JP6764469B2 - 生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法に関する。

従来、試料中に含まれる物質から生成される発光を、顕微鏡を用いて観察することが行われてきた。例えば、従来の蛍光顕微鏡では、試料に紫外線やＸ線や可視光線を照射して試料中の物質を励起させ、励起状態の物質が基底状態に戻るときに放出する蛍光を検出することによって試料を観察する。したがって、従来の蛍光顕微鏡では、試料中の物質を励起させるための励起光の光源を必要とする。

近年では、励起光源を必要としない顕微鏡も出現している。このタイプの顕微鏡は、励起光源からの光照射を受けることなく、試料中に含まれる物質によって生成される化学発光を検出する。特許文献１には、７００ｎｍ、強度４００ｍＷのイレース光を試料である鉄道虫の観察領域外に照射して当該観察領域外での化学発光の発生を抑制することによって、鉄道虫の観察領域から生成された化学発光を顕微鏡によって高感度で検出することが開示されている。

特開２００８−５７９９７号公報

特許文献１記載の化学発光を観察する顕微鏡は、励起光源を必要としないので、構造が簡素で低コストで入手可能である。しかし、特許文献１記載の顕微鏡は、観察領域外からの化学発光を抑制するために、細胞が瞬時に死んでしまうほど高い強度照度でイレース光を照射するので、細胞を生存状態で観察することはできない。例えば、神経細胞の活動を、当該細胞を構成している多数のタンパク質分子のうちのどのタンパク質分子がどのように反応するのかを観察したい場合、当然に細胞を生存状態で観察することが求められる。

そこで、本発明は、生体試料を生存状態で高感度かつ低コストで観察することが可能な顕微鏡、方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の側面は、生体試料を生存状態で観察するための顕微鏡であって、前記生体試料は、化学発光を生成する化学発光物質を含み、前記顕微鏡は、前記化学発光の状態を変化させる制御光を射出する光源と、前記生体試料の観察面に照射される前記制御光の照射パターンを画定する画定部と、前記生体試料から射出された前記化学発光を検出する検出器と、を備えることを特徴とする。

また、本発明の第２の側面は、生体試料を生存状態で観察する方法であって、発光酵素および蛍光タンパク質を含み発光基質と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体と、前記発光酵素と結合され、前記化学発光の状態を変化させる制御光の照明の有無に応じて前記化学発光を制御する発光制御部分と、を含む前記生体試料に前記発光基質を添加する添加工程と、前記制御光の照射パターンを画定し、前記照射パターンに画定された前記制御光で前記生体試料を照明する照明工程と、前記生体試料から射出される前記化学発光を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。

本発明によれば、生体試料を生存状態で高感度かつ低コストで観察することが可能な顕微鏡、方法を提供することができる。

実施例１の顕微鏡を示す図。 実施例２の顕微鏡を示す図。 本発明に係る観察方法を説明するフローチャート。 化学発光物質を説明する図。 制御光の作用を説明する図。 ネガティブ型の化学発光物質を説明する図。 デカップル型の化学発光物質を説明する図。 光変換型の化学発光物質を説明する図。 生体試料の観察面に制御光を照射した例を示す図。

＜第１実施形態＞
以下、図面を用いて本発明の第１実施形態を説明する。

［化学発光物質］
細胞等の生体試料の中に含まれ化学発光を生成する化学発光物質について説明する。本実施形態で使用される化学発光物質２０は、制御光の照射により化学発光の状態が変化する特性を有しており、図４に示されるように、発光基質（ルシフェリン）２５と、発光基質２５と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体２４とを含む。自発光タンパク質融合体２４は、蛍光タンパク質２１と発光酵素（ルシフェラーゼ）２２とを含む。発光酵素２２が発光基質２５の化学反応（酸化）を触媒することで化学発光が発生する。発光酵素２２の発光量子収率よりも蛍光タンパク質２１の蛍光量子収率が高ければ、発光酵素２２と蛍光タンパク質２１との間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により化学発光の光強度が増加する。そこで、発光酵素２２と蛍光タンパク質２１との自発光タンパク質融合体２４は、高い光強度の化学発光を生成するナノスケールの光源という意味を込めて、ナノランタン（Nano-lantern）と呼ばれる。

本実施形態において、自発光タンパク質融合体（ナノランタン）２４として、互いに生成する化学発光の波長（色）が異なる、イエロ−ナノランタン、シアン−ナノランタン、オレンジ−ナノランタン、グリーン−ナノランタン、レッド−ナノランタン、および、それらの改変体の少なくとも１つを使用することができる。互いに色が異なる複数の自発光タンパク質融合体（ナノランタン）２４を使用すれば、細胞中の複数の種類のタンパク質の挙動を同時に観察可能である。例えば、万能細胞（ＥＳ細胞）の万能性維持に重要な３つの遺伝子の発現の様子を同時に観察することが可能となる。

発光制御部分２３は、制御光が照射されていない状態（図４の状態４１）では、自発光タンパク質融合体２４に化学発光反応を発生させる第１の立体構造をとらせる。一方、発光制御部分２３は、制御光が照射されている状態（図４の状態４２）では、自発光タンパク質融合体２４に化学発光反応の発生が抑制される第２の立体構造をとらせる。すなわち、発光制御部分２３は、制御光の照明の有無に応じて化学発光を制御する。本実施形態では、制御光として、１光子吸収の３８０〜４８０ｎｍの波長を有する青色の光または２光子吸収の８５０〜９５０ｎｍの波長を有する光を使用する。自発光タンパク質融合体２４に制御光の青色光を照射すれば、発光基質２５が存在していても化学発光反応の発生が抑制される状態４２となり、青色光の照射が停止されれば、自発光タンパク質融合体２４は、熱緩和によって状態４１に復帰される。発光制御部分２３は、例えば、フォトトロピンのLight-oxygen-voltage-sensing ドメイン２（ＬＯＶ２ドメイン）、ＬＯＶ２ドメインの変異体であるＬＯＶ２−Ｉ４２７Ｖ、ＢＬＵＦタンパク質のＡｐｐＡドメイン（１−１３３）、ＢＬＵＦタンパク質のＰａｐＢドメイン（１−１４７）、ＢＬＵＦタンパク質のＹｃｇＦドメイン（１−９７）である。

［制御光］
化学発光物質２０の化学発光、すなわち、自発光タンパク質融合体２４と発光基質２５との協働による化学発光を制御する制御光の作用について説明する。生体試料の観察面を、図５の５１のように、化学発光の生成を許容する第１領域７ａと化学発光の生成を抑制する第２領域７ｂとに分ける。第１領域７ａには、化学発光の生成を抑制する制御光は照射されない。一方、第２領域７ｂには、化学発光の生成を抑制するために制御光が照射される。制御光は、第１領域７ａを取り囲むドーナツ形状の第２領域７ｂのみに照射されるドーナツ光である。

図５の５２に示されるように、第１領域７ａから化学発光が射出され、第１領域７ａを取り囲む第２領域７ｂからは化学発光が抑制される。もし、制御光を使用しない場合には、観察面全体すなわち第１領域７ａおよび第２領域７ｂの双方から化学発光が射出されるので、顕微鏡で生体試料７の観察面を観察すると化学発光の強度は、５３の点線で示されるように、ブロードに分布する。一方、第２領域７ｂのみに制御光を照射する場合には、第１領域７ａ内の化学発光のみが主として観察されるので、化学発光の強度は、５３の実線で示されるように、シャープに分布する。したがって、制御光を使用することで化学発光のコントラストが増大して検出感度が向上する。化学発光が生成する第１領域７ａの位置を変えて化学発光を検出することを繰り返して大量の画像を撮り、これらを重ねわせることによって観察面全体の画像が得られる。

図５は、制御光が照射されない第１領域７ａの数が１つの例を示している。しかし、制御光が照射されない第１領域７ａの数を複数とすると、複数の第１領域７ａからの複数の化学発光を同時に検出し得るので、効率的である。このように、複数の第１領域７ａからの複数の化学発光を同時に検出する場合でも、隣接し合う２つの化学発光を生成する領域同士は充分に離れているので、化学発光を生成する複数の領域それぞれについて、精密に位置を確定することができる。観察面全体における第１領域７ａと第２領域７ｂとの分布は、制御光の照明形状を画定する後述の画定部４によって決定される。第１領域７ａの径は、例えば、顕微鏡の光学系のＮＡを１とするとき、制御光の波長の半分程度とすることができる。本実施形態では、第１領域７ａの径を５０ｎｍ程度、第２領域７ｂの径を２５０ｎｍ程度としている。

本実施形態では、化学発光物質として、蛍光タンパク質２１と発光酵素２２との自発光タンパク質融合体２４と、ＬＯＶ２ドメイン、ＬＯＶ２ドメインの変異体等の発光制御部分２３と、を含むものを使用する。そのため、１Ｗ／ｃｍ^２以下、好ましくは１８ｍＷ／ｃｍ^２〜１Ｗ／ｃｍ^２という微弱な制御光を使用して化学発光を制御することができる。したがって、ＫＷ／ｃｍ^２〜ＧＷ／ｃｍ^２レベルという生体試料７が瞬時に死んでしまうほど高強度のイレース光を使用する特許文献１に記載の顕微鏡と比べると、生体試料７を損傷する度合いがはるかに小さいので、生体試料７を生存状態で観察することが可能である。制御光として、１光子吸収の３８０〜４８０ｎｍの波長を有する青色光または２光子吸収の８５０〜９４０ｎｍの波長を有する光を使用する。

［顕微鏡］
生体試料７を生存状態で観察するための顕微鏡について説明する。

実施例１
図１は、実施例１の顕微鏡を示す。光源１は、生体試料７に含まれる化学発光物質２０からの化学発光の生成を抑制する制御光を射出する。制御光の強度は、１Ｗ／ｃｍ^２以下と微弱なので生体試料７を損傷する度合いがわずかであり、観察対象の生体試料７を生存状態で観察することが可能である。シャッタ２は、生体試料７に対する制御光の入射をオンオフする。画定部４は、生体試料７の観察面のうちで、化学発光の生成を許容して化学発光物質２０からの化学発光を検出すべき第１領域７ａに制御光を照射せずに、第１領域７ａを取り囲み化学発光の生成を抑制する第２領域７ｂに制御光を照射するように、制御光の照明形状（照射パターン）を画定する。制御光は画定部４によってドーナツ形状のドーナツ光にされる。画定部４として、例えば、Ｖｏｌｔｅｘ位相板（ラセン型位相板）、空間光変調器、または、制御光を遮断する材料が第１領域７ａに対応する部分に塗布された透明板を使用し得る。

生体試料７は、ディッシュ８の中に格納される。ディッシュ８内の生体試料７の画定部４の側とは反対の側（図１の右側）の観察面の第１領域７ａから化学発光が検出器１３に向けて射出される。生体試料７を格納したディッシュ８は、ステージ（保持台）６に保持される。ステージ６は、制御光の光路と直交する方向（図１の紙面上下方向）に画定部４に対して移動可能に設けられている。したがって、ステージ６を図１の紙面上下方向に少し移動して、制御光の照射と化学発光の検出とを繰り返すことで、生体試料７の観察面の全領域を観察することができる。

図示されていないが、顕微鏡は、ステージ６に保持されているディッシュ８内の生体試料７に発光基質２５を添加する添加部を備えている。添加部は、発光基質２５を生体試料７に滴下するか、または、発光基質２５を生体試料７に潅流して導入する。顕微鏡の外部で発光基質２５をディッシュ８内の生体試料７に添加し、発光基質２５が添加された生体試料７が格納されたディッシュ８をステージ６に載置する場合には、発光基質２５を添加する添加部を省略し得る。

ステージ６と検出器１３との間には、第１領域７ａからの化学発光を平行光とする対物レンズ１０と、平行光とされた化学発光を検出器１３に集光する結像レンズ１２と、が配置される。また、ステージ６に保持されているディッシュ８と対物レンズ１０との間には、屈折率を調整するための屈折率マッチングオイル９が介在される。検出器１３は、生体試料７の画定部４の側とは反対の側（図１の右側）の観察面の第１領域７ａから射出された化学発光を検出する。画定部４が、２次元的に配置された複数の第１領域７ａを制御光により照明するように構成される場合、検出器１３は、複数の化学発光を同時に検出するために、例えば、２次元的に配置されたアレイ型検出器とされる。処理部（コンピュータ）１６は、検出器１３から送られた検出結果を処理して化学発光の画像を生成する。

実施例２
図２は、実施例２の顕微鏡を示す。実施例２の顕微鏡は、実施例１の顕微鏡と基本構成において共通するので、相違する以下の３つの構成だけを説明する。

実施例１の顕微鏡では、制御光の光源１と化学発光を検出する検出器１３とが、ステージ６を挟んで配置されていた。これに対し、実施例２の顕微鏡では、制御光の光源１と化学発光を検出する検出器１３とが、図２に示されるように、ステージ６に対して同じ側（図２の紙面の下側）に配置される。したがって、制御光の光源１から生体試料７が格納されステージ６に保持されたディッシュ８に至る制御光の光路と、ディッシュ８内の生体試料７から検出器１３に至る化学発光の光路とは、部分的に重なる。そこで、実施例２の顕微鏡は、制御光の光源１とステージ６との間に配置され、光源１から射出された制御光をステージ６に向けて導き、生体試料７の観察面から射出された化学発光を検出器１３に向けて導くビームスプリッタ１１をさらに備える。

実施例１の顕微鏡では、生体試料７を刺激する刺激光を射出する光源を有していなかった。これに対し、実施例２の顕微鏡では、生体試料７を刺激する刺激光を射出する第２の光源１４と、刺激光の照明形状を例えばパターン形状に画定する第２の画定部１５をさらに備えている。例えば、光遺伝学を行う場合には、透過照明により、生体試料７の上面からパターン形状の刺激光を生体試料７に照射する。刺激光の光源１４として、例えばＬＥＤを用いることができる。刺激光の照射タイミングは、検出器１３のデッドタイムとし、化学発光の検出中に刺激光が漏れないようにする。ここで、刺激光としては、波長および強度の少なくとも一方が制御光と異なる光が用いられうる。例えば、刺激光は、波長が４００〜６００ｎｍの範囲内、強度が０．０１〜１Ｗ／ｃｍ^２の範囲内であるとよい。

実施例１の顕微鏡では、１種類の化学発光物質２０を含む生体試料７を観察した。これに対し、実施例２の顕微鏡では、互いに異なる波長の複数の化学発光をそれぞれ生成する複数種類の化学発光物質２０を含む生体試料７を観察する。例えば、生体試料７は、イエロ−ナノランタン、シアン−ナノランタン、オレンジ−ナノランタン、グリーン−ナノランタン、および、レッド−ナノランタンの少なくとも２つを含む。複数の化学発光に対応するため、実施例２の顕微鏡は、複数の化学発光を波長に基づいて分離する波長フィルタ１７をさらに備える。実施例２の顕微鏡では、検出器１３は、波長フィルタ１７によって分離された化学発光のそれぞれを検出する。生体試料７内の観察対象とする複数の種類のタンパク質のそれぞれに互いに色が異なる複数のナノランタン２４を結合させ、かつ、実施例２の顕微鏡を使用すると、観察対象とする複数の種類のタンパク質の挙動を同時に観察可能である。

［観察方法］
図３を用いて、図１に示される実施例１の顕微鏡を用いて生体試料７を生存状態で観察する方法を説明する。まず、ステップＳ１で、発光酵素および蛍光タンパク質を含み発光基質と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体と、制御光の照明の有無に応じて化学発光を制御する発光制御部分と、を含む生体試料７に発光基質を添加して生体試料７を準備する。ステップＳ１は、例えば以下のようなサブステップに区分され得る。
・サブステップ１：光スイッチング化学発光を発現する細胞、生体組織、個体などの生体試料７を作成する。
・サブステップ２：高開口数の対物レンズ観察に適した厚さのガラス製のディッシュ８上で生体試料７を培養する。
・サブステップ３：ディッシュ８内の培養が血清培地であれば、観察開始前に血清を取り除いた培地に交換する。

次いで、ステップＳ２では、顕微鏡のステージ６に生体試料７が収容されたディッシュ８を搭載する。ステージ６は、細胞培養用のインキュベーション（培養）機能を備えていることが望ましい。ステップＳ３では、発光基質２５、例えばセレンテラジンを生体試料７に添加する（添加工程）。なお、発光基質２５を顕微鏡外で、すなわち、ステップＳ１中で添加することも可能である。ステップＳ２またはステップＳ３の後、顕微鏡による観察の準備、例えば、明視野観察や蛍光観察で顕微鏡のフォーカスを調整したり、化学発光を観察するためのオートフォーカス装置を作動させたりする。本実施形態では、自発光タンパク質融合体（ナノランタン）２４が、蛍光タンパク質２１を含んでいるので蛍光観察が可能である。

ステップＳ４では、生体試料７の観察面のうちで、化学発光の生成を許容する第１領域７ａに制御光を照射せずに、第１領域７ａを取り囲み化学発光の生成を抑制する第２領域７ｂに制御光を照射するようにして、制御光で生体試料７を照明する（照明工程）。制御光は、第１領域７ａを取り囲む第２領域７ｂのみを照明するドーナツ形状の照明形状を有する。制御光は、発光制御部分２３であるＬＯＶ２ドメインの構造変化を誘導する３８０〜４８０ｎｍの波長を有するシアン色（青色）の光である。なお、生体試料７に照射される制御光は、１光子吸収の３８０〜４８０ｎｍの波長を有するシアン色（青色）の光である必要はなく、２光子吸収の８５０〜９５０ｎｍの波長を有する光でもよい。

ステップＳ５では、制御光による生体試料７の照明を停止する（停止工程）。ステップＳ６では、制御光による生体試料７の照明が遮断され、かつ、ＬＯＶ２ドメインが回復していない状態で、生体試料７の第１領域７ａから射出される化学発光を検出器１３により検出する（検出工程）。なお、検出工程において、検出器１３に対する制御光の入射が阻止されるのであれば、Ｓ５の停止工程を設ける必要はない。ステップＳ７では、ステージ６を制御光、化学発光の光路に直交する方向に移動して、生体試料７の位置、化学発光が射出される第１領域７ａの位置を変更する（変更工程）。ステップＳ８では、ステップＳ４の照明工程、ステップＳ５の停止工程およびステップＳ６の検出工程をその順序で行い、生体試料７の異なる第１領域７ａを観察する。そして、ステップＳ４の照明工程、ステップＳ５の停止工程およびステップＳ６の検出工程を生体試料７の多数の第１領域７ａのそれぞれについて繰り返し行って、生体試料７の観察面の全領域に対する観察を行う。

本実施形態では、制御光の照射により化学発光の生成が抑制される化学発光物質２０を含む生体試料７を生存状態で観察する例を示した。このように制御光の照射により化学発光をオン／オフすることができる化学発光物質は光スイッチング型と呼ばれ、中でも、本実施形態で用いた化学発光物質２０のように制御光の照射により化学発光の生成が抑制されるものはポジティブ型と呼ばれる。ポジティブ型の化学発光物質は、例えばPadronやKohinoorなどの蛍光タンパク質を含み、制御光を照射すると、化学発光の発生を抑制させて蛍光タンパク質の発光強度を低下させることができる。

＜第２実施形態＞
第２実施形態では、光スイッチング型の化学発光物質のうち、制御光の照射により化学発光の生成が促進する、いわゆるネガティブ型の化学発光物質を生体試料が含む例について説明する。ネガティブ型の化学発光物質は、例えばDronpaやrsEGFP、Skylan、rsTagRFPなどの蛍光タンパク質を含み、制御光を照射すると、化学発光の生成を促進させて蛍光タンパク質の発光強度を増加させることができる。図６Ａは、ネガティブ型の化学発光物質２０ａを示す図であり、該図では発光酵素２２と発光制御部分２３とを合わせて図示している。制御光を照射する前では（下図）、励起状態にある発光酵素２２のエネルギーが蛍光タンパク質２１ａに共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）することにより、化学発光の生成が抑制されている。この状態から制御光を照射すると、化学発光の生成が促進され、蛍光タンパク質２１ａからの発光強度を増加させることができる（上図）。

次に、ネガティブ型の化学発光物質を含む生体試料を、上記の実施例１および実施例２で示した顕微鏡を用いて観察する例について説明する。ネガティブ型の化学発光物質を含む生体試料７を観察する場合、顕微鏡の画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光物質からの化学発光を検出すべき領域（第１領域）に制御光を照射するように、制御光の照射パターンを画定する。例えば、制御光は、該領域のみに照射されるように、画定部４によってドット形状のドット光にされる。これにより、制御光を照射した該領域と他の領域とにおける発光強度のコントラストを増大させ、該領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。ここで、化学発光を検出すべき該領域を生体試料７の観察面に複数設ける場合には、画定部４は、複数のドット光が配列するように制御光の照射パターンを画定するとよい。

＜第３実施形態＞
第３実施形態では、光スイッチング型の化学発光物質のうち、互いに異なる２種類の制御光の照射により化学発光の生成が促進されたり抑制されたりする、いわゆるデカップル型の化学発光物質を生体試料が含む例について説明する。デカップル型の化学発光物質は、例えばDreiklangやPSFPなどの蛍光タンパク質を含み、第１制御光を照射すると、化学発光の生成を促進させて蛍光タンパク質の発光強度を増加させることができる。一方、第１制御光とは異なる第２制御光を照射すると、化学発光の生成を抑制して蛍光タンパク質の発光強度を低下させることができる。

図６Ｂは、デカップル型の化学発光物質２０ｂを示す図であり、該図では発光酵素２２と発光制御部分２３とを合わせて図示している。第１制御光（例えば３５５ｎｍ）を照射すると、励起状態にある発光酵素２２のエネルギーが蛍光タンパク質２１ｂに共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）することにより、化学発光の生成が促進され、蛍光タンパク質２１ｂからの発光強度を増加させることができる（上図）。一方、第２制御光（例えば４０５ｎｍ）を照射すると、化学発光の生成が抑制され、蛍光タンパク質２１ｂからの発光強度を低下させることができる（下図）。

次に、デカップル型の化学発光物質を含む生体試料を、上記の実施例１および実施例２で示した顕微鏡を用いて観察する例について説明する。デカップル型の化学発光物質を含む生体試料を観察する場合、顕微鏡の画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光物質からの化学発光を検出すべき第１領域に第１制御光を照射し、該第１領域を取り囲む第２領域に第２制御光を照射するように、第１制御光および第２制御光の照射パターンを画定する。例えば、第１制御光は、第１領域のみに照射されるように画定部４によってドット形状のドット光にされ、第２制御光は、第１領域を取り囲む第２領域のみに照射されるように画定部４によってドーナツ形状のドーナツ光にされる。これにより、第１領域と第２領域とにおける発光強度のコントラストを増大させ、第１領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。

＜第４実施形態＞
第４実施形態では、制御光の照射により化学発光の波長（発光色）が変化する、いわゆる光変換型の化学発光物質を生体試料が含む例について説明する。光変換型の化学発光物質は、例えばKaedeやKikGR、PS-CFP1、mEOS2、mEOS3.2、PSmOrangeなどの蛍光タンパク質を含み、制御光を照射すると、化学発光の波長を第１波長から第２波長に変化する。図７は、光変換型の化学発光物質２０ｃを示す図であり、該図では発光酵素２２と発光制御部分２３とを合わせて図示している。制御光を照射する前では（下図）、化学発光の波長が第１波長（例えば緑色光）であるのに対し、制御光を照射すると、化学発光の波長を第１波長から第２波長（例えば赤色光）に変化させることができる。

次に、光変換型の化学発光物質を含む生体試料を、上記の実施例１および実施例２で示した顕微鏡を用いて観察する例について説明する。光変換型の化学発光物質を含む生体試料７を観察する場合、顕微鏡の画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光を検出すべき領域（第１領域）に制御光を照射するように、制御光の照射パターンを画定する。例えば、制御光は、該領域のみに照射されるように、画定部４によってドット形状のドット光にされる。そして、検出器１３は、第１波長の光を透過させずに第２波長の光を透過させるフィルタを介して、生体試料７からの化学発光（第２波長）を検出する。これにより、第２波長で化学発光する該領域と第１波長で化学発光する他の領域とにおける発光強度のコントラストを増大させ、該領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。

また、上記の例では第２波長の化学発光を検出したが、第１波長の化学発光を検出してもよい。この場合、画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光を検出すべき第１領域に制御光を照射せず、該第１領域を取り囲む第２領域に制御光を照射するように、制御光の照射パターンを画定する。そして、検出器１３は、第２波長の光を透過させずに第１波長の光を透過させるフィルタを介して、生体試料７からの化学発光（第１波長）を検出する。これにより、第１波長で化学発光する第１領域と第２波長で化学発光する第２領域とにおいて発光強度のコントラストを増大させ、第１領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。

＜第５実施形態＞
第５実施形態では、上記の実施例１および実施例２に示した顕微鏡を用いて生体試料を観察する他の方法について説明する。生体試料は、低周波情報（粗い構造情報）から高周波情報（細かい構造情報）までの様々な情報を含んでおり、従来の顕微鏡では、解像限界（回折限界）により高周波情報を得ることが困難であった。そこで、本実施形態では、制御光を既知の照射パターン（第１パターン）で生体試料の観察面に照射し、生体試料の周波数成分と制御光の照射パターンの周波数成分との相互干渉（相互作用）によって該観察面に形成された干渉パターン（第２パターン（例えばモアレパターン））を検出器１３で検出する。そして、制御光の照射パターンの周波数成分と検出器１３で検出された干渉パターンの周波数成分とに基づいて、生体試料の周波数成分を処理部１６で求める。つまり、既知の照射パターンで制御光を生体試料に照射すると、生体試料の周波数成分を干渉パターン（モアレパターン）として低周波側にずらして検出することが可能となるため、従来の顕微鏡では観察することのできなかった生体試料の高周波情報までも観察することができる。

図８は、生体試料７の観察面に、既知の縞状の照射パターン８１で制御光を照射した例を示す図である。制御光の照射パターン８１は、画定部４に設けられたＬＣｏＳ（Liquid Crystals on Silicon）やＤＭＤ（Digital Mirror Device）などの空間変調器により画定される。該空間変調器は、顕微鏡（画定部４）に着脱可能に設けられていることが好ましい。

生体試料７の観察面に、既知の縞状の照射パターン８１で制御光を照射すると、生体試料がポジティブ型の化学発光物質を含む場合、制御光が照射された部分では化学発光が抑制され、制御光が照射されなかった部分では化学発光が許容されたままとなる。その結果、該観察面には、生体試料７の周波数成分と制御光の照射パターン８１の周波数成分との相互干渉によりモアレパターン８２（干渉パターン）が形成される。このモアレパターン８２は検出器１３よって検出され、処理部１６は、検出器１３で検出されたモアレパターン８２の周波数成分から制御光の照射パターン８２の周波数成分を除去する処理を行う。これにより、生体試料７の周波数成分を、従来の顕微鏡では観察することが困難であった高周波成分（高周波情報）までも得ることができる。つまり、従来の顕微鏡では観察することのできない生体試料７の高周波情報についての超解像化学発光観察を行うことができる。

ここで、図８に示す例では、制御光の照射パターン８１として、ライン状の照射領域と非照射領域とが交互に且つ周期的に配列したラインアンドスペースパターンが用いられているが、それに限られるものではなく、生体試料７の周波数成分と相互作用を生じさせる周波数成分を有するパターンであればよい。また、生体試料７の２次元の画像を得るためには、該生体試料７に対して３方向×３位相のパターン光を照射した合計９枚の画像を取得し、各方向・各位相について得られた生体試料７の周波数成分を合成（加算）するとよい。

本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために、以下の請求項を添付する。

本願は、２０１６年３月２３日提出の日本国特許出願特願２０１６−０５８９４６を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。

Claims (13)

1. 生体試料を生存状態で観察する方法であって、
   発光酵素および蛍光タンパク質を含み発光基質と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体と、前記発光酵素と結合され、前記化学発光の状態を変化させる制御光の照明の有無に応じて前記化学発光を制御する発光制御部分と、を含む前記生体試料に前記発光基質を添加する添加工程と、
   前記生体試料の観察面に照射される前記制御光の照射パターンを第１パターンに画定し、前記第１パターンの前記制御光で前記生体試料を照明する照明工程と、
   前記生体試料の周波数成分と前記第１パターンの周波数成分との相互作用により前記観察面に形成された前記化学発光の第２パターンを検出し、前記第１パターンの周波数成分と前記第２パターンの周波数成分とに基づいて前記生体試料の周波数成分を求める検出工程と、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 前記制御光は、その照射により前記化学発光の生成を抑制し、
   前記照明工程では、前記制御光の照射パターンを、前記第１パターンとして、前記制御光で照射されない第１領域と前記制御光で照射される第２領域とが交互に且つ周期的に前記観察面上に配列されるように画定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記制御光は、その照射により前記化学発光の生成を促進し、
   前記照明工程では、前記制御光の照射パターンを、前記第１パターンとして、前記制御光で照射されない第１領域と前記制御光で照射される第２領域とが交互に且つ周期的に前記観察面上に配列されるように画定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記制御光は、照射により前記化学発光の生成を促進する第１制御光と、照射により前記化学発光の生成を抑制する第２制御光とを含み、
   前記照明工程では、前記第１制御光および前記第２制御光の照射パターンを、前記第１パターンとして、前記第１制御光で照射される第１領域と前記第２制御光で照射される第２領域とが交互に且つ周期的に前記観察面上に配列されるように画定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記制御光は、その照射により前記化学発光の波長を第１波長から第２波長に変化させ、
   前記照明工程では、前記制御光の照射パターンを、前記第１パターンとして、前記制御光で照射されない第１領域と前記制御光で照射される第２領域とが交互に且つ周期的に前記観察面上に配列されるように画定し、
   前記検出工程では、前記第１波長の光を透過させずに前記第２波長の光を透過させるフィルタを介して、前記生体試料から射出された前記化学発光を検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記制御光の光路に直交する方向における前記生体試料の位置を変更する変更工程を含み、
   前記変更工程の後、前記照明工程および前記検出工程をその順序で繰り返し行うことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第１パターンは、縞状のパターンを含み、
   前記第２パターンは、前記生体試料の周波数成分と前記第１パターンの周波数成分との相互干渉により得られるモアレを含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記制御光は、１Ｗ／ｃｍ^２以下の強度を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記発光制御部分は、フォトトロピンのLight-oxygen-voltage-sensingドメイン２（ＬＯＶ２ドメイン）、前記ＬＯＶ２ドメインの変異体であるＬＯＶ２−Ｉ４２７Ｖ、ＢＬＵＦタンパク質のＡｐｐＡドメイン（１−１３３）、ＢＬＵＦタンパク質のＰａｐＢドメイン（１−１４７）、または、ＢＬＵＦタンパク質のＹｃｇＦドメイン（１−９７）を含むことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記自発光タンパク質融合体は、イエロ−ナノランタン、シアン−ナノランタン、オレンジ−ナノランタン、グリーン−ナノランタン、および、レッド−ナノランタンの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記制御光は、１光子吸収の３８０〜４８０ｎｍの波長または２光子吸収の８５０〜９４０ｎｍの波長を有することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記生体試料は、互いに異なる波長の複数の化学発光をそれぞれ生成する複数種類の化学発光物質を含み、
    前記検出工程では、前記複数の化学発光を検出することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法を用いて、生体試料を生存状態で観察する顕微鏡。