WO2017164332A1 - 生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法 - Google Patents

生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017164332A1
WO2017164332A1 PCT/JP2017/011837 JP2017011837W WO2017164332A1 WO 2017164332 A1 WO2017164332 A1 WO 2017164332A1 JP 2017011837 W JP2017011837 W JP 2017011837W WO 2017164332 A1 WO2017164332 A1 WO 2017164332A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
control light
chemiluminescence
biological sample
light
pattern
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/011837
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健治 永井
由之 新井
和志 鈴木
Original Assignee
国立研究開発法人科学技術振興機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人科学技術振興機構 filed Critical 国立研究開発法人科学技術振興機構
Priority to JP2018507415A priority Critical patent/JP6764469B2/ja
Priority to EP17770372.5A priority patent/EP3435135B1/en
Publication of WO2017164332A1 publication Critical patent/WO2017164332A1/ja
Priority to US16/133,867 priority patent/US11268906B2/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N2021/751—Comparing reactive/non reactive substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N2021/757—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated using immobilised reagents

Definitions

  • the present invention relates to a microscope and a method for observing a biological sample in a living state.
  • luminescence generated from substances contained in a sample has been observed using a microscope.
  • a microscope For example, in a conventional fluorescence microscope, the sample is irradiated with ultraviolet rays, X-rays or visible light to excite the substance in the sample, and the sample is detected by detecting the fluorescence emitted when the excited substance returns to the ground state. Observe. Therefore, the conventional fluorescence microscope requires a light source of excitation light for exciting the substance in the sample.
  • the microscope for observing chemiluminescence described in Patent Document 1 does not require an excitation light source, it has a simple structure and can be obtained at low cost. However, in order to suppress chemiluminescence from outside the observation region, the microscope described in Patent Document 1 irradiates erase light with such high intensity illuminance that the cells die instantly, so that the cells are observed in a living state. I can't. For example, when it is desired to observe the activity of a nerve cell and which protein molecule of many protein molecules constituting the cell reacts, it is naturally required to observe the cell in a living state. .
  • an object of the present invention is to provide a microscope and a method capable of observing a biological sample in a living state with high sensitivity and low cost.
  • a first aspect of the present invention is a microscope for observing a biological sample in a living state, wherein the biological sample includes a chemiluminescent substance that generates chemiluminescence, and the microscope indicates the chemiluminescent state.
  • a light source that emits control light to be changed, a demarcating unit that demarcates an irradiation pattern of the control light that is irradiated onto the observation surface of the biological sample, and a detector that detects the chemiluminescence emitted from the biological sample; It is characterized by providing.
  • the second aspect of the present invention is a method for observing a biological sample in a living state, comprising a self-luminescent protein fusion containing a luminescent enzyme and a fluorescent protein and generating chemiluminescence in cooperation with a luminescent substrate; An addition step of adding the luminescent substrate to the biological sample, the luminescence control part controlling the chemiluminescence according to the presence or absence of control light illumination that is coupled to the luminescent enzyme and changes the state of the chemiluminescence An illumination step of defining an irradiation pattern of the control light, and illuminating the biological sample with the control light defined in the irradiation pattern; and a detection step of detecting the chemiluminescence emitted from the biological sample. It is characterized by including.
  • the present invention it is possible to provide a microscope and a method capable of observing a biological sample in a living state with high sensitivity and low cost.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a microscope of Example 1.
  • FIG. FIG. 6 shows a microscope of Example 2.
  • the chemiluminescent substance 20 used in the present embodiment has a characteristic that the state of chemiluminescence changes by irradiation of control light, and as shown in FIG. 4, a luminescent substrate (luciferin) 25 and a luminescent substrate. And a self-luminous protein fusion 24 that generates chemiluminescence in cooperation with 25.
  • the self-luminous protein fusion 24 includes a fluorescent protein 21 and a luminescent enzyme (luciferase) 22.
  • Chemiluminescence is generated when the luminescent enzyme 22 catalyzes the chemical reaction (oxidation) of the luminescent substrate 25. If the fluorescence quantum yield of the fluorescent protein 21 is higher than that of the luminescent enzyme 22, the light intensity of chemiluminescence increases due to Forster resonance energy transfer (FRET) between the luminescent enzyme 22 and the fluorescent protein 21. . Therefore, the self-luminescent protein fusion 24 of the luminescent enzyme 22 and the fluorescent protein 21 is called a nano-lantern in the sense of a nanoscale light source that generates chemiluminescence with high light intensity.
  • FRET Forster resonance energy transfer
  • the self-luminous protein fusion (nanolantern) 24 the chemiluminescence wavelengths (colors) generated from each other are different from each other: yellow-nanolantan, cyan-nanolantan, orange-nanolantan, green-nanolantan, At least one of red-nanolantan and variants thereof can be used. If a plurality of self-luminous protein fusions (nanolantan) 24 having different colors are used, the behavior of a plurality of types of proteins in a cell can be observed simultaneously. For example, it becomes possible to simultaneously observe the expression of three genes important for maintaining the universality of universal cells (ES cells).
  • ES cells universality of universal cells
  • the light emission control portion 23 causes the self-luminous protein fusion 24 to take a first three-dimensional structure that causes a chemiluminescent reaction in a state where the control light is not irradiated (state 41 in FIG. 4). On the other hand, the light emission control portion 23 causes the self-luminous protein fusion 24 to take the second three-dimensional structure in which the occurrence of the chemiluminescence reaction is suppressed in the state where the control light is irradiated (state 42 in FIG. 4). That is, the light emission control part 23 controls chemiluminescence according to the presence or absence of illumination of control light.
  • blue light having a one-photon absorption wavelength of 380 to 480 nm or two-photon absorption light having a wavelength of 850 to 950 nm is used as control light.
  • the self-luminous protein fusion 24 is irradiated with the blue light of the control light, even if the luminescent substrate 25 is present, the occurrence of the chemiluminescence reaction is suppressed, and when the blue light irradiation is stopped, Photoprotein fusion 24 is returned to state 41 by thermal relaxation.
  • the luminescence control part 23 includes, for example, Light-oxygen-voltage-sensing domain 2 (LOV2 domain) of phototropin, LOV2-I427V which is a mutant of LOV2 domain, AppA domain (1-133) of BLUF protein, BLUF protein PapB domain (1-147), YcgF domain (1-97) of BLUF protein.
  • LOV2 domain Light-oxygen-voltage-sensing domain 2
  • LOV2-I427V which is a mutant of LOV2 domain
  • AppA domain (1-133) of BLUF protein
  • BLUF protein PapB domain (1-147
  • YcgF domain (1-97) of BLUF protein.
  • Control light The action of the control light for controlling the chemiluminescence of the chemiluminescent substance 20, that is, the chemiluminescence by the cooperation of the self-luminous protein fusion 24 and the luminescent substrate 25 will be described.
  • the observation surface of the biological sample is divided into a first region 7a that allows the generation of chemiluminescence and a second region 7b that suppresses the generation of chemiluminescence, as indicated by 51 in FIG.
  • the first region 7a is not irradiated with control light that suppresses generation of chemiluminescence.
  • the second region 7b is irradiated with control light to suppress generation of chemiluminescence.
  • the control light is donut light that is applied only to the donut-shaped second region 7b surrounding the first region 7a.
  • chemiluminescence is emitted from the first region 7a, and chemiluminescence is suppressed from the second region 7b surrounding the first region 7a.
  • chemiluminescence is emitted from the entire observation surface, that is, both the first region 7a and the second region 7b. Therefore, when the observation surface of the biological sample 7 is observed with a microscope, the intensity of chemiluminescence Are distributed broadly as indicated by the dotted line 53.
  • the second region 7b is irradiated with the control light, only the chemiluminescence in the first region 7a is mainly observed, so that the intensity of the chemiluminescence is sharp as shown by the solid line 53.
  • control light increases the chemiluminescence contrast and improves the detection sensitivity.
  • a large number of images are taken by repeating the detection of chemiluminescence by changing the position of the first region 7a where chemiluminescence is generated, and an image of the entire observation surface is obtained by superimposing these images.
  • FIG. 5 shows an example in which the number of the first regions 7a not irradiated with the control light is one.
  • the number of the first regions 7a not irradiated with the control light is plural, it is efficient because a plurality of chemiluminescences from the plurality of first regions 7a can be detected simultaneously.
  • two adjacent chemiluminescence generating regions are sufficiently separated from each other. The position can be accurately determined for each region.
  • the distribution of the first region 7a and the second region 7b in the entire observation surface is determined by a demarcating unit 4 described later that demarcates the illumination shape of the control light.
  • the diameter of the first region 7a can be about half the wavelength of the control light.
  • the diameter of the first region 7a is about 50 nm
  • the diameter of the second region 7b is about 250 nm.
  • chemiluminescent substance a substance containing a self-luminescent protein fusion 24 of a fluorescent protein 21 and a luminescent enzyme 22 and a luminescence control part 23 such as a LOV2 domain, a LOV2 domain mutant or the like is used. Therefore, chemiluminescence can be controlled using weak control light of 1 W / cm 2 or less, preferably 18 mW / cm 2 to 1 W / cm 2 . Therefore, the degree of damage to the biological sample 7 is higher than that of the microscope described in Patent Document 1 that uses erase light that is so strong that the biological sample 7 of KW / cm 2 to GW / cm 2 level instantly dies.
  • control light blue light having a wavelength of 380 to 480 nm with one photon absorption or light having a wavelength of 850 to 940 nm with two photon absorption is used.
  • FIG. 1 shows a microscope of Example 1.
  • the light source 1 emits control light that suppresses the generation of chemiluminescence from the chemiluminescent substance 20 contained in the biological sample 7. Since the intensity of the control light is as weak as 1 W / cm 2 or less, the degree of damage to the biological sample 7 is slight, and the biological sample 7 to be observed can be observed in a living state.
  • the shutter 2 turns on and off the incidence of control light on the biological sample 7.
  • the demarcating unit 4 allows the generation of chemiluminescence on the observation surface of the biological sample 7 and irradiates control light to the first region 7 a that should detect chemiluminescence from the chemiluminescent material 20.
  • the illumination shape (irradiation pattern) of the control light is defined so as to irradiate the second region 7b surrounding the region 7a and suppressing the generation of chemiluminescence.
  • the control light is changed to donut-shaped donut light by the demarcating portion 4.
  • a Voltex phase plate helical phase plate
  • a spatial light modulator or a transparent plate in which a material that blocks control light is applied to a portion corresponding to the first region 7a can be used as the defining portion 4.
  • the biological sample 7 is stored in the dish 8. Chemiluminescence is emitted toward the detector 13 from the first region 7a on the observation surface on the side opposite to the defining portion 4 side of the biological sample 7 in the dish 8 (right side in FIG. 1).
  • the dish 8 storing the biological sample 7 is held on a stage (holding table) 6.
  • the stage 6 is provided so as to be movable with respect to the demarcating portion 4 in a direction (vertical direction in FIG. 1) perpendicular to the optical path of the control light. Therefore, the entire region of the observation surface of the biological sample 7 can be observed by moving the stage 6 a little in the vertical direction of the paper in FIG. 1 and repeating the control light irradiation and the chemiluminescence detection.
  • the microscope includes an adding unit for adding the luminescent substrate 25 to the biological sample 7 in the dish 8 held on the stage 6.
  • the adding unit drops the luminescent substrate 25 onto the biological sample 7 or introduces the luminescent substrate 25 by perfusing the biological sample 7.
  • the luminescent substrate 25 is added to the biological sample 7 in the dish 8 outside the microscope and the dish 8 containing the biological sample 7 to which the luminescent substrate 25 is added is placed on the stage 6, the luminescent substrate 25 is used.
  • the added part to be added may be omitted.
  • an objective lens 10 that converts the chemiluminescence from the first region 7 a into parallel light
  • an imaging lens 12 that condenses the chemiluminescence converted into parallel light onto the detector 13, , Is arranged.
  • a refractive index matching oil 9 for adjusting the refractive index is interposed between the dish 8 held on the stage 6 and the objective lens 10.
  • the detector 13 detects chemiluminescence emitted from the first region 7a of the observation surface on the side opposite to the defining part 4 side of the biological sample 7 (right side in FIG. 1).
  • the detector 13 detects, for example, 2 in order to simultaneously detect a plurality of chemiluminescences. It is an array type detector arranged in a dimension.
  • the processing unit (computer) 16 processes the detection result sent from the detector 13 to generate a chemiluminescent image.
  • FIG. 2 shows the microscope of Example 2. Since the microscope of the second embodiment is common to the microscope of the first embodiment in the basic configuration, only the following three different configurations will be described.
  • the light source 1 for control light and the detector 13 for detecting chemiluminescence were arranged with the stage 6 in between.
  • the light source 1 for control light and the detector 13 for detecting chemiluminescence are on the same side with respect to the stage 6 as shown in FIG. Side). Therefore, the control light optical path from the control light source 1 to the dish 8 in which the biological sample 7 is stored and held on the stage 6 and the chemiluminescence optical path from the biological sample 7 in the dish 8 to the detector 13 are: Partly overlap.
  • the microscope of the second embodiment is disposed between the control light source 1 and the stage 6, guides the control light emitted from the light source 1 toward the stage 6, and is emitted from the observation surface of the biological sample 7.
  • a beam splitter 11 that guides chemiluminescence toward the detector 13 is further provided.
  • the microscope of Example 1 did not have a light source that emits stimulation light that stimulates the biological sample 7.
  • the microscope according to the second embodiment further includes a second light source 14 that emits stimulation light that stimulates the biological sample 7, and a second defining unit 15 that defines the illumination shape of the stimulation light, for example, in a pattern shape.
  • the biological sample 7 is irradiated with stimulation light having a pattern shape from the upper surface of the biological sample 7 by transmitted illumination.
  • the light source 14 for stimulation light for example, an LED can be used.
  • the irradiation timing of the stimulation light is the dead time of the detector 13 so that the stimulation light does not leak during detection of chemiluminescence.
  • the stimulation light light having at least one of wavelength and intensity different from the control light can be used.
  • the stimulation light may have a wavelength in the range of 400 to 600 nm and an intensity in the range of 0.01 to 1 W / cm 2 .
  • the biological sample 7 containing one type of chemiluminescent substance 20 was observed with the microscope of Example 1.
  • the biological sample 7 including a plurality of types of chemiluminescent substances 20 that respectively generate a plurality of chemiluminescences having different wavelengths is observed.
  • the biological sample 7 includes at least two of yellow-nano lanthanum, cyan-nano lanthanum, orange-nano lanthanum, green-nano lanthanum, and red-nano lanthanum.
  • the microscope of Example 2 further includes a wavelength filter 17 that separates the plurality of chemiluminescences based on the wavelengths.
  • the detector 13 detects each chemiluminescence separated by the wavelength filter 17.
  • a plurality of nanolanterns 24 having different colors are bonded to each of a plurality of types of proteins to be observed in the biological sample 7 and the microscope of Example 2 is used, a plurality of types of proteins to be observed Can be observed at the same time.
  • step S1 a self-luminous protein fusion that contains a luminescent enzyme and a fluorescent protein and generates chemiluminescence in cooperation with a luminescent substrate, and a luminescence control part that controls chemiluminescence according to the presence or absence of illumination of control light
  • a biological sample 7 is prepared by adding a luminescent substrate to the biological sample 7 containing.
  • Step S1 can be divided into the following sub-steps, for example.
  • Substep 1 A biological sample 7 such as a cell, biological tissue, or individual that expresses photoswitching chemiluminescence is prepared.
  • Substep 2 The biological sample 7 is cultured on a glass dish 8 having a thickness suitable for observation of an objective lens having a high numerical aperture.
  • Sub-step 3 If the culture in the dish 8 is a serum medium, replace the medium with the serum removed before starting the observation.
  • step S2 the dish 8 containing the biological sample 7 is mounted on the stage 6 of the microscope.
  • the stage 6 desirably has an incubation function for cell culture.
  • step S3 the luminescent substrate 25, for example coelenterazine, is added to the biological sample 7 (addition process). It is possible to add the luminescent substrate 25 outside the microscope, that is, in step S1.
  • step S2 or step S3 the focus of the microscope is adjusted in preparation for observation with a microscope, for example, bright field observation or fluorescence observation, or an autofocus device for observing chemiluminescence is activated.
  • the self-luminous protein fusion (nanolantern) 24 contains the fluorescent protein 21, fluorescence observation is possible.
  • step S4 the second region that surrounds the first region 7a and suppresses the generation of chemiluminescence without irradiating the control light to the first region 7a that allows the generation of chemiluminescence on the observation surface of the biological sample 7.
  • the biological sample 7 is illuminated with the control light so that the control light is irradiated onto the light 7b (illumination process).
  • the control light has a donut-shaped illumination shape that illuminates only the second region 7b surrounding the first region 7a.
  • the control light is cyan (blue) light having a wavelength of 380 to 480 nm that induces a structural change of the LOV2 domain that is the light emission control portion 23.
  • the control light applied to the biological sample 7 does not have to be cyan (blue) light having a wavelength of 380 to 480 nm for one-photon absorption, and may be light having a wavelength of 850 to 950 nm for two-photon absorption. Good.
  • step S5 the illumination of the biological sample 7 by the control light is stopped (stop process).
  • step S6 chemiluminescence emitted from the first region 7a of the biological sample 7 is detected by the detector 13 in a state where the illumination of the biological sample 7 by the control light is interrupted and the LOV2 domain is not recovered (step S6). Detection step). If the control light is prevented from entering the detector 13 in the detection step, there is no need to provide a stop step in S5.
  • step S7 the stage 6 is moved in a direction orthogonal to the optical path of the control light and chemiluminescence to change the position of the biological sample 7 and the position of the first region 7a where chemiluminescence is emitted (changing step).
  • step S8 the illumination process of step S4, the stop process of step S5, and the detection process of step S6 are performed in that order, and different first regions 7a of the biological sample 7 are observed. And the illumination process of step S4, the stop process of step S5, and the detection process of step S6 are repeatedly performed for each of the first regions 7a of the biological sample 7, and the entire region of the observation surface of the biological sample 7 is observed. .
  • the biological sample 7 including the chemiluminescent substance 20 in which the generation of chemiluminescence is suppressed by the irradiation of the control light is observed in a living state.
  • a chemiluminescent substance that can turn on / off chemiluminescence by irradiation of control light is called an optical switching type.
  • the chemiluminescent substance 20 used in the present embodiment is chemically activated by irradiation of control light. Those in which the generation of luminescence is suppressed are called positive types.
  • the positive-type chemiluminescent substance contains, for example, fluorescent proteins such as Padron and Kohinoor, and when irradiated with control light, the generation of chemiluminescence can be suppressed and the luminescence intensity of the fluorescent protein can be reduced.
  • a biological sample includes a so-called negative chemiluminescent substance that promotes the generation of chemiluminescence by irradiation of control light among light-switching chemiluminescent substances.
  • the negative chemiluminescent substance includes, for example, fluorescent proteins such as Dronpa, rsEGFP, Skylan, and rsTagRFP.
  • the control light is irradiated, the generation of chemiluminescence can be promoted to increase the luminescence intensity of the fluorescent protein.
  • FIG. 6A is a diagram showing a negative chemiluminescent substance 20a, in which the luminescent enzyme 22 and the luminescence control portion 23 are shown together.
  • the energy of the luminescent enzyme 22 in the excited state undergoes resonance energy transfer (FRET) to the fluorescent protein 21a, thereby suppressing the generation of chemiluminescence.
  • FRET resonance energy transfer
  • the microscope demarcating unit 4 controls the observation surface of the biological sample 7 to an area (first area) in which chemiluminescence from the chemiluminescent substance is to be detected.
  • a control light irradiation pattern is defined so as to emit light.
  • the control light is converted into dot-shaped dot light by the demarcating unit 4 so that only the region is irradiated.
  • the demarcation unit 4 may demarcate the control light irradiation pattern so that a plurality of dot lights are arranged.
  • a biological sample is a so-called decoupled chemiluminescent substance in which generation of chemiluminescence is promoted or suppressed by irradiation of two different types of control light among light-switching chemiluminescent substances.
  • the decoupled chemiluminescent substance includes, for example, a fluorescent protein such as Dreiklang or PSFP.
  • the first control light is irradiated, the generation of chemiluminescence can be promoted to increase the emission intensity of the fluorescent protein.
  • the second control light different from the first control light is irradiated, the generation of chemiluminescence can be suppressed and the emission intensity of the fluorescent protein can be reduced.
  • FIG. 6B is a diagram showing a decoupled chemiluminescent substance 20b, in which the luminescent enzyme 22 and the luminescence control portion 23 are shown together.
  • the first control light for example, 355 nm
  • the energy of the luminescent enzyme 22 in the excited state undergoes resonance energy transfer (FRET) to the fluorescent protein 21b, thereby promoting the generation of chemiluminescence and light emission from the fluorescent protein 21b.
  • the strength can be increased (upper figure).
  • the second control light for example, 405 nm
  • the generation of chemiluminescence is suppressed, and the luminescence intensity from the fluorescent protein 21b can be reduced (lower diagram).
  • the demarcating unit 4 of the microscope sends the first control light to the first region of the observation surface of the biological sample 7 where chemiluminescence from the chemiluminescent substance is to be detected.
  • the irradiation pattern of the first control light and the second control light is defined so that the second control light is irradiated to the second region surrounding the first region.
  • the first control light is converted into dot-shaped dot light by the demarcating unit 4 so as to be applied only to the first region, and the second control light is applied only to the second region surrounding the first region. Then, a donut-shaped donut light is formed by the demarcating portion 4. Thereby, the contrast of the light emission intensity in the first region and the second region can be increased, and the detection sensitivity of chemiluminescence from the first region can be improved.
  • a biological sample includes a so-called light-converting chemiluminescent substance in which the wavelength of chemiluminescence (emission color) is changed by irradiation of control light.
  • Light-converting chemiluminescent substances include, for example, fluorescent proteins such as Kaede, KikGR, PS-CFP1, mEOS2, mEOS3.2, and PSmOrange.
  • the wavelength of chemiluminescence is changed from the first wavelength to the second wavelength.
  • FIG. 7 is a diagram showing a light-converting chemiluminescent substance 20c, in which the luminescent enzyme 22 and the luminescence control portion 23 are shown together.
  • the chemiluminescence wavelength is the first wavelength (for example, green light), whereas when the control light is irradiated, the chemiluminescence wavelength is changed from the first wavelength to the second wavelength (for example, the green light). Red light).
  • the demarcation unit 4 of the microscope irradiates the control light to the region (first region) where chemiluminescence should be detected in the observation surface of the biological sample 7.
  • the irradiation pattern of the control light is defined.
  • the control light is converted into dot-shaped dot light by the demarcating unit 4 so that only the region is irradiated.
  • the detector 13 detects chemiluminescence (second wavelength) from the biological sample 7 through a filter that transmits light of the second wavelength without transmitting light of the first wavelength. As a result, it is possible to increase the contrast of the emission intensity between the region emitting chemiluminescence at the second wavelength and the other region emitting chemiluminescence at the first wavelength, thereby improving the detection sensitivity of chemiluminescence from the region.
  • chemiluminescence of the second wavelength is detected, but chemiluminescence of the first wavelength may be detected.
  • the demarcating unit 4 does not irradiate the first region of the observation surface of the biological sample 7 where chemiluminescence is to be detected, but irradiates the second region surrounding the first region with the control light.
  • the detector 13 detects chemiluminescence (first wavelength) from the biological sample 7 through a filter that transmits light of the first wavelength without transmitting light of the second wavelength.
  • the contrast of the light emission intensity can be increased in the first region chemiluminescent at the first wavelength and the second region chemiluminescent at the second wavelength, and the detection sensitivity of chemiluminescence from the first region can be improved.
  • ⁇ Fifth Embodiment> 5th Embodiment demonstrates the other method of observing a biological sample using the microscope shown in said Example 1 and Example 2.
  • FIG. Biological samples contain various information ranging from low-frequency information (rough structure information) to high-frequency information (fine structure information), and it is difficult for conventional microscopes to obtain high-frequency information due to the resolution limit (diffraction limit).
  • first pattern irradiation pattern
  • second pattern for example, moire pattern
  • the frequency component of the biological sample is obtained by the processing unit 16.
  • the processing unit 16 Based on the frequency component of the control light irradiation pattern and the frequency component of the interference pattern detected by the detector 13, the frequency component of the biological sample is obtained by the processing unit 16.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating an example in which the observation surface of the biological sample 7 is irradiated with control light with a known striped irradiation pattern 81.
  • the control light irradiation pattern 81 is defined by a spatial modulator such as LCoS (Liquid Crystals on Silicon) or DMD (Digital Mirror Device) provided in the defining unit 4. It is preferable that the spatial modulator is detachably provided on the microscope (defining part 4).
  • the moire pattern 82 is detected by the detector 13, and the processing unit 16 performs processing to remove the frequency component of the control light irradiation pattern 82 from the frequency component of the moire pattern 82 detected by the detector 13.
  • the high frequency component which was difficult to observe with a conventional microscope can be obtained. That is, it is possible to perform super-resolution chemiluminescence observation of high-frequency information of the biological sample 7 that cannot be observed with a conventional microscope.
  • a line-and-space pattern in which line-shaped irradiation areas and non-irradiation areas are alternately and periodically arranged is used as the control light irradiation pattern 81.
  • Any pattern that has a frequency component that causes an interaction with the frequency component of the biological sample 7 may be used.
  • a total of nine images obtained by irradiating the biological sample 7 with pattern light of 3 directions ⁇ 3 phases are obtained and obtained for each direction and each phase.
  • the frequency components of the obtained biological sample 7 may be synthesized (added).

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

化学発光を生成する化学発光物質を含む生体試料を生存状態で顕微鏡により観察する。前記顕微鏡は、前記化学発光の状態を変化させる制御光を射出する光源と、前記生体試料の観察面に照射される前記制御光の照射パターンを画定する画定部と、前記生体試料から射出された前記化学発光を検出する検出器と、を備える。

Description

生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法
　本発明は、生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法に関する。
　従来、試料中に含まれる物質から生成される発光を、顕微鏡を用いて観察することが行われてきた。例えば、従来の蛍光顕微鏡では、試料に紫外線やＸ線や可視光線を照射して試料中の物質を励起させ、励起状態の物質が基底状態に戻るときに放出する蛍光を検出することによって試料を観察する。したがって、従来の蛍光顕微鏡では、試料中の物質を励起させるための励起光の光源を必要とする。
　近年では、励起光源を必要としない顕微鏡も出現している。このタイプの顕微鏡は、励起光源からの光照射を受けることなく、試料中に含まれる物質によって生成される化学発光を検出する。特許文献１には、７００ｎｍ、強度４００ｍＷのイレース光を試料である鉄道虫の観察領域外に照射して当該観察領域外での化学発光の発生を抑制することによって、鉄道虫の観察領域から生成された化学発光を顕微鏡によって高感度で検出することが開示されている。
特開２００８－５７９９７号公報
　特許文献１記載の化学発光を観察する顕微鏡は、励起光源を必要としないので、構造が簡素で低コストで入手可能である。しかし、特許文献１記載の顕微鏡は、観察領域外からの化学発光を抑制するために、細胞が瞬時に死んでしまうほど高い強度照度でイレース光を照射するので、細胞を生存状態で観察することはできない。例えば、神経細胞の活動を、当該細胞を構成している多数のタンパク質分子のうちのどのタンパク質分子がどのように反応するのかを観察したい場合、当然に細胞を生存状態で観察することが求められる。
　そこで、本発明は、生体試料を生存状態で高感度かつ低コストで観察することが可能な顕微鏡、方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の側面は、生体試料を生存状態で観察するための顕微鏡であって、前記生体試料は、化学発光を生成する化学発光物質を含み、前記顕微鏡は、前記化学発光の状態を変化させる制御光を射出する光源と、前記生体試料の観察面に照射される前記制御光の照射パターンを画定する画定部と、前記生体試料から射出された前記化学発光を検出する検出器と、を備えることを特徴とする。
　また、本発明の第２の側面は、生体試料を生存状態で観察する方法であって、発光酵素および蛍光タンパク質を含み発光基質と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体と、前記発光酵素と結合され、前記化学発光の状態を変化させる制御光の照明の有無に応じて前記化学発光を制御する発光制御部分と、を含む前記生体試料に前記発光基質を添加する添加工程と、前記制御光の照射パターンを画定し、前記照射パターンに画定された前記制御光で前記生体試料を照明する照明工程と、前記生体試料から射出される前記化学発光を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする。
　本発明によれば、生体試料を生存状態で高感度かつ低コストで観察することが可能な顕微鏡、方法を提供することができる。
実施例１の顕微鏡を示す図。 実施例２の顕微鏡を示す図。 本発明に係る観察方法を説明するフローチャート。 化学発光物質を説明する図。 制御光の作用を説明する図。 ネガティブ型の化学発光物質を説明する図。 デカップル型の化学発光物質を説明する図。 光変換型の化学発光物質を説明する図。 生体試料の観察面に制御光を照射した例を示す図。
　＜第１実施形態＞
　以下、図面を用いて本発明の第１実施形態を説明する。
　［化学発光物質］
　細胞等の生体試料の中に含まれ化学発光を生成する化学発光物質について説明する。本実施形態で使用される化学発光物質２０は、制御光の照射により化学発光の状態が変化する特性を有しており、図４に示されるように、発光基質（ルシフェリン）２５と、発光基質２５と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体２４とを含む。自発光タンパク質融合体２４は、蛍光タンパク質２１と発光酵素（ルシフェラーゼ）２２とを含む。発光酵素２２が発光基質２５の化学反応（酸化）を触媒することで化学発光が発生する。発光酵素２２の発光量子収率よりも蛍光タンパク質２１の蛍光量子収率が高ければ、発光酵素２２と蛍光タンパク質２１との間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により化学発光の光強度が増加する。そこで、発光酵素２２と蛍光タンパク質２１との自発光タンパク質融合体２４は、高い光強度の化学発光を生成するナノスケールの光源という意味を込めて、ナノランタン（Nano-lantern）と呼ばれる。
　本実施形態において、自発光タンパク質融合体（ナノランタン）２４として、互いに生成する化学発光の波長（色）が異なる、イエロ－ナノランタン、シアン－ナノランタン、オレンジ－ナノランタン、グリーン－ナノランタン、レッド－ナノランタン、および、それらの改変体の少なくとも１つを使用することができる。互いに色が異なる複数の自発光タンパク質融合体（ナノランタン）２４を使用すれば、細胞中の複数の種類のタンパク質の挙動を同時に観察可能である。例えば、万能細胞（ＥＳ細胞）の万能性維持に重要な３つの遺伝子の発現の様子を同時に観察することが可能となる。
　発光制御部分２３は、制御光が照射されていない状態（図４の状態４１）では、自発光タンパク質融合体２４に化学発光反応を発生させる第１の立体構造をとらせる。一方、発光制御部分２３は、制御光が照射されている状態（図４の状態４２）では、自発光タンパク質融合体２４に化学発光反応の発生が抑制される第２の立体構造をとらせる。すなわち、発光制御部分２３は、制御光の照明の有無に応じて化学発光を制御する。本実施形態では、制御光として、１光子吸収の３８０～４８０ｎｍの波長を有する青色の光または２光子吸収の８５０～９５０ｎｍの波長を有する光を使用する。自発光タンパク質融合体２４に制御光の青色光を照射すれば、発光基質２５が存在していても化学発光反応の発生が抑制される状態４２となり、青色光の照射が停止されれば、自発光タンパク質融合体２４は、熱緩和によって状態４１に復帰される。発光制御部分２３は、例えば、フォトトロピンのLight-oxygen-voltage-sensing ドメイン２（ＬＯＶ２ドメイン）、ＬＯＶ２ドメインの変異体であるＬＯＶ２－Ｉ４２７Ｖ、ＢＬＵＦタンパク質のＡｐｐＡドメイン（１－１３３）、ＢＬＵＦタンパク質のＰａｐＢドメイン（１－１４７）、ＢＬＵＦタンパク質のＹｃｇＦドメイン（１－９７）である。
　［制御光］
　化学発光物質２０の化学発光、すなわち、自発光タンパク質融合体２４と発光基質２５との協働による化学発光を制御する制御光の作用について説明する。生体試料の観察面を、図５の５１のように、化学発光の生成を許容する第１領域７ａと化学発光の生成を抑制する第２領域７ｂとに分ける。第１領域７ａには、化学発光の生成を抑制する制御光は照射されない。一方、第２領域７ｂには、化学発光の生成を抑制するために制御光が照射される。制御光は、第１領域７ａを取り囲むドーナツ形状の第２領域７ｂのみに照射されるドーナツ光である。
　図５の５２に示されるように、第１領域７ａから化学発光が射出され、第１領域７ａを取り囲む第２領域７ｂからは化学発光が抑制される。もし、制御光を使用しない場合には、観察面全体すなわち第１領域７ａおよび第２領域７ｂの双方から化学発光が射出されるので、顕微鏡で生体試料７の観察面を観察すると化学発光の強度は、５３の点線で示されるように、ブロードに分布する。一方、第２領域７ｂのみに制御光を照射する場合には、第１領域７ａ内の化学発光のみが主として観察されるので、化学発光の強度は、５３の実線で示されるように、シャープに分布する。したがって、制御光を使用することで化学発光のコントラストが増大して検出感度が向上する。化学発光が生成する第１領域７ａの位置を変えて化学発光を検出することを繰り返して大量の画像を撮り、これらを重ねわせることによって観察面全体の画像が得られる。
　図５は、制御光が照射されない第１領域７ａの数が１つの例を示している。しかし、制御光が照射されない第１領域７ａの数を複数とすると、複数の第１領域７ａからの複数の化学発光を同時に検出し得るので、効率的である。このように、複数の第１領域７ａからの複数の化学発光を同時に検出する場合でも、隣接し合う２つの化学発光を生成する領域同士は充分に離れているので、化学発光を生成する複数の領域それぞれについて、精密に位置を確定することができる。観察面全体における第１領域７ａと第２領域７ｂとの分布は、制御光の照明形状を画定する後述の画定部４によって決定される。第１領域７ａの径は、例えば、顕微鏡の光学系のＮＡを１とするとき、制御光の波長の半分程度とすることができる。本実施形態では、第１領域７ａの径を５０ｎｍ程度、第２領域７ｂの径を２５０ｎｍ程度としている。
　本実施形態では、化学発光物質として、蛍光タンパク質２１と発光酵素２２との自発光タンパク質融合体２４と、ＬＯＶ２ドメイン、ＬＯＶ２ドメインの変異体等の発光制御部分２３と、を含むものを使用する。そのため、１Ｗ／ｃｍ２以下、好ましくは１８ｍＷ／ｃｍ２～１Ｗ／ｃｍ２という微弱な制御光を使用して化学発光を制御することができる。したがって、ＫＷ／ｃｍ２～ＧＷ／ｃｍ２レベルという生体試料７が瞬時に死んでしまうほど高強度のイレース光を使用する特許文献１に記載の顕微鏡と比べると、生体試料７を損傷する度合いがはるかに小さいので、生体試料７を生存状態で観察することが可能である。制御光として、１光子吸収の３８０～４８０ｎｍの波長を有する青色光または２光子吸収の８５０～９４０ｎｍの波長を有する光を使用する。
　［顕微鏡］
　生体試料７を生存状態で観察するための顕微鏡について説明する。
　実施例１
　図１は、実施例１の顕微鏡を示す。光源１は、生体試料７に含まれる化学発光物質２０からの化学発光の生成を抑制する制御光を射出する。制御光の強度は、１Ｗ／ｃｍ２以下と微弱なので生体試料７を損傷する度合いがわずかであり、観察対象の生体試料７を生存状態で観察することが可能である。シャッタ２は、生体試料７に対する制御光の入射をオンオフする。画定部４は、生体試料７の観察面のうちで、化学発光の生成を許容して化学発光物質２０からの化学発光を検出すべき第１領域７ａに制御光を照射せずに、第１領域７ａを取り囲み化学発光の生成を抑制する第２領域７ｂに制御光を照射するように、制御光の照明形状（照射パターン）を画定する。制御光は画定部４によってドーナツ形状のドーナツ光にされる。画定部４として、例えば、Ｖｏｌｔｅｘ位相板（ラセン型位相板）、空間光変調器、または、制御光を遮断する材料が第１領域７ａに対応する部分に塗布された透明板を使用し得る。
　生体試料７は、ディッシュ８の中に格納される。ディッシュ８内の生体試料７の画定部４の側とは反対の側（図１の右側）の観察面の第１領域７ａから化学発光が検出器１３に向けて射出される。生体試料７を格納したディッシュ８は、ステージ（保持台）６に保持される。ステージ６は、制御光の光路と直交する方向（図１の紙面上下方向）に画定部４に対して移動可能に設けられている。したがって、ステージ６を図１の紙面上下方向に少し移動して、制御光の照射と化学発光の検出とを繰り返すことで、生体試料７の観察面の全領域を観察することができる。
　図示されていないが、顕微鏡は、ステージ６に保持されているディッシュ８内の生体試料７に発光基質２５を添加する添加部を備えている。添加部は、発光基質２５を生体試料７に滴下するか、または、発光基質２５を生体試料７に潅流して導入する。顕微鏡の外部で発光基質２５をディッシュ８内の生体試料７に添加し、発光基質２５が添加された生体試料７が格納されたディッシュ８をステージ６に載置する場合には、発光基質２５を添加する添加部を省略し得る。
　ステージ６と検出器１３との間には、第１領域７ａからの化学発光を平行光とする対物レンズ１０と、平行光とされた化学発光を検出器１３に集光する結像レンズ１２と、が配置される。また、ステージ６に保持されているディッシュ８と対物レンズ１０との間には、屈折率を調整するための屈折率マッチングオイル９が介在される。検出器１３は、生体試料７の画定部４の側とは反対の側（図１の右側）の観察面の第１領域７ａから射出された化学発光を検出する。画定部４が、２次元的に配置された複数の第１領域７ａを制御光により照明するように構成される場合、検出器１３は、複数の化学発光を同時に検出するために、例えば、２次元的に配置されたアレイ型検出器とされる。処理部（コンピュータ）１６は、検出器１３から送られた検出結果を処理して化学発光の画像を生成する。
　実施例２
　図２は、実施例２の顕微鏡を示す。実施例２の顕微鏡は、実施例１の顕微鏡と基本構成において共通するので、相違する以下の３つの構成だけを説明する。
　実施例１の顕微鏡では、制御光の光源１と化学発光を検出する検出器１３とが、ステージ６を挟んで配置されていた。これに対し、実施例２の顕微鏡では、制御光の光源１と化学発光を検出する検出器１３とが、図２に示されるように、ステージ６に対して同じ側（図２の紙面の下側）に配置される。したがって、制御光の光源１から生体試料７が格納されステージ６に保持されたディッシュ８に至る制御光の光路と、ディッシュ８内の生体試料７から検出器１３に至る化学発光の光路とは、部分的に重なる。そこで、実施例２の顕微鏡は、制御光の光源１とステージ６との間に配置され、光源１から射出された制御光をステージ６に向けて導き、生体試料７の観察面から射出された化学発光を検出器１３に向けて導くビームスプリッタ１１をさらに備える。
　実施例１の顕微鏡では、生体試料７を刺激する刺激光を射出する光源を有していなかった。これに対し、実施例２の顕微鏡では、生体試料７を刺激する刺激光を射出する第２の光源１４と、刺激光の照明形状を例えばパターン形状に画定する第２の画定部１５をさらに備えている。例えば、光遺伝学を行う場合には、透過照明により、生体試料７の上面からパターン形状の刺激光を生体試料７に照射する。刺激光の光源１４として、例えばＬＥＤを用いることができる。刺激光の照射タイミングは、検出器１３のデッドタイムとし、化学発光の検出中に刺激光が漏れないようにする。ここで、刺激光としては、波長および強度の少なくとも一方が制御光と異なる光が用いられうる。例えば、刺激光は、波長が４００～６００ｎｍの範囲内、強度が０．０１～１Ｗ／ｃｍ２の範囲内であるとよい。
　実施例１の顕微鏡では、１種類の化学発光物質２０を含む生体試料７を観察した。これに対し、実施例２の顕微鏡では、互いに異なる波長の複数の化学発光をそれぞれ生成する複数種類の化学発光物質２０を含む生体試料７を観察する。例えば、生体試料７は、イエロ－ナノランタン、シアン－ナノランタン、オレンジ－ナノランタン、グリーン－ナノランタン、および、レッド－ナノランタンの少なくとも２つを含む。複数の化学発光に対応するため、実施例２の顕微鏡は、複数の化学発光を波長に基づいて分離する波長フィルタ１７をさらに備える。実施例２の顕微鏡では、検出器１３は、波長フィルタ１７によって分離された化学発光のそれぞれを検出する。生体試料７内の観察対象とする複数の種類のタンパク質のそれぞれに互いに色が異なる複数のナノランタン２４を結合させ、かつ、実施例２の顕微鏡を使用すると、観察対象とする複数の種類のタンパク質の挙動を同時に観察可能である。
　［観察方法］
　図３を用いて、図１に示される実施例１の顕微鏡を用いて生体試料７を生存状態で観察する方法を説明する。まず、ステップＳ１で、発光酵素および蛍光タンパク質を含み発光基質と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体と、制御光の照明の有無に応じて化学発光を制御する発光制御部分と、を含む生体試料７に発光基質を添加して生体試料７を準備する。ステップＳ１は、例えば以下のようなサブステップに区分され得る。
・サブステップ１：光スイッチング化学発光を発現する細胞、生体組織、個体などの生体試料７を作成する。
・サブステップ２：高開口数の対物レンズ観察に適した厚さのガラス製のディッシュ８上で生体試料７を培養する。
・サブステップ３：ディッシュ８内の培養が血清培地であれば、観察開始前に血清を取り除いた培地に交換する。
　次いで、ステップＳ２では、顕微鏡のステージ６に生体試料７が収容されたディッシュ８を搭載する。ステージ６は、細胞培養用のインキュベーション（培養）機能を備えていることが望ましい。ステップＳ３では、発光基質２５、例えばセレンテラジンを生体試料７に添加する（添加工程）。なお、発光基質２５を顕微鏡外で、すなわち、ステップＳ１中で添加することも可能である。ステップＳ２またはステップＳ３の後、顕微鏡による観察の準備、例えば、明視野観察や蛍光観察で顕微鏡のフォーカスを調整したり、化学発光を観察するためのオートフォーカス装置を作動させたりする。本実施形態では、自発光タンパク質融合体（ナノランタン）２４が、蛍光タンパク質２１を含んでいるので蛍光観察が可能である。
　ステップＳ４では、生体試料７の観察面のうちで、化学発光の生成を許容する第１領域７ａに制御光を照射せずに、第１領域７ａを取り囲み化学発光の生成を抑制する第２領域７ｂに制御光を照射するようにして、制御光で生体試料７を照明する（照明工程）。制御光は、第１領域７ａを取り囲む第２領域７ｂのみを照明するドーナツ形状の照明形状を有する。制御光は、発光制御部分２３であるＬＯＶ２ドメインの構造変化を誘導する３８０～４８０ｎｍの波長を有するシアン色（青色）の光である。なお、生体試料７に照射される制御光は、１光子吸収の３８０～４８０ｎｍの波長を有するシアン色（青色）の光である必要はなく、２光子吸収の８５０～９５０ｎｍの波長を有する光でもよい。
　ステップＳ５では、制御光による生体試料７の照明を停止する（停止工程）。ステップＳ６では、制御光による生体試料７の照明が遮断され、かつ、ＬＯＶ２ドメインが回復していない状態で、生体試料７の第１領域７ａから射出される化学発光を検出器１３により検出する（検出工程）。なお、検出工程において、検出器１３に対する制御光の入射が阻止されるのであれば、Ｓ５の停止工程を設ける必要はない。ステップＳ７では、ステージ６を制御光、化学発光の光路に直交する方向に移動して、生体試料７の位置、化学発光が射出される第１領域７ａの位置を変更する（変更工程）。ステップＳ８では、ステップＳ４の照明工程、ステップＳ５の停止工程およびステップＳ６の検出工程をその順序で行い、生体試料７の異なる第１領域７ａを観察する。そして、ステップＳ４の照明工程、ステップＳ５の停止工程およびステップＳ６の検出工程を生体試料７の多数の第１領域７ａのそれぞれについて繰り返し行って、生体試料７の観察面の全領域に対する観察を行う。
　本実施形態では、制御光の照射により化学発光の生成が抑制される化学発光物質２０を含む生体試料７を生存状態で観察する例を示した。このように制御光の照射により化学発光をオン／オフすることができる化学発光物質は光スイッチング型と呼ばれ、中でも、本実施形態で用いた化学発光物質２０のように制御光の照射により化学発光の生成が抑制されるものはポジティブ型と呼ばれる。ポジティブ型の化学発光物質は、例えばPadronやKohinoorなどの蛍光タンパク質を含み、制御光を照射すると、化学発光の発生を抑制させて蛍光タンパク質の発光強度を低下させることができる。
　＜第２実施形態＞
　第２実施形態では、光スイッチング型の化学発光物質のうち、制御光の照射により化学発光の生成が促進する、いわゆるネガティブ型の化学発光物質を生体試料が含む例について説明する。ネガティブ型の化学発光物質は、例えばDronpaやrsEGFP、Skylan、rsTagRFPなどの蛍光タンパク質を含み、制御光を照射すると、化学発光の生成を促進させて蛍光タンパク質の発光強度を増加させることができる。図６Ａは、ネガティブ型の化学発光物質２０ａを示す図であり、該図では発光酵素２２と発光制御部分２３とを合わせて図示している。制御光を照射する前では（下図）、励起状態にある発光酵素２２のエネルギーが蛍光タンパク質２１ａに共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）することにより、化学発光の生成が抑制されている。この状態から制御光を照射すると、化学発光の生成が促進され、蛍光タンパク質２１ａからの発光強度を増加させることができる（上図）。
　次に、ネガティブ型の化学発光物質を含む生体試料を、上記の実施例１および実施例２で示した顕微鏡を用いて観察する例について説明する。ネガティブ型の化学発光物質を含む生体試料７を観察する場合、顕微鏡の画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光物質からの化学発光を検出すべき領域（第１領域）に制御光を照射するように、制御光の照射パターンを画定する。例えば、制御光は、該領域のみに照射されるように、画定部４によってドット形状のドット光にされる。これにより、制御光を照射した該領域と他の領域とにおける発光強度のコントラストを増大させ、該領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。ここで、化学発光を検出すべき該領域を生体試料７の観察面に複数設ける場合には、画定部４は、複数のドット光が配列するように制御光の照射パターンを画定するとよい。
　＜第３実施形態＞
　第３実施形態では、光スイッチング型の化学発光物質のうち、互いに異なる２種類の制御光の照射により化学発光の生成が促進されたり抑制されたりする、いわゆるデカップル型の化学発光物質を生体試料が含む例について説明する。デカップル型の化学発光物質は、例えばDreiklangやPSFPなどの蛍光タンパク質を含み、第１制御光を照射すると、化学発光の生成を促進させて蛍光タンパク質の発光強度を増加させることができる。一方、第１制御光とは異なる第２制御光を照射すると、化学発光の生成を抑制して蛍光タンパク質の発光強度を低下させることができる。
　図６Ｂは、デカップル型の化学発光物質２０ｂを示す図であり、該図では発光酵素２２と発光制御部分２３とを合わせて図示している。第１制御光（例えば３５５ｎｍ）を照射すると、励起状態にある発光酵素２２のエネルギーが蛍光タンパク質２１ｂに共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）することにより、化学発光の生成が促進され、蛍光タンパク質２１ｂからの発光強度を増加させることができる（上図）。一方、第２制御光（例えば４０５ｎｍ）を照射すると、化学発光の生成が抑制され、蛍光タンパク質２１ｂからの発光強度を低下させることができる（下図）。
　次に、デカップル型の化学発光物質を含む生体試料を、上記の実施例１および実施例２で示した顕微鏡を用いて観察する例について説明する。デカップル型の化学発光物質を含む生体試料を観察する場合、顕微鏡の画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光物質からの化学発光を検出すべき第１領域に第１制御光を照射し、該第１領域を取り囲む第２領域に第２制御光を照射するように、第１制御光および第２制御光の照射パターンを画定する。例えば、第１制御光は、第１領域のみに照射されるように画定部４によってドット形状のドット光にされ、第２制御光は、第１領域を取り囲む第２領域のみに照射されるように画定部４によってドーナツ形状のドーナツ光にされる。これにより、第１領域と第２領域とにおける発光強度のコントラストを増大させ、第１領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。
　＜第４実施形態＞
　第４実施形態では、制御光の照射により化学発光の波長（発光色）が変化する、いわゆる光変換型の化学発光物質を生体試料が含む例について説明する。光変換型の化学発光物質は、例えばKaedeやKikGR、PS-CFP1、mEOS2、mEOS3.2、PSmOrangeなどの蛍光タンパク質を含み、制御光を照射すると、化学発光の波長を第１波長から第２波長に変化する。図７は、光変換型の化学発光物質２０ｃを示す図であり、該図では発光酵素２２と発光制御部分２３とを合わせて図示している。制御光を照射する前では（下図）、化学発光の波長が第１波長（例えば緑色光）であるのに対し、制御光を照射すると、化学発光の波長を第１波長から第２波長（例えば赤色光）に変化させることができる。
　次に、光変換型の化学発光物質を含む生体試料を、上記の実施例１および実施例２で示した顕微鏡を用いて観察する例について説明する。光変換型の化学発光物質を含む生体試料７を観察する場合、顕微鏡の画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光を検出すべき領域（第１領域）に制御光を照射するように、制御光の照射パターンを画定する。例えば、制御光は、該領域のみに照射されるように、画定部４によってドット形状のドット光にされる。そして、検出器１３は、第１波長の光を透過させずに第２波長の光を透過させるフィルタを介して、生体試料７からの化学発光（第２波長）を検出する。これにより、第２波長で化学発光する該領域と第１波長で化学発光する他の領域とにおける発光強度のコントラストを増大させ、該領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。
　また、上記の例では第２波長の化学発光を検出したが、第１波長の化学発光を検出してもよい。この場合、画定部４は、生体試料７の観察面のうち化学発光を検出すべき第１領域に制御光を照射せず、該第１領域を取り囲む第２領域に制御光を照射するように、制御光の照射パターンを画定する。そして、検出器１３は、第２波長の光を透過させずに第１波長の光を透過させるフィルタを介して、生体試料７からの化学発光（第１波長）を検出する。これにより、第１波長で化学発光する第１領域と第２波長で化学発光する第２領域とにおいて発光強度のコントラストを増大させ、第１領域からの化学発光の検出感度を向上させることができる。
　＜第５実施形態＞
　第５実施形態では、上記の実施例１および実施例２に示した顕微鏡を用いて生体試料を観察する他の方法について説明する。生体試料は、低周波情報（粗い構造情報）から高周波情報（細かい構造情報）までの様々な情報を含んでおり、従来の顕微鏡では、解像限界（回折限界）により高周波情報を得ることが困難であった。そこで、本実施形態では、制御光を既知の照射パターン（第１パターン）で生体試料の観察面に照射し、生体試料の周波数成分と制御光の照射パターンの周波数成分との相互干渉（相互作用）によって該観察面に形成された干渉パターン（第２パターン（例えばモアレパターン））を検出器１３で検出する。そして、制御光の照射パターンの周波数成分と検出器１３で検出された干渉パターンの周波数成分とに基づいて、生体試料の周波数成分を処理部１６で求める。つまり、既知の照射パターンで制御光を生体試料に照射すると、生体試料の周波数成分を干渉パターン（モアレパターン）として低周波側にずらして検出することが可能となるため、従来の顕微鏡では観察することのできなかった生体試料の高周波情報までも観察することができる。
　図８は、生体試料７の観察面に、既知の縞状の照射パターン８１で制御光を照射した例を示す図である。制御光の照射パターン８１は、画定部４に設けられたＬＣｏＳ（Liquid Crystals on Silicon）やＤＭＤ（Digital Mirror Device）などの空間変調器により画定される。該空間変調器は、顕微鏡（画定部４）に着脱可能に設けられていることが好ましい。
　生体試料７の観察面に、既知の縞状の照射パターン８１で制御光を照射すると、生体試料がポジティブ型の化学発光物質を含む場合、制御光が照射された部分では化学発光が抑制され、制御光が照射されなかった部分では化学発光が許容されたままとなる。その結果、該観察面には、生体試料７の周波数成分と制御光の照射パターン８１の周波数成分との相互干渉によりモアレパターン８２（干渉パターン）が形成される。このモアレパターン８２は検出器１３よって検出され、処理部１６は、検出器１３で検出されたモアレパターン８２の周波数成分から制御光の照射パターン８２の周波数成分を除去する処理を行う。これにより、生体試料７の周波数成分を、従来の顕微鏡では観察することが困難であった高周波成分（高周波情報）までも得ることができる。つまり、従来の顕微鏡では観察することのできない生体試料７の高周波情報についての超解像化学発光観察を行うことができる。
　ここで、図８に示す例では、制御光の照射パターン８１として、ライン状の照射領域と非照射領域とが交互に且つ周期的に配列したラインアンドスペースパターンが用いられているが、それに限られるものではなく、生体試料７の周波数成分と相互作用を生じさせる周波数成分を有するパターンであればよい。また、生体試料７の２次元の画像を得るためには、該生体試料７に対して３方向×３位相のパターン光を照射した合計９枚の画像を取得し、各方向・各位相について得られた生体試料７の周波数成分を合成（加算）するとよい。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために、以下の請求項を添付する。
　本願は、２０１６年３月２３日提出の日本国特許出願特願２０１６－０５８９４６を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。

Claims (31)

  1. 　生体試料を生存状態で観察するための顕微鏡であって、
    　前記生体試料は、化学発光を生成する化学発光物質を含み、
    　前記顕微鏡は、
    　前記化学発光の状態を変化させる制御光を射出する光源と、
    　前記生体試料の観察面に照射される前記制御光の照射パターンを画定する画定部と、
    　前記生体試料から射出された前記化学発光を検出する検出器と、
    　を備えることを特徴とする顕微鏡。
  2. 　前記制御光は、その照射により前記化学発光の生成を抑制し、
    　前記画定部は、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記制御光を照射せずに、前記第１領域を取り囲む第２領域に前記制御光を照射するように、前記制御光の照射パターンを画定することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
  3. 　前記制御光は、その照射により前記化学発光の生成を促進し、
    　前記画定部は、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記制御光を照射するように、前記制御光の照射パターンを画定することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
  4. 　前記制御光は、照射により前記化学発光の生成を促進する第１制御光と、照射により前記化学発光の生成を抑制する第２制御光とを含み、
    　前記画定部は、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記第１制御光を照射し、前記第１領域を取り囲む第２領域に前記第２制御光を照射するように、前記第１制御光および前記第２制御光の照射パターンを画定することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
  5. 　前記制御光は、その照射により前記化学発光の波長を第１波長から第２波長に変化させ、
    　前記画定部は、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記制御光を照射するように、前記制御光の照射パターンを画定し、
    　前記検出器は、前記第１波長の光を透過させずに前記第２波長の光を透過させるフィルタを介して、前記生体試料から射出された前記化学発光を検出することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
  6. 　前記画定部は、前記観察面に複数の前記第１領域を形成するように前記制御光の照射パターンを画定することを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  7. 　前記検出器の検出結果を処理して前記化学発光の画像を生成する処理部を更に備えることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  8. 　前記検出器の検出結果を処理する処理部を更に備え、
    　前記画定部は、前記生体試料の観察面に照射される前記制御光の照射パターンを第１パターンに画定し、
    　前記検出器は、前記生体試料の周波数成分と前記第１パターンの周波数成分との相互作用により前記観察面に形成された第２パターンを検出し、
    　前記処理部は、前記第１パターンの周波数成分と前記第２パターンの周波数成分とに基づいて前記生体試料の周波数成分を求めることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
  9. 　前記第１パターンは、縞状のパターンを含み、
    　前記第２パターンは、前記生体試料の周波数成分と前記第１パターンの周波数成分との相互干渉により得られるモアレを含むことを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡。
  10. 　前記制御光は、１Ｗ／ｃｍ２以下の強度を有することを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  11. 　前記生体試料を刺激する刺激光を射出する第２の光源をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  12. 　前記化学発光物質は、発光基質と、発光酵素および蛍光タンパク質を含み前記発光基質と協働して前記化学発光を生成する自発光タンパク質融合体と、前記発光酵素と結合され、前記制御光の照明の有無に応じて前記化学発光を制御する発光制御部分と、を含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  13. 　前記自発光タンパク質融合体は、化学発光反応を発生させる第１の立体構造と、前記化学発光反応の発生が抑制される第２の立体構造とをとることができ、
    　前記制御光は、前記自発光タンパク質融合体の立体構造を前記第１の立体構造から前記第２の立体構造に変化させることを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡。
  14. 　前記発光制御部分は、フォトトロピンのLight-oxygen-voltage-sensing ドメイン２（ＬＯＶ２ドメイン）、前記ＬＯＶ２ドメインの変異体であるＬＯＶ２－Ｉ４２７Ｖ、ＢＬＵＦタンパク質のＡｐｐＡドメイン（１－１３３）、ＢＬＵＦタンパク質のＰａｐＢドメイン（１－１４７）、または、ＢＬＵＦタンパク質のＹｃｇＦドメイン（１－９７）を含むことを特徴とする請求項１２又は１３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  15. 　前記自発光タンパク質融合体は、イエロ－ナノランタン、シアン－ナノランタン、オレンジ－ナノランタン、グリーン－ナノランタン、および、レッド－ナノランタンの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  16. 　前記生体試料に前記発光基質を添加する添加部をさらに含むことを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  17. 　前記画定部は、Ｖｏｌｔｅｘ位相板、空間光変調器、または、前記制御光を遮断する材料が部分的に塗布された透明板であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  18. 　前記生体試料を保持する保持部と、
    　前記光源から射出された前記制御光の前記画定部への入射をオンオフするシャッタと、
    　前記保持部と前記検出器との間に配置された対物レンズと、
    　をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  19. 　前記検出器は、前記生体試料の前記画定部の側とは反対の側の前記観察面から射出された前記化学発光を検出することを特徴とする請求項１８に記載の顕微鏡。
  20. 　前記光源と前記保持部との間に配置され、前記光源から射出された前記制御光を前記保持部に向けて導き、前記画定部の側の前記観察面から射出された前記化学発光を前記検出器に向けて導くビームスプリッタをさらに備えることを特徴とする請求項１８に記載の顕微鏡。
  21. 　前記保持部は、前記制御光の光路と直交する方向に前記画定部に対して移動可能であることを特徴とする請求項１８乃至２０のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  22. 　前記制御光は、１光子吸収の３８０～４８０ｎｍの波長または２光子吸収の８５０～９４０ｎｍの波長を有することを特徴とする請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  23. 　前記生体試料は、互いに異なる波長の複数の化学発光をそれぞれ生成する複数種類の化学発光物質を含み、
    　前記検出器は、前記複数の化学発光を検出することを特徴とする請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の顕微鏡。
  24. 　前記複数の化学発光を波長に基づいて分離する波長フィルタをさらに備え、
    　前記検出器は、前記波長フィルタによって分離された前記複数の化学発光のそれぞれを検出することを特徴とする請求項２３に記載の顕微鏡。
  25. 　生体試料を生存状態で観察する方法であって、
    　発光酵素および蛍光タンパク質を含み発光基質と協働して化学発光を生成する自発光タンパク質融合体と、前記発光酵素と結合され、前記化学発光の状態を変化させる制御光の照明の有無に応じて前記化学発光を制御する発光制御部分と、を含む前記生体試料に前記発光基質を添加する添加工程と、
    　前記制御光の照射パターンを画定し、前記照射パターンに画定された前記制御光で前記生体試料を照明する照明工程と、
    　前記生体試料から射出される前記化学発光を検出する検出工程と、
    　を含むことを特徴とする方法。
  26. 　前記制御光は、その照射により前記化学発光の生成を抑制し、
    　前記照明工程では、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記制御光を照射せずに、前記第１領域を取り囲む第２領域に前記制御光を照射するように、前記制御光の照射パターンを画定することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  27. 　前記制御光は、その照射により前記化学発光の生成を促進し、
    　前記照明工程では、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記制御光を照射するように、前記制御光の照射パターンを画定することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  28. 　前記制御光は、照射により前記化学発光の生成を促進する第１制御光と、照射により前記化学発光の生成を抑制する第２制御光とを含み、
    　前記照明工程では、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記第１制御光を照射し、前記第１領域を取り囲む第２領域に前記第２制御光を照射するように、前記第１制御光および前記第２制御光の照射パターンを画定することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  29. 　前記制御光は、その照射により前記化学発光の波長を第１波長から第２波長に変化させ、
    　前記照明工程では、前記生体試料の観察面のうち前記化学発光を検出すべき第１領域に前記制御光を照射するように、前記制御光の照射パターンを画定し、
    　前記検出工程では、前記第１波長の光を透過させずに前記第２波長の光を透過させるフィルタを介して、前記生体試料から射出された前記化学発光を検出することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  30. 　前記照明工程では、前記生体試料の観察面に照射される前記制御光の照射パターンを第１パターンに画定し、
    　前記検出工程では、前記生体試料の周波数成分と前記第１パターンの周波数成分との相互作用により前記観察面に形成された第２パターンを検出し、前記第１パターンの周波数成分と前記第２パターンの周波数成分とに基づいて前記第生体試料の周波数成分を求めることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  31. 　前記制御光の光路に直交する方向における前記生体試料の位置を変更する変更工程を含み、
    　前記変更工程の後、前記照明工程および前記検出工程をその順序で繰り返し行うことを特徴とする請求項２５乃至３０のいずれか１項に記載の方法。
PCT/JP2017/011837 2016-03-23 2017-03-23 生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法 WO2017164332A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018507415A JP6764469B2 (ja) 2016-03-23 2017-03-23 生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法
EP17770372.5A EP3435135B1 (en) 2016-03-23 2017-03-23 Microscope and method for observing biological sample in living state
US16/133,867 US11268906B2 (en) 2016-03-23 2018-09-18 Microscope and method for observing biological specimen in living state

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-058946 2016-03-23
JP2016058946 2016-03-23

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/133,867 Continuation US11268906B2 (en) 2016-03-23 2018-09-18 Microscope and method for observing biological specimen in living state

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017164332A1 true WO2017164332A1 (ja) 2017-09-28

Family

ID=59899578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/011837 WO2017164332A1 (ja) 2016-03-23 2017-03-23 生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11268906B2 (ja)
EP (1) EP3435135B1 (ja)
JP (1) JP6764469B2 (ja)
WO (1) WO2017164332A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3865566A4 (en) * 2018-10-12 2022-08-03 Nikon Corporation SUB CULTURE LEVEL CALCULATION DEVICE AND SUB CULTURE LEVEL CALCULATION METHOD AND PROGRAM

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220054011A1 (en) * 2020-08-19 2022-02-24 Li-Cor, Inc. Multi-modal imaging systems and methods

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008057997A (ja) * 2006-08-29 2008-03-13 Olympus Corp 化学発光試料の観察方法および顕微鏡
JP2009069076A (ja) * 2007-09-14 2009-04-02 Olympus Corp 光シグナル観察方法および光シグナル観察システム

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008057997A (ja) * 2006-08-29 2008-03-13 Olympus Corp 化学発光試料の観察方法および顕微鏡
JP2009069076A (ja) * 2007-09-14 2009-04-02 Olympus Corp 光シグナル観察方法および光シグナル観察システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIRA TAKAI ET AL.: "Expanded palette of Nano- lanterns for real-time multicolor luminescence imaging", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, vol. 112, no. 14, 7 April 2015 (2015-04-07), pages 4352 - 4356, XP055518808 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3865566A4 (en) * 2018-10-12 2022-08-03 Nikon Corporation SUB CULTURE LEVEL CALCULATION DEVICE AND SUB CULTURE LEVEL CALCULATION METHOD AND PROGRAM

Also Published As

Publication number Publication date
EP3435135B1 (en) 2020-09-23
JP6764469B2 (ja) 2020-09-30
EP3435135A4 (en) 2019-02-06
US20190017937A1 (en) 2019-01-17
US11268906B2 (en) 2022-03-08
EP3435135A1 (en) 2019-01-30
JPWO2017164332A1 (ja) 2019-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11988604B2 (en) Optical microscopy with phototransformable optical labels
Sanderson et al. Fluorescence microscopy
Tam et al. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods
US8174692B2 (en) High spatial resolution imaging of a structure of interest in a specimen
Bates et al. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging
Staudt et al. Far-field optical nanoscopy with reduced number of state transition cycles
JP5392406B2 (ja) 顕微鏡装置、観察方法
Müller et al. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale
EP2291641B1 (en) High spatial resolution imaging of a structure of interest in a specimen
US7897937B2 (en) Method of fluorescence-microscopically imaging a structure in a sample with high three-dimensional spatial resolution
Martial et al. Programmable illumination and high-speed, multi-wavelength, confocal microscopy using a digital micromirror
Hell Nobel Lecture: Nanoscopy with freely propagating light
Bélisle et al. Rapid multicomponent optical protein patterning
CN111103678B (zh) 晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法
US20180372640A1 (en) Imaging device and imaging method
Orth et al. High throughput multichannel fluorescence microscopy with microlens arrays
WO2017164332A1 (ja) 生体試料を生存状態で観察する顕微鏡および方法
JP2016534395A (ja) 高解像度の３ｄ蛍光顕微鏡検査
Prakash Laser-free super-resolution microscopy
US11073477B2 (en) Epi-cone shell light-sheet super-resolution system and microscope
US20240176123A1 (en) Tiling light sheet microscope and imaging method of a sample
JP2010044018A (ja) 観察装置、観察容器、及びスライドガラス
Bodner Determining the oligomeric state of G-protein-coupled receptors via single-molecule fluorescence microscopy
Bodén et al. STED and RESOLFT Fluorescent Nanoscopy
Yan et al. Point Spread Function Engineering SRM

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018507415

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017770372

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017770372

Country of ref document: EP

Effective date: 20181023

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17770372

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1