JPH04336516A - フラッシュフォトリシス用顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞内のイオン濃度測
定をはじめとする、化学反応の瞬間的変化や過渡的現象
の測定に用いられる顕微鏡装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】紫外光（ＵＶ光）が照射されると光化学
反応を起こして、種々の化学物質やイオンが解離する試
薬を「ケージドコンパウンド（Ｃａｇｅｄ　Ｃｏｍｐｏ
ｕｎｄｓ）」と称している。この試薬を生体細胞内に入
れ、紫外光を数ミリ秒〜数十ミリ秒の間照射すると、試
薬より特定の化学物質またはイオンが解離し、細胞内に
あらかじめ注入されている蛍光試薬と選択的に結合し、
その結果蛍光を発する。この蛍光強度を測定することに
より、細胞内における目的物質の瞬間的な濃度や過渡的
変化を測定したり、運動の状態や変化を調べることがで
きる。ケージドコンパウンドとしては、ＡＴＰ（アデノ
シントリホフファターゼ）を解離させるケージドＡＴＰ
やカルシウムイオンを解離させるケージドカルシウム等
が知られている。

【０００３】ケージドコンパウンドに光化学反応を起こ
させるためにフラッシュ光を用いる手法を、フラッシュ
フォトリシス（Ｆｌａｓｈ　Ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ）と
称している。フォトリシス用の波長域と、標本観察およ
び測光のための照明用の波長域とを異ならせることによ
って、フラッシュ光が測光に悪影響を及ぼしたり、標本
の褪色を促進させないように工夫されている。一般には
フォトリシス用としてＵＶ光が、照明用として可視光が
使用される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】顕微鏡を使用した従来
のフラッシュフォトリシスでは、顕微鏡の外部から標本
にダイレクトにフラッシュ光を照射していた。しかし従
来の照射方法ではフラッシュ光を標本上の目的の位置に
正確に導くことが難しく、目的の位置から外れて照射し
てしまうことがしばしばあった。特に正立顕微鏡の場合
、対物レンズが標本の直上に極めて接近して存在するた
めに、対物レンズの真下の標本にフラッシュ光を照射す
ることが困難であるという問題点があった。さらにこの
従来の照射方法では、フォトリシス反応を起こしたい微
小領域にビームを絞ることができないため、目的の位置
の周辺部分も感光させてしまうという問題もあった。 また、フラッシュ照射範囲を予め確認することも困難で
あった。

【０００５】一方、フラッシュの代わりに紫外線レーザ
を使用することも従来用いられていたが、レーザ光の強
度の調整と位置合わせが難しく、ビームの径を小さくす
ることはできても任意のビーム径を得ることができず、
フレキシブルな応用は期待できない。また装置自体が大
型して扱い難い上に高価格であった。本発明は上記の諸
問題を解決し、観察または測光と同一照射範囲に限って
ＵＶフラッシュ光を照射してフォトリシス反応を起こさ
せる簡易な装置を安価に提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の顕微鏡は、標本
照明用の照明光を射出する照明光学系（１）と、上記照
明光とは異なる波長域のフォトリシス用のフラッシュ光
を射出するフラッシュ光学系（５）と、照明光学系の途
中からフラッシュ光を照明光学系に同軸に導入するため
に設けられたダイクロイックミラー（９）と、照明光と
フラッシュ光の照射範囲を両者が標本上で同一になるよ
うに規定する視野絞り（１２）と、標本からの光学情報
を受ける観察光学系（１５）とを備える。

【０００７】本発明の一つの態様において、上記観察光
学系はフラッシュ光の波長域をカットする光学手段（１
３，１４）を有する。

【０００８】

【作用】本発明においては、標本照明用の照明光とフォ
トリシス用のフラッシュ光とを同軸で標本上に供給し、
且つ両光束が標本上で同一の領域を照明するように視野
絞りを配置することにより、フォトリシスの前にフラッ
シュ照射範囲を予め確認することが可能になる。

【０００９】

【実施例】本発明を倒立顕微鏡に応用した実施例を説明
する。図１において、観察および測光用の励起照明光Ｂ
を供給する照明光学系１は、水銀，キセノン，ハロゲン
，タングステンランプ等から成る照明光源２、集光レン
ズ３、および励起フィルター４を含む。集光レンズ３は
光軸方向に移動可能に設けられ、光源２のピント出しの
ために調節可能である。励起フィルター４は後述する蛍
光試薬（Ｆｌｕｏ　３）の励起波長である４７０〜４９
０ｎｍの光のみを通過させる特性を有する。

【００１０】フォトリシス用のＵＶフラッシュ光を供給
するフラッシュ光学系５は、キセノン管によって構成さ
れるフラッシュ光源６、石英集光レンズ７、およびバン
ドパスフィルター８を含む。石英集光レンズ７は光軸方
向に移動可能に設けられ、光源６のピント出しのために
調節可能である。バンドパスフィルター８はフォトリシ
スに使用するＵＶ波長域、即ち波長２８０〜３８０ｎｍ
の光のみを通過させる特性を有する。

【００１１】ダイクロイックミラー９は、照明光学系１
から射出した長波長の励起照明光Ｂを透過し、フラッシ
ュ光学系５から射出したフラッシュ光ＵＶを反射する。 このダイクロイックミラー９によって、照明光学系１の
光軸とフラッシュ光学系５の光軸とは一致させられる。 なお、ダイクロイックミラー９の透過・反射率特性は図
２に示す如くである。

【００１２】標本１０は図示なきステージ上に載置され
、その下方には対物レンズ１１が配置されている。この
対物レンズ１１に関して標本１０と共役な位置に配置さ
れた視野絞り１２は、観察および測光の視野を限定する
ものである。照明光学系１からの励起照明光Ｂとフラッ
シュ光学系５からのフラッシュ光ＵＶとは、共にこの視
野絞り１２を通過するので、励起照明光およびフラッシ
ュ光の照射範囲は上記視野内に限定される。

【００１３】ダイクロイックミラー１３は、前述のダイ
クロイックミラー９とは異なった特性を有し、励起照明
光Ｂとフラッシュ光ＵＶとの何れも対物レンズ１１およ
び標本１０に向けて反射し、標本から発せられた蛍光Ｆ
Ｌをフィルター１４および観察・測光光学系１５に向け
て透過する。このダイクロイックミラー１３の透過・反
射率特性は図３に示す如くである。

【００１４】フィルター１４は、観察および測光に必要
な蛍光ＦＬのみを透過し、励起照明光Ｂやフラッシュ光
ＵＶによる迷光や、標本から発生される不要な波長域の
光を吸収するために設けられている。観察・測光光学系
１５は、標本観察用の接眼レンズ１６、フォトメータ等
の測光装置１７、およびフィルター１４からの蛍光ＦＬ
を接眼レンズ１６と測光装置１７とにそれぞれ向けるた
めのビームスプリッタ１８を含む。

【００１５】上記ダイクロイックミラー１３とフィルタ
ー１４とは光路から一体的に退避可能に設けられている
。観察・測光光学系１５を用いて励起照明光Ｂによる標
本の照明領域をフォトリシスの実行前に確認する時には
、ダイクロイックミラー１３とフィルター１４とを光路
外に退避操作し、代わりにダイクロイックミラー１３の
位置にハーフミラー２３を配置させる。

【００１６】次に、本実施例で用いる試薬について説明
する。本実施例ではケージドコンパウンドとしてのケー
ジドカルシウム（Ｃａｇｅｄ　Ｃａｌｃｉｕｍ）試薬　
Ｎｉｔｒ　５　と、カルシウムイオン測定用の蛍光試薬
　Ｆｌｕｏ　３　とが用いられる。ケージドカルシウム
試薬Ｎｉｔｒ　５　が注入された細胞組織にＵＶ光を照
射すると、光化学反応によってカルシウムイオンが　Ｎ
ｉｔｒ　５　から瞬時に細胞内に放出される。 蛍光試薬　Ｆｌｕｏ　３　はカルシウムイオンに結びつ
いて、波長４７０〜４９０ｎｍの励起光の照射によって
波長５２０〜５６０ｎｍの蛍光が発せられる。従ってこ
れら２種類の試薬が注入された細胞標本に、励起照明光
の照射のもとでＵＶフラッシュ光を瞬時照射すれば、Ｕ
Ｖ光に応答して放出されたカルシウムイオンからの蛍光
を観察・測光することが可能になる。

【００１７】次に、本実施例の動作を説明する。顕微鏡
のステージに載置された標本１０は上記２種類の試薬が
あらかじめ注入された細胞組織である。照明光源２を点
灯すると、照明光学系１から射出した励起照明光Ｂは、
ダイクロイックミラー９を透過しダイクロイックミラー
１３で反射して、対物レンズ１１を介して標本１０を照
明する。ダイクロイックミラー１３とフィルター１４と
を光路から退避させ、ハーフミラー２３を光路内に挿入
すると、標本１０で反射した励起照明光Ｂはハーフミラ
ー２３を透過して観察・測光光学系１５に到達するよう
になり、励起照明光Ｂで照明された標本１０の像を接眼
レンズ１６を通して観察可能になる。そこで標本１０上
に投影された視野絞り１２の像を観察しながら絞り径を
調節し、照明領域を所望の範囲に限定しておく。また、
光源２の像が対物レンズ１１の瞳上に投影された、いわ
ゆるケーラー照明が得られるように集光レンズ３の位置
を調節しておく。

【００１８】これらの調節が完了したら、ダイクロイッ
クミラー１３とフィルター１４とを再び図示のように光
路内に戻す。この状態でフラッシュ光源６をトリガーす
ることによってキセノン管が放電し、フラッシュ光学系
５からフラッシュ光ＵＶが照射される。フラッシュ光Ｕ
Ｖはダイクロイックミラー９，１３で反射され、視野絞
り１２で規定された照明領域と同一領域内にある標本１
０に、対物レンズ１１を介して照射される。このＵＶ光
の照射に反応してケージドカルシウム試薬は標本１０の
細胞組織内にカルシウムイオンを放出し、そのカルシウ
ムイオンと蛍光試薬とが結びつき、励起照明光Ｂの照射
を受けて蛍光が励起される。

【００１９】発生した蛍光ＦＬは、対物レンズ１１を通
り、ダイクロイックミラー１３を透過し、フィルター１
４を透過して観察・測光光学系１５に導かれる。従って
接眼レンズ１６を通して肉眼でカルシウムイオンの発生
状態を観察することが可能であり、接眼レンズの代わり
にＴＶカメラを配置すれば、ＴＶモニターを通して観察
することができる。また、フォトメータ１７を動作して
蛍光強度を測定すれば、カルシウムイオンの濃度を知る
ことができる。

【００２０】なお、本実施例においては倒立顕微鏡につ
いて説明したが、正立顕微鏡を用いた場合でも容易に実
施可能であると共に、透過照明系の倒立または正立顕微
鏡を用いた場合でも実施可能である。さらに本実施例と
は別の蛍光試薬およびケージド試薬を用いた場合でも同
様の原理で実施可能である。また、視野絞り１２は操作
上の利点および励起照明光Ｂとフラッシュ光ＵＶとの両
者について兼用できる観点から図１に示す位置に配置し
たが、標本１０と共役関係を有する位置であれば、例え
ば照明光学系１とフラッシュ光学系５とに個々に配置し
、それぞれ連動させながら絞り径を調節するように構成
してもよい。

【００２１】

【発明の効果】フォトリシス用のフラッシュ光を励起照
明光と同軸で標本に照射する構成により、フォトリシス
用のフラッシュ光を標本の必要範囲のみに照射すること
が可能になったため、標本の不要部分の反応や褪色を防
止でき、フラッシュ光の照射範囲を予め接眼レンズまた
はＴＶモニターを通して観察可能になるという効果を有
する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例による顕微鏡の光路図である。

【図２】ダイクロイックミラー９の透過・反射率特性を
示すグラフである。

【図３】ダイクロイックミラー１３の透過・反射率特性
を示すグラフである。

【符号の説明】

１・・・・照明光学系 ５・・・・フラッシュ光学系 ９・・・・ダイクロイックミラー １０・・・・標本 １１・・・・対物レンズ １２・・・・視野絞り １３・・・・ダイクロイックミラー １５・・・・観察・測光光学系 ２３・・・・ハーフミラー Ｂ・・・・励起照明光 ＵＶ・・・・フラッシュ光 ＦＬ・・・・蛍光

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　標本照明用の照明光を射出する照明光
   学系と、該照明光とは異なる波長域のフラッシュ光を射
   出するフラッシュ光源と、該フラッシュ光を前記照明光
   学系に同軸に導き入れるために設けられたダイクロイッ
   クミラーと、前記照明光とフラッシュ光の照射範囲を両
   者が前記標本上で同一になるように規定する視野絞りと
   、前記標本からの光学情報を受ける観察光学系とを備え
   たことを特徴とする顕微鏡。
2. 【請求項２】　　前記観察光学系は前記フラッシュ光の
   波長域をカットする光学手段を有することを特徴とする
   請求項１に記載の顕微鏡。