JP2009109787A - レーザー走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、観察用のレーザー走査光学系と光刺激用の光学系とを異なる特性の光学系を使って光刺激と観察を行うことにより、それぞれに最適な光線の照射が可能なレーザー走査型顕微鏡を提供することである。
【解決手段】本発明の上記課題は、観察用光学系と光刺激用光学系を備えたレーザー走査型顕微鏡において、前記観察用光学系は励起光を集光させたスポットを試料面で走査する走査手段を備え、前記光刺激用光学系は刺激光をワイドフィールド照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡によって解決される。
【選択図】図１

Description

本発明は生体物質及び生細胞などの試料に光刺激を行い、その光刺激に対する試料の反応を観察するためのレーザ走査型顕微鏡に関する。

近年、生体物質の動態及び機能や生細胞内のタンパク質の挙動・相互作用を解析する研究方法が広く行われている。これらの研究手法では蛍光物質（蛍光色素、蛍光たんぱく質、Ｑ−ｄｏｔなど）を使った観察が利用される。これらの蛍光物質を使って標本内を特異的に指標する事によって、標本内の細部構造を観察することができる。

さらに上記観察法に加えて、蛍光物質の反応をアクティブにコントロールする手法も利用されてきている。特に標本の特定部位にある波長の光を照射する手法を光刺激と呼び、顕微鏡による生細胞観察では広く用いられている。

例えば上記のような観察にはＰｈｏｔｏ・Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＰＡ）を使った観察が挙げられる。例えばＰＡ−ＧＦＰでは、通常状態では弱い蛍光強度しか持たない蛍光物質が光刺激を行うことによって大きく蛍光強度が上がるという現象を起こす。この現象を用いることによって、多くの生細胞の中から目標の細胞（あるいは細胞内の特定部位）を選択的にマーキングすることができる。

また、ＦＲＡＰ／ＦＬＩＰという観察手法もよく知られる。蛍光物質は必要以上に光を照射すると、蛍光強度が低下するという性質を持っている。この現象は蛍光の褪色と呼ばれる。ＦＲＡＰ／ＦＬＩＰではこの褪色を利用して、試料の一部を褪色させた後あるいは最中に、その領域に細胞内物質が蛍光物質と共に移動する様子を観察する。このことによって細胞内物質の動きを捉えることができる。

さらに、ｃａｇｅｄ試薬と呼ばれる試薬を用いた観察手法もある。このｃａｇｅｄ試薬とは、不活性化した状態の試薬に光刺激を与えることによって活性化させる（ｕｎｃａｇｅ）することができる試薬である。この試薬を用いると光刺激を与えたタイミングで生体反応を開始させることや停止させることができる。

さらに近年では、蛍光の褪色以外の方法で蛍光物質の蛍光特性を消すことができる蛍光物質が開発されている。例えば、Ｄｒｏｎｐａという蛍光タンパク質では、４８８ｎｍの強い刺激光を照射すると蛍光特性を消すことができ、４０５ｎｍの刺激光を照射することによって蛍光特性を復活させることができる。しかも、この蛍光のＯＮとＯＦＦの操作は繰り返すことができる。

しかし、Ｄｒｏｎｐａの蛍光のＯＮ／ＯＦＦを繰り返した場合、実際には蛍光強度が完全には復元されないという現象が観察される。その理由は、蛍光の消光（４８８ｎｍ光の照射）がＤｒｏｎｐａの蛍光物質としての褪色が誘発してしまっているからであると考えられている。つまり、蛍光を消光するために照射した４８８ｎｍの刺激光の強度が不適切なのではないかと考えられている。このことからも、刺激光の光量を適切にコントロールすることが重要であることが理解される。

上記のような手法に利用されるレーザー走査型顕微鏡として、特許文献１には試料観察用の第一の走査光学系と試料刺激用の第二の走査光学系とを備えたレーザー走査型顕微鏡が開示されている。しかし、特許文献１に記載のレーザー走査型顕微鏡のような構成では光刺激用の光路と励起用の光路が同じ構成となっているので、光刺激と励起のそれぞれに最適な光線を照射することが難しく、光刺激に必要な量以上の光量を照射してしまい、蛍光の褪色を誘発してしまっていた。
特開平１０−２０６７４２号公報

本発明の課題は、観察用の光学系と光刺激用の光学系を異なる特性の光学系を使って光刺激と観察を行うことにより、それぞれに最適な光線の照射が可能なレーザー走査型顕微鏡を提供することである。特に、観察用の光路と光刺激用の光路に異なる光源を利用することによって光量とその波長の調節を容易にし、また、観察用の光路と光刺激用の光路を独立にすることによってそれぞれの光線分離を容易にする。

上記課題は、観察用光学系と光刺激用光学系を備えたレーザー走査型顕微鏡において、前記観察用光学系は励起光を集光させたスポットを試料面で走査する走査手段を備え、前記光刺激用光学系は刺激光をワイドフィールド照射（刺激光をスポット照射せず、ある程度の広範囲の領域に刺激光を照射する刺激方法）することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡によって解決される。この構成により、観察と光刺激のそれぞれに最適な光線の照射が行える。

とくに、前記観察用光学系と前記光刺激用光学系は試料面に関して反対側に配置されている構成は好ましい。観察用光学系と光刺激用光学系を試料に関して反対に配置することによって、両者の光学系をより完全に独立に構成できる。

また、前記観察用光学系は対物レンズを通じて励起光を照射して蛍光を集め、前記刺激光学系はコンデンサレンズを通じて刺激光を照射することが好ましい。レーザー走査型顕微鏡は高解像度の観察が前提として作られており、その観察光学系には非常に高度に収差補正された対物レンズを利用することが好ましい。

なお、前記観察用光学系は前記対物レンズの後段に刺激光をカットするフィルタを備えることが望ましい。コンデンサレンズから照射された刺激光は試料を透過して対物レンズに進入してしまう。この刺激光によって観察用光学系の内部の自家蛍光が発生しないように刺激光をカットするフィルタを備えることは望ましい。

上記構成において、前記コンデンサレンズはその前側焦点位置に開口絞りを備えてあり、前記開口絞りによって刺激領域の立体形状を調節することが望ましい。通常のコンデンサレンズにはその後焦点位置に開口絞りを備えてある。本願発明ではこの開口絞りを通常の利用方法とは異なり、刺激領域の立体形状を調節することに利用することができる。

上記構成において、前記観察用光学系は前記試料面と共役な位置に視野絞りを備え、刺激範囲を制限することが好ましい。また、前記視野絞りは光軸方向と光軸に垂直方向に移動可能に備えられていることも好ましい。本願発明では刺激光の照射範囲を視野絞りを使って調節する。このとき、光軸に垂直方向に移動可能な構成とすれば、刺激領域の中心位置を移動させることができる。また、光軸方向に移動可能とする構成では、光刺激用光学系の色収差による焦点面のズレにも対応できる。また、前記コンデンサレンズは光軸合わせ手段を備えてあれば、これによって刺激位置を調節することも可能である。

上記構成において、前記蛍光観察用光学系はレーザー光源を備え、前記光刺激用光学系はアーク光源を備えることが好ましい。レーザー光は点光源であるために集光時にスポット径が小さくなるので、観察用光源として利用した場合に解像度を向上させる。また、アーク光源はある程度の大きさを持った光源であるので、比較的広い領域を均一に照射することに適している。

上記構成において、前記光刺激用光学系はハロゲン光源をさらに備えることは望ましい。刺激光を照射し観察をする前に、照射位置の確認や試料の観察をするという利用方法は多い。そのためにハロゲン光源をさらに備えておく構成は好適である。また、前記光刺激用光学系はガイド光源をさらに備えることも望ましい。刺激領域を前もってガイド光照明することは作業を大いに簡便化する。

上記構成において、前記光刺激用光学系はクリティカル照明光学系とケーラー照明光学系を交換可能に構成されていることが好ましい。クリティカル照明光学系とケーラー照明光学系はそれぞれに長所の異なる光学系である。この二つの光学系を交換可能に構成しておけば、刺激光の照射の調節に選択性が高まり、より最適な光刺激が行える。

本発明のレーザー走査型顕微鏡よれば、観察用のレーザー走査光学系と光刺激用の光学系とを異なる特性の光学系を使って光刺激と観察を行うことができる。とくに、ワイドフィールド刺激（刺激光をスポット照射せず、ある程度の広範囲の領域に刺激光を照射する刺激方法）を行いながら、一方で励起光はスポット走査観察を行うことができる。

また、観察用光路と光刺激用光路を独立に配置することにより、シンプルでより自由度の高い構成となっている。特に、光路を独立にしたことにより刺激光と励起光と蛍光の光線分離が容易になっている。

更には、光刺激用の光学系の光源をアーク光源とすることで、点光源であるレーザー光源を用いて試料に刺激をした時よりも均一に広い領域を照射ができる。その結果、不必要な光量を照射しないで蛍光物質の褪色を抑えることができる。

加えて、アーク光源は連続スペクトルと複数の輝線を持つので、フィルタの交換により波長選択を行える。このことはレーザー光源が一般に単波長（とその高階調波）しか利用できないことと比較して、非常に利便性が高い。

また、本願発明では刺激光と観察光路が分離されていることにより、刺激光による観察光路内で発生する自家蛍光が少ない。つまり、ＳＮ比の高い蛍光観察ができ、より細部の構造が再現できる。

以下、本発明の実施の形態に係わるレーザー走査型顕微鏡について図を用いて説明を行う。
図１は本実施の形態の倒立型のレーザー走査型顕微鏡１の外観を概略した図である。

レーザー走査型顕微鏡１は試料２が載置されているステージ３の一方側（下方）に配置された観察用のレーザー走査光学系Ａと他方側（上方）に配置されている光刺激用の光学系Ｂとで構成されている。

観察用のレーザー走査光学系Ａには、主にスキャンユニット４と対物レンズ５で構成されている。このスキャンユニット４は、不図示のレーザー光源から導入された励起光と試料が発する蛍光とを走査するスキャナ、および蛍光と励起光を分離するフィルタ類、収集された蛍光を検出するための光電子増倍管、さらに瞳投影レンズや結像レンズなどを備えている。

詳述すると、レーザー光源から導入された励起光は、スキャンユニット４内のスキャナによって走査され、瞳投影レンズと結像レンズによって対物レンズ５に導かれ、対物レンズ５によって試料２に照射される。このときの励起光の経路がＡ１で概略的に示されている。

励起光を照射された試料２は蛍光を発し、この蛍光は対物レンズ５によって収集される。対物レンズ５によって収集された蛍光は、励起光とは逆に、結像レンズと瞳投影レンズによってスキャナに導かれる。その後、励起光と蛍光はダイクロイックミラーとフィルタによって分離され、分離された蛍光のみが光電子増倍管に導かれる。このときの蛍光の経路がＡ２によって概略的に示されている。

光学系Ｂは、主にアーク光源７、フィルタ装置８、視野絞り９及びコンデンサレンズユニット１０で構成され、アーク光源７からの光線はフィルタ装置８、視野絞り９、コンデンサレンズユニット１０の順で通過し、試料２の一領域を照射する。このときの光線の経路がＢ１によって概略的に示されている。

ここでアーク光源７としては、水銀ランプやキセノンランプなどが利用できる。さらに、アーク光源７以外にもハロゲンランプを別に備え、光路切り替え又はダイクロイックミラーによる結合によって２つの光源を備える構成とすることも好ましい。アーク光源とハロゲンランプを備えた構成によれば、ハロゲンランプの透過光照明による明視野観察によって、試料の形状や位置の確認を行った後に、アーク光源による刺激光照射をするといった利用方法ができる。また、ガイド光源を別に備える構成も好ましい。刺激光は紫外光であることもあり、目視で照射位置を確認できないことも多い。また、刺激光は可能な限り観察前には照射しないほうが好ましいので、異なる波長の光を利用したガイド光源を持つことが好ましい。なお、本実施の構成要素であるアーク光源は広い放射波長帯域を持っているので、フィルタの交換によってガイド光源の役割を兼ねることも可能である。

アーク光源７から発した光は、光の波長を選択するフィルタ装置８に入射され、刺激光として利用される波長を選択する。レーザー光源を刺激光源として利用した場合は、一つのレーザーに対して一つの波長を発するものであるため、刺激光の種類の数だけ、レーザー光源を用意しなければいけなかった。例えばＣＡＧＥＤ試薬にはＵＶ光が使用され、ＰＡ−ＧＦＰは４０５ｎｍ、ＧＦＰのＦＬＩＰ／ＦＲＡＰでは４８８ｎｍの波長など目的に応じたレーザーが利用される。一方、アーク光源の場合は、連続スペクトルと複数の輝線を持っているので、その中から所望の波長領域のみをフィルタによって選択して刺激光として利用することができる。つまり、アーク光源を使った場合は一つの光源で様々な刺激光を作り出すことができる。尚、本実施の形態の光源は、アーク光源を用いているが、これに限定されず、連続スペクトルや複数の輝線を持つ光源ならば適切に利用できる。

この実施例では、フィルタ装置８のレボルバ１１に複数のフィルタ１２を備え、レボルバ１１を回転させることでフィルタ１２を交換する方式を採用している。しかし、この方式に限らずスライド式のフィルタ交換方式など適宜様々な方式を採用しても構わない。

フィルタ装置８を通過した刺激光は視野絞り９によって刺激範囲及び刺激位置が調節される。この刺激範囲の調節は視野絞り９の絞り径を変えることで光が通過する孔の大小を調節させて行い、刺激位置の調節は視野絞り９を光軸に対して垂直方向に平面移動させて行う。このとき、視野絞り９を複数備えて交換可能にする構成も考えられる。透過照明による明視野観察時にも視野絞りを利用するので、明視野観察用と刺激光用など複数の視野絞りを準備することは操作性の向上に役立つ。

コンデンサレンズユニット１０は複数のレンズによって構成され、開口絞りが設けられている。通常観察時には、開口絞りは光源からの光束の開口数（明るさおよび照射角）の調節を行うものであるが、本願発明では、試料面に対しての刺激領域の形状を調節することに使われる。つまり、開口数を小さく絞れば刺激領域は円柱状あるいは角柱状（視野絞りが円形のときは円柱状、多角形のときは角柱状）に近くなり、逆に大きくすれば円錐状あるいは角錐状（視野絞りが円形のときは円錐状、多角形のときは角錐状）の刺激領域となる。例えば、厚い標本または断面の情報を得たい場合は開口絞りを絞り、刺激領域を柱体状にすることが好ましく、薄い標本の場合は開口絞りを開けて、刺激領域を錐体状にする方が効率が良い。錐体状の場合は光のエネルギー密度が最も高いのが頂点であるので、この部分を有効に活用することが好ましい。

この光学系Ｂは、コンデンサレンズユニット１０及び視野絞り９を調節することで、その刺激領域を調節する手段を備えた光学系である。また、観察用のレーザー走査光学系と光刺激用の光学系とを分けて構成しているので、ワイドフィールド刺激とレーザー走査による観察の両立が可能である。また、本実施の形態では、光刺激用の光源がアーク光源７であるため、光刺激を行った際におきる蛍光物質の褪色が起きにくい。

また、従来のような観察と光刺激とが共にレーザー光源であると、それぞれが局所的な観察および光刺激を行い、それぞれが独立に走査を行うことによって所望の領域を観察および光刺激を行うので、光刺激と観察に時間的誤差が生じることがある。このような時間の誤差を解決するためには、本発明のワイドフィールド刺激は効果を持つ。

本発明の実施には倒立型レーザー走査型顕微鏡に限らず正立型レーザー走査型顕微鏡でも構わない。図２では、正立型レーザー走査型顕微鏡において本発明を実施した場合の構成の外観図を示す。

本発明の実施による正立型レーザー走査型顕微鏡１５では試料２が載置されているステージ３の上方側に配置された観察用の走査光学系Ａと下方側に配置されている光刺激用の光学系Ｂとで構成されている。つまり、倒立型に対して正立型はステージ３に関して上方側と下方側とが反対となって構成となっている。

観察用のレーザー走査光学系Ａは、主にスキャンユニット４と対物レンズ５によって構成され、スキャンユニット４の内部は励起光と蛍光を走査するスキャナ、蛍光と励起光を分離するフィルタ類、試料からの蛍光を検出するための光電子増倍管、さらに瞳投影レンズや結像レンズなどによって構成される。図２中では、励起光の経路がＡ１で示され、蛍光の経路がＡ２で概略的に示されている。

刺激用の光学系Ｂは、主にアーク光源、フィルタ装置８、視野絞り９およびコンデンサレンズユニット１０で構成される。このときアーク光源７からの光線の経路がＢ１によって概略的に示されている。

なお、各構成の詳細な説明は倒立型のレーザー走査型顕微鏡の実施例（図１）を参照して頂きたい。
図３と図４は倒立型の実施例における刺激用光学系Ｂの光路を説明するための図である。ここでは倒立型の実施例に基づいて説明をするが、この説明は本質的には同様に正立型の実施例にも成り立つ。なお、図３は光源と試料がクリティカル照明の関係となった刺激用光学系であり、図４は光源と試料がケーラー照明の関係となった刺激用光学系である。

図３では、アーク光源７から放射された光線はコレクタレンズ１６によってほぼ平行光束に変換される。そしてほぼ平行光束に変換された光線はフィルタ装置８を透過し、所望の波長を選択する。その後リレーレンズ１７によって視野絞り９の位置に光源の像を結像させる。その後、コンデンサレンズユニット１０によって試料面に光源像を再度結像させる。このとき、コンデンサレンズユニット１０には開口絞り１９が備えられていて、刺激光照射の開口数を調節することができる。なお、図中の符号１８で示されるものは光路を曲げるためのミラーである。

クリティカル照明では光源からの光を試料面に集光させるために、試料面での照明強度が大きい（ただし照明ムラが大きい）。そのため本発明の実施では、比較的狭い刺激領域に対して強い刺激を与える場合に好適といえる。

図４では、アーク光源７から放射された光線はコレクタレンズ１６によってほぼ平行光束に変換される。そしてほぼ平行光束に変換された光線はフィルタ装置８を透過し、所望の波長を選択する。その後平行光束のままリレーレンズ１７を通過し、コンデンサレンズユニット１０内の開口絞り１０の位置に光源の像を結像させる。このことにより、試料面には光源の瞳像が投影される。

ケーラー照明では試料面に光源の瞳像を投影するために、試料面での照明ムラが小さい。そのため本発明の実施では、比較的広い刺激領域に対して均一な刺激を与える場合に好適といえる。

また本実施の形態では、コンデンサレンズ１６とアーク光源７の距離を変化させることにより、クリティカル照明（図３）とケーラー照明（図４）を切り変えることができる。このことにより、目的とした光刺激方法に適切な照射方法を選択できる。

以上のように、本発明のレーザー走査型顕微鏡よれば、観察用のレーザー走査光学系と光刺激用の光学系とを異なる特性の光学系を使って光刺激と観察を行うことができる。とくに、ワイドフィールド刺激を行いながら、一方で励起光はスポット走査観察を行うことができる。

倒立型のレーザー走査型顕微鏡の外観図である。 正立型のレーザー走査型顕微鏡の外観図である。 光刺激用のクリティカル照明光学系の光路図である。 光刺激用のケーラー照明光学系の光路図である。

符号の説明

１ 倒立型のレーザー走査型顕微鏡
２ 試料
３ ステージ
４ スキャンユニット
５ 対物レンズ
７ アーク光源
８ フィルタ装置
９ 視野絞り
１０ コンデンサレンズユニット
１０ａ レンズ
１０ｂ レンズ
１１ レボルバ
１２ フィルタ
１５ 正立型のレーザー走査型顕微鏡
１６ コレクタレンズ
１７ リレーレンズ
１８ ミラー
１９ 開口絞り
Ａ 観察用のレーザー走査光学系
Ａ１ 励起光路
Ａ２ 蛍光路
Ｂ 光刺激用の光学系
Ｂ１ 刺激光路

Claims (12)

1. 観察用光学系と光刺激用光学系を備えたレーザー走査型顕微鏡において、
   前記観察用光学系は励起光を集光させたスポットを試料面で走査する走査手段を備え、
   前記光刺激用光学系は刺激光をワイドフィールド照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
2. 前記観察用光学系と前記光刺激用光学系は試料面に関して反対側に配置されていることを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
3. 前記観察用光学系は対物レンズを通じて励起光を照射して蛍光を集め、
   前記刺激光学系はコンデンサレンズを通じて刺激光を照射することを特徴とする請求項２に記載のレーザー走査型顕微鏡。
4. 前記観察用光学系は前記対物レンズの後段に刺激光をカットするフィルタを備えることを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査型顕微鏡。
5. 前記コンデンサレンズはその前側焦点位置に開口絞りを備えてあり、
   前記開口絞りによって刺激領域の立体形状を調節することを特徴とする請求項３から請求項４の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
6. 前記観察用光学系は前記試料面と共役な位置に視野絞りを備え、刺激範囲を制限することを特徴とする請求項１から請求項５の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
7. 前記視野絞りは光軸方向と光軸に垂直方向に移動可能に備えられていることを特徴とする請求項６に記載のレーザー走査型顕微鏡。
8. 前記コンデンサレンズは光軸合わせ手段を備えてあり、
   前記光軸あわせ手段によって刺激位置を調節することを特徴とする請求項３から請求項７の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
9. 前記蛍光観察用光学系はレーザー光源を備え、前記光刺激用光学系はアーク光源を備えることを特徴とする請求項１から請求項８の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
10. 前記光刺激用光学系はハロゲン光源をさらに備えることを特徴とする請求項５に記載のレーザー走査型顕微鏡。
11. 前記光刺激用光学系はガイド光源をさらに備えることを特徴とする請求項５に記載のレーザー走査型顕微鏡。
12. 前記光刺激用光学系はクリティカル照明光学系とケーラー照明光学系を交換可能に構成されていることを特徴とする請求項１から請求項１１の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
    

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