JP5392406B2 - 顕微鏡装置、観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置、観察方法に関する。
本願は、２０１０年６月１１日に、日本に出願された特願２０１０−１３４２１７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

従来から、超解像顕微鏡として、ＳＴＯＲＭ（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば特許文献１参照）。この顕微鏡では、観察試料として、所定波長の活性化光を照射すると活性化し、後に活性化光とは異なる波長の励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する特性を有する蛍光物質又はこの蛍光物質を付着させたものが用いられる。このような観察試料に対して微弱な活性化光を照射することで低密度に蛍光物質を活性化させ、その後に励起光を照射して蛍光物質を発光させることで蛍光画像を取得する。このようにして取得した蛍光画像では、蛍光輝点（蛍光物質の像）が低密度に配置され、個々に分離されたものとなるため、個々の像の重心位置を求めることができる。このような蛍光画像を得るステップを複数回、例えば数百回〜数万回以上繰り返し、得られた複数の蛍光画像を合成する画像処理を行うことにより、高分解能の試料画像を得ることができる。

米国特許公開第２００８／００３２４１４号

従来の観察方法では、同一視野内に蛍光物質の密度が大きく異なる複数の領域が存在する場合には、高密度に蛍光物質が配置された部位において個々の蛍光輝点を分離検出できないために、高解像度の画像を得ることができなかった。

本発明の態様は、同一視野内で蛍光物質の分布に偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる顕微鏡装置、および観察方法を提供することを目的とする。

本発明のいくつかの態様は次のような試料の顕微鏡装置、観察方法を提供した。
すなわち、本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。

また本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。

また本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記活性化光照射後の前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。

また本発明の一態様にかかる顕微鏡装置は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定装置と、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、を有する。

また本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。

また本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。

また、本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で前記活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。

また本発明の一態様にかかる観察方法は、所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料が配置された観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得し、前記観察領域の蛍光強度分布を測定する分布測定ステップと、前記蛍光強度分布に基づいて前記観察領域の部分毎の前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、前記観察領域に対して前記部分毎に設定された照射強度の前記励起光を照射する動作と、前記観察領域の前記励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、を有する。

本発明の態様にかかる顕微鏡装置、および観察方法によれば、同一視野内で蛍光物質の分布に大きな偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる。

顕微鏡装置の第１実施形態を示す構成図である。 第１実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。 全反射照明の模式図である。 第１の蛍光画像の概略図である。 二次元輝度分布の概略図である。 第２の蛍光画像の概略図である。 蛍光輝点の検出に係る説明図である。 蛍光輝点の検出に係る説明図である。 蛍光輝点の検出に係る説明図である。 顕微鏡装置の第２実施形態を示す構成図である。 第５実施形態において参照する観察方法の第１態様を示す図である。 第５実施形態において参照する観察方法の第２態様を示す図である。 第５実施形態において参照する観察方法の第３態様を示す図である。 第６実施形態において参照する細胞観察画像を示す図である。

以下、図面を参照して試料の観察方法、および顕微鏡装置の一実施形態について説明する。なお、本実施形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。また、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上、要部となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。

（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る顕微鏡装置を示す概要図である。
顕微鏡装置１０は、顕微鏡本体１５と、顕微鏡本体１５に装着された励起照明系１１と、活性化照明系１３と、制御部１４と、記憶部１６と、表示部１７とを備えている。

本実施形態の顕微鏡装置１０は超解像顕微鏡技術（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy；ＳＴＯＲＭ）を用いた顕微鏡装置である。
顕微鏡装置１０では、所定波長の活性化光Ｌ２を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光Ｌ２とは異なる波長の励起光Ｌ１を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を標識として付与された試料を用いる。そして、励起照明系１１と活性化照明系１３とを用いて試料中の一部の蛍光物質のみを発光させることで離散的に分布した蛍光を観察する動作を繰り返し、これにより取得した多数の蛍光画像を用いて試料画像を形成する。

顕微鏡本体１５は、例えば、倒立顕微鏡である。顕微鏡本体１５は、観察対象である試料を載置するステージ３１を備えており、レーザ光源２１から照射される励起光Ｌ１をステージ３１に向けて反射させる全反射ミラー３２と、後述するレーザ光源４１から照射される活性化光Ｌ２をステージ３１に向けて反射させる一方、励起光Ｌ１を透過させるダイクロイックミラー３３と、ステージ３１に載置された試料の蛍光画像を撮像するカメラ３４と、が接続されている。

また図示は省略しているが、顕微鏡本体１５には、ステージ３１に励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２を照射する対物レンズや、試料から放射された蛍光（観察光）をカメラ３４の受光面に結合させる結像レンズなどが設けられている。
ステージ３１は、試料に貼り付けられたカバーガラスと試料との界面で励起光Ｌ１及び活性化光Ｌ２を全反射させる全反射照明が可能に構成されている。全反射照明によれば、照明光（励起光Ｌ１、活性化光Ｌ２）が全反射する際にカバーガラスから試料側へにじみ出るエバネッセント光により試料を照明することができる。エバネッセント光が届く範囲は界面から１００〜１５０ｎｍ程度の範囲に限られるため、カバーガラス表面近傍に位置する蛍光物質のみを発光させることができ、バックグランウドの蛍光を著しく低減することで高いＳ／Ｎ比で実現することができる。
なお、本実施形態の顕微鏡本体１５は、上記の全反射照明と、通常の落射照明とを切り替えて使用可能に構成されている。

励起照明系１１は、レーザ光源２１と、シャッタ２２と、全反射ミラー３２とを備えており、全反射ミラー３２を介して顕微鏡本体１５に接続されている。
レーザ光源２１は、試料に付与した蛍光物質を発光させるための励起光Ｌ１を顕微鏡本体１５に供給する光源である。レーザ光源２１は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の励起光Ｌ１を射出するものであればよく、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。
シャッタ２２は、顕微鏡本体１５への励起光Ｌ１の供給、停止を切り替える装置であり、例えば、レーザ光源２１から射出される励起光Ｌ１を遮蔽する遮光部材と、この遮光部材を励起光Ｌ１の光路に対して進退させる駆動装置とを備えた構成とすることができる。あるいはシャッタ２２として、ＡＯＴＦ（Acousto-Optic Tunable Filter；音響光学フィルタ）を用いても良い。
励起照明系１１は、ステージ３１上の観察視野（観察領域）の全域に対して励起光Ｌ１を照射するように構成されている。

活性化照明系１３は、レーザ光源４１と、ＡＯＴＦ４２と、スキャナ４３と、ダイクロイックミラー３３とを備えており、ダイクロイックミラー３３が励起光Ｌ１の光路上に挿入されることで、活性化照明系１３と顕微鏡本体１５とが接続されている。
レーザ光源４１は、蛍光物質を活性化するための活性化光Ｌ２を顕微鏡本体１５に向けて照射する。レーザ光源４１は、試料に含まれる蛍光物質に適合する波長の活性化光Ｌ２を射出するものであればよく、例えば、蛍光物質の種類に応じて、緑色レーザ（波長５３２ｎｍ）、赤色レーザ（波長６３３ｎｍ、６５７ｎｍ）、紫色レーザ（波長４０５ｎｍ）、青色レーザ（波長４５７ｎｍ）などを用いることができる。

ＡＯＴＦ４２は、音響光学フィルタ（Acousto-Optic Tunable Filter）であり、例えば二酸化テルルなどの複屈折結晶に超音波発振器からの超音波を加えることで、この複屈折結晶内に生じる疎密波を利用して、レーザ光源４１から入射された活性化光Ｌ２を分光偏光させる機能を有する。ＡＯＴＦ４２は、レーザ光源４１から入射する活性化光Ｌ２の強度を設定値に制御し、スキャナ４３に向けて射出する。
スキャナ４３は、活性化光Ｌ２を顕微鏡本体１５のステージ３１上で走査する。スキャナ４３としては、例えば、二軸のガルバノスキャナを用いることができる。
活性化照明系１３は、ステージ３１上の観察視野（観察領域）に対して、ＡＯＴＦ４２により変調された照射強度の活性化光Ｌ２を、スキャナ４３により走査しながら照射可能に構成されている。

制御部１４は、顕微鏡装置１０を総合的に制御するコンピュータであり、記憶部１６と、表示部１７と、ＡＯＴＦコントローラ１８と、カメラコントローラ１９とに接続されている。本実施形態において、制御部１４は、少なくとも、これらの装置を制御するための制御信号を生成する制御信号生成機能と、カメラコントローラ１９を介して蛍光画像を取得する蛍光画像取得機能と、取得した蛍光画像を解析する画像解析機能と、複数の蛍光画像から試料画像を生成する画像形成機能と、を有する。

記憶部１６は、例えば半導体メモリやハードディスクなどからなり、制御部１４において使用されるプログラムや制御部１４から供給されるデータ（蛍光画像など）を、制御部１４から読出可能な状態で記憶する。
表示部１７は、例えばモニタ（表示装置）やプリンタ（印刷装置）であり、制御部１４から出力される画像データに基づく映像を表示、印刷する機能を提供する。
ＡＯＴＦコントローラ１８は、活性化照明系１３に備えられたＡＯＴＦ４２を駆動制御する。ＡＯＴＦコントローラ１８は、制御部１４から入力される制御信号に基づいてＡＯＴＦ４２を駆動し、レーザ光源４１から出力された活性化光Ｌ２を変調する。
カメラコントローラ１９は、顕微鏡本体１５に接続されたカメラ３４を駆動制御する。カメラコントローラ１９は、制御部１４から入力される制御信号に基づいてカメラ３４を動作させ、試料から放射された蛍光の画像を取得し、取得した蛍光画像を制御部１４に出力する。

なお、励起照明系１１において、シャッタ２２と全反射ミラー３２との間に、ＡＯＴＦが設けられていてもよい。また、活性化照明系１３において、例えばＡＯＴＦ４２とスキャナ４３との間に、シャッタが設けられていてもよい。
さらに、レーザ光源２１とレーザ光源４１とを１つの筐体内に備え、複数種のレーザ光を射出可能に構成されたレーザ光源装置を採用してもよい。このようなレーザ光源装置を備える場合、レーザ光源装置とともにシャッタ２２やＡＯＴＦ４２、スキャナ４３を備えた照明系を構成することで、１つの照明系により励起光Ｌ１と活性化光Ｌ２の両方を顕微鏡本体１５に供給可能となる。

顕微鏡装置１０は、制御部１４に備えられた上記の機能を組み合わせて実行することにより、後述する観察方法の実施に必要な各種の動作を実現する。したがって、顕微鏡装置１０は、蛍光物質の分布に対応する蛍光強度分布を測定する分布測定装置、観察領域の部分毎の活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置、及び、ＳＴＯＲＭ撮影処理及び画像処理により試料画像を生成する画像形成装置の機能を兼ね備えたものである。

次に、顕微鏡装置１０を用いた観察方法について説明する。
図２は、本実施形態の観察方法を示すフローチャートである。本実施形態の観察方法は、分布測定ステップＳ１０１と、照射強度設定ステップＳ１０２と、画像形成ステップＳ１０３と、からなる。

分布測定ステップＳ１０１は、顕微鏡装置１０において第１の蛍光画像を取得するステップＳ１１と、第１の蛍光画像における二次元輝度分布（蛍光強度分布）を計算するステップＳ１２とを含む。
照射強度設定ステップＳ１０２は、上記の蛍光強度分布に基づいて活性化光Ｌ２の二次元強度マップ（照射強度分布）を設定するステップＳ１３を含む。
画像形成ステップＳ１０３は、二次元強度マップに基づき照射強度を制御された活性化光Ｌ２を試料に照射するステップＳ１４と、試料に励起光Ｌ１を照射して第２の蛍光画像を取得するステップＳ１５と、第２の蛍光画像を保存するステップＳ１６と、撮影終了を判定するステップＳ１７と、複数の第２の蛍光画像から試料画像を生成するステップＳ１８と、を含む。

顕微鏡装置１０による観察手順の概略は以下の通りである。
まず、分布測定ステップＳ１０１において、試料における蛍光物質の存在密度に対応する二次元輝度分布を把握する。その後、照射強度設定ステップＳ１０２において、二次元輝度分布に基づいて試料の領域毎に活性化光Ｌ２の照射強度を設定する（二次元強度マップの作成）。その後、画像形成ステップＳ１０３において、二次元強度マップに基づいて活性化光Ｌ２の強度を変調しながら試料に照射する動作と、励起光Ｌ１を照射して第２の蛍光画像を得る動作とを、数百回から数万回繰り返す（ＳＴＯＲＭ撮影処理）。そして、撮影した多数の第２の蛍光画像を合成することで、高解像度の試料画像を得る（ＳＴＯＲＭ画像処理）。

以下、各段階の手順について詳細に説明する。
まず、顕微鏡装置１０のステージ３１上に、標識として蛍光物質を付与された試料がセットされる。観察対象となる試料は、例えば培養液に浸漬された細胞などである。
蛍光物質としては、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発して不活性化する蛍光物質が用いられる。具体的には、米国特許公開第２００８／００３２４１４号明細書に記載されたものを用いることができ、例えば、２種類のシアニン染料を結合させた染料対（Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対、Ｃｙ２−Ｃｙ５染料対など）を用いることができる。

上記の染料対において、一方の染料（第１の染料）が励起光により発光する光放射部分を形成し、他方の染料（第２の染料）が、光照射に応答して第１の染料を活性化するか、あるいは第１の染料の状態を切り替えるスイッチとして機能する活性化部分を形成する。例えば、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対では、Ｃｙ５が光放射部分であり、Ｃｙ３はＣｙ５を活性化可能な活性化部分である。したがって、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対を含む蛍光物質に、Ｃｙ３の吸収波長に対応する緑色レーザ（５３２ｎｍ）を照射すると、光放射部分であるＣｙ５が活性化され、Ｃｙ５が蛍光状態に移行する。そして、Ｃｙ５が蛍光状態にある蛍光物質に対してＣｙ５の吸収波長に対応する赤色レーザ（６３３ｎｍ）を照射すると、Ｃｙ５が発光するとともに、非活性状態（暗状態）に戻る。
ＳＴＯＲＭでは、蛍光物質における蛍光状態と暗状態とのスイッチング動作を制御することで、試料に付与された蛍光物質のごく一部のみを選択的に発光させ、蛍光物質を１分子レベルで検出可能としている。

ステージ３１への試料のセットが完了したならば、制御部１４は、分布測定ステップＳ１０１を開始する。分布測定ステップＳ１０１では、まず、第１の蛍光画像を取得するステップＳ１１が実行される。

ステップＳ１１では、最初に、活性化照明系１３から射出される活性化光Ｌ２が顕微鏡本体１５に供給され、ステージ３１上の試料に対して活性化光Ｌ２が照射される。このとき、励起照明系１１のシャッタ２２が閉状態とされることで励起光Ｌ１が遮断され、顕微鏡本体１５には活性化光Ｌ２のみが入射する。また、ＡＯＴＦ４２は、制御部１４から入力される制御信号に基づいて動作するＡＯＴＦコントローラ１８により、レーザ光源４１から入射する活性化光Ｌ２を一定強度で出力する状態とされる。そして、スキャナ４３により活性化光Ｌ２が観察視野全域に対して走査され、視野全域の試料に対して均一な強度の活性化光Ｌ２が照射される。これにより、視野全域にわたって試料に含まれる蛍光物質が活性化される。例えば、蛍光物質がＣｙ３−Ｃｙ５染料対を有する場合には、光放射部分であるＣｙ５が蛍光状態に移行し、発光可能な状態となる。

なお、活性化光Ｌ２は全反射照明、落射照明のいずれの形態で試料に照射してもよい。
図３は、全反射照明により活性化光Ｌ２（あるいは励起光Ｌ１）を試料Ｓに照射する場合を示す説明図である。図３に示すように、ステージ３１のカバーガラス３１ａ上に試料Ｓが配置されており、活性化光Ｌ２はカバーガラス３１ａの下方からカバーガラス３１ａの表面に対して斜めに入射する。そして、活性化光Ｌ２はカバーガラス３１ａと試料Ｓとの界面で全反射され、上記界面から試料Ｓ側へにじみ出すエバネッセント光ＥＶが試料Ｓの界面側表層に照射される。これにより、試料Ｓのごく表層部分に位置する蛍光物質のみが選択的に活性化される。
一方、落射照明の場合には、カバーガラス３１ａの法線方向に活性化光Ｌ２を入射させ、カバーガラス３１ａを透過させた活性化光Ｌ２を試料Ｓに照射する。この場合、試料Ｓの厚さ方向の全体に活性化光Ｌ２が照射される。

続いて、活性化照明系１３が活性化光Ｌ２を射出しない状態とされるとともに、励起照明系１１のシャッタ２２が開状態とされ、レーザ光源２１から射出される励起光Ｌ１が全反射ミラー３２を介して顕微鏡本体１５に供給される。本実施形態の顕微鏡装置１０では、励起照明系１１から供給された励起光Ｌ１は観察視野全域に照射される。そうすると、活性化光Ｌ２で活性化されている蛍光物質は、励起光Ｌ１が照射されることにより蛍光を発するとともに、不活性状態に移行する。この蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ１９を介してカメラ３４を動作させることで撮影し、第１の蛍光画像を取得することができる。撮影された第１の蛍光画像はカメラコントローラ１９から制御部１４に送信され、制御部１４は必要に応じて第１の蛍光画像を記憶部１６に記憶させる。

次に、ステップＳ１２では、制御部１４において、第１の蛍光画像における二次元輝度分布（蛍光強度分布）が算出される。
ここで図４は、分布測定ステップＳ１０１で得られる第１の蛍光画像を概略的に示す図である。図４に示す第１の蛍光画像Ｅ１では、図中に＋印で示された蛍光の輝点が、観察視野Ｅ内に偏って存在している。すなわち、試料の部位により蛍光物質の存在密度が異なっているために、蛍光物質が多い部分では輝点が多く、そのために蛍光強度が強くなる。一方、蛍光物質が少ない部分では輝点が少なく、したがって蛍光強度が弱くなる。

このような蛍光強度の偏りは、あらゆる試料において通常見られる現象であり、例えば細胞試料等では、細胞組織ごとの密度の差異によって蛍光強度分布（二次元輝度分布）の不均一を生じる。図４において、輝点が密集している領域（蛍光強度が強い部分）は、例えば細胞中の細胞核近傍の部分に対応し、輝点が散在している領域（蛍光強度が低い部分）は、例えば細胞内の小器官の部分に対応する。

第１の蛍光画像Ｅ１から観察視野における蛍光強度の分布を導出することで、例えば、図５に示すような二次元輝度分布を得ることができる。
図５に示す二次元輝度分布ＥＭは、領域Ｒ１〜Ｒ４の４つの領域に区画されており、各々の領域Ｒ１〜Ｒ４に対して、蛍光強度の水準（レベル）が設定されている。領域Ｒ１は、輝点密度が最も大きく、放射強度が最も大きい範囲に対応する。以後、領域Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の順に、輝点密度が小さくなり、より低い放射強度の範囲に対応して分類されている。
なお、図５では、蛍光強度を４水準に分類しているが、分類する水準の数は特に限定されない。ＡＯＴＦ４２による制御が可能な範囲で細かく分類することが可能である。

以上の手順により二次元輝度分布ＥＭを取得したならば、照射強度設定ステップＳ１０２に移行し、二次元強度マップを作成、保存するステップＳ１３が実行される。
ステップＳ１３において、制御部１４は、分布測定ステップＳ１０１で算出した二次元輝度分布ＥＭに基づいて、観察視野の位置毎に活性化光Ｌ２の照射強度を規定する二次元強度マップを作成する。

二次元強度マップの作成にあたっては、図５に示した二次元輝度分布ＥＭにおいて蛍光強度が最も高い領域Ｒ１に対する活性化光Ｌ２の照射強度を最も低く設定する一方、蛍光強度が最も低い領域Ｒ４に対する活性化光Ｌ２の照射強度を最も高く設定する。領域Ｒ２、Ｒ３については、それぞれの放射強度のレベルに応じて領域Ｒ１、Ｒ４の中間の照射強度に設定される。
すなわち、観察視野において、蛍光物質が多く存在する領域Ｒ１、Ｒ２には比較的弱い活性化光Ｌ２が照射されるようにし、蛍光物質が少ない領域Ｒ３、Ｒ４には、比較的強い活性化光Ｌ２が照射されるようにする。

二次元強度マップは、本実施形態の場合、ＡＯＴＦコントローラ１８に出力する制御信号のマップであるため、ＡＯＴＦ４２において活性化光Ｌ２に対する所望の変調（照射強度の変化）が可能であれば、そのデータ形式は特に限定されない。

二次元強度マップは、例えば、分布測定ステップＳ１０１で得られた二次元輝度分布ＥＭにおいて、領域Ｒ１〜Ｒ４に、それぞれの放射強度のレベルの逆数を割り当てたマップとして作成することができる。例えば、領域Ｒ１〜Ｒ４の放射強度のレベルがそれぞれ４，３，２，１であれば、二次元強度マップにおける領域Ｒ１〜Ｒ４には、それぞれ０．２５（１／４）、０．３３（１／３）、０．５（１／２）、１（１／１）が照射強度の制御値として設定される。

あるいは、二次元輝度分布ＥＭを階調反転させた反転画像として作成してもよい。例えば、領域Ｒ１〜Ｒ４の放射強度のレベルに対応する階調値が２００、１５０、１００、５０であり、階調値の範囲が１〜２５５であるとしたとき、二次元強度マップにおける領域Ｒ１〜Ｒ４には、それぞれ５５、１０５、１５５、２０５が照射強度の制御値として設定される。

このようにして照射強度設定ステップＳ１０２で生成された二次元強度マップ（照射強度分布のデータ）は、制御部１４から記憶部１６に保存される。

二次元強度マップの設定が終了したならば、制御部１４は、画像形成ステップＳ１０３を開始する。画像形成ステップＳ１０３では、照射強度設定ステップＳ１０２で設定された二次元強度マップを用いて数百から数万枚の第２の蛍光画像を取得するＳＴＯＲＭ撮影処理（ステップＳ１４〜Ｓ１７）と、第２の蛍光画像から試料画像を生成するＳＴＯＲＭ画像処理（ステップＳ１８）とが実行される。

まず、ステップＳ１４では、制御された活性化光Ｌ２が試料に照射される。顕微鏡装置１０では、励起照明系１１のシャッタ２２が閉状態とされ、顕微鏡本体１５には活性化光Ｌ２のみが供給される。制御部１４は、記憶部１６に保存されている二次元強度マップを読み出し、二次元強度マップを構成する個々のデータ（制御信号）を、ＡＯＴＦコントローラ１８に送信する。ＡＯＴＦコントローラ１８は、入力された制御信号に基づいてＡＯＴＦ４２を駆動する。

活性化照明系１３では、レーザ光源４１から射出された活性化光Ｌ２が、ＡＯＴＦコントローラ１８により駆動されるＡＯＴＦ４２により二次元強度マップに設定された照射強度に変調される。そして、照射強度を制御された活性化光Ｌ２がスキャナ４３により位置制御されてダイクロイックミラー３３に入射し、ダイクロイックミラー３３で反射されてステージ３１上の観察視野の所定位置に照射される。

このとき、顕微鏡装置１０が全反射照明モードにある場合には、図３に示したように、活性化光Ｌ２はエバネッセント光ＥＶとして試料Ｓに照射され、試料Ｓのごく表層部分に位置する蛍光物質のみが選択的に活性化される。

上記のステップＳ１４では、二次元強度マップに基づいて、観察視野の部分毎に制御された照射強度の活性化光Ｌ２が照射されるので、観察視野内の蛍光物質が相対的に高密度に存在する領域（高密度領域）には相対的に低い強度の活性化光Ｌ２が照射され、蛍光物質が相対的に低密度に存在する領域（低密度領域）には相対的に高い強度の活性化光Ｌ２が照射される。

そうすると、上記の高密度領域では蛍光物質が活性化される確率が相対的に低くなり、低密度領域では活性化される確率が相対的に高くなる。しかしその一方で、高密度領域では蛍光物質の量が多く、低密度領域では蛍光物質の量が少ないため、活性化光Ｌ２により活性化される蛍光物質の量は、高密度領域と低密度領域とでほぼ同等の量になる。

次に、ステップＳ１５に移行すると、活性化照明系１３が活性化光Ｌ２を射出しない状態とされるとともに、励起照明系１１のシャッタ２２が開状態とされ、レーザ光源２１から射出される励起光Ｌ１が全反射ミラー３２を介して顕微鏡本体１５に供給される。これにより、励起光Ｌ１が観察視野全域に照射され、活性化光Ｌ２で活性化されている蛍光物質のみが選択的に発光する。蛍光を発した蛍光物質は不活性状態に移行する。この蛍光物質が発する蛍光を、カメラコントローラ１９を介してカメラ３４を動作させることで撮影し、第２の蛍光画像を取得することができる。撮影された第２の蛍光画像はカメラコントローラ１９から制御部１４に送信される。

ここで図６は、第２の蛍光画像を概略的に示す図である。図６に示す第２の蛍光画像Ｅ２では、撮影された蛍光の輝点を＋印で示し、二次元輝度分布ＥＭにおける領域Ｒ１〜Ｒ４の境界を重ねて図示することで、領域Ｒ１〜Ｒ４のそれぞれにおける輝点の密度を識別可能にしている。図６に示すように、本実施形態で取得される第２の蛍光画像Ｅ２は、領域Ｒ１〜Ｒ３の各領域における輝点（＋印）の密度がほぼ均一化されたものとなる。これは、領域Ｒ１に対する活性化光Ｌ２の照射強度を低くするとともに、領域Ｒ３に対する活性化光Ｌ２の照射強度を高めることで、領域Ｒ１〜Ｒ３において活性化される蛍光物質の量がほぼ同等となるように補正しているからである。

そして、ステップＳ１６において、制御部１４は受信した第２の蛍光画像を記憶部１６に記憶させる。第２の蛍光画像が記憶部１６に保存されたならば、ステップＳ１７において、ＳＴＯＲＭ撮影処理が終了したか否かが判定される。すなわち、予め設定された枚数の第２の蛍光画像の取得が終了したか否かが判定される。第２の蛍光画像の枚数が予定数に達していない場合には、ステップＳ１４に戻り、上述したステップＳ１４〜Ｓ１６が繰り返し実行される。

本実施形態の場合、ステップＳ１５において発光した蛍光物質は、発光するとともに不活性化されるため、ステップＳ１７からステップＳ１４に戻って活性化光Ｌ２の照射が再度行われる場合には、試料Ｓに含まれる蛍光物質は不活性状態である。そのため、ステップＳ１４を再実行する毎に、活性化される蛍光物質は確率的に異なるものとなり、その後のステップＳ１５で取得される第２の蛍光画像は、前のサイクルで取得された第２の蛍光画像と異なる輝点パターンを示すものとなる。
このようにして、ステップＳ１４〜Ｓ１６を繰り返し実行することで、輝点の位置が異なる第２の蛍光画像を数百枚〜数万枚取得する。

なお、このような数百から数万回の第２の蛍光画像の取得が可能となるのは、試料Ｓに付与された蛍光物質が、発光させたときに不活性状態に戻る性質を有していることから、１回の撮影毎の発光時間を短くすることができ、退色までの期間を長くすることができること、及び、活性化光Ｌ２によって活性化する蛍光物質が全体のごく一部であり、１回の撮影で発光させる蛍光物質が比較的少ないことによる。

一方、予定数の第２の蛍光画像の撮影が完了している場合には、ステップＳ１７において終了と判定され、ステップＳ１８に移行する。
ステップＳ１８では、記憶部１６に蓄積された数百〜数万枚の第２の蛍光画像を重ね合わせることで、試料画像を生成する。第２の蛍光画像を重ね合わせる際には、制御部１４において、複数の第２の蛍光画像の間でほぼ同一と見なせる座標に存在する複数の蛍光輝点は、単一の蛍光輝点となるように変換する。

本実施形態では領域毎に活性化光Ｌ２の照射強度を異ならせているため、領域毎に蛍光物質が活性化される確率が異なることとなる。特に蛍光物質の存在密度が比較的低い領域Ｒ３において、活性化光Ｌ２の照射強度を高めていると、領域Ｒ３では同一の蛍光物質が活性化される確率が高くなる。そこで、上記のように同一と見なせる蛍光輝点を間引くことで、照射強度を変化させたことに起因する試料画像の不具合の発生を防止することができる。
なお、同一と見なせる蛍光輝点は、それらの間隔によって判断することができ、例えばＳＴＯＲＭの分解能（約２０ｎｍ）未満の間隔である場合に同一の蛍光輝点と判定するように設定する。

あるいは、上述の蛍光輝点を間引く方法に代えて、生成した試料画像に対して二次元強度マップの情報を付加した情報付加画像を生成する方法を採用してもよい。すなわち、第２の蛍光画像をそのまま重ねることで試料画像を作成し、作成された試料画像に対して、領域Ｒ１〜Ｒ４のそれぞれで異なる色の着色を施してもよい。このようにすると、蛍光物質の存在密度が比較的大きい領域Ｒ１において画像がつぶれてしまうのを防止できるとともに、存在密度が比較的低い領域Ｒ３における画像の鮮明度を向上させることができる。その一方で、あたかも蛍光物質が一様に分布しているような試料画像となるため、照射強度を変化させた領域Ｒ１〜Ｒ４を色分けして表示する等により二次元強度マップの情報を付加することで、蛍光物質の存在密度に基づく情報をユーザーに提供することができる。
なお、活性化光Ｌ２の照射強度に応じた情報としては、上記の色分けの他に、領域Ｒ１〜Ｒ４の境界線を試料画像に重ねて示す方法や、領域Ｒ１〜Ｒ４に対応させて試料画像の背景色を異ならせる方法などを用いてもよい。

以上に説明した本実施形態の観察方法によれば、観察視野において蛍光物質の存在密度に偏りがあったとしても、鮮明な試料画像を得ることができる。以下、かかる作用効果について詳細に説明する。

従来のＳＴＯＲＭ撮影処理では、図４に示した第１の蛍光画像Ｅ１のように蛍光物質の偏りがある場合、領域Ｒ１のような蛍光物質が密集した領域では、画像がつぶれてしまっていた。これは、図７Ｂに示すように、蛍光輝点同士が近接して配置されていると、検出パルスが分離不可能に重なってしまい、２つの蛍光輝点として検出することができなくなるためである。蛍光物質の１分子ごとの蛍光輝点を検出するには、図７Ａ、図７Ｃに示すように、蛍光物質の分子１つが孤立しているか、あるいは蛍光物質の分子同士が適度に離れて配置されている必要がある。

そこで、本実施形態の観察方法では、観察視野における蛍光物質の存在密度に応じて活性化光Ｌ２の照射強度を異ならせることとした。すなわち、蛍光物質が相対的に多く存在する領域には相対的に弱い活性化光Ｌ２を照射し、蛍光物質が相対的に少ない領域には相対的に強い活性化光Ｌ２を照射することとした。これにより、図６に示したように、領域Ｒ１〜Ｒ３の各領域における蛍光輝点（＋印）の密度をほぼ均一化することができるとともに、図７Ｃに示したような、蛍光輝点同士がほどよく離れている状態とすることができる。したがって、図６に基づく蛍光輝点の検出によれば、蛍光物質の１分子に対応する蛍光輝点を識別することが可能である。

なお、図６において、蛍光輝点同士の平均的な間隔は、活性化光Ｌ２の照射強度により調整することができる。活性化光Ｌ２の照射強度を高めれば、より多くの蛍光物質が活性化されることから、蛍光輝点同士の平均的な間隔が狭くなり、逆に照射強度を低くすると間隔が広くなる。
蛍光輝点同士の間隔は、狭すぎると図７Ｃに示したように個々の蛍光輝点を検出することが困難になる。一方、蛍光輝点同士の間隔が広すぎると第２の蛍光画像の１枚当たりの蛍光輝点の数が少なくなるために、第２の蛍光画像の必要枚数が多くなり、測定時間が長くなったり、蛍光物質の退色の問題が生じやすくなったりする。

したがって、蛍光輝点同士の平均的な間隔（蛍光輝点の存在密度）が適切な範囲となるように、活性化光Ｌ２の照射強度を調整することが好ましい。具体的に、第２の蛍光画像における蛍光輝点同士の間隔は、顕微鏡装置１０の光学分解能の２倍以上とすることが好ましく、３倍程度とすることがより好ましい。少なくとも光学分解能の２倍以上の間隔があれば、個々の蛍光輝点を識別することができる。また、光学分解能の３倍程度とすれば、蛍光輝点を比較的高密度に配置することができるので、効率良く観察を行うことができる。

例えば、顕微鏡装置１０の光学分解能が２００ｎｍであるならば、第２の蛍光画像における蛍光輝点同士の平均的な間隔が、６００ｎｍ程度となるように、活性化光Ｌ２の照射強度を調整すればよい。詳しくは、二次元強度マップにおいて、領域ごとの制御値の差又は比率を維持したまま、二次元強度マップ全体の制御値を増加又は減少させればよい。

また、上記の蛍光輝点同士の間隔を調整するために、ステップＳ１５で取得した第２の蛍光画像に基づいて、活性化光Ｌ２の照射強度の再調整を行ってもよい。この場合、制御部１４において、カメラコントローラ１９から取得した第２の蛍光画像を解析し、蛍光輝点同士の平均的な間隔を算出する。そして、算出された間隔が光学分解能の２倍未満である場合には、次に実行されるステップＳ１４において照射する活性化光Ｌ２の照射強度を低く補正する。あるいは、算出された間隔が光学分解能の例えば４倍以上と広すぎる場合には、活性化光Ｌ２の照射強度を高く補正する。

さらに、上記の補正後に第２の蛍光画像から蛍光輝点同士の平均的な間隔を算出し、算出された間隔が適切な範囲を超えている場合には、上記の活性化光Ｌ２の照射強度の補正を再度実施してもよい。またさらに、蛍光輝点同士の平均的な間隔が適切な範囲（少なくとも光学分解能の２倍以上）となるまで、活性化光Ｌ２の照射強度の補正を繰り返してもよい。

また本実施形態において、ステップＳ１４における活性化光Ｌ２の照射を行った後、ステップＳ１５、Ｓ１６による第２の蛍光画像の取得動作を、複数回繰り返して実行してもよい。これにより、活性化させた蛍光物質を有効に利用して第２の蛍光画像を効率良く取得することができる。
なお、発光した蛍光物質は不活性化するため、このように励起光Ｌ１の照射を繰り返すと、観測される蛍光の輝点数が徐々に減少していく。輝点数が少なすぎると第２の蛍光画像を取得する時間が無駄になるため、ステップＳ１５の繰り返し回数は、２〜５回程度である。

上記のように１回の活性化光照射に対して複数回の励起光照射を行う場合には、最初の励起光照射により取得される第２の蛍光画像に基づいて、輝点の平均間隔の調整（活性化光Ｌ２の照射強度の調整）を行う。２回目以降の第２の蛍光画像では輝点の数が減って平均間隔が大きくなるため、個々の輝点を検出しやすくなるからである。

上記のように第２の蛍光画像の情報に基づいて活性化光Ｌ２の照射強度を調整し、次回以降のサイクルで得られる第２の蛍光画像における蛍光輝点同士の間隔を適切な範囲に調整することで、高解像度の画像を効率良く取得することが可能となる。

また本実施の形態において、第１の蛍光画像を、第２の蛍光画像の一部として用いてもよい。第１の蛍光画像も試料の蛍光物質の蛍光輝点を撮影したものであるため、第２の蛍光画像とともに重畳して試料画像の作成に用いることができる。第１の蛍光画像において蛍光輝点が過度に密集した領域が生じないように活性化光Ｌ２の強度を調整しておくと、試料画像の重畳に好適に用いることができる第１の蛍光画像とすることができる。

また本実施形態において、二次元強度マップ作成のための第１の蛍光画像を複数枚取得してもよい。この場合に、第１の蛍光画像を取得する度に活性化光Ｌ２を試料に照射してもよく、活性化光Ｌ２を１回照射した後、第１の蛍光画像の取得動作を複数回実行してもよい。
そして、二次元強度マップを作成する際には、取得した複数の第１の蛍光画像を重畳した画像において二次元輝度分布を算出し、かかる二次元輝度分布に基づいて二次元強度マップを作成する。
二次元強度マップの作成に複数の第１の蛍光画像を用いるようにすることで、個々の第１の蛍光画像における蛍光輝点の数を減らすことができるため、試料画像の一部として用いることができる第１の蛍光画像を得やすくなる。

（第２の実施形態）
図８は、第２実施形態に係る顕微鏡装置を示す概要図である。なお、図８中の第１実施形態と共通の構成要素には同一の符号を付し、それらについての詳細な説明は省略する。

第２実施形態の顕微鏡装置６０は、第１実施形態の活性化照明系１３に代えて、活性化照明系６３を備えた構成である。活性化照明系６３は、水銀ランプ６１と、空間光変調装置６２と、ダイクロイックミラー３３とを備えており、ダイクロイックミラー３３を介して顕微鏡本体１５に接続されている。空間光変調装置６２には、光変調コントローラ６８が接続され、光変調コントローラ６８は制御部１４と接続されている。

空間光変調装置６２は、例えば、ＤＭＤ（デジタルミラーデバイス；登録商標）や液晶パネルである。ＤＭＤは、多数の微小鏡面（マイクロミラー）を平面に配列した構成を備えている。空間光変調装置６２としてＤＭＤを用いた場合には、光変調コントローラ６８から入力される駆動信号に基づいてマイクロミラーの角度を高速にスイッチングし、入射光を反射させる方向を制御することで、個々のマイクロミラーに対応する領域の射出光量を制御することができる。

これにより、活性化照明系６３は、水銀ランプ６１から射出される活性化光Ｌ３を、空間光変調装置６２により変調し、所望の照射強度分布を有する面照明として顕微鏡本体１５に供給することができる。
第２実施形態の顕微鏡装置６０では、活性化光Ｌ２を変調する装置として空間光変調装置６２を用いているので、第１実施形態と同様に観察視野に対して、その領域毎に制御された照射強度の活性化光Ｌ２を照射することができる。したがって、第１実施形態と同様の観察方法を実施することができる。
なお、第２実施形態に係る活性化照明系６３では、第１実施形態の活性化照明系１３のようにレーザ光を走査するスキャナを設ける必要はない。

（第３の実施形態）
以上の実施形態では、活性化用と励起用に波長の異なる２つのレーザを用いる顕微鏡装置について説明してきた。一方、１つの短波長レーザのみを用いる超解像顕微鏡技術として、ｄＳＴＯＲＭ（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）が知られている（例えば、論文：Applied Physics B(2008)93: 725-731, Photoswitching microscopy with standard fluorophores、 S.van de Linde・R.Kasper・ M.Heilemann・ M.Sauer）。ｄＳＴＯＲＭにおいては、従来のＳＴＯＲＭのように活性化用のレーザを照射することなく、蛍光物質の自発的な明滅を元に、少数の蛍光色素のみの画像を取得する。

第３の実施形態の蛍光顕微鏡装置は、このｄＳＴＯＲＭを適用した構成である。
第３の実施形態の顕微鏡装置としては、図１に示した顕微鏡装置１０から活性化照明系１３を省略した構成を採用することができる。かかる構成の顕微鏡装置では、励起照明系１１によって所定波長の励起光を照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料を顕微鏡本体１５のステージ３１上の観察領域に配置し、この観察領域に対して、励起照明系１１から励起光を照射することで蛍光物質を明滅させ、蛍光物質から放射される光をカメラ３４により撮像することで蛍光画像を取得する。

第３実施形態に係る顕微鏡装置において、制御部１４は、カメラコントローラ１９からの信号に基き観察領域の蛍光強度分布を測定し、蛍光強度分布に基づいて観察領域の部分毎の励起光の照射強度を設定する。そして、制御部１４は、観察領域に対して部分毎に設定された照射強度の励起光を照射する動作と、観察領域の励起光で励起された蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から試料画像を生成する。

したがって、第３実施形態に係る観察方法の手順は、図２に示した第１実施形態に係る観察方法と同様に、分布測定ステップＳ１０１と、照射強度設定ステップＳ１０２と、画像形成ステップＳ１０３と、を有する。ただし本実施形態の場合、分布測定ステップＳ１０１において、活性化照明系１３ではなく、励起照明系１１が用いられる。

本実施形態では、分布測定ステップＳ１０１において、励起照明系１１から観察領域に対して一様な強度分布の励起光Ｌ１を照射する。そして、励起光Ｌ１を照射された蛍光物質から射出される蛍光を、カメラコントローラ１９を介してカメラ３４を動作させることで撮影する。撮影された第１の蛍光画像はカメラコントローラ１９から制御部１４に送信される。制御部１４は、第１の蛍光画像における二次元輝度分布（蛍光強度分布）を算出する。

その後、照射強度設定ステップＳ１０２では、第１実施形態と同様に、二次元強度分布から二次元強度マップが作成される。
一方、画像形成ステップＳ１０３では、照射強度設定ステップＳ１０２において作成された二次元強度マップに基づいて、照射強度を変調しながら励起光Ｌ１を試料に照射することで、数百から数万枚の第２の蛍光画像を取得し、第２の蛍光画像から試料画像を生成する。第１実施形態では活性化光Ｌ２の強度を変調していたが、本実施形態の場合には励起光Ｌ１を照射するのみで蛍光物質が発光するので、励起光Ｌ１の強度を変調しながら照射することになる。

以上に説明した第３実施形態によれば、先の実施形態と同様に、蛍光物質の分布に大きな偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる。また励起光の照射により自発的に明滅する蛍光物質を用いるので、照明系を簡素化することができる。

（第４の実施形態）
先の第１の実施形態では、活性化後に励起光を照射すると蛍光を発して不活性化する蛍光物質を用いた顕微鏡技術（ＳＴＯＲＭ）に関して説明したが、蛍光物質の種類が異なる同様の技術として、ＰＡＬＭ（Photoactivated Localization Microscopy）も知られている（例えば、特表２００８−５４２８２６号公報、論文：Proposed method for molecular optical imaging, Optics Letters, vol.20, No.3, (Feb.1, 1995), pp.237-239.）。

先の第１実施形態の観察方法の手順は、試料画像の取得にＰＡＬＭを用いる場合にもそのまま適用され、顕微鏡装置１０、６０の構成変更も不要である。顕微鏡装置１０又は顕微鏡装置６０において、制御部１４は、カメラコントローラ１９からの信号に基づき観察領域の蛍光強度分布を測定し、蛍光強度分布に基づいて観察領域の部分毎の励起光の照射強度を設定する。そして、制御部１４は、観察領域に対して部分毎に設定された照射強度の活性化光を照射する動作と、励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に複数回繰り返すことで複数の蛍光画像を取得し、複数の蛍光画像から試料画像を生成する。

ＰＡＬＭを用いる場合には、試料に付与される蛍光物質が変更される。具体的には、蛍光物質として、所定波長の活性化光を照射されると活性化し、活性化状態で活性化光とは異なる波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質が用いられる。

このような蛍光物質としては、クラゲやサンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種が挙げられる。例えば、クラゲ由来の蛍光タンパク質の変異種であるPA-GFPは、活性化光の照射により蛍光強度が大幅に上昇し、PS-CFPは、活性化光の照射により他の色の蛍光を発光可能に変化する。また、サンゴ由来の蛍光タンパク質の変異種であるDronpaは、活性化光の照射により励起波長の光の照射による発光が可能になり、Kaedeは、活性化光の照射により蛍光色が変化する。

本実施形態の観察方法においても、図２に示した分布測定ステップＳ１０１と、照射強度設定ステップＳ１０２と、画像形成ステップＳ１０３を順次実行することにより、高解像の試料画像を得ることができる。

分布測定ステップＳ１０１のステップＳ１１では、活性化照明系１３から均一強度の活性化光Ｌ２が試料に照射された後、励起光Ｌ１が試料に照射され、発光光の観測により第１の蛍光画像が取得される。本実施形態の場合も、例えば図４に示した第１の蛍光画像Ｅ１が取得される。

なお、活性化光を照射しない状態でも励起光の照射により発光する蛍光タンパク質（PS-CFP、Kaede）を用いている場合には、変化前の蛍光（PS-CFPの青色光、Kaedeの緑色光）を観測すればよいため、分布測定ステップＳ１０１における活性化光の照射は不要である。
また、不活性化が可能な蛍光物質を用いている場合には、分布測定ステップＳ１０１の実行後に、蛍光物質を不活性化させ、蛍光物質の退色の進行を抑えるようにしてもよい。例えば、キンドリング蛍光タンパク質を用いる場合には、分布測定ステップＳ１０１において照射する活性化光の照射強度を、蛍光物質に自発的な不活性化が生じる照射強度とすればよい。またDronpaのように励起光の連続照射により不活性状態に戻る蛍光タンパク質を用いてもよい。

次に、ステップＳ１２において、第１の蛍光画像における二次元強度分布が算出される。当該ステップにおける具体的な処理は、第１の実施形態と同様であり、これにより図５に示した二次元輝度分布ＥＭが取得される。

次に、照射強度設定ステップＳ１０２において、二次元輝度分布ＥＭに基づく活性化光Ｌ２の照射強度の二次元マップが作成される。当該ステップにおける具体的な処理は第１の実施形態と同様であり、作成された二次元強度マップは記憶部１６に保存される。

次に、画像形成ステップＳ１０３のステップＳ１４では、上記で作成した二次元強度マップを用いて変調された活性化光Ｌ２が試料に照射される。すなわち、二次元強度マップに基づいて、蛍光物質が高密度に存在する領域には相対的に低い強度の活性化光Ｌ２が照射される一方、蛍光物質が低密度に存在する領域には相対的に高い強度の活性化光Ｌ２が照射される。これにより、活性化される蛍光物質の密度が視野全体で平均化される。

次に、ステップＳ１５において、試料に励起光Ｌ１が照射される。これにより、活性化状態の蛍光物質が発光し、その発光光がカメラ３４によって撮影され、第２の蛍光画像が取得される。本実施形態の場合も、第１実施形態と同様に、図６に示す第２の蛍光画像Ｅ２のように、蛍光の輝点がほぼ均一な密度で存在する第２の蛍光画像が得られる。取得された第２の蛍光画像は、ステップＳ１６において記憶部１６に保存される。
なお、本実施形態の場合、ステップＳ１５、Ｓ１６における第２の蛍光画像の取得動作は、ステップＳ１４で活性化させた蛍光物質が退色してしまうか、不活性状態に戻るまで繰り返し実行される。

次に、ステップＳ１７において、撮影の終了が判断され、撮影が完了していない場合には、ステップＳ１４に戻り、再び試料に対する活性化光Ｌ２の照射動作が実行される。この活性化光Ｌ２の照射により、退色していない蛍光物質が活性化される。その後、ステップＳ１５、Ｓ１６の第２の蛍光画像の取得、保存動作が実行される。

ステップＳ１４からステップＳ１６が予め設定された回数繰り返し実行されると、ステップＳ１７において撮影が終了していると判定され、ステップＳ１８に移行する。そして、ステップＳ１８の画像処理動作が実行されることにより、多数の第２の蛍光画像から高解像の試料画像が作成される。

以上に説明した第４実施形態によれば、先の実施形態と同様に、蛍光物質の分布に大きな偏りがある場合でも高解像度の画像を得ることができる。

（第５の実施形態）
図９〜図１１は、第５の実施形態に係る観察方法の説明図である。図９は先の実施形態に用いられた観察方法（第１態様）を示した図である。図１０は、観察方法の第２態様を示す図である。図１１は、観察方法の第３態様を示す図である。第２態様の観察方法は、上述した第１、第２、第４実施形態に適用することができ、第３態様の観察方法は、先の第１〜第４実施形態のいずれにも適用することができる。

なお、図９〜図１１では、図２に示した各ステップのうち、説明に必要なステップのみを表示して説明する。具体的には、二次元輝度分布を計算するステップＳ１２や二次元強度マップを作成するステップＳ１３、第２の蛍光画像を保存するステップＳ１６等についての図示を省略している。

上記した第１、第２、第４実施形態の顕微鏡装置における第１態様の観察方法では、図９に示すように、蛍光物質の分布を測定するために第１の蛍光画像を取得するステップＳ１１において、まず、試料に活性化光Ｌ２を照射し、試料に含まれる蛍光物質を活性化させるステップＳ１が実行される。その後、試料に励起光Ｌ１を照射し、試料から発せられる蛍光を検出して第１の蛍光画像を取得するステップＳ２が実行される。

また、ＳＴＯＲＭ（ＰＡＬＭ）撮影処理においては、二次元強度マップに基づき照射強度を制御された活性化光Ｌ２を試料に照射し、蛍光物質を活性化するステップＳ１４と、励起光Ｌ１を照射して蛍光物質を発光させ、第２の蛍光画像を取得するステップＳ１５とが、この順に、所定枚数の第２の蛍光画像を取得するまで繰り返し実行される。

上記に対して、図１０に示す第２態様では、蛍光物質の分布を測定するために第１の蛍光画像を取得するステップＳ１１において、試料に活性化光Ｌ２を照射するステップＳ１と、試料に励起光Ｌ１を照射して第１の蛍光画像を取得するステップＳ２とを同時に実行される。このとき、ステップＳ１とステップＳ２の開始タイミング及び終了タイミングは一致している必要はなく、少なくとも同時に実行される期間を有していればよい。
上記のようにステップＳ１、Ｓ２が同時に実行されることで、蛍光物質の活性化と励起をほぼ同時に進行させ蛍光物質を発光させることができる。したがって、第２態様の観察方法でも第１態様と同様の第１の蛍光画像を取得することができ、蛍光強度分布を得ることができる。

また図１０に示す第２態様では、ＳＴＯＲＭ（ＰＡＬＭ）撮影処理においても、試料に活性化光Ｌ２を照射するステップＳ１４と、試料に励起光Ｌ１を照射して第２の蛍光画像を取得するステップＳ１５とが同時に実行される。このときも、ステップＳ１４とステップＳ１５の開始タイミング及び終了タイミングは一致している必要はなく、少なくとも同時に実行される期間を有していればよい。
ステップＳ１４、Ｓ１５が同時に実行されることで、蛍光物質の活性化、励起をほぼ同時に進行させ蛍光物質を発光させることができるので、第１態様と同様の第２の蛍光画像を取得することができる。

なお、１回の活性化光照射に対して、複数回の励起光照射及び画像取得が行われる場合には、試料に対して活性化光Ｌ２を照射している期間に、少なくとも１回の励起光Ｌ１の照射を行えばよい。例えば励起光Ｌ１の照射を３回行う場合に、最初の励起光Ｌ１の照射期間を活性化光Ｌ２との同時照射期間とすればよく、活性化光Ｌ２の照射期間中に２回の励起光Ｌ１の照射を行ってもよい。

上記の第２態様の観察方法によれば、蛍光物質の活性化と励起とが同時に実行される。これにより、先の第１態様と比較して画像取得に要する時間を短縮することができ、効率良く超解像画像の測定及び作成を行うことができる。

次に、先の第１〜第４実施形態では、図２に示したように、蛍光物質の分布を得るための分布測定ステップＳ１０１と、活性化光Ｌ２の照射強度を制御するための二次元強度マップの作成を各々１回のみ実行することとしていた。

これに対して、図１１に示す第３態様の観察方法では、最初に第１の蛍光画像を取得するステップＳ１１（ステップＳ１、Ｓ２）が実行され、その後に、第１の蛍光画像に基づいて作成した二次元強度マップに基づき変調した活性化光Ｌ２を照射するステップＳ１４と、励起光Ｌ１を照射して第２の蛍光画像を取得するステップＳ１５とが複数回（図示では４回）実行される。
そして、所定枚数の第２の蛍光画像を取得した後に、再び第１の蛍光画像を取得するステップＳ１１（ステップＳ１、Ｓ２）が実行され、かかる第１の蛍光画像に基づく計算によって二次元強度マップが更新される。
その後は、更新された二次元強度マップに基づき変調した活性化光Ｌ２を照射するステップＳ１４と、励起光Ｌ１を照射して第２の蛍光画像を取得するステップＳ１５とが、所定回数実行される。また必要に応じて、二次元強度マップを更新する動作が実行される。

第３態様において、二次元強度マップの更新動作の間隔は任意に設定することができる。二次元強度マップの更新動作は、所定枚数の第２の蛍光画像を取得する期間に少なくとも１回設定されていればよく、所定枚数（例えば１００枚、５００枚、１０００枚等）の第２の蛍光画像を取得する毎に実行されるように設定されていてもよい。

図１１に示す第３態様では、数百枚から数万枚の第２の蛍光画像の取得動作中に二次元強度マップが更新されるので、ＳＴＯＲＭ（ＰＡＬＭ）撮影処理の進行に伴う蛍光物質の退色状況に対応した二次元強度マップを用いて活性化光Ｌ２が変調される。これにより、適切な数の蛍光輝点を含む第２の蛍光画像を効率良く取得することが可能な観察方法となる。

（第６の実施形態）
上記各実施形態の顕微鏡装置によれば、固定標本観察だけでなく、例えば図１２に示すようなライブセル観察を行うこともできる。以下、第１実施形態の顕微鏡装置を用いてライブセル観察を行う場合について説明する。なお、第２〜第４実施形態の顕微鏡装置を用いてライブセル観察を行う場合も全く同様である。

図１２には、細胞核１００と、細胞核１００の表面から延びる多数の微小管１０１からなる微小管ネットワークの概略が示されている。図中の点線は、細胞核１００の表面を示しており、かかる表面から外側に向かって多数の微小管１０１が延びている。

細胞核１００の表面近傍では、微小管１０１が非常に密集しているため、この密集領域では微小管１０１に付着した蛍光物質の密度が相対的に高くなる。また、細胞核１００表面には微小管１０１を生成する組織が多数存在するため、かかる組織に蛍光物質が付着すると、蛍光物質の密度がさらに高くなる。一方、細胞核１００から離れた位置では、微小管１０１が疎らになるため、細胞核１００の表面近傍と比較すると蛍光物質の密度は著しく低くなる。

第１実施形態に係る顕微鏡装置１０によりライブセル観察を行う場合にも、図２に示した分布測定ステップＳ１０１と、照射強度設定ステップＳ１０２と、画像形成ステップＳ１０３が順次実行される。これにより、高解像のライブセル画像が得られる。

分布測定ステップＳ１０１及び照射強度設定ステップＳ１０２の動作は、第１実施形態と同様である。すなわち、分布測定ステップＳ１０１では、均一強度の活性化光Ｌ２を試料に照射する動作の後、励起光Ｌ１を試料に照射して第１の蛍光画像を取得する動作が実行され、かかる第１の蛍光画像における二次元強度分布が算出される。
照射強度設定ステップＳ１０２では、二次元輝度分布に基づく活性化光Ｌ２の照射強度の二次元強度マップが作成される。作成された二次元強度マップは記憶部１６に保存される。

図１２に示すライブセルを観察する場合の二次元強度マップでは、細胞核１００の表面近傍の微小管１０１が密集した領域に対して活性化光Ｌ２の照射強度が相対的に低く設定され、細胞核１００から離れた微小管１０１が疎らに存在する領域に対して活性化光Ｌ２の照射強度が相対的に高く設定される。

次に、画像形成ステップＳ１０３のステップＳ１４では、上記で作成した二次元強度マップを用いて試料に活性化光Ｌ２が照射される。すなわち、上記の二次元強度マップに基づいて、蛍光物質が高密度に存在する領域に相対的に低い強度の活性化光Ｌ２が照射される一方、蛍光物質が低密度に存在する領域には相対的に高い強度の活性化光Ｌ２が照射される。これにより、活性化される蛍光物質の密度が視野全体で平均化される。

次に、ステップＳ１５において、試料に励起光Ｌ１が照射され、活性化状態の蛍光物質から発せられた蛍光をカメラ３４で撮影することにより第２の蛍光画像が取得される。本実施形態の場合も、第１実施形態と同様に、図６に示す第２の蛍光画像Ｅ２のように、蛍光の輝点がほぼ均一な密度で存在する第２の蛍光画像が得られる。取得された第２の蛍光画像は、ステップＳ１６において記憶部１６に保存される。

次に、ステップＳ１７において、撮影の終了が判断され、撮影が完了していない場合には、ステップＳ１４に戻り、再び試料に対する活性化光Ｌ２の照射動作が成される。この活性化光Ｌ２の照射により、退色していない蛍光物質が活性化される。その後、ステップＳ１５、Ｓ１６の第２の蛍光画像の取得、保存動作が実行される。

ライブセル観察を行う場合、ステップＳ１４〜Ｓ１７による第２の蛍光画像の撮影速度が比較的速く設定され、例えば、１秒当たり５００枚程度の第２の蛍光画像が取得される。数分間の測定時間全体では、数万枚〜二十万枚程度の第２の蛍光画像が取得される。
ステップＳ１４からステップＳ１６が予め設定された回数繰り返し実行されると、ステップＳ１７において撮影が終了していると判定され、ステップＳ１８に移行する。

ステップＳ１８では、取得した第２の蛍光画像から試料画像が作成されるが、ライブセル観察の場合、微小管１０１等の動きを経時的に表示するための時系列画像が作成される。具体的には、測定時刻順に配列された第２の蛍光画像が時系列に沿って所定の時間間隔又は所定の枚数毎に区画され、区画ごとに第２の蛍光画像を重畳した時系列画像が生成される。例えば、第２の蛍光画像を、時系列に沿って２５０枚ずつ区画し、これら２５０枚の第２の蛍光画像を重畳して１枚の時系列画像を作成する動作が実行される。これにより、例えば１秒当たり５００枚、３分間の測定を行った場合には、９万枚の第２の蛍光画像から３６０枚の時系列画像が作成される。

作成された時系列画像は、顕微鏡装置に接続されたモニタ（表示装置）に連続的に表示される。これにより、超解像画像の動画により微小管１０１等の動きが表現される。時系列画像の表示方法は任意の方法を採用することができる。例えば、時間の経過に伴って画像を構成するドットの色を青系から赤系等に変化させながら表示する方法などを採用することができる。

本実施形態のようにライブセル観察を行う場合に、二次元強度マップに基づいて活性化光Ｌ２を変調しながら第２の蛍光画像を取得することで、鮮明な時系列画像を得ることができる。
具体的には、図１２に示す細胞核１００の表面近傍と、細胞核１００から離れた位置とでは微小管１０１の密集度に大きな差があるため、例えば微小管１０１が密集した領域に合わせた照射強度で均一に活性化光Ｌ２を照射すると、微小管１０１の先端側の領域では、蛍光輝点がほとんど観測されなくなり、微小管１０１の動きが全く見えなくなる。一方、微小管１０１の先端側の蛍光物質の密度に合わせた照射強度で均一に活性化光Ｌ２を照射すると、細胞核１００の表面近傍の蛍光輝点が多すぎるために画像が潰れて見えなくなる。よってこの観察方法では、視野内の特定部分でしか最適な解析ができない。

これに対して本実施形態では、蛍光物質の密度が異なる領域に対してそれぞれ最適な照射強度の活性化光Ｌ２を照射するので、細胞核１００の表面近傍から微小管１０１の先端部分にわたって鮮明な画像を得ることができ、広範囲の微小管１０１の経時的な動きを観察することができる。

なお、ライブセル観察を行う場合には、観察中に細胞が移動するため、先の第５実施形態において説明した第３態様の観察方法を採用し、二次元強度マップを随時更新しながら第２の蛍光画像を取得するとよい。例えば、１枚の時系列画像を作成するために必要な第２の蛍光画像を取得する毎に、二次元強度マップの更新を行うとよい。これにより、細胞が移動による蛍光物質の分布の変化に対応した二次元強度マップに基づいて活性化光Ｌ２を変調することができ、蛍光輝点の分布が平均化された第２の蛍光画像を取得することができる。

（第７の実施形態）
上記第１から第６の実施形態では、ステップＳ１４において、二次元強度マップに基づき変調した活性化光Ｌ２（ＳＴＯＲＭ／ＰＡＬＭ）又は励起光Ｌ１（ｄＳＴＯＭ）を試料に照射することとしたが、活性化光Ｌ２又は励起光Ｌ１の照射強度を視野内で一定とすることもできる。

具体的には、分布測定ステップＳ１０１のステップＳ１１において、第１の蛍光画像が取得され、続くステップＳ１２において第１の蛍光画像における二次元強度分布が算出される。
そして、照射強度設定ステップＳ１０２において、二次元強度分布における放射強度の最大値に基づいて、活性化光Ｌ２の照射強度が設定される。すなわち、放射強度が最大である領域において適切な蛍光輝点間隔（光学分解能の３倍以上）が得られるように、活性化光Ｌ２の照射強度が設定される。

次に、画像形成ステップＳ１０３では、照射強度設定ステップＳ１０２において設定された照射強度で活性化光Ｌ２を試料に照射するステップＳ１４と、試料に励起光Ｌ１を照射することにより第２の蛍光画像を取得するステップＳ１５とが所定回数繰り返し実行され、数百から数万枚の第２の蛍光画像が取得される。その後、ステップＳ１８において、第２の蛍光画像から試料画像が生成される。

本実施形態では、画像形成ステップＳ１０３において試料に照射する活性化光Ｌ２の照射強度を、分布測定ステップＳ１０１で観測した放射強度の最大値に基づいて設定するので、第２の蛍光画像において蛍光輝点の間隔が狭くなりすぎて画像が潰れてしまうのを防ぐことができる。
また活性化光Ｌ２の照射強度を視野内で異ならせるための空間光変調装置６２等が不要であるため、顕微鏡を安価に構成することができる。

１０，６０ 顕微鏡装置、１１ 励起照明系、１３ 活性化照明系、１４ 制御部、１５ 顕微鏡本体、１６ 記憶部、１７ 表示部、１８ ＡＯＴＦコントローラ、１９ カメラコントローラ、２１，４１ レーザ光源、２２ シャッタ、３１ ステージ、３２ 全反射ミラー、３３ ダイクロイックミラー、３４ カメラ、４２ ＡＯＴＦ、４３ スキャナ、６１ 水銀ランプ、６２ 空間光変調装置、６８ 光変調コントローラ、Ｌ１ 励起光、Ｌ２，Ｌ３ 活性化光、Ｓ１０１ 分布測定ステップ、Ｓ１０２ 照射強度設定ステップ、Ｓ１０３ 画像形成ステップ

Claims (24)

1. 所定波長の活性化光が照射されると活性化して、活性化状態で所定波長の励起光が照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料における観察領域の前記蛍光物質の存在密度分布に応じて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、
   前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、
   を有する、顕微鏡装置。
2. 所定波長の励起光が照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料における観察領域の前記蛍光物質の存在密度分布に応じて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定装置と、
   前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成装置と、
   を有する、顕微鏡装置。
3. 前記活性化光を照射する動作、又は前記励起光を照射する動作は、前記照射強度を変調しながら照射することを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記活性化光を照射する動作、又は前記励起光を照射する動作は、前記観察領域の部分領域毎に制御された前記照射強度で面照明を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
5. 前記画像形成装置は、前記観察領域に前記活性化光を照射する動作と、活性化光を照射された後の前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを交互に繰り返すことにより複数の前記蛍光画像を取得する、請求項１に記載の顕微鏡装置。
6. 前記画像形成装置は、前記観察領域に対して前記活性化光を照射する動作と前記励起光を照射する動作とを少なくとも一部の期間において同時に実行する、請求項１に記載の顕微鏡装置。
7. 前記試料に照射される前記活性化光又は前記励起光の照射強度は、前記蛍光物質の存在密度が相対的に高い領域において相対的に低い強度に設定され、前記蛍光物質の存在密度が相対的に低い領域において相対的に高い強度に設定される、請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
8. 前記蛍光物質の存在密度は、予め取得した、前記観察領域の蛍光強度分布から特定されることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
9. 前記観察領域の蛍光強度分布を、前記観察領域に前記励起光を照射して前記蛍光画像を取得することにより測定する分布測定装置を備えることを特徴とする請求項８記載の顕微鏡装置。
10. 前記試料に照射される前記活性化光又は前記励起光の照射強度は、前記蛍光強度分布において前記蛍光強度が相対的に高い領域において相対的に低い強度に設定され、前記蛍光強度が相対的に低い領域において相対的に高い強度に設定される、請求項８又は９に記載の顕微鏡装置。
11. 前記照射強度設定装置は、前記蛍光強度分布を所定の蛍光強度の範囲毎に複数の水準に分類し、各々の前記水準毎に前記照射強度を設定する、請求項１０に記載の顕微鏡装置。
12. 前記照射強度設定装置は、前記蛍光強度分布を階調反転させた分布に基づいて前記照射強度を設定する、請求項１０に記載の顕微鏡装置。
13. 前記照射強度設定装置は、前記画像形成装置により取得された前記蛍光画像における蛍光輝点の密度に基づいて、前記活性化光の照射強度を再設定する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
14. 前記照射強度設定装置は、前記画像形成装置により取得された前記蛍光画像における蛍光輝点の平均間隔が、当該顕微鏡装置の光学分解能の２倍以上となるまで、前記活性化光の照射強度の設定を繰り返す、請求項１３に記載の顕微鏡装置。
15. 前記照射強度設定装置は、前記蛍光物質の存在密度が相対的に高い領域に合わせて前記活性化光又は前記励起光の照射強度を設定し、
    前記画像形成装置は、設定された前記照射強度の前記活性化光又は前記励起光を前記観察領域に対して照射する、請求項１から６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
16. 前記蛍光物質の存在密度は、予め取得した、前記観察領域の蛍光強度分布から特定されることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡装置。
17. 前記観察領域の蛍光強度分布を、前記観察領域に前記励起光を照射して前記蛍光画像を取得することにより測定する分布測定装置を備えることを特徴とする請求項１６記載の顕微鏡装置。
18. 前記試料に照射される前記活性化光又は前記励起光の照射強度は、前記蛍光強度分布において前記蛍光強度が相対的に高い領域に合わせて前記活性化光又は前記励起光の照射強度を設定される、請求項１６又は１７に記載の顕微鏡装置。
19. 前記画像形成装置は、生成した前記試料画像に対して前記活性化光又は前記励起光の照射強度分布の情報を付加した情報付加画像を生成する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
20. 前記画像形成装置は、複数の前記蛍光画像を重畳させて前記試料画像を生成する際に、複数の前記蛍光画像間で同一とみなせる座標に存在する複数の蛍光輝点を単一の蛍光輝点とする、請求項１から１５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
21. 前記画像形成装置は、複数の前記蛍光画像を時系列に沿って所定の時間間隔又は所定の枚数毎に区画し、各区画に属する複数の前記蛍光画像を重畳することにより複数の時系列画像を生成する、請求項１から１５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
22. 前記画像形成装置は、全反射蛍光観察によって前記蛍光画像を取得する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
23. 所定波長の活性化光が照射されると活性化し、活性化状態で所定波長の励起光を照射されると蛍光を発する蛍光物質を含む試料における観察領域の前記蛍光物質の存在密度分布に応じて前記観察領域に照射する前記活性化光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、
    前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記活性化光を照射する動作と、前記観察領域に前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作とを含む動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、
    を有する、観察方法。
24. 所定波長の励起光が照射されると自発的に明滅する蛍光物質を含む試料における観察領域の前記蛍光物質の存在密度分布に応じて前記観察領域に照射する前記励起光の照射強度を設定する照射強度設定ステップと、
    前記観察領域に対して、設定された前記照射強度の前記励起光を照射して蛍光画像を取得する動作を複数回繰り返すことで複数の前記蛍光画像を取得し、複数の前記蛍光画像から試料画像を生成する画像形成ステップと、
    を有する、観察方法。

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