり、細胞内のケージド試薬の解除範囲を決定するのに、光路中に可倒式全反射ミラー３３が挿入されると、フラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７とハーフミラー３８により視野絞り１９の開口像が接眼部１１に投影され、また、これと同時に透過観察用光源装置１２によって、細胞の透過像が接眼部１１に投影されているので、これらを重ね合わせたものが確認できるようになる。また、視野絞り１９は、その平面方向に可動であり、大きさも可変であるので、接眼部１１を覗きながら細胞の任意の部位に視野絞り１９の像を合わせることができる。
【００３８】
なお、このようにフラッシュ光照明範囲確認のために可倒式全反射ミラー３３が光路に挿入されると、これと同時に、落射観察・測光光源装置１でのシャッタ３０が閉じ、落射照明用光源２からの光を遮蔽するようになる。また、可倒式全反射ミラー３３は、光源１６から発せられる光を完全に遮断するようにシャッタの機能も兼ねている。勿論、別途にシャッタを設けてもよい。また、これらの動作が完了しないと、ダイクロイックミラー６からハーフミラー３８に切り替えることができないようなロック機能も有している。逆に、ハーフミラー３８からダイクロイックミラー６に切り替える作業が終了しないと落射観察用光源装置１のシャッタ３０は開かず、また、可倒式全反射ミラー３３はケージド試薬解除用光源装置２１の光路から退避しない。
【００３９】
このようにして、ケージド試薬解除用光源装置２１の紫外線フラッシュ光専用光源１６から発せられる紫外光が直接接眼部１１に届かないような配慮としている。
【００４０】
また、ダイクロイックミラー６とハーフミラー３８との相対位置関係は、これらの厚さを考慮すると、切り替えたときに図４に示すような関係になっていれば、フラッシュ光照射時と観察時とで標本に対するフラッシュ光照明範囲の位置ずれは生じない。すなわち、フラッシュ光照射時においては、視野絞り１９を通過したフラッシュ光は、光路４０１を通り、ダイクロイックミラー６によって標本８の方向に反射し、光路４０２を通って標本８面に照射される。そして、標本８からの反射光、もしくは蛍光は、再び光路４０２を通ってダイクロイックミラー６に達し、これを透過し、光路４０３ｂを通って接眼部１１へ導かれる。
【００４１】
一方、フラッシュ光照明範囲確認時においては、フラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４の光が、同様に視野絞り１９を通過して光路４０１を通り、今度はハーフミラー３８に与えられ、光路４０３ａを通って接眼部１１に導かれる。この時、透過観察用光源装置１２の透過照明用光源１３より発せられ、標本８面を透過した光は、光路４０２を通ってハーフミラー３８を透過したのち、光路４０３ａを通るので、標本像と視野絞り１９の開口像は完全に重なって確認できる。
【００４２】
なお、ダイクロイックミラー６とハーフミラー３８とを切り替えると、接眼部１１における像は、光路４０３ａと光路４０３ｂのようなずれを生じるが、標本８面を透過した標本像とフラッシュ光照明範囲確認のための視野絞り像との相対的なずれは生じない。また、視野絞り１９を光路軸の外に移動させて視野絞り開口像を視野中心から外したような場合でも、ダイクロイックミラー６とハーフミラー３８の厚さを十分に薄いものと考えると、ほとんどずれは生じない。
【００４３】
これにより、フラッシュ光照明範囲確認時に視野内の標本８の所望部位に視野絞り１９の開口像を合わせれば、フラッシュ光照射時において、所望の部位にフラッシュ光を照射することができる。
【００４４】
このようにして細胞に対するフラッシュ光の照明範囲が決定したらば、再びハーフミラー３８からダイクロイックミラー６に切り替える。そして、ケージド試薬解除用光源装置２１の紫外線フラッシュ光専用光源１６を点灯する。すると、光源１６から発せられたフラッシュ光は、集光レンズ１７を透過され、バンドパスフィルタ１８によって励起光として波長を限定され、視野絞り１９に照射される。そして、この視野絞り１９を通過した光は、レンズ５１を透過し、ダイクロイックミラ６で反射され対物レンズ７によって標本８面上に視野絞り１９の開口像として結像される。
【００４５】
そして、標本８面上でのカルシウムイオンの変化量は、蛍光強度として、フォトディテクタやビデオカメラなどを用いた光電変換装置１５により測定される。この場合、ケージド試薬解除用光源装置２１のバンドパスフィルタ１８として、360nm 付近の波長を有するものを用い、標本８上の特定された細胞位置にフラッシュ光が照射されると、この照射された範囲内のケージドカルシウムが解除され、カルシウムイオンが遊離して、この部位でのみのカルシウムイオン濃度が上昇する。
【００４６】
すると、この遊離したカルシウムイオンは、fluo-3と結合し、特定の波長を持つ励起光を照射すると、蛍光を発することから、この蛍光強度が光電変換装置１５によって測定される。つまり、細胞の特定部位のカルシウムイオンの上昇から、例えば細胞が伝達物質を放出するなどの機能を調査することによって、カルシウムイオン濃度との相関を調べることなどが可能になる。
【００４７】
なお、視野絞り１９は、可動式で、平面方向への移動、絞り形状の可変を可能であるから、標本８面上には、任意の位置および範囲に視野絞り像を形成できる。すなわち、標本８面上の任意の位置および範囲で、フラッシュ光の照明が可能になる。また、紫外線フラッシュ光専用光源１６としては、通常セキノンフラッシュ、パルスレーザなどが用いられるが、例えば、図５に示すように紫外線フラッシュ光専用光源１６として、水銀灯やセキノン灯などを用い、この光源１６の前面光路に電磁シャッタ３９を配置するようにしてもよい。また、視野絞り１９は、上述の可変式に限らず、交換式のものを採用することもできる。
【００４８】
従って、このようにすれば、落射観察・測光光源装置１の照明用光源２からの光を、出射側を環状に形成したファイバ束３１に入射し、このファイバ束３１より出射した光をリング状レンズ３２で集光し、ダイクロイックミラー６で反射させて、対物レンズ７により標本８面を照明できるようにしたので、標本の観察像に一様な明るさに得られ、常に正確な観察像の確認を行うことができる。
【００４９】
また、透過観察用光源装置１２の透過照明用光源１３より発せられる光を標本８面に照射し、ここでの透過光をダイクロイックミラー６に代わって配置されたハーフミラー３８を透過し、接眼レンズ１０で結像させると同時に、光路中に挿入された可倒式全反射ミラー３３で反射されたフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４からの光を視野絞り１９を通し、さらにハーフミラー３８により標本８と反対側に反射させ接眼レンズ１０に結像させ、これら標本８の透過像と、フラッシュ光照明範囲となる視野絞り１９の開口像を接眼部１１で重ね合わせ観察できるようにしたので、仮に標本の形状や厚さにバラツキがあっても、フラッシュ光照明範囲の確認を正確に行うことができる。
【００５０】
また、従来のダイクロイックミラーを使用しないでよいので、かかるミラーでのロスも回避できる。さらに、かかるフラッシュ光照明範囲の確認では、照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４からの光が標本８に照射されることがないので、確認動作の段階から蛍光試薬の退色が始まるのを阻止して、本来の測定に支障をきたすような問題も防止できる。
【００５１】
さらに、全反射ミラー３３が光路中に挿入され、フラッシュ光照明範囲の確認動作に移行すると、観察・測光光源装置１およびケージド試薬解除用光源装置２１のそれぞれの光源２、１６からの光を遮断できるので、これら光源２、１６から発せられる紫外光が直接接眼部１１に届くようなことも防止できる。
（第２の実施の形態）
第１の実施の形態では、落射観察・測光光源装置１からの光と、ケージド試薬解除用光源装置２１からの光をファイバ束３１を介して同軸的に導光するようにしたが、この第２の実施の形態では、ファイバ束３１を用いることなくダイクロイックミラーとハーフミラーの組み合わせを用いている。
【００５２】
図６は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
ケージド試薬解除用光源装置２１は、バンドパスフィルタ１８と視野絞り１９の間に可倒式全反射ミラー３３を挿入可能にし、さらに、照明用光源３４、バンドパスフィルタ３５、集光レンズ３６を有するフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７を有していて、このフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４からの照明光を可倒式全反射ミラー３３での全反射により視野絞り１９側に照射できるようにしている。
【００５３】
ここで、可倒式全反射ミラー３３は、非同軸になっている光源１６と照明用光源３４からの光をダイクロイックミラー２２に対して同軸入射させるようにしている。また、バンドパスフィルタ１８と視野絞り１９の間の光路中に可倒式全反射ミラー３３が挿入される図７（ａ）に示す状態では、光路上にハーフミラー３８が配置され、可倒式全反射ミラー３３が光路から退避される図７（ｂ）に示す状態では、ハーフミラー３８に代わってダイクロイックミラー６が配置されるようになっている。
【００５４】
ダイクロイックミラー６（ハーフミラー３８）と接眼レンズ１０との間に配置される全反射ミラー９は、光路に対して挿脱可能にしていて、光路に挿入された状態で、ダイクロイックミラー６（ハーフミラー３８）からの光を接眼レンズ１０側に偏向し、光路に挿入されない状態で、ダイクロイックミラー６（ハーフミラー３８）からの光を光電変換装置１５に導入するようにしている。
【００５５】
なお、４３１はダイクロイックミラー６（ハーフミラー３８）と全反射ミラー９との間に挿入されるフィルタである。
しかして、このような構成において、まず、ケージド試薬解除用光源装置２１の光源１６からの紫外線フラッシュ光の照明範囲と位置を設定する場合を説明する。この場合、可倒式全反射ミラー３３を光路に挿入するとともに、ハーフミラー３８をダイクロイックミラー６に代わって光路中に挿入する。また、フィルタ４３１は光路から外される。
【００５６】
図７（ａ）は、この時のフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４から出射される光の経路を示すもので、照明用光源３４から出た光は、バンドパスフィルタ３５、集光レンズ３６を通って可倒式全反射ミラー３３で反射され、視野絞り１９を照明する。ここで、バンドパスフィルタ３５は、落射観察・測光光源装置１からの光と区別するために照明用光源３４から発する光のうち特定の波長を通過させるようにしている。また、集光レンズ３６は、照明用光源３４のピント出しのため光軸方向に移動可能にしている。
【００５７】
視野絞り１９を通過した光は、ダイクロイックミラー２２、ハーフミラー３８で反射され、観察、測光側に導入される。この時、ミラー９が光路内に挿入されていれば、接眼レンズ１０により観察ができる。勿論、ミラー９が光路から外されていれば、光電変換装置１５により測光ができる。
【００５８】
一方、透過観察用光源装置１２の透過照明用光源１３より発せられる光は、標本８をケーラー照明する。そして、標本８を透過した光は、対物レンズ７、ハーフミラー３８を透過するが、この標本８からの光は、視野絞り１９を通過した照明範囲確認照明光と一緒になり、観察者は、接眼レンズ１０を通して標本８の像と視野絞り１９の開口像を同時に観察することができる。なお、透過照明による観察は、位相差観察やノマルスキー観察などの検鏡法による観察が可能であるため、これらの観察を利用すれば、さらに良好な標本観察ができる。
【００５９】
この場合、視野絞り１９の位置と大きさの調整中は、可倒式全反射ミラー３３が紫外線フラッシュ光専用光源１６の光路を塞ぐように配置されるので、この状態で、誤って光源１６が発光しても、目に有害となる紫外線は可倒式全反射ミラー３３で遮断され、観察者の目に届くようなことはない。また、フラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４と視野絞り１９との間に他の光源などの遮光物体が存在しないため、視野絞り１９を効率よく照明することができる。さらに、観察・測光光源装置１の照明用光源２からの光が標本８に照射されることがないので、標本８の褪色を防止できる。
【００６０】
次に、ケージド試薬解除用光源装置２１の紫外線フラッシュ光専用光源１６による紫外線フラッシュ光の照射の様子を説明する。この場合、可倒式全反射ミラー３３を移動して光路から外すとともに、ハーフミラー３８に代わってダイクロイックミラー６を光路中に挿入する。この場合、フィルタ４３１は光路中に挿入される。
【００６１】
図７（ｂ）は、この時の紫外線フラッシュ光専用光源１６からの光の経路を示すもので、光源１６から出た光は、集光レンズ１７、バンドパスフィルタ１８を通過して視野絞り１９を照明する。
【００６２】
視野絞り１９を通過した光は、ダイクロイックミラー２２、ダイクロイックミラー６でそれぞれ反射され、対物レンズ７を通って標本８を照射する。すると、標本８内のケージド試薬は、照射された紫外線によりケージド基が外され、内部の物質が標本８内に拡散していく。
この拡散の様子は、落射観察・測光光源装置１の落射照明用光源２からの蛍光照明により観察、測光が行われる。この場合、照明用光源２から出た光のうち観察、測光のために必要な波長のものが干渉フィルタ４を通過される。干渉フィルタ４を通過した励起光は、ダイクロイックミラー２２を通過し、ダイクロイックミラー６で反射され、対物レンズ７を通って標本８を照射される。
【００６３】
そして、標本８から発生した蛍光と、標本８（この場合はカバーガラスなど）や対物レンズ７から反射した紫外線や励起光は、対物レンズ７を通過してダイクロイックミラー６に入射する。すると、ダイクロイックミラー６では、これら紫外線や励起光を反射し、蛍光のみを通過する。これによりダイクロイックミラー６を通過された蛍光は、フィルタ４３１を通って接眼レンズ１０による観察または光電変換装置１５による測光が可能になる。
【００６４】
従って、このようにしても上述したと同様な効果が得られ、さらに、特殊な形状をしたファイバ束を用いることなくダイクロイックミラー６、２２およびハーフミラー３８の組み合わせにより実現できるので、コスト的に安価にできる。
（第３の実施の形態）
第２の実施の形態では、可倒式全反射ミラー３３を光路に対し出し入れするようにしたが、この第３の実施の形態では、可倒式全反射ミラー３３に代わってフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４をスライドして光路に出し入れできるようにしている。
【００６５】
図８および図９は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図６と同一部分には、同符号を付している。
図１０（ａ）（ｂ）に示すように、フラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４、ケージド試薬解除用光源装置２１のバンドパスフィルタ１８、ダイクロイックミラー６およびハーフミラー３８を同一の光路切り換えユニット４２に搭載し、この光路切り換えユニット４２をスライド操作することにより、視野絞り１９を通る光路上に、照明用光源３４とハーフミラー３８を結ぶ光路または紫外線フラッシュ光専用光源１６、バンドパスフィルタ１８およびダイクロイックミラー６を結ぶ光路を選択的に位置させることができるようになっている。
【００６６】
さらに、プリズム４３、反射鏡４４、切り換えミラー４５、測光絞り４６および照明用光源４７、接眼シャッタ４８を有する観測、測光光学系を設けている。しかして、このような構成において、まず、紫外線フラッシュ光専用光源１６からの紫外線フラッシュ光の照明範囲と位置を設定する場合を図９により説明する。
【００６７】
この場合、図示しない透過光源装置１２より発せられる光が、標本８を下から照明する。標本８を透過した光は、対物レンズ７、ダイクロイックミラー２２、ダイクロイックミラー６（この時点では、光路切り換えユニット４２をスライド操作されておらず、光路中には、ダイクロイックミラー６が挿入されている。）を透過し、プリズム４３で反射され、接眼レンズ１０により標本像として観察される。この場合、標本８の褪色防止のため、落射観察・測光光源装置１の照明用光源２からの励起光が標本８に照射しないように、シャッタ４１を閉じておく。
【００６８】
次に、図１０（ａ）に示すようにフラッシュ光照明範囲確認用光源装置３７の照明用光源３４とハーフミラー３８を結ぶ光路が視野絞り１９を通る光路上に位置するように、光路切り換えユニット４２をスライド操作する。この状態で、光源３４から発せられる光は、視野絞り１９によって照明範囲を限定され、ハーフミラー３８、プリズム４３で反射され、接眼レンズ１０に入射され、この接眼レンズ１０により標本８の像に視野絞り１９の開口像が重なったものが観察できる。この場合、照明用光源３４から発せられる光は、標本８を照射せず直接接眼レンズ１０に入るため、視野絞り１９の開口像を確認できる程度のＬＥＤや光量を調整できる可視光を使用できる。
【００６９】
また、光電変換装置１５により標本８上の測光される位置は、次のようにして確認される。この場合、照明用光源４７から発せられた光は、可倒式の切り換えミラー４５で反射され、測光絞り４６によって範囲を限定され、プリズム４３、反射鏡４４で反射され、再びプリズム４３に入射され、接眼レンズ１０により測光絞り４６の像を結ぶ。
【００７０】
これにより、接眼レンズ１０によって、標本８の像に視野絞り１９の開口像を加え、さらに測光位置を示す測光絞り４６の開口像を同時に重ね合わせ、確認することができる。ここで、視野絞り１９の開口像と測光絞り４６の開口像が同時に表示されるので、これらを区別するため、それぞれの光源の色を変えられるように、ＬＥＤの色を変えたり、色ガラスを設定するような工夫もなされている。
【００７１】
また、この場合、紫外線フラッシュ光専用光源１６の手前に光路切り換えユニット４２が挿入されているので、この紫外線フラッシュ光専用光源１６のシャッタの役目を光路切り換えユニット４２に持たせるようにすれば、この状態で、誤って、光源１６が発光しても、目に有害となる紫外線は、光路切り換えユニット４２により遮断され、観察者の目に届くようなことはない。また、照明用光源３４と視野絞り１９との間に他の光源が存在しないため、視野絞り１９を効率よく照明することができる。さらに、観察・測光光源装置１の照明用光源２からの光が標本８に照射されることがないので、標本８の褪色を防止できる。
【００７２】
次に、紫外線フラッシュ光専用光源１６による紫外線フラッシュ光の照射の様子を図９により説明する。
この場合、図１０（ｂ）に示すように紫外線フラッシュ光専用光源１６、バンドパスフィルタ１８およびダイクロイックミラー６を結ぶ光路が視野絞り１９を通る光路上に位置するように、光路切り換えユニット４２をスライド操作する。
【００７３】
この状態から、落射観察・測光光源装置１の照明用光源２を発光させると、この照明用光源２の光は、集光レンズ３を透過し、励起フィルタ４により励起光として波長が限定され、ダイクロイックミラー２２で反射され、対物レンズ７を通って標本８を照射される。そして、標本８から発せられる蛍光は、ダイクロイックミラー２２、ダイクロイックミラー６を透過してプリズム４３により分光され、反射光は接眼レンズ１０により観察され、また、プリズム４３を透過された光は、測光絞り４６で測光が限定され、この測光絞り４６を通った蛍光量のみを光電変換装置１５により測定し記録する。この場合の測光時には、接眼レンズ１０から入ってくる迷光を防止するため接眼シャッタ４８を閉じることができる。
【００７４】
一方、紫外線フラッシュ光専用光源１６から出た光は、集光レンズ１７、バンドパスフィルタ１８を通過して視野絞り１９を照明する。そして、視野絞り１９で照明範囲を限定された光は、ダイクロイックミラー６で反射され、ダイクロイックミラー６を透過され、対物レンズ７を通って標本８を照射する。この場合、視野絞り１９を、その平面方向に移動調整することで、標本８上の任意の位置に紫外線フラッシュ光を照明できる。また、測光絞り４６についても、その平面方向に移動調整することで、標本８上の任意の位置を測光することができる。
【００７５】
この場合、標本８内のケージド試薬は、この紫外線フラッシュ光によりケージド基が外され、内部の物質が標本８内に拡散するようになるが、この状態がダイクロイックミラー２２、ダイクロイックミラー６より紫外線や励起光が除去された蛍光量として、接眼レンズ１０により観察または光電変換装置１５により測光される。
【００７６】
ここで、さらに具体例を挙げて説明すると、この場合、標本８として予めケージドカルシウム（Nitr5)およびカルシウム指示薬fluo-3を導入した細胞を用いるものとする。また、バンドパスフィルタ１８として３６０ｎｍ付近の波長を持つ干渉フィルタを用い、図１１に示すように、ダイクロイックミラー６として、４００ｎｍ付近以上の波長を透過する特性を有するものを用い、さらにダイクロイックミラー２２として、３６０ｎｍ付近の波長と５００ｎｍ付近以上の波長を透過する２重透過特性を有するものを用いると、水銀やキセノンなどの紫外線域を有する光源１６から発光される紫外線フラッシュ光は、バンドパスフィルタ１８により３６０ｎｍの波長に限定され、ダイクロイックミラー６で反射され、ダイクロイックミラー２２を透過し、対物レンズ７を通って標本８に照射される。すると、標本８の紫外線フラッシュ光が照射された範囲のケージドカルシウム(Nitr-5)のケージド基が解除され、カルシウムイオンが遊離し、この遊離カルシウムイオンにカルシウム指示薬fluo-3が結合するようになる。
【００７７】
この状態から、落射観察・測光光源装置１の照明用光源２からの発光が、図１１に示す４９０ｎｍ付近の透過特性を有する励起フィルタ４を通って波長が限定された励起光として、標本８の細胞面に照明されると、細胞面からは５３０ｎｍ付近の蛍光が発せられ、この蛍光を図１１に示す５３０ｎｍ付近の透過特性を有するフィルタ４３１を通し、５３０ｎｍ付近のみの蛍光を測定するように限定し、光電変換装置１５により遊離カルシウムイオンの変化量を測定、記録するようになる。
【００７８】
なお、このことを利用して、細胞の特定部位のカルシウムイオンの上昇によって、例えば細胞が伝達物質を放出するなどの機能を調査することによって、カルシウムイオン濃度との相関も調べることができる。
【００７９】
従って、このようにしても上述したと同様な効果が得られ、さらに光路切り換えユニット４２をスライド操作により照明用光源３４、ダイクロイックミラー６およびハーフミラー３８を光路に対し出し入れできるので、取扱い操作を簡単なものにできる。
【００８０】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、絞り手段を介して設定された照明用光源によるケージド試薬解除用光源の標本上の照明範囲を観察している状態では、光しゃ断手段によりケージド試薬解除用光源の照明光をしゃ断することができるので、絞り手段の調整中などに誤ってケージド試薬解除用光源が発光することがあっても、目に有害となる紫外線が観察者の目に届くようなことを皆無にできる。また、照明用光源と絞り手段の間には、他の光源が位置されるようなこともないので、照明用光源により絞り手段を効率よく照明できる。
【００８１】
また、標本の透過像と、絞り手段を介して設定された照明用光源によるケージド試薬解除用光源の標本上の照明範囲とを重ね合わせて観察できるので、標本像を確認しながら標本上でのケージド試薬解除用光源の照明範囲を精度よく設定することができる。
【００８２】
さらに、観察照明用光源からの光をファイバに通し標本面を照明できるので、標本の観察像に一様な明るさに得られ、精度の高い標本観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】 第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】 第１の実施の形態に用いられるファイバの概略構成を示す図。
【図４】 第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーとハーフミラーとの相対位置関係を説明するための図。
【図５】 第１の実施の形態に用いられるフラッシュ光照明系の他例の概略構成を示す図。
【図６】 本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図７】 第２の実施の形態の動作を説明するための図。
【図８】 本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図９】 第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１０】 第３の実施の形態に用いられる光路切り換えユニットの動作を説明するための図。
【図１１】 第３の実施の形態に用いられるダイクロイックミラー、フィルタなどの透過特性図。
【図１２】 従来のケージド試薬解除用光源装置を有する蛍光顕微鏡の一例を示す概略構成図。
【図１３】 従来のケージド試薬解除用光源装置を有する蛍光顕微鏡の他例を示す概略構成図。
【符号の説明】
１…落射観察・測光光源装置、
２…落射照明用光源、
３…集光レンズ、
４…干渉フィルタ、
５…視野絞り、
６…ダイクロイックミラー、
７…対物レンズ、
８…標本、
９…全反射ミラー、
１０…接眼レンズ、
１１…接眼部、
１２…透過観察用光源装置、
１３…透過照明用光源、
１４…ファイバー、
１５…光電変換装置、
１６…紫外線フラッシュ光専用光源、
１７…集光レンズ、
１８…バンドパスフィルタ、
１９…視野絞り、
２０…視野絞り照明用光源、
２１…ケージド試薬解除用光源装置、
２２…ダイクロイックミラー、
３０…シャッタ、
３１…ファイバ束、
３２…リング状レンズ、
３３…可倒式全反射ミラー、
３４…照明用光源、
３５…バンドパスフィルタ、
３６…集光レンズ、
３７…フラッシュ光照明範囲確認用光源装置、
３８…ハーフミラー、
３９…電磁シャッタ、
４１…シャッタ、
４２…光路切り換えユニット、
４３…プリズム、
４４…反射鏡、
４５…切り換えミラー、
４６…測光絞り、
４７…照明用光源。

Claims (2)

1. 標本のケージド試薬を解除するためのケージド試薬解除用光源と，
   このケージド試薬解除用光源による前記標本上の照明範囲を確認するための照明用光源と、
   前記ケージド試薬解除用光源または前記照明用光源により照明され前記標本面上の前記ケージド試薬解除用光源の照明範囲を設定する絞り手段と、
   前記照明用光源による前記絞り手段の照明中に前記ケージド試薬解除用光源の照明光をしゃ断する光しゃ断手段と、
   透過照明用光源と、を具備し、
   この透過照明用光源により照明される前記標本の透過像と、前記光しゃ断手段により前記ケージド試薬解除用光源の照明光をしゃ断した状態で、前記絞り手段を介して設定された前記照明用光源による前記ケージド試薬解除用光源の前記標本上の照明範囲とを重ね合わせて観察可能にしたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
2. さらに観察照明用光源、この観察照明用光源からの光が入射され且つ出射側を環状に形成されたファイバ、このファイバより出射した光を集光して標本面を照明する光学系を有し、
   前記絞り手段を通った前記ケージド試薬解除用光源または前記照明用光源からの光を、前記ファイバを通る前記観察照明用光源からの光と同軸的に導光することを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。

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