JP2009115891A - 走査型顕微鏡および標本画像取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】データ取得を行う標本の点が３次元的に分布している場合に、点相互の影響を排除して個々の点の輝度を正しく検出する。
【解決手段】光源手段２，３と、標本Ａ上にレーザ光を集光させる照射手段１０と、レーザ光の集光位置を２次元的に走査する走査手段９と、集光位置を光軸方向に移動させる集光位置移動手段１１と、標本Ａの所定の３次元領域に複数のレーザ照射点を設定する設定手段１８〜２０と、設定された複数のレーザ照射点に対して、照射順序に従ってレーザ光が順次集光されるよう走査手段９および集光位置移動手段１１を制御する制御手段１と、レーザ照射により生じる標本Ａからの光および標本の状態変化の少なくとも一方を計測する計測手段１２と、計測された光の強度情報および標本の状態変化情報を記憶する記憶手段１７と、各情報に基づいて画像を形成する画像形成手段１５とを備える走査型顕微鏡。
【選択図】図１

Description

本発明は、生物標本の研究ツールとして用いられる走査型顕微鏡および標本画像取得方法に関する。

従来、生物標本の研究ツールとして用いられる走査型顕微鏡として、データ取得を行う標本の点相互の影響を排除して個々の点の輝度を正しく検出する走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２００６−２２７６００号公報

しかしながら、特許文献１に開示されている走査型顕微鏡においては、観察したい部位が３次元的に分布している場合について開示がなく、どのように制御すべきかについて明確ではなかった。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ照射を行う標本内の点が３次元的に分布している場合に、点相互の影響を排除して個々の点へのレーザ照射により生じる標本の反応を正しく検出する走査型顕微鏡および標本画像取得方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を射出する光源手段と、標本上のレーザ照射点に前記レーザ光を集光させる照射手段と、該照射手段によるレーザ光の集光位置を光軸に交差する方向に２次元的に走査する走査手段と、前記照射手段によるレーザ光の集光位置を光軸方向に移動させる集光位置移動手段と、前記標本の所定の３次元領域に複数の前記レーザ照射点を設定する設定手段と、該設定手段により設定された複数のレーザ照射点に対して、３次元空間的に隣り合うレーザ照射点が連続しない照射順序に従って前記レーザ光が順次集光されるよう前記走査手段および前記集光位置移動手段を制御する制御手段と、前記各レーザ照射点へのレーザ照射により生じる前記標本からの光および標本の状態変化の少なくとも一方を、前記各レーザ照射点へのレーザ照射ごとに計測する計測手段と、該計測手段により計測された前記光の強度情報および標本の状態変化情報を前記レーザ照射点の位置情報に対応付けして記憶する記憶手段と、前記各情報に基づいて画像を形成する画像形成手段とを備える走査型顕微鏡を提供する。

また、本発明は、標本上のレーザ照射点にレーザ光を集光させ、前記レーザ照射点が隣り合わない順序に従って、光軸に交差する２次元方向および光軸方向に前記レーザ光の集光位置を移動させて各レーザ照射点にレーザ光を順次照射し、前記各レーザ照射点へのレーザ照射により生じる前記標本からの光および標本の状態変化の少なくとも一方を、前記各レーザ照射点へのレーザ照射ごとに計測して前記レーザ照射点の位置情報に対応付けして記憶し、前記各情報に基づいて画像を形成する標本画像取得方法を提供する。

本発明によれば、レーザ照射を行う標本内の点が３次元的に分布している場合に、点相互の影響を排除して個々の点へのレーザ照射により生じる標本の反応を正しく検出することができるという効果を奏する。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
＜第１の実施形態＞
図１は、本発明の第１の実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡）の概略構成を示している。
図１に示されるように、共焦点レーザ顕微鏡は、レーザ光を射出するための光源手段としてのレーザ光源ユニット１と、レーザ光の光路を曲げる反射ミラー７と、レーザ光を２次元走査するための走査手段としての走査光学ユニット９と、レーザ光を標本Ａ上のレーザ照射点に収束させる対物レンズ１０と、レーザ光と蛍光とを分離するダイクロイックミラー８と、蛍光（検出光）を検出するための計測手段としての検出器１２とを有している。

レーザ光源ユニット１は、レーザ光源２，３と、反射ミラー４と、ダイクロイックミラー５と、音響光学可変フィルタ（ＡＯＴＦ）６とを含んでいる。レーザ光源２，３は、波長の異なるレーザ光を発するようになっている。反射ミラー４は、レーザ光源２からのレーザ光の光路上に配置されている。ダイクロイックミラー５は、レーザ光源３からのレーザ光の光路上で、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上に配置されている。

ダイクロイックミラー５は、レーザ光源３からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射することにより、これら２つのレーザ光の光路を合成するようになっている。ＡＯＴＦ６は、ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上に配置されている。ＡＯＴＦ６は、レーザ光の強度、レーザ光の波長成分、レーザ光照射のオンオフなどの制御を可能にしている。

反射ミラー７はＡＯＴＦ６の射出光路上に配置されている。ダイクロイックミラー８は反射ミラー７の反射光路上に配置されている。ダイクロイックミラー８は、反射ミラー７で反射されるレーザ光を透過し、後述する標本Ａから発せられる蛍光を反射するようになっている。

走査光学ユニット９は、ダイクロイックミラー８の透過光路上に配置されている。走査光学ユニット９は、直交する２方向に光を偏向するためのＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを有し、これらのＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂにより標本Ａ上に収束されるレーザ光を光軸に直交する２次元平面の任意の点に照射可能にしている。

対物レンズ１０は走査光学ユニット９から射出されるレーザ光の光路上に配置されている。走査光学ユニット９から射出されたレーザ光は、対物レンズ１０によって標本Ａ上のレーザ照射点に集光されるようになっている。言い換えれば、対物レンズ１０は、レーザ光を標本Ａ上のレーザ照射点に集光する照射手段としての光学系を構成している。

また、対物レンズ１０には、該対物レンズ１０によるレーザ光の集光位置を光軸方向に移動させる対物駆動機構１１が取り付けられている。対物駆動機構１１の作動により、対物レンズ１０を光軸方向に移動させ、走査光学ユニット９によるレーザ照射点の移動平面を光軸方向に移動させることができるようになっている。

標本Ａは、レーザ光の照射により、内部に含まれている蛍光物質が励起され、蛍光を発するようになっている。標本Ａから発せられた蛍光は、上述した光路を逆行し、対物レンズ１０と走査光学ユニット９を経てダイクロイックミラー８まで戻るようになっている。

検出器１２は、ダイクロイックミラー８によって選択的に反射される蛍光の光路上に配置されている。検出器１２は、これに限らないが、例えば、フォトマルチプライヤである。検出器１２は、標本Ａからの蛍光の輝度を反映したアナログ電気信号を出力するようになっている。

共焦点レーザ顕微鏡は、さらに、信号処理手段としてのＡ／Ｄ変換器１３、制御手段としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１４、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動するための駆動手段としてのスキャナ駆動部２１と、情報入力手段としての入力装置２２、表示手段としてのモニタ２３とを有している。

入力装置２２は、これに限らないが、例えば、キーボードである。あるいは、入力装置２２は、マウスなどのポインティングデバイスとＧＵＩ（グラフィカルユーザーインターフェース）とで構成されていてもよい。モニタ２３は、これに限らないが、例えば、ＣＲＴである。

パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１４はＡ／Ｄ変換器１３を介して検出器１２に接続されている。Ａ／Ｄ変換器１３は、検出器１２からのアナログの電気信号をデジタル信号に変換してＰＣ１４に出力するようになっている。

ＰＣ１４は、制御プログラム部１５、レーザ出力制御部１６、フレームメモリ１７、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８、Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ１９、Ｚ方向駆動波形メモリ２０およびクロック生成部２４を有している。

フレームメモリ１７は、検出器１２で検出されＡ／Ｄ変換器１３を介してデジタル信号に変換された輝度データを画像化領域内の各ポイント座標（レーザ照射点の位置情報）に対応付けして記憶するようになっている。フレームメモリ１７は、蛍光の輝度情報をレーザ照射点の位置情報に対応付けして記憶する記憶手段を構成している。

制御プログラム部１５は、図２に示すように、走査条件入力部１５１、走査ポイント配列生成部１５２および画像生成部１５３を有している。走査条件入力部１５１は、入力装置２２から、ＸＹスキャンサイズ、Ｚ方向総移動距離、Ｚ方向移動ステップ移動量、サンプリングスピード、画像化領域内の１ポイント当たりのデータ取得時間などの走査条件が入力される。

走査ポイント配列生成部１５２は、３次元的な画像化領域内の隣り合う２点を連続してデータ取得しないランダムな走査ポイント配列を作成するようになっている。このランダムな走査ポイント配列の作成には、例えば、乱数を用いるようになっている。そして、生成された配列の中に隣り合うポイントがないかをチェックし、隣り合うポイントがあった場合には他のポイントと入れ替えるなどの処理を行うようになっている。

画像生成部１５３は、フレームメモリ１７に書き込まれる輝度データと画像化領域内の各ポイント座標（レーザ照射点の位置情報）の対応付けに基づいて画像データを生成する。画像生成部１５３は、蛍光の輝度情報とレーザ照射点の位置情報の対応付けに基づいて画像を形成する画像形成手段を構成している。

レーザ出力制御部１６は、走査条件入力部１５１に設定される１ポイント当たりのデータ取得時間に応じてレーザ光源ユニット１のレーザ光の出力を制御するようになっている。
Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８、Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ１９およびＺ方向駆動波形メモリ２０は、走査ポイント配列生成部１５２で生成されたランダムな走査ポイント配列から変換されるＸ方向スキャナ９ｂおよびＹ方向スキャナ９ａを走査し、かつ、対物レンズ１０の光軸方向するための駆動波形データ（スキャナ駆動部２１および対物駆動機構１１のＤ／Ａコンバータに与える波形ＤＡＣデータ）を記憶する。

スキャナ駆動部２１は、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９に接続されている。スキャナ駆動部２１は、クロック生成部２４のクロックパルスに同期して読み出されるＸ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９からの波形データ（波形ＤＡＣデータ）に従って、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動するようになっている。

また、対物駆動機構１１は、Ｚ方向駆動波形メモリ２０に接続されており、クロック生成部２４のクロックパルスに同期して読み出されるＺ方向駆動波形メモリ２０からの波形データに従って対物レンズ１０を光軸方向に移動させるようになっている。
クロック生成部２４は、制御プログラム部１５、レーザ出力制御部１６、フレームメモリ１７、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８、Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ１９およびＺ方向駆動波形メモリ２０の動作タイミングを決定するクロックパルスを生成する。

次に、本実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡の作用を説明する。
まず、入力装置２２から、ＰＣ１４の走査条件入力部１５１に対して走査条件が入力される。入力される走査条件は、光軸に直交する２次元方向の画像化領域（例えば、５１２×５１２ポイント）を決定するためのＸＹスキャンサイズ、光軸に沿う方向の画像化領域を決定するためのＺスキャンサイズ（例えば、５１２ポイント）、Ｚ方向の１ステップ当たり移動量（すなわち、Ｚ方向のデータ取得間隔）、Ａ／Ｄ変換器１３における検出信号のサンプリング間隔を決めるサンプリングスピード、画像化領域内の１ポイント当たりのデータ取得時間などである。

すると、走査ポイント配列生成部１５２により、３次元的な画像化領域内の隣り合う２点を連続してデータ取得しないランダムな走査ポイント配列が作成され、レーザ照射点が隣り合わないデータ取得順序が決定される。また、サンプリングスピードと１ポイント当たりのデータ取得時間により、１ポイント当たりのサンプリング回数が算出される。この第１の実施の形態では、１ポイント当たりのサンプリング回数は１回に設定されている。

次に、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント配列（座標データ）がＸ方向スキャナ９ｂ、Ｙ方向スキャナ９ａおよび対物駆動機構１１を駆動するための駆動波形データ（波形ＤＡＣデータ）に変換され、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８、Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ１９およびＺ方向駆動波形メモリ２０に記憶される。

本実施形態においては、まず、Ｘ方向スキャナ９ｂおよびＹ方向スキャナ９ａの駆動により、対物レンズ１０の光軸に交差する２次元方向の画像化領域のうちの１つ目のＺ位置に対応する領域の全てのレーザ照射点からのデータ取得が行われた後に、対物駆動機構１１の駆動により対物レンズ１０を光軸方向に１ステップ移動させてレーザ光の集光位置をＺ方向に１ステップ分ずらし、次に、光軸に交差する２次元方向の２つ目のＺ位置に対応する画像化領域のデータ取得が行われるように走査ポイント配列が生成される。

光軸に交差する２次元方向のランダムな走査ポイント配列は、例えば、図３（ａ）に示すように、（１０）、（２５０）、（１２０）…のＸ位置データ配列３０１と、（２０）、（４０）、（２００）、…のＹ位置データ配列３０２の５１２×５１２ポイントの座標データとして与えられる。また、光軸に沿う方向の走査ポイント配列は、例えば、図３（ａ）に示すように（１００）、（１１０）…のＺ位置データ配列３０３の５１２ポイントの座標データとして与えられる。

これらの座標データは、図３（ｂ）に示すように、（２５００）、（１０００）…のＸＤＡＣデータ配列４０１、（１０００）、（５００）…のＹＤＡＣデータ配列４０２および（１０００）、（１１００）…のＺＤＡＣデータ配列４０３に変換される。
そして、これらＸＤＡＣデータ配列４０１、ＹＤＡＣデータ配列４０２およびＺＤＡＣデータ配列４０３のそれぞれのＤＡＣデータは、それぞれＸ方向スキャナ駆動波形メモリ１８、Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ１９およびＺ方向駆動波形メモリ２０に記憶される。

Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９の駆動波形データはクロック生成部２４のクロックパルスに同期してスキャナ駆動部２１に読み出され、スキャナ駆動部２１はＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動する。また、Ｚ方向駆動波形メモリ２０の駆動波形データ（例えば、Ｚ＝１００）は、クロック生成部２４のクロックパルスに同期して対物駆動機構１１に読み出され、Ｘ，Ｙ方向の全てのデータ取得が終了するまで同一の値に維持される。

対物駆動機構１１は読み出された駆動波形データに従って、対物レンズ１０を軸方向に駆動する。これと同時に、レーザ出力制御部１６の指示によりレーザ光源ユニット１はレーザ光を射出する。レーザ光は、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂにより偏向され、対物レンズ１０を介して標本Ａ上の各データ取得ポイントに順番に照射される。

レーザ光の照射により、標本Ａ上の各レーザ照射点（データ取得ポイント）から蛍光が発せられる。蛍光は、対物レンズ１０と走査光学ユニット９を経てダイクロイックミラー８に入射し、ダイクロイックミラー８で反射され、検出器１２により検出される。検出器１２は蛍光の輝度を反映したアナログ信号を出力する。検出器１２から出力されるアナログ信号は、Ａ／Ｄ変換器１３によってデジタル信号に変換され、フレームメモリ１７に書き込まれる。

検出器１２により取得される画像化領域内の各ポイントの輝度データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント（図３（ａ）に示すＸ位置データ配列３０１、Ｙ位置データ配列３０２およびＺ位置データ３０３）に対応付けされてフレームメモリ１７に書き込まれる。

そして、画像生成部１５３は、フレームメモリ１７に書き込まれた輝度データと画像化領域内の各ポイント座標の対応付けに基づいてＸＹ画像データを生成する。そのＸＹ画像データに対応する画像はモニタ２３に表示される。

従来のラスター走査による蛍光観察では、ある点（Ｘｎ，Ｙｎ）のデータが取得された直後に隣り合う次の点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータが取得される。例えばケージド手法による観察においては、点（Ｘｎ，Ｙｎ）から放出されたカルシウムイオンの影響は、点（Ｘｎ，Ｙｎ）だけにとどまらず、その周囲（例えば、次の点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ））にまで及ぶ可能性がある。従って、点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータは前の点（Ｘｎ，Ｙｎ）に対する刺激の反応挙動の影響を受けたものになってしまうおそれがある。また刺激を行わない蛍光観察においても、蛍光が例えばマイクロ秒オーダーの長い寿命を持つ場合、やはり、ある点（Ｘｎ＋１，Ｙｎ）のデータが前の点（Ｘｎ，Ｙｎ）の影響を受けてしまうという問題が生じる。

これに対して、本実施の形態では、画像化領域（例えば、５１２×５１２ポイント）について、隣り合う２点を連続してデータ取得しないランダムな走査ポイント配列を作成してデータ取得順序を決定し、この決定した取得順序にあわせてＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂの駆動信号を生成し、駆動信号によりポイント走査を行い、各データ取得ポイントからの蛍光を検出して輝度データを取得し、取得した各ポイントの輝度データをランダムな走査ポイント配列に対応付けしてフレームメモリ１７に記憶し、最終的に全てのポイントの輝度データを取得して２次元画像を完成させる。

このため、各ポイントからの取得データは、隣り合う２点が連続して取得されたものを含まず、他のポイントの光の影響を受けていない。つまり、データ取得を行う際の点相互の影響が確実に排除される。従って、個々の点の輝度が他の点の影響を受けることなく正しく検出される。

そして、１枚の２次元画像を形成するためのデータ取得が終了した時点で、Ｚ方向駆動波形メモリ２０の次の駆動波形データ（Ｚ＝１１０）が、クロック生成部２４のクロックパルスに同期して対物駆動機構１１に読み出され、対物レンズ１０が１ステップ光軸方向に移動させられた後に、その場所でＸ方向スキャナ９ｂおよびＹ方向スキャナ９ａの駆動により、対物レンズ１０の光軸に交差する新たな２次元方向の画像化領域の全てのデータ取得点からのデータ取得が行われることが繰り返される。これにより、３次元的な画像化領域のデータを取得することができる。この場合に、３次元方向のいずれの位置においても、隣り合う２点が連続してデータ取得されることが防止され、個々の点の輝度が他の点の影響を受けることなく正しく検出される。

なお、本実施形態においては、データ取得点を移動する間、レーザ光が射出され続けているが、Ｙ方向スキャナ９ａ、Ｘ方向スキャナ９ｂおよび対物駆動機構の動作に同期させてＡＯＴＦ６を制御し、データ取得点を次のデータ取得点に移動する間はレーザ光の射出を停止してもよい。こうすれば、データ取得点の移動の際にレーザ光が与える全ての影響が排除される。また、画像化領域は、定まった矩形でなく、標本の存在する領域に限ってもよい。

また、本実施形態においては、走査光学ユニット９の駆動により、対物レンズ１０の光軸に交差する２次元方向のデータ取得を行った後に、対物駆動機構１１により光軸に沿う方向にデータ取得平面を移動させることとしたが、これに代えて、走査光学ユニット９と対物駆動機構１１との連動により、３次元的にレーザ照射点を移動させることにしてもよい。

＜第２の実施形態＞
本発明の第２の実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡について、以下に説明する。
本実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用する。
第１の実施形態においては、１ポイント当たりのデータ取得時間をサンプリング１回分に設定することで、標本Ａ上の１枚のＸＹ画像を取得するが、この第２の実施形態では、１ポイント当たりのデータ取得時間の中でサンプリングを複数回行うことで、時間的に連続した複数枚のＸＹ画像のスタック（束）であるＸＹＴ画像を、Ｚ方向に異なる複数のＸＹ平面で取得するようになっている。

サンプリングスピードと１ポイント当たりのデータ取得時間により算出される１ポイント当たりのサンプリング回数が、複数、例えば５０サンプリングに設定されたものとする。また、フレームメモリ１７は、１ポイント当たりのサンプリング回数に対応して５０枚用意される。

走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント配列は、例えば、上述の図３（ａ）に示すＸ位置データ配列３０１とＹ位置データ配列３０２が画像化領域の座標データとして与えられる。これらＸ位置データ配列３０１およびＹ位置データ配列３０２より変換される駆動波形データ（波形ＤＡＣデータ）は、図３（ａ）に示す最初のＸ位置データ（１０）に対して５０データ分のＸＤＡＣデータ（２５００）が生成され、同様に、最初のＹ位置データ（２０）に対しても５０データ分のＹＤＡＣデータ（１０００）が生成される。以下、同様にして、各データ取得ポイントのＸＹ位置データに対して５０データずつのＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータが生成される。図４（ａ）と図４（ｂ）は、このようにして生成されるＸＤＡＣデータ配列５０１とＹＤＡＣデータ配列５０２をそれぞれ示している。

これらＸＤＡＣデータ配列５０１とＹＤＡＣデータ配列５０２は、Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９にそれぞれ記憶される。
これらＸ方向スキャナ駆動波形メモリ１８およびＹ方向スキャナ駆動波形メモリ１９の駆動波形データはクロック生成部２４のクロックパルスに同期してスキャナ駆動部２１に読み出され、スキャナ駆動部２１はＹ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂを駆動する。

この状態で、レーザ光源ユニット１から射出されるレーザ光は、Ｙ方向スキャナ９ａとＸ方向スキャナ９ｂにより偏向され、対物レンズ１０を介して標本Ａ上の各データ取得ポイントに照射される。レーザ光の照射に反応して、標本Ａ上の各データ取得ポイントから蛍光が発せられる。蛍光は検出器１２によって検出される。検出器１２は蛍光の輝度を反映したアナログ信号を出力する。検出器１２から出力されるアナログ信号は、Ａ／Ｄ変換器１３によってデジタル信号に変換され、フレームメモリ１７に書き込まれる。

この場合、ＸＤＡＣデータ配列５０１の１番目のＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータ配列５０２の１番目のＹＤＡＣデータに対応した輝度データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント（図３（ａ）に示すＸ位置データ配列３０１およびＹ位置データ配列３０２）に対応付けされた＃１のフレームメモリ１７に書き込まれる。また、ＸＤＡＣデータ配列５０１の２番目のＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータ配列５０２の２番目のＹＤＡＣデータに対応した輝度データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイントに対応付けされた＃２のフレームメモリ１７に書き込まれる。

以下、同様にしてＸＤＡＣデータ配列５０１の３番目から５０番目のＸＤＡＣデータ、ＹＤＡＣデータ配列５０２の３番目から５０番目のＹＤＡＣデータに対応した輝度データについても同じ順位のものが、＃３から＃５０のフレームメモリ１７に書き込まれる。この動作は、ランダムな走査ポイントに対応するＸＤＡＣデータ配列５０１のＸＤＡＣデータとＹＤＡＣデータ配列５０２のＹＤＡＣデータに対応して取得される全ての輝度データについて繰り返され、図５に示すように＃１〜＃５０のフレームメモリ１７に書き込まれる。

そして、ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３は、＃１〜＃５０のフレームメモリ１７に書き込まれた輝度データと画像化領域内の各データ取得ポイント座標の対応付けに基づいてＸＹＴ画像データを生成する。そのＸＹ画像データに対応する画像はモニタ２３に個別に表示される。
以上で一つのＸＹ平面についての画像取得処理が終了する。次に、第１実施形態と同じように、対物駆動機構１１により対物レンズ１０が１ステップ光軸方向に移動させられた後に、同様の画像取得を繰り返す。

本実施の形態では、ランダムに設定されたデータ取得ポイントのそれぞれについて所定の時間間隔をおいて複数回ずつ繰り返してデータ取得（サンプリング）を行い、これら取得される各ポイントの複数個（ｔ＝Ｔ１、Ｔ２、…Ｔｎ）（ｎ＝５０）の輝度データのうち同じ順位で検出されたものについて＃１から＃５０のフレームメモリ１７に個別に書き込むので、各ポイントの検出データが他のポイントの影響を受けないとともに、各フレームメモリ１７に書き込まれた輝度データに基づいて、ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３で生成される複数のＸＹＴ画像により標本Ａの刺激に対する反応挙動の動的変化を観察できる。

＜第３の実施形態＞
本発明の第３の実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡について、以下に説明する。
本実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用する。

本実施形態では、１ポイント当たりのデータ取得時間の中でサンプリングを複数回行い、さらに、これら１ポイント当たりの複数のサンプリングに対応させてレーザ光強度、レーザ光の波長成分、レーザ光照射のオンオフなどのレーザ条件を設定する。
サンプリングスピードと１ポイント当たりのデータ取得時間により算出される１ポイント当たりのサンプリング回数が、例えば１０サンプリングに設定されたものとする。

走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント配列は、例えば、上述の図３（ａ）に示すＸ位置データ配列３０１とＹ位置データ配列３０２が画像化領域の座標データとして与えられる。第２の実施形態で述べたと同様な手順により、Ｘ位置データ配列３０１およびＹ位置データ配列３０２の最初の位置データに対して１０データ分の駆動波形データ（Ｘ（Ｙ）ＤＡＣデータ）Ａ１、Ａ２、…Ａ１０が生成され、以下、同様にして、続く各位置データに対しても１０データ分ずつのＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＢ１、Ｂ２、…、Ｃ１、Ｃ２、…が生成される。図６の上段は、このようにして生成されるＸ（Ｙ）ＤＡＣデータ配列６０１を示している。

また、それぞれの１０データ分のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ１、Ａ２、…、Ｂ１、Ｂ２、…、Ｃ１、Ｃ２、…に対応させて、図６の下段に示すようにレーザ条件が書き込まれたレーザ設定データ配列７０１が生成される。レーザ設定データは、Ｘ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ３、Ｂ３、Ｃ３、…に対してのみレーザ光照射のオンデータＯＮが設定され、その他のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータに対してレーザ光照射のオフデータＯＦＦが設定されている。

レーザ設定データ配列７０１は、レーザ出力制御部１６のメモリ１６ａに記憶される。レーザ出力制御部１６は、メモリ１６ａに記憶したレーザ設定データ配列７０１をデータ取得時のサンプリングタイミングに同期して読み出し、ＡＯＴＦ６によりレーザ光照射のオンオフを制御する。

この構成によると、クロック生成部２４のクロックパルスに同期して読み出されるＸ（Ｙ）ＤＡＣデータ配列６０１のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ１、Ａ２、…、Ｂ１、Ｂ２、…、Ｃ１、Ｃ２、…に応じて標本Ａ上のデータ取得ポイントが設定される。同時にレーザ設定データ配列７０１のレーザ設定データに基づいてレーザ光照射のオンオフが制御される。この場合、レーザ設定データ配列７０１には、それぞれ１０データ分のＸ（Ｙ）ＤＡＣデータＡ、Ｂ、Ｃ、…のうち、Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、…に対してのみレーザ光照射のオンデータＯＮが設定されるので、これらのタイミングでのみＡＯＴＦ６がＯＮになり、標本にレーザ光が照射される。このようにして一つのＸＹ平面についての画像取得処理が終了したら、第１実施形態と同じように、対物駆動機構１１により対物レンズ１０が１ステップ光軸方向に移動させられた後に、同様の画像取得を繰り返す。

本実施の形態では、各レーザ照射点からの光を所定の時間間隔をおいて複数回ずつ検出し、これら複数回の検出のそれぞれの検出タイミングに対応させて異なるレーザ条件を設定できる。ここでは、データ取得ポイントでの複数回のデータ取得（サンプリング）によって取得される複数個（ｔ＝Ｔ１、Ｔ２、・・・Ｔｎ）（ｎ＝１０）の輝度データに対して、ｔ＝Ｔ３（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、…）のときのみレーザ光照射をオンにし、その他のｔ＝Ｔ１、Ｔ２、Ｔ４…Ｔｎではレーザ光照射をオフにするので、刺激を与える前からの標本Ａの状態を観察できるとともに、刺激を与えた時点および刺激をやめた後の標本Ａの動的挙動を観察できる。

なお、データ取得ポイントでの複数回のデータ取得時に設定するデータ条件は、レーザ光照射のオンオフに限らず、レーザ光の強度と波長成分の一方または両方を異ならせて設定することも可能である。例えば多重染色された蛍光標本の観察において、それぞれの蛍光色素に対応する励起波長のレーザ光をひとつずつ順に照射するようにしてもよい。

＜第４の実施形態＞
図７は、本発明の第４の実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡の概略構成を示している。図７において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。

本実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡は、図７に示すように、図１の装置構成に加えて、標本の状態変化を計測する手段として標本Ａからの電流値を検出するための電流検出器２５（電流検出手段）をさらに有している。電流検出器２５は、検出した電流値を反映したアナログ電気信号を出力する。

電流検出器２５から出力される電流値のアナログ信号は、検出器１２からの蛍光の輝度と同様に、Ａ／Ｄ変換器１３に入力されてデジタル信号に変換される。その電流値データは輝度情報としてフレームメモリ１７に書き込まれる。つまり、電流値は、蛍光検出のサンプリングタイミングと同じタイミングで取得される。電流値データは、走査ポイント配列生成部１５２により生成されたランダムな走査ポイント（図３（ａ）に示されるＸ位置データ配列３０１，Ｙ位置データ配列３０２およびＺ位置データ配列３０３）に対応付けされてフレームメモリ１７に書き込まれる。

そして、ＸＹ、ＸＹＴ画像生成部１５３はフレームメモリ１７に書き込まれた電流データと画像化領域内の各ポイント座標の対応付けに基づいてＸＹ画像データを生成する。そのＸＹ画像データに対応する画像はモニタ２３に表示される。

本実施の形態では、直前のレーザ照射影響を排除して電流値を計測できる。従って、標本Ａの各レーザ照射点にレーザ光を照射した際の標本Ａの電気的反応を正確に視覚化できる。本実施形態を第１〜第３の実施形態と組み合わせて実施してもよい。また、検出器１２を用いた蛍光検出を行わずに、電流検出器２５だけを用いて標本の反応を計測してもよい。

（第４の実施形態の応用例）
図８に示されるように、神経細胞２６のスパイン２６ａを含む領域２７ａ，２７ｂ，２７ｃの各レーザ照射点に、各実施形態で説明する方式で刺激光（標本に所定の刺激を与えるためのレーザ光）を照射し、この刺激に対する神経細胞２６の反応を部位２６ｂに挿入した電流検出器２５によって測定する。
電流値の計測は複数の部位に対して行われてもよい。その場合、それぞれの計測部位に電流検出器２５が挿入される。

＜第５の実施形態＞
第１の実施形態では、隣り合うレーザ照射点が連続しないデータ取得順序をランダムに決定している。これに対して本実施の形態では、規則性をもって隣り合うレーザ照射点が連続しないデータ取得順序を決定する。
第５の実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡の概略構成は、図１と同様なので、同図を援用する。

本実施形態では、走査ポイント配列生成部１５２が、例えば、図９のような照射順序の走査ポイント配列を生成する。画像生成部１５３は、第１の実施形態と同じように、取得した輝度データと各走査ポイントの対応付けに基づいて画像データを生成する。

図９の例では、ひとつの走査領域を同じ大きさの４つの領域Ａ〜Ｄに分割する。そして、ＡＢＣＤの順に各分割領域の左上ポイントを照射する。一巡したらＸライン方向にひとつ隣のポイントを同じようにＡＢＣＤの順序で照射する。１ライン分が完了したら各領域の２ライン目を同じように照射する。つまり、領域Ａ〜Ｄを一定の順序で同じ規則に従ってレーザ光を照射する。図９は、４×４ピクセルの走査領域における照射順序、図１０は１６×１６ピクセルの走査領域における照射順序を示している。

各マスの数字が照射順序を示す。この例では、１番目に照射されたポイントの隣は５番目に照射されるので、隣同士のポイントのレーザ照射の時間間隔はピクセル５個分のデータ取得時間となる。このようにしてひとつの平面について４×４ピクセルの全ての位置へのレーザ照射が終わると、対物駆動機構１１によりＺ位置をＺ＝１からＺ＝２へずらして、次の平面へのレーザ照射を行う。

このような照射順序（ポイント配列）は、あらかじめメモリに記憶しておいて使用時に呼び出してもよいし、配列を決定するための算出式を用いてその都度決定してもよい。またこのような走査方法を、前述の第２〜第４の実施形態に組み合わせて用いてもよい。

その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形されてよい。
例えば、始めに１フレームの画像を取得して（通常のＸＹ走査でも本発明のランダム走査でもよい）、標本の存在する位置を検出あるいはモニタ上で指定し、標本の存在する位置だけに対して、隣り合うレーザ照射点が連続しないデータ取得順序を決定してレーザ走査を行うようにしてもよい。こうすれば、標本の存在しない位置は走査されないので、画像取得時間が大幅に短縮される。また、画像取得を行う平面は、ＸＹ平面でなく、ＸＺ平面またはレーザ光軸に対して傾斜した平面であってもよい。この場合、Ｚ方向に収束点を高速に移動させるには、デフォーマブルミラーなどの光学素子を光路中に設ければよい。

また、近赤外でフェムト秒オーダーのパルス光を発する超短パルスレーザ光源を用いて、レーザ照射点（集光位置）に生じる多光子吸収現象を利用してもよい。多光子吸収現象を用いて蛍光励起や光刺激を行うことにより、３次元的な空間分解能が向上し、精度をより高めたデータ取得が可能になる。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、実施形態中で述べられている利点が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡の概略構成を示している。 第１の実施の形態に用いられる制御プログラム部の概略構成を示している。 第１の実施の形態の（ａ）Ｘ位置データ配列、Ｙ位置データ配列およびＺ位置データ配列、（ｂ）対応するＸＤＡＣデータ配列、ＹＤＡＣデータ配列およびＺＤＡＣデータ配列をそれぞれ示している。 本発明の第２の実施形態の（ａ）ＸＤＡＣデータ配列、（ｂ）ＹＤＡＣデータ配列をそれぞれ示している。 第２の実施形態に用いられるフレームメモリの概略構成を示している。 本発明の第３の実施形態に係るレーザ設定データ配列を示している。 本発明の第４の実施の形態に係る共焦点レーザ顕微鏡の概略構成を示している。 図７の共焦点レーザ顕微鏡による電流計測の応用例を示している。 本発明の第４の実施形態に係る共焦点レーザ顕微鏡におけるデータ取得順序の一例を示している。 図９の共焦点レーザ顕微鏡におけるデータ取得順序の別の例を示している。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２，３…レーザ光源（光源手段）、４…反射ミラー、５…ダイクロイックミラー、６…音響光学可変フィルタ、７…反射ミラー、８…ダイクロイックミラー、９…走査光学ユニット（走査手段）、９ａ…Ｙ方向スキャナ、９ｂ…Ｘ方向スキャナ、１０…対物レンズ（照射手段）、１１…対物移動機構（集光位置移動手段）、１２…検出器（計測手段）、１３…Ａ／Ｄ変換器、１４…パーソナルコンピュータ（制御手段）、１５…制御プログラム部（画像形成手段）、１６…レーザ出力制御部、１６ａ…メモリ、１７…フレームメモリ（記憶手段）、１８…Ｘ方向スキャナ駆動波形メモリ（設定手段）、１９…Ｙ方向スキャナ駆動波形メモリ（設定手段）、２０…Ｚ方向駆動波形メモリ（設定手段）、２１…スキャナ駆動部、２２…入力装置、２３…モニタ、２４…クロック生成部、２５…電流検出器、２６…神経細胞、２６ａ…スパイン、２６ｂ…部位、２７…領域、１５１…走査条件入力部、１５２…走査ポイント配列生成部、１５３…ＸＹＴ画像生成部、３０１…Ｘ位置データ配列、３０２…Ｙ位置データ配列、３０３…Ｚ位置データ配列、４０１…ＸＤＡＣデータ配列、４０２…ＹＤＡＣデータ配列、４０３…ＺＤＡＣデータ配列、５０１…ＸＤＡＣデータ配列、５０２…ＹＤＡＣデータ配列、６０１…ＸＤＡＣデータ配列、７０１…レーザ設定データ配列。

Claims (9)

1. レーザ光を射出する光源手段と、
   標本上のレーザ照射点に前記レーザ光を集光させる照射手段と、
   該照射手段によるレーザ光の集光位置を光軸に交差する方向に２次元的に走査する走査手段と、
   前記照射手段によるレーザ光の集光位置を光軸方向に移動させる集光位置移動手段と、
   前記標本の所定の３次元領域に複数の前記レーザ照射点を設定する設定手段と、
   該設定手段により設定された複数のレーザ照射点に対して、３次元空間的に隣り合うレーザ照射点が連続しない照射順序に従って前記レーザ光が順次集光されるよう前記走査手段および前記集光位置移動手段を制御する制御手段と、
   前記各レーザ照射点へのレーザ照射により生じる前記標本からの光および標本の状態変化の少なくとも一方を、前記各レーザ照射点へのレーザ照射ごとに計測する計測手段と、
   該計測手段により計測された前記光の強度情報および標本の状態変化情報を前記レーザ照射点の位置情報に対応付けして記憶する記憶手段と、
   前記各情報に基づいて画像を形成する画像形成手段とを備える走査型顕微鏡。
2. 前記計測手段が、１つのレーザ照射点へのレーザ照射に対して所定の時間間隔をおいて複数回ずつ計測を行い、
   前記画像形成手段が、前記計測手段により計測される情報のうち、同じ順位で計測された情報を、それぞれ、前記レーザ照射点の前記位置情報と対応付けることにより、計測順位に応じた複数の画像を形成する請求項１に記載の走査型顕微鏡。
3. 前記計測手段は、前記レーザ照射点にレーザ光が照射された際の前記標本の状態変化情報として、電流値を計測する請求項１に記載の走査型顕微鏡。
4. 前記光源手段から出射されるレーザ光の波長および強度の少なくとも一方を制御するレーザ光制御手段をさらに備え、
   前記計測手段が、１つのレーザ照射点への照射に対して所定の時間間隔をおいて複数回ずつ計測を行い、
   前記レーザ光制御手段が、各レーザ照射点へのレーザ照射に対応する前記計測手段における複数回の計測タイミングに対応させて前記レーザ光の照射変更を設定する請求項１に記載の走査型顕微鏡。
5. 前記レーザ光の照射条件が、レーザ光照射のオンオフ、レーザ光の強度、波長成分の少なくとも１つである請求項４に記載の走査型顕微鏡。
6. 前記制御部が、前記レーザ照射順序をランダムに決定する請求項１に記載の走査型顕微鏡。
7. 前記制御部が、規則性をもって前記レーザ照射順序を決定する請求項１に記載の走査型顕微鏡。
8. 前記制御部が、走査領域を複数の領域に分割し、それらの領域を一定の順序で同じ規則に従ってレーザ光を照射する順序を決定する請求項７に記載の走査型顕微鏡。
9. 標本上のレーザ照射点にレーザ光を集光させ、
   前記レーザ照射点が隣り合わない順序に従って、光軸に交差する２次元方向および光軸方向に前記レーザ光の集光位置を移動させて各レーザ照射点にレーザ光を順次照射し、
   前記各レーザ照射点へのレーザ照射により生じる前記標本からの光および標本の状態変化の少なくとも一方を、前記各レーザ照射点へのレーザ照射ごとに計測して前記レーザ照射点の位置情報に対応付けして記憶し、
   前記各情報に基づいて画像を形成する標本画像取得方法。

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