CN102939555A - 显微镜装置、观察方法 - Google Patents

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Abstract

一种显微镜装置，具有：分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述活化光的照射强度；和图像形成装置，将包括对所述观察区域照射按所述每个部分设定的照射强度的所述活化光的动作、和对所述活化光照射后的所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。

Description

显微镜装置、观察方法
技术领域
本发明涉及显微镜装置、观察方法。
本申请基于2010年6月11日在日本提出的特愿2010-134217号要求优先权，并将其内容援引至此。
背景技术
目前，作为超分辨率显微镜，已知有STORM(Stochastic OpticalReconstruction Microscopy；随机光学重建显微镜)(例如参照专利文献1、2)。在该显微镜中，作为观察试样，使用荧光物质或者附着有荧光物质的物质。该荧光物质具有这样的特性：若被照射规定波长的活性光则成为活化状态，若此后被照射与活性光的波长不同的激发光则发出荧光并成为非活化状态。通过对观察试样照射微弱的活性光，荧光物质在低密度下成为活化状态。然后，通过照射激发光而使活化状态的荧光物质发光，从而取得荧光图像。在这样取得的荧光图像中，由于荧光亮点(荧光物质的像)是以低密度配置且是各自分离的，所以能够求出各个像的重心位置。使这种获取荧光图像的步骤重复多次、例如数百次～数万次以上，并进行将所得到的多个荧光图像合成的图像处理，由此，能够得到高分辨率的试样图像。
现有技术文献
专利文献1：美国专利公开第2008/0032414号
通过以往的观察方法，若在同一视野内存在荧光物质的密度大为不同的多个区域，则在荧光物质以高密度配置的部位，无法分离检测出各个荧光亮点，因此，无法得到高分辨率的图像。
发明内容
本发明的目的在于提供一种即使在同一视野内荧光物质的分布存在不平均的情况下也能够得到高分辨率的图像的显微镜装置以及观察方法。
本发明的几个方式提供如下的试样的显微镜装置、观察方法。
即，本发明的一个方式的显微镜装置具有：分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述活化光的照射强度；和图像形成装置，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述活化光的动作、和对所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
另外，本发明的一个方式的显微镜装置具有：分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述激发光的照射强度；和图像形成装置，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
另外，本发明的一个方式的显微镜装置具有：分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述活化光的照射强度；和图像形成装置，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述活化光的动作、和对所述活化光照射后的所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作交替地反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
另外，本发明的一个方式的显微镜装置具有：分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述激发光的照射强度；和图像形成装置，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作交替地反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
另外，本发明的一个方式的观察方法具有：分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述活化光的照射强度；和图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述活化光的动作、和对所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
另外，本发明的一个方式的观察方法具有：分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述激发光的照射强度；和图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
另外，本发明的一个方式的观察方法具有：分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述活化光的照射强度；和图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述活化光的动作、和对所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
另外，本发明的一个方式的观察方法具有：分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述活化光的照射强度；和图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
发明的效果
根据本发明的方式的显微镜装置以及观察方法，即使在同一视野内荧光物质的分布具有较大的不平均的情况下，也能够得到高分辨率的图像。
附图说明
图1是表示显微镜装置的第一实施方式的构成图。
图2是表示第一实施方式的观察方法的流程图。
图3是全反射照明的示意图。
图4是第一荧光图像的概略图。
图5是二维亮度分布的概略图。
图6是第二荧光图像的概略图。
图7A是荧光亮度的检测的说明图。
图7B是荧光亮度的检测的说明图。
图7C是荧光亮度的检测的说明图。
图8是表示显微镜装置的第二实施方式的构成图。
图9是表示在第五实施方式中参照的观察方法的第一方式的图。
图10是表示在第五实施方式中参照的观察方法的第二方式的图。
图11是表示在第五实施方式中参照的观察方法的第三方式的图。
图12是表示在第六实施方式中参照的细胞观察图像的图。
具体实施方式
以下，参照附图说明试样的观察方法以及显微镜装置的一个实施方式。此外，本实施方式是为了更好地理解发明的要旨来进行具体说明的，在没有特别指定的情况下，并不对本发明构成限定。另外，以下说明中所用的附图，为了使特征易于理解，出于方便，有时会将重要部分放大表示，各构成要素的尺寸比例等不一定与实际相同。
(第一实施方式)
图1是表示第一实施方式的显微镜装置的概要图。
显微镜装置10具有显微镜主体15、安装在显微镜主体15上的激发照明系统11、活化照明系统13、控制部14、存储部16和显示部17。
本实施方式的显微镜装置10是采用了超分辨率显微镜技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy；STORM)的显微镜装置。
在显微镜装置10中，采用被付与了荧光物质来作为标识的试样，该荧光物质若被照射规定波长的活化光L2则成为活化状态，若在活化状态下被照射波长与活化光L2不同的激发光L1，则发出荧光并成为非活化状态。而且，反复进行这样的动作：通过使用激发照明系统11和活化照明系统13仅使作为试样中一部分的荧光物质发光，由此来观察离散分布的荧光，利用这样获取的大量的荧光图像能够形成试样图像。
显微镜主体15例如是倒置显微镜。显微镜主体15具有载置观察对象、即试样的载物台31，并且连接有：全反射镜32，使从激光光源21照射的激发光L1向着载物台31反射；分色镜33，使从后述的激光光源41照射的活化光L2向着载物台31反射，但使激发光L1透过；和照相机34，对载置于载物台31上的试样的荧光图像进行拍摄。
另外，虽然省略了图示，但在显微镜主体15上设置有向载物台31照射激发光L1以及活化光L2的物镜、和使从试样放射出的荧光(观察光)耦合于照相机34的受光面上的成像透镜等。
载物台31构成为能够实现在贴附于试样上的玻璃盖片与试样的界面处使激发光L1以及活化光L2全反射的全反射照明。通过全反射照明，能够利用在照明光(激发光L1、活化光L2)全反射时从玻璃盖片向试样侧透出的瞬逝光(evanescent light)来照亮试样。由于瞬逝光的到达范围限于距离界面100～150nm左右的范围内，所以能够仅使位于玻璃盖片表面附近的荧光物质发光，从而能够通过使背景的荧光显著降低来实现高的S/N比。
此外，本实施方式的显微镜主体15构成为能够对上述的全反射照明和通常的落射照明切换使用。
激发照明系统11具有激光光源21、快门22和全反射镜32，并且激发照明系统11经由全反射镜32而连接在显微镜主体15上。
激光光源21是向显微镜主体15供给激发光L1的光源，该激发光L1用于使付与给试样的荧光物质发光。激光光源21只要是射出适合于试样所含的荧光物质的波长的激发光L1的光源即可，例如，可以根据荧光物质的种类来使用绿色激光(波长532nm)、红色激光(波长633nm、657nm)、紫色激光(波长405nm)、蓝色激光(波长457nm)等。
快门22是对向显微镜主体15的激发光L1的供给、停止进行切换的装置，例如能够构成为具有：对从激光光源21射出的激发光L1进行遮挡的遮光部件；和使该遮光部件相对于激发光L1的光路进退的驱动装置。或者，作为快门22，也可以使用AOTF(Acousto-OpticTunable Filter；声光可调滤波器)。
激发照明系统11构成为，相对于载物台31上的观察视野(观察区域)的全部区域照射激发光L1。
活化照明系统13具有激光光源41、AOTF 42、扫描器43和分色镜33，并且通过使分色镜33插入到激发光L1的光路上，而使活化照明系统13与显微镜主体15连接。
激光光源41将用于使荧光物质活化的活化光L2向着显微镜主体15照射。激光光源41只要是射出适合于试样所含的荧光物质的波长的活化光L2的光源即可，例如，能够根据荧光物质的种类来使用绿色激光(波长532nm)、红色激光(波长633nm、657nm)、紫色激光(波长405nm)、蓝色激光(波长457nm)等。
AOTF42是声光可调滤波器(Acousto-Optic Tunable Filter)，具有如下功能：通过向例如二氧化碲等的双折射晶体施加来自的超声波振动器的超声波，从而利用在该双折射晶体内产生的疏密波来使从激光光源41入射的活化光L2偏振分光。AOTF42将从激光光源41入射的活化光L2的强度控制为设定值，并向着扫描器43射出。
扫描器43使活化光L2在显微镜主体15的载物台31上扫描。作为扫描器43，例如能够使用双轴的电扫描器(galvano-scanner)。
活化照明系统13构成为，能够相对于载物台31上的观察视野(观察区域)，将照射强度通过AOTF42调制了的活化光L2一边通过扫描器43扫描一边照射。
控制部14是综合地控制显微镜装置10的计算机，连接有存储部16、显示部17、AOTF控制器18和照相机控制器19。在本实施方式中，控制部14至少具有：生成用于控制这些装置的控制信号的控制信号生成功能；经由照相机控制器19取得荧光图像的荧光图像取得功能；对取得了的荧光图像进行解析的图像解析功能；和由多张荧光图像生成试样图像的图像形成功能。
存储部16例如由半导体存储器、硬盘等构成，存储部16将在控制部14中所使用的程序和由控制部14供给的数据(荧光图像等)以能够由控制部14读取的状态存储。
显示部17例如是监视器(显示装置)和打印机(印刷装置)，提供对基于从控制部14输出的图像数据的映像进行显示、印刷的功能。
AOTF控制器18对活化照明系统13中所具有的AOTF42进行驱动控制。AOTF控制器18基于从控制部14输入的控制信号而驱动AOTF42，并对从激光光源41输出的活化光L2进行调制。
照相机控制器19对连接在显微镜主体15上的照相机34进行驱动控制。照相机控制器19基于从控制部14输入的控制信号而使照相机34动作，并取得从试样放射的荧光的图像，并将取得了的荧光图像向控制部14输出。
此外，在激发照明系统11中，也可以在快门22与全反射镜32之间设置AOTF。另外，在活化照明系统13中，也可以例如在AOTF42与扫描器43之间设置快门。
而且，也可以采用如下的激光光源装置，该激光光源装置构成为，在一个壳体内具有激光光源21和激光光源41，且能够射出多种激光。在具有这样的激光光源装置的情况下，构成具有激光光源装置、快门22和AOTF42、扫描器43的照明系统，由此，能够通过一个照明系统向显微镜主体15供给激发光L1和活化光L2这两种光。
显微镜装置10通过使控制部14所具有的上述功能组合执行，来实现在后述的观察方法的实施中所必需的各种动作。因此，显微镜装置10兼具有：对与荧光物质的分布对应的荧光强度分布进行测定的分布测定装置的功能：对观察区域的每个部分的活化光的照射强度进行设定的照射强度设定装置的功能；以及通过STORM拍摄处理以及图像处理而生成试样图像的图像形成装置的功能。
接下来，说明使用显微镜装置10的观察方法。
图2是表示本实施方式的观察方法的流程图。本实施方式的观察方法由分布测定步骤S101、照射强度设定步骤S102和图像形成步骤S103构成。
分布测定步骤S101包含有在显微镜装置10中取得第一荧光图像的步骤S11、和计算第一荧光图像中的二维亮度分布(荧光强度分布)的步骤S12。
照射强度设定步骤S102包含有基于上述的荧光强度分布来设定活化光L2的二维强度分布图(照射强度分布)的步骤S13。
图像形成步骤S103包含有将根据二维强度分布图控制了照射强度的活化光L2向试样照射的步骤S14、向试样照射激发光L1而取得第二荧光图像的步骤S15、保存第二荧光图像的步骤S16、判断拍摄结束的步骤S17和由多张第二荧光图像生成试样图像的步骤S18。
基于显微镜装置10进行的观察步骤的概略说明如下所述。
首先，在分布测定步骤S101中，掌握与试样中的荧光物质的存在密度相对应的二维亮度分布。然后，在照射强度设定步骤S102中，基于二维亮度分布来对试样的每个区域设定活化光L2的照射强度(制成二维强度分布图)。然后，在图像形成步骤S103中，将一边基于二维强度分布图对活化光L2的强度进行调制一边向试样照射的动作、和照射激发光L1而得到第二荧光图像的动作反复进行数百次至数万次(STORM拍摄处理)。然后，通过将拍摄到的多张第二荧光图像合成而得到高分辨率的试样图像(STORM图像处理)。
以下，详细说明各阶段的步骤。
首先，在显微镜装置10的载物台31上放置付与了荧光物质来作为标识的试样。作为观察对象的试样例如为浸渍在培养液中的细胞等。
作为荧光物质，使用若被照射规定波长的活化光则成为活化状态、若在活化状态下被照射波长与活化光不同的激发光则发出荧光并成为非活化状态的荧光物质。具体地，能够使用美国专利公开第2008/0032414号说明书中记载的荧光物质，例如能够使用将两种花青染料结合而成的染料对(Cy3-Cy5染料对、Cy2-Cy5染料对等)。
在上述染料对中，一方的染料(第一染料)通过激发光而形成发光的光放射部分，另一方的染料(第二染料)形成响应于光照射而使第一染料活化、或者作为对第一染料的状态进行切换的开关而发挥功能的活化部分。例如，在Cy3-Cy5染料对中，Cy5是光放射部分，Cy3是能够使Cy5活化的活化部分。因此，若向包含Cy3-Cy5染料对的荧光物质照射与Cy3的吸收波长对应的绿色激光(532nm)，则光放射部分、即Cy5会被活化，且Cy5变成荧光状态。然后，若相对于Cy5处于荧光状态的荧光物质照射与Cy5的吸收波长对应的红色激光(633nm)，则Cy5会发光，并且返回至非活性状态(暗态)。
在STORM中，通过对荧光物质中的荧光状态和暗态的切换动作进行控制，能够使付与到试样中的荧光物质的仅极少部分选择性地发光，从而能够以一个分子的水平检测出荧光物质。
若完成了试样向载物台31的放置，则控制部14开始分布测定步骤S101。在分布测定步骤S101中，首先执行取得第一荧光图像的步骤S11。
在步骤S11中，首先向显微镜主体15供给从活化照明系统13射出的活化光L2，从而相对于载物台31上的试样照射活化光L2。此时，通过使激发照明系统11的快门22成为关闭状态而使激发光L1被遮挡，从而仅有活化光L2向显微镜主体15入射。另外，AOTF42通过基于从控制部14输入的控制信号来动作的AOTF控制器18，而成为以恒定强度输出从激光光源41入射的活化光L2的状态。然后，通过扫描器43使活化光L2相对于观察视野的全部区域进行扫描，从而相对于视野全部区域的试样照射均匀强度的活化光L2。由此，在视野全部区域的范围内，使试样所含的荧光物质活化。例如，在荧光物质具有Cy3-Cy5染料对的情况下，使光放射部分、即Cy5变成荧光状态而成为能够发光的状态。
此外，活化光L2也可以通过全反射照明、落射照明的任意一种方式对试样照射。
图3是表示通过全反射照明向试样S照射活化光L2(或者激发光L1)的情况的说明图。如图3所示，在载物台31的玻璃盖片31a上配置有试样S，活化光L2从玻璃盖片31a的下方相对于玻璃盖片31a的表面倾斜地入射。而且，活化光L2在玻璃盖片31a与试样S的界面全反射，从上述界面向试样S侧透出的瞬逝光EV照射在试样S的界面侧表层。由此，仅使位于试样S的极其表层部分的荧光物质选择性地活化。
另一方面，在落射照明的情况下，使活化光L2在玻璃盖片31a的法线方向上入射，使从玻璃盖片31a透过的活化光L2向试样S照射。在该情况下，在试样S的整个厚度方向上照射活化光L2。
接着，使活化照明系统13成为不射出活化光L2的状态，并且使激发照明系统11的快门22成为打开状态，从激光光源21射出的激发光L1经由全反射镜32而供给至显微镜主体15。在本实施方式的显微镜装置10中，从激发照明系统11供给的激发光L1照射到观察视野全部区域。于是，由活化光L2活化了的荧光物质因照射有激发光L1而发出荧光，并且变成非活性状态。经由照相机控制器19使照相机34动作，对该荧光物质所发出的荧光进行拍摄，从而能够取得第一荧光图像。所拍摄的第一荧光图像从照相机控制器19向控制部14发送，控制部14根据需要使第一荧光图像存储在存储部16中。
接下来，在步骤S12中，在控制部14中，计算第一荧光图像中的二维亮度分布(荧光强度分布)。
在此，图4是概略表示在分布测定步骤S101中得到的第一荧光图像的图。在图4所示的第一荧光图像E1中，在图中用+标记所示的荧光的亮点在观察视野E内不平均地存在。即，根据试样的部位而荧光物质的存在密度不同，因此，在荧光物质较多的部分亮点较多，由此荧光强度变强。另一方面，在荧光物质较少的部分亮点较少，由此荧光强度变弱。
这种荧光强度的不平均是在所有的试样中都常见的现象，例如在细胞试样等中，会根据每个细胞组织的密度的差异而产生荧光强度分布(二维亮度分布)的不平均。在图4中，亮点密集的区域(荧光强度强的部分)例如与细胞中的细胞核附近的部分对应，亮点分散的区域(荧光强度低的部分)例如与细胞内的小器官的部分对应。
通过从第一荧光图像E1导出观察视野中的荧光强度的分布，能够得到例如图5所示的二维亮度分布。
图5所示的二维亮度分布EM被划分为区域R1～R4这四个区域，相对于各个区域R1～R4，设定有荧光强度的水准(水平)。区域R1的亮点密度最大，与放射强度最大的范围对应。然后，以区域R2、R3、R4的顺序，亮点密度变小，与放射强度更低的范围对应地分类。
此外，在图5中，将荧光强度分类为四个水准，但是分类的水准的数量并不限于此。能够在AOTF42能够控制的范围内精细地分类。
若通过以上步骤取得了二维亮度分布EM，则移至照射强度设定步骤S102，执行制成并保存二维强度分布图的步骤S13。
在步骤S13中，控制部14基于在分布测定步骤S101中算出的二维亮度分布EM而制成在观察视野的每个位置上对活化光L2的照射强度进行规定的二维强度分布图。
在制成二维强度分布图时，将针对图5所示的二维亮度分布EM中荧光强度最高的区域R1的、活化光L2的照射强度设定成最低，另一方面，将针对荧光强度最低的区域R4的、活化光L2的照射强度设定成最高。关于区域R2、R3，根据各自的放射强度的水平设定成R1、R4的中间的照射强度。
即，在观察视野中，对于荧光物质大量存在的区域R1、R2，照射比较弱的活化光L2，对于荧光物质较少的区域R3、R4，照射比较强的活化光L2。
二维强度分布图在本实施方式的情况下是输出给AOTF控制器18的控制信号的分布图，所以只要在AOTF42中能够进行对活化光L2的所希望的调制(照射强度的变化)，就不对其数据形式进行特别限定。
二维强度分布图例如能够制成为这样的分布图，即，在分布测定步骤S101所得到的二维亮度分布EM中，向区域R1～R4分配各自的放射强度水平的倒数而成的分布图。例如，若区域R1～R4的放射强度水平分别为4、3、2、1，则在二维强度分布图中的区域R1～R4中，作为照射强度的控制值，分别设定有0.25(1/4)、0.33(1/3)、0.5(1/2)、1(1/1)。
或者，也可以作为使二维亮度分布EM灰度反转而成的反转图像来制成。例如，在与区域R1～R4的放射强度的水平对应的灰度值为200、150、100、50，且灰度值的范围为1～255时，在二维强度分布图的区域R1～R4中，作为照射强度的控制值，分别设定为55、105、155、205。
这样地在照射强度设定步骤S102中生成的二维强度分布图(照射强度分布的数据)从控制部14保存到存储部16中。
若二维强度分布图的设定结束，则控制部14开始图像形成步骤S103。在图像形成步骤S103中，执行STORM拍摄处理(步骤S14～S17)和STROM图像处理(步骤S18)，该STORM拍摄处理为，使用在照射强度设定步骤S102中设定的二维强度分布图来取得数百至数万张第二荧光图像，该STROM图像处理为，由第二荧光图像生成试样图像。
首先，在步骤S14中，向试样照射被控制了的活化光L2。在显微镜装置10中，使激发照明系统11的快门22为关闭状态，向显微镜主体15仅供给活化光L2。控制部14读取保存在存储部16中的二维强度分布图，将构成二维强度分布图的各个数据(控制信号)发送给AOTF控制器18。AOTF控制器18基于所输入的控制信号来驱动AOTF42。
在活化照明系统13中，从激光光源41射出的活化光L2通过由AOTF控制器18驱动的AOTF42而被调制为在二维强度分布图中所设定的照射强度。而且，照射强度被控制了的活化光L2通过扫描器43而被进行位置控制，并入射至分色镜33，通过分色镜33反射而照射在载物台31上的观察视野的规定位置。
此时，如图3所示，在显微镜装置10处于全反射照明模式的情况下，活化光L2作为瞬逝光EV而照射到试样S上，且仅使位于试样S的极其表层部分的荧光物质选择性地活化。
在上述步骤S14中，由于基于二维强度分布图向观察视野的每个部分照射照射强度被控制了的活化光L2，所以，对于观察视野内的荧光物质以相对高密度存在的区域(高密度区域)照射相对低强度的活化光L2，对于观察视野内的荧光物质以相对低密度存在的区域(低密度区域)照射相对高强度的活化光L2。
于是，在上述的高密度区域中，荧光物质活化的概率相对变低，在低密度区域中，荧光物质活化的概率相对变高。但是，另一方面，由于在高密度区域中荧光物质的量较多，在低密度区域中荧光物质的量较少，所以通过活化光L2活化的荧光物质的量在高密度区域和低密度区域中成为大致相等的量。
接下来，移至步骤S15，活化照明系统13成为不射出活化光L2的状态，并且，激发照明系统11的快门22成为打开状态，从激光光源21射出的激发光L1经由全反射镜32供给至显微镜主体15。由此，激发光L1向观察视野全部区域照射，且仅使通过活化光L2活化了的荧光物质选择性地发光。发出荧光的荧光物质变为非活性状态。经由照相机控制器19使照相机34动作，对该荧光物质所发出的荧光进行拍摄，从而能够取得第二荧光图像。所拍摄的第二荧光物质被从照相机控制器19向控制部14发送。
在此，图6是概略表示第二荧光图像的图。在图6所示的第二荧光图像E2中，用+标记表示所拍摄的荧光的亮点，并将二维亮度分布EM中的区域R1～R4的边界重叠地表示，由此，能够识别出各个区域R1～R4中的亮度的密度。如图6所示，通过本实施方式所取得的第二荧光图像E2是区域R1～R3的各区域中的亮点(+标记)的密度大致平均化的图像。这是由于进行了修正，使得针对区域R1的活化光L2的照射强度降低，并且使得针对区域R3的活化光L2的照射强度提高，由此使在区域R1～R3中活化的荧光物质的量大致相等。
而且，在步骤S16中，控制部14使接收的第二荧光图像存储到存储部16中。若第二荧光图像保存到存储部16中，则在步骤S 17中，判断STORM拍摄处理是否结束。即，判断预先设定的张数的第二荧光图像的取得是否结束。在第二荧光图像的张数未达到预定数量的情况下，返回至步骤S14，反复执行上述的步骤S14～S16。
在本实施方式的情况下，由于在步骤S15中发光的荧光物质发光，并且成为非活化状态，所以在从步骤S17返回至步骤S14再次进行活化光L2的照射的情况下，试样S所含的荧光物质处于非活化状态。因此，每当再次执行步骤S14时，被活化的荧光物质在概率上不同，在之后的步骤S15中取得的第二荧光图像表示出与在上一个循环取得的第二荧光图像不同的亮点图案。
这样，通过反复执行步骤S14～S16，取得数百张～数万张亮点位置不同的第二荧光图像。
此外，能够进行这种数百至数万次的第二荧光图像的取得，是由于付与给试样S的荧光物质具有在发光时返回至非活性状态的性质，并且是由于能够使每次拍摄的发光时间缩短，能够使到退色的期间延长，以及通过活化光L2活化的荧光物质只是整体的极少一部分，在一次拍摄中发光的荧光物质比较少。
另一方面，在预定数量的第二荧光图像的拍摄完成的情况下，在步骤S17判断为结束，并移至步骤S18。
在步骤18，通过使积蓄在存储部16中的数百～数万张第二荧光图像重合来生成试样图像。在使第二荧光图像重合时，在控制部14中进行变换，使得在多张第二荧光图像之间存在于被视为大致同一坐标处的多个荧光亮点成为单一的一个荧光亮点。
由于在本实施方式中，使活化光L2的照射强度在每个区域不同，所以在每个区域中荧光物质活化的概率不同。尤其在荧光物质的存在密度比较低的区域R3中，当提高活化光L2的照射强度时，在区域R3中同一荧光物质的活化的概率变高。因此，通过将上述的视为同一个的荧光亮点忽略，能够防止因照射强度变化而引起的试样图像的不良情况的发生。
此外，视为同一个的荧光亮点能够通过它们的间隔来判断，例如设定为，在是未达到STROM的分辨率(约20nm)的间隔的情况下，则判断为同一荧光亮点。
或者，作为取代上述忽略荧光亮点的方法，也可以采用生成信息附加图像的方法，该信息附加图像是相对于生成的试样图像附加二维强度分布图的信息而得的。即也可以为，通过将第二荧光图像不作改变地重叠而制成试样图像，且对所制成的试样图像进行颜色在各个区域R1～R4中彼此不同的着色。这样，能够在荧光物质的存在密度较大的区域R1中防止图像变形，并且能够提高在存在密度较低的区域R3中的图像的鲜明度。在另一方面，由于成为恰如使荧光物质均匀分布那样的试样图像，所以通过将照射强度变化了的区域R1～R4分色显示等而附加二维强度分布图的信息，由此能够向用户提供基于荧光物质的存在密度的信息。
此外，作为与活化光L2的照射强度对应的信息，除了上述的分色，还可以使用将区域R1～R4的边界线重叠在试样图像上表示的方法、和与区域R1～R4对应地使试样图像的背景色不同的方法等。
根据以上所说明的本实施方式的观察方法，在观察视野中，即使在荧光物质的存在密度中具有不平均，也能够得到鲜明的试样图像。以下，具体说明作用效果。
在以往的STORM拍摄处理中，若像图4所示的第一荧光图像E1那样存在荧光物质不平均的情况，则在如区域R1那样的荧光物质密集的区域中，图像会发生溃散。如图7B所示，这是由于若荧光亮点彼此接近地配置，则检测脉冲不能分离地重叠，无法作为两个荧光亮点来检测。如图7A、图7C所示，为了对荧光物质的每一个分子的荧光亮点进行检测，需要使荧光物质的分子一个个孤立，或者使荧光物质的分子彼此适当离开地配置。
因此，在本实施方式的观察方法中，根据观察视野中的荧光物质的存在密度，使活化光L2的照射强度不同。即，对荧光物质相对多地存在的区域照射相对弱的活化光L2，对荧光物质相对少地存在的区域照射相对强的活化光L2。由此，如图6所示，能够使区域R1～R3的各区域中的荧光亮度(+标记)的密度大致均匀化，并且，能够成为如图7C所示的、荧光亮点彼此适当离开的状态。因此，提高基于图6的荧光亮点的检测，能够识别出与荧光物质的一个分子对应的荧光亮点。
此外，在图6中，荧光亮点彼此的平均间隔能够通过活化光L2的照射强度来调整。若提高活化光L2的照射强度，则能够使更多的荧光物质活化，因此，荧光亮点彼此的平均间隔变窄，相反，若降低照射强度，则间隔变宽。
荧光亮点彼此的间隔若变得过窄，则如图7C所示很难检测出各个荧光亮点。另一方面，若荧光亮点彼此的间隔过宽，则每一张第二荧光图像中的荧光亮点的数量减少，因此第二荧光图像的需要张数变多，或是测定时间变长，或是易于产生荧光物质退色的问题。
因此，优选为，对活化光L2的照射强度进行调整，以使荧光亮点彼此的平均间隔(荧光亮点的存在密度)成为适当的范围。具体优选为，第二荧光图像中的荧光亮点彼此的间隔为显微镜装置10的光学分辨率的两倍以上，更优选为三倍左右。只要至少为光学分辨率的两倍以上的间隔，就能够识别出每个荧光亮点。另外，若成为光学分辨率的三倍左右，则能够将荧光亮点较高密度地配置，因此能够高效地进行观察。
例如，若显微镜装置10的光学分辨率为200nm，则只要调整活化光L2的照射强度，以使第二荧光图像中的荧光亮点彼此的平均间隔为600nm左右即可。具体地，只要在二维强度分布图中，在维持每个区域的控制值的差或者比例的情况下，使二维强度分布图整体的控制值增加或者减少即可。
另外，为了调整上述的荧光亮点彼此的间隔，也可以基于在步骤S15取得的第二荧光图像进行活化光L2的照射强度的再调整。在该情况下，在控制部14中，对从照相机控制器19取得的第二荧光图像进行解析，以算出荧光亮点彼此的平均间隔。而且，在算出的间隔未达到光学分辨率的两倍的情况下，进行修正使在接下来执行的步骤S14中照射的活化光L2的照射强度变低。或者，在算出的间隔为光学分辨率的例如四倍以上过宽的情况下，进行修正使活化光L2的照射强度变高。
而且，也可以在上述的修正后从第二荧光图像算出荧光亮点彼此的平均间隔，且在所算出的间隔超出适当的范围的情况下，再次实施上述的活化光L2的照射强度的修正。进一步地，可以反复进行活化光L2的照射强度的修正，直到荧光亮点彼此的平均间隔成为适当的范围(至少为光学分辨率的两倍以上)。
另外，在本实施方式中，也可以在进行了步骤S14的活化光L2的照射后，多次反复执行基于步骤S15、S16的第二荧光图像的取得动作。由此，能够有效地利用活化的荧光物质来高效地取得第二荧光图像。
此外，由于发光了的荧光物质成为非活化状态，所以若这样反复进行激发光L1的照射，则观测的荧光的亮点数量会逐渐减少。当亮点数量过少时，取得第二荧光图像的时间就变成浪费了，由此，步骤S15的重复次数为2～5次左右。
在上述那样对于一次活化光照射而进行多次激发光照射的情况下，基于由最初的激发光照射而取得的第二荧光图像，进行亮点的平均间隔的调整(活化光L2的照射强度的调整)。这是因为在第二次以后的第二荧光图像中，亮点的数量减少而平均间隔变大，因此变得易于检测出每个亮点。
如上所述，基于第二荧光图像的信息来调整活化光L2的照射强度，将在下一次以后的循环中得到的第二荧光图像中的荧光亮点彼此的间隔调整为适当的范围，由此，能够高效地取得高分辨率的图像。
另外，在本实施方式中，也可以使用第一荧光图像作为第二荧光图像的一部分来使用。由于第一荧光图像也是对试样的荧光物质的荧光亮点进行拍摄而得的，所以也能够与第二荧光物质一同重叠而用于试样图像的制成。若调整活化光L2的强度，使得在第一荧光图像中不产生荧光亮点过度密集的区域。则能够成为能适用于试样图像的重叠中的第一荧光图像。
另外在本实施方式中，也可以取得多张用于制成二维强度分布图的第一荧光图像。在该情况下，可以在每当取得第一荧光图像时，向试样照射活化光L2，也可以为，在进行了一次活化光L2的照射后，多次执行第一荧光图像的取得动作。
而且，在制成二维强度分布图时，在将取得的多张第一荧光图像重叠而成的图像中，算出二维亮度分布，并基于该二维亮度分布来制成二维强度分布图。
由于通过在二维强度分布图的制作中使用多张第一荧光图像，能够减少每个第一荧光图像中的荧光亮点的数量，所以变得易于获得能够作为试样图像的一部分来使用的第一荧光图像。
(第二实施方式)
图8是表示本发明第二实施方式的显微镜装置的概要图。此外，在图8中的与第一实施方式相同的构成要素上标注相同的附图标记，并省略对它们的具体说明。
第二实施方式的显微镜装置60是代替第一实施方式的活化照明系统13而具有活化照明系统63的构成。活化照明系统63具有水银灯61、空间光调制装置63和分色镜33，该活化照明系统63经由分色镜33而连接在显微镜主体15上。在空间光调制装置62上连接有光调制控制器68，光调制控制器68与控制部14连接。
空间光调制装置62例如是DMD(Digital mirror Device；数字微镜器件；注册商标)或液晶面板。DMD具有将多个微小镜面(微镜)在平面中排列的构成。在作为空间光调制装置62而使用DMD的情况下，基于从光调制控制器68输入的驱动信号，以高速切换微镜的角度，控制使入射光反射的方向，由此，能够控制与每个微镜对应的区域的射出光量。
由此，活化照明系统63将从水银灯61射出的活化光L3通过空间光调制装置62来进行调制从而能够作为具有所希望的照射强度分布的面照明而向显微镜主体15供给。
在第二实施方式的显微镜装置60中，作为调制活化光L2的装置而使用空间光调制装置62，因此与第一实施方式同样地，对于观察视野能够对其每个区域照射照射强度被控制了的活化光L2。因此，能够实施与第一实施方式相同的观察方法。
此外，在第二实施方式的活化照明系统63中，不需要如第一实施方式的活化照明系统13那样设置扫描激光的扫描器。
(第三实施方式)
在以上实施方式中，说明了在活化用与激发用中使用波长不同的两种激光的显微镜装置。另一方面，作为仅使用一种短波长激光的超分辨率显微镜技术，已知有dSTORM(direct Stochastic OpticalReconstruction Microscopy；直接随机光学重建显微镜)(例如论文：Applied Physics B(2008)93：725-731，Photoswitching microscopy withstandard fluorophores，S.van de Linde·R.Kasper·M.Heilemann·M.Sauer)。在dSTORM中，不会如以往的STORM那样照射活化用的激光，而是以荧光物质的自发的闪烁为基础，取得仅有少量荧光色素的图像。
第三实施方式的荧光显微镜装置为应用了该dSTORM的构成。
作为第三实施方式的显微镜装置，能够采用从图1所示的显微镜装置10省略了活化照明系统13的构成。在该构成的显微镜装置中，将如下试样配置在显微镜主体15的载物台31上的观察区域中，该试样含有若通过激发照明系统11被照射规定波长的激发光则自发地闪烁的荧光物质，通过对该观察区域从激发照明系统11照射激发光而使荧光物质闪烁，并通过照相机34拍摄从荧光物质放射的光，由此取得荧光图像。
在第三实施方式的显微镜装置中，控制部14基于来自照相机控制器19的信号来测定观察区域的荧光强度分布，并基于荧光强度分布来设定观察区域的每部分的激发光的照射强度。而且，控制部14使对观察区域照射按每部分设定的照射强度的激发光的动作、和取得观察区域的由激发光激发的荧光图像的动作交替地反复进行多次，从而由多张荧光图像生成试样图像。
因此，第三实施方式的观察方法的步骤与图2所示的第一实施方式的观察方法同样，具有分布测定步骤S101、照射强度设定步骤S102和图像形成步骤S103。但是在本实施方式的情况下，在分布测定步骤S101中，不是采用活化照明系统13而是采用激发照明系统11。
在本实施方式中，在分布测定步骤S101中，由激发照明系统11对观察区域照射强度分布均匀的激发光L1。然后，经由照相机控制器19使照相机34动作，由此拍摄从照射了激发光L1的荧光物质所射出的荧光。所拍摄的第一荧光图像从照相机控制器19向控制部14发送。控制部14算出第一荧光图像中的二维亮度分布(荧光强度分布)。
然后，在照射强度设定步骤S102中，与第一实施方式同样地，根据二维强度分布制成二维强度分布图。
另一方面，在图像形成步骤S103中，一边基于在照射强度设定步骤S102中制成的二维强度分布图调制照射强度一边向试样照射激发光L1，由此取得数百至数万张第二荧光图像，并从第二荧光图像生成试样图像。在第一实施方式中对活化光L2的强度进行了调制，但是在本实施方式的情况下，因为仅通过照射激发光L1而使荧光物质发光，所以一边调制激发光L1的强度一边照射。
根据以上说明的第三实施方式，与之前的实施方式相同地，即使在荧光物质的分布具有较大的不平均的情况下，也能够得到高分辨率的图像。另外，因为使用通过激发光的照射而自发地闪烁的荧光物质，所以能够使照明系统简单化。
(第四实施方式)
在之前的第一实施方式中，关于使用了若在活化后被照射激发光则发出荧光且变成非活化状态的荧光物质的显微镜技术(STORM)进行了说明，但是作为荧光物质的种类不同的同样的技术还知道有PALM(Photoactivated Localization Microscopy；光激活定位显微技术)(例如，日本特表2008-542826号公报，论文：Proposedmethod for molecular optical imaging，Optics Letters，vol.20，NO.3，(Feb.1，1995)，pp.237-239.)。
之前的第一实施方式的观察方法的步骤也可以直接应用在将PALM用于试样图像的取得的情况，不需要改变显微镜装置10、60的构成。在显微镜装置10或者显微镜装置60中，控制部14基于来自照相机控制器19的信号来测定观察区域的荧光强度分布，并基于荧光强度分布来设定观察区域的每部分的激发光的照射强度。而且，控制部14使对观察区域照射按每部分设定了照射强度的活化光的动作、和照射激发光而取得荧光图像的动作交替地进行多次，从而由多张荧光图像生成试样图像。
在使用PALM的情况下，变更了付与给试样的荧光物质。具体地说，作为荧光物质，使用了若被照射规定波长的活化光则变为活化状态、若在活化状态下被照射波长与活化光不同的激发光则发出荧光的荧光物质。
作为这种荧光物质能够列举从水母或珊瑚中得到的荧光蛋白质的变异种。例如，从水母得到的作为荧光蛋白质的变异种的PA-GFP因活化光的照射而荧光强度大幅上升，PS-CFP因活化光的照射而能够发光地变化为其他颜色的荧光。另外，从珊瑚得到的作为荧光蛋白质的变异种的Dronpa因活化光的照射而能够在激发波长的光的照射下发光，Kaeda因活化光的照射而荧光色变化。
在本实施方式的观察方法中，也通过依次执行图2所示的分布测定步骤S101、照射强度设定步骤S102和图像形成步骤S103而能够得到高分辨的试验图像。
在分布测定步骤S101的步骤S11中，在从活化照明系统13向试样照射均匀强度的活化光L2后，向试样照射激发光L1，且通过对所发出光的观测而取得第一荧光图像。在本实施方式的情况下，也能够取得例如图4所示的第一荧光图像E1。
此外，在使用即使在不照射活化光的状态下通过激发光的照射也发光的荧光蛋白质(PS-CFP、Kaede)的情况下，由于只要观测变化前的荧光(PS-CFP的蓝色光、Kaede的绿色光)即可，所以不需要分布测定步骤S101中的活化光的照射。
另外，在使用能够变为非活化状态的荧光物质的情况下，也可以在分布测定步骤S101的执行后使荧光物质变为非活化状态，从而抑制荧光物质的逐渐退色。例如，在使用可点燃的荧光蛋白质(Kindling Fluorescent Protein)的情况下，只要使在分布测定步骤S101中照射的活化光的照射强度成为在荧光物质中产生自发的非活化的照射强度即可。另外，也可是使用如Dronpa那样通过激发光的连续照射而返回至非活性状态的荧光蛋白质。
接下来，在步骤S12中，算出第一荧光图像中的二维强度分布。该步骤中的具体处理与第一实施方式相同，由此取得图5所示的二维亮度分布EM。
接下来，在照射强度设定步骤S102中，制成基于二维亮度分布EM的活化光L2的照射强度的二维分布图。该步骤中的具体处理与第一实施方式相同，所制成的二维强度分布图保存在存储部16中。
接下来，在图像形成步骤S103的步骤S14中，向试样照射使用如上所述制成的二维强度分布图而调制了的活化光L2。即，基于二维强度分布图，对荧光物质以高密度存在的区域照射强度相对低的活化光L2，另一方面，对荧光物质以低密度存在的区域照射强度相对高的活化L2。由此，使活化的荧光物质的密度在整个视野中平均化。
接下来，在步骤S15中，向试样照射激发光L1。由此，活化状态的荧光物质发光，该所发出光被照相机34拍摄，取得第二荧光图像。在本实施方式的情况下，也与第一实施方式同样地，得到如图6所示的第二荧光图像E2那样荧光的亮点以大致均匀的密度存在的第二荧光图像。所取得的第二荧光图像在步骤S16中保存在存储部16中。
此外，在本实施方式的情况下，步骤S15、S16中的第二荧光图像的取得动作反复执行，直到在步骤S14活化了的荧光物质退色、或返回至非活性状态。
接下来，在步骤S17中，判断拍摄的结束，且在拍摄未结束的情况下，返回至步骤S14，再次执行对试样照射活化光L2的动作。通过该活化光L2的照射，使未退色的荧光物质活化。然后，执行步骤S15、S16的第二荧光图像的取得、保存动作。
若从步骤S14至步骤S16被反复执行预先设定的次数，则在步骤S17中判断为拍摄结束，且移至步骤S18。而且，通过执行步骤S18的图像处理动作而由多张第二荧光图像制成高分辨率的试样图像。
根据以上说明的第四实施方式，与之前的实施方式相同地，即使在荧光物质的分布具有较大的不平均的情况下，也能够得到高分辨率的图像。
(第五实施方式)
图9～图11是第五实施方式的观察方法的说明图。图9是表示在之前的实施方式中使用的观察方法(第一方式)的图。图10是表示观察方法的第二方式的图。图11是表示观察方法的第三方式的图。第二方式的观察方法能够适用于上述第一、第二、第四实施方式，第三方式的观察方法能够适用于之前的第一～第四实施方式的任意一个。
此外，在图9～图11中，仅对图2所示的各步骤中的需要说明的步骤进行示出并说明。具体地，省略了计算二维亮度分布的步骤S12、制成二维强度分布图的步骤S13、和保存第二荧光图像的步骤S16等的图示。
在上述第一、第二、第四实施方式的显微镜装置中的第一方式的观察方法中，如图9所示，在为了测定荧光物质的分布而取得第一荧光图像的步骤S11中，首先执行向试样照射活化光L2以使试样所含的荧光物质活化的步骤S1。然后，执行向试样照射激发光L1且检测从试样发出的荧光以取得第一荧光图像的步骤S2。
另外，在STORM(PALM)拍摄处理中，向试样照射基于二维强度分布图控制了照射强度的活化光L2以使荧光物质活化的步骤S14、和照射激发光L1而使荧光物质发光并取得第二荧光图像的步骤S15被按照该顺序反复执行，直到取得规定张数的第二荧光图像。
相对于以上所述，在图10所示的第二方式中，在为了测定荧光物质的分布而取得第一荧光图像的步骤S11中，同时执行向试样照射活化光L2的步骤S1、和向试样照射激发光L1来取得第一荧光图像的步骤S2。此时，不需要使步骤S1与步骤S2的开始时刻以及结束时刻一致，只要至少具有同时执行的期间即可。
通过如上述那样地同时执行步骤S1、S2，能够使荧光物质的活化和激发大致同时进行且使荧光物质发光。因此，通过第二方式的观察方法也能够取得与第一方式同样的第一荧光图像，且能够得到荧光强度分布。
另外，在图10所示的第二方式中，在STORM(PALM)拍摄处理中，也同时执行向试样照射活化光L2的步骤S14、和向试样照射激发光L1来取得第二荧光图像的步骤S15。此时，也不需要使步骤S14与步骤S15的开始时刻以及结束时刻一致，只要至少具有同时执行的期间即可。
通过使步骤S14、S15同时执行，能够使荧光物质的活化、激发大致同时进行且使荧光物质发光，因此能够取得与第一方式相同的第二荧光图像。
此外，在针对一次活化光照射而进行多次激发光照射以及图像取得的情况下，只要在对试样照射活化光L2的期间，至少进行一次激发光的照射即可。例如在进行三次激发光L1的照射的情况下，只要使最初的激发光L 1的照射期间为与活化光L2的同时照射期间即可，也可以在活化光L2的照射期间中进行两次激发光L1的照射。
根据上述的第二方式的观察方法，荧光物质的活化与激发同时执行。由此，与之前的第一方式相比，能够缩短图像取得所需要的时间，从而能够高效地进行超分辨率图像的测定以及制成。
接下来，在之前的第一～第四实施方式中，如图2所示，分别仅执行一次用于得到荧光物质的分布的分布测定步骤S101、和用于控制活化光L2的照射强度的二维强度分布图的制成。
相对于此，在图11所示的第三方式的观察方法中，首先执行取得第一荧光图像的步骤S11(步骤S1、S2)，然后多次(图示中为四次)执行照射根据基于第一荧光图像而制成的二维强度分布图调制了的活化光L2的步骤S14、和照射激发光L1来取得第二荧光图像的步骤S15。
而且，在取得规定张数的第二荧光图像后，再次执行取得第一荧光图像的步骤S11(步骤S1、S2)，并通过基于该第一荧光图像的计算而更新二维强度分布图。
然后，照射基于更新了的二维强度分布图而调制了的活化光L2的步骤S14、和照射激发光L1来取得第二荧光图像的步骤S15被执行规定次数。另外，根据需要执行更新二维强度分布图的动作。
在第三方式中，二维强度分布图的更新动作的间隔能够任意设定。二维强度分布图的更新动作只要在取得规定张数的第二荧光图像的期间设定至少一次即可，也可以设定为每当取得规定张数(例如100张、500张、1000张等)的第二荧光图像时执行。
在图11所示的第三方式中，在取得数百张至数万张的第二荧光图像的动作中更新二维强度分布图，因此，使用与荧光物质的退色状况对应的二维强度分布图来调制活化光L2，该荧光物质的退色状况随着STORM(PALM)拍摄处理的进行而变化。由此成为能够高效地取得包含有适当数量的荧光亮点的第二荧光图像的观察方法。
(第六实施方式)
根据上述各实施方式的显微镜装置，不仅能够进行固定样本观察，而且能够进行例如图12所示的活细胞观察。以下，说明使用第一实施方式的显微镜装置进行活细胞观察的情况。此外，使用第二～第四实施方式的显微镜装置进行活细胞观察的情况也是完全相同的。
在图12中示出了由细胞核100、和由从细胞核100的表面延伸的多个微细管101构成的微细管网的概略。图中的虚线表示细胞核100的表面，从该表面向着外侧延伸有多个微细管101。
在细胞核100的表面附近，由于微细管101非常密集，所以在该密集区域中，附着在微细管101上的荧光物质的密度相对较高。另外，由于在细胞核100表面存在多个生成微细管101的组织，所以若在该组织上附着有荧光物质，则荧光物质的密度变得更高。另一方面，在从细胞核100离开的位置上，由于微细管101变得稀疏，所以与细胞核100的表面附近相比较，荧光物质的密度显著降低。
在通过第一实施方式的显微镜装置10进行活细胞观察的情况下，也依次执行图2所示的分布测定步骤S101、照射强度设定步骤S102和图像形成步骤S103。由此，得到高分辨率的活细胞图像。
分布测定步骤S101以及照射强度设定步骤S102的动作与第一实施方式相同。即，在分布测定步骤S101中，在向试样照射均匀强度的活化光L2的动作后，执行向试样照射激发光L1来取得第一荧光图像的动作，且算出该第一荧光图像中的二维强度分布。
在照射强度设定步骤S102中，制成基于二维亮度分布的活化光L2的照射强度的二维强度分布图。所制成的二维强度分布图保存在存储部16中。
在图12所示的观察活细胞的情况下的二维强度分布图中，对于细胞核100的表面附近的微细管101密集的区域，活化光L2的照射强度被设定得相对低，对于从细胞核100离开的微细管101稀疏存在的区域，活化光L2的照射强度被设定得相对高。
接下来，在图像形成步骤S103的步骤S14中，使用上述制成的二维强度分布图来向试样照射活化光L2。即，基于上述的二维强度分布图，对荧光物质以高密度存在的区域照射强度相对低的活化光L2，另一方面，对荧光物质以低密度存在的区域照射强度相对高的活化光L2。由此，使活化的荧光物质的密度在整个视野中平均化。
接下来，在步骤S15中，向试样照射激发光L1，通过用照相机34拍摄从活化状态的荧光物质发出的荧光，从而取得第二荧光图像。在本实施方式的情况下，也与第一实施方式同样地，能够得到如图6所示的第二荧光图像E2那样荧光的亮点以大致均匀的密度存在的第二荧光图像。所取得的第二荧光图像在步骤S16保存在存储部16中。
接下来，在步骤S17中，判断拍摄的结束，且在拍摄未结束的情况下，返回至步骤S14，再次执行对试样照射活化光L2的动作。通过该活化光L2的照射，使未退色的荧光物质活化。然后，执行步骤S15、S16的第二荧光图像的取得、保存动作。
在进行活细胞观察的情况下，基于步骤S14～S17的第二荧光图像的拍摄速度被设定得比较快，例如每秒取得500张左右的第二荧光图像。在几分钟的整个测定时间中，取得数万张～二十万张左右的第二荧光图像。
若从步骤S14至步骤S16被反复执行了预先设定的次数，则在步骤S17中判断为拍摄结束，且移至步骤S18。
在步骤S18中，由取得的第二荧光图像制成试样图像，但在活细胞观察的情况下，制成用于按时间顺序显示微细管101等的运动的时序图像。具体地，使以测定时刻顺序排列的第二荧光图像沿着时序每隔规定的时间间隔或者规定的张数而被划分，并按每次划分生成将第二荧光图像重叠而成的时序图像。例如，执行将第二荧光图像沿着时序每隔250张划分，将这些250张的第二荧光图像重叠来制成一张时序图像的动作。由此，例如在以每秒500张进行三分钟测定的情况下，由9万张第二荧光图像制成360张时序图像。
所制成的时序图像在连接于显微镜装置上的监视器(显示装置)中连续地显示。由此，通过超分辨率图像的动画来表现微细管101等的运动。时序图像的显示方法能够采用任意的方法。例如，能够采用一边使随着时间的经过而构成图像的点的颜色从蓝色系变化为红色系等一边进行显示的方法。
如本实施方式那样，在进行活细胞观察的情况下，通过一边基于二维强度分布图调制活化光L2、一边取得第二荧光图像，从而能够得到鲜明的时序图像。
具体地，由于在图12所示的细胞核100的表面附近与从细胞核100离开的位置上，微细管101的密集度存在较大的差，所以若以与微细管101密集的区域配合的照射强度均匀地照射活化光L2，则在微细管101的前端侧的区域中，荧光亮点几乎观测不到，微细管101的运动完全无法观察。另一方面，若以与微细管101的前端侧的荧光物质的密度配合的照射强度均匀地照射活化光L2，则由于细胞核100的表面附近的荧光亮点过多，所以图像溃散而无法观察。因此，通过该观察方法只能在视野内的特定部分进行最佳的解析。
相对于此，在本实施方式中，对荧光物质的密度不同的区域分别照射最佳照射强度的活化光L2，因此能够从细胞核100的表面附近到微细管101的前端部分的范围内得到鲜明的图像，且能够观察较宽范围的微细管101随时间的运动。
此外，在进行活细胞观察的情况下，由于在观察中细胞会移动，所以优选采用在之前的第五实施方式中说明的第三方式的观察方法，一边随时更新二维强度分布图，一边取得第二荧光图像。例如，优选每当取得为了制成一张时序图像而需要的第二荧光图像时就进行二维强度分布图的更新。由此，能够基于与因细胞移动而产生的荧光物质的分布变化对应的二维强度分布图来调整活化光L2，且能够取得荧光亮点的分布被平均化了的第二荧光图像。
(第七实施方式)
在上述第一至第六实施方式中，在步骤S14中，向试样照射基于二维强度分布图调制了的活化光L2(STORM/PALM)或者激发光L1(dSTORM)，但是也能够使活化光L2或者激发光L1的照射强度在视野内恒定。
具体地，在分布测定步骤S101的步骤S11中，取得第一荧光图像，接着在步骤S12中算出第一荧光图像中的二维强度分布。
而且，在照射强度设定步骤S102中，基于二维强度分布中的放射强度的最大值，设定活化光L2的照射强度。即，活化光L2的照射强度被设定为，在放射强度最大的区域中能够得到适当的荧光亮点间隔(光学分辨率的三倍以上)。
接下来，在图像形成步骤S103中，以规定次数反复执行以在照射强度设定步骤S102中设定的照射强度向试样照射活化光L2的步骤S14、和通过向试样照射激发光L1而取得第二荧光图像的步骤S15，从而取得数百至数万张的第二荧光图像。然后，在步骤S18中，由第二荧光图像生成试样图像。
在本实施方式中，基于在分布测定步骤S101中观测的放射强度的最大值，来设定在图像形成步骤S103中向试样照射的活化光L2的照射强度，因此，能够防止在第二荧光图像中荧光亮点的间隔过窄而使图像溃散。
另外，由于不需要用于使活化光L2的照射强度在视野内不同的空间光调制装置62等，所以能够以低价格构成显微镜。
附图标记说明
10、60 显微镜装置
11 激发照明系统
13 活化照明系统
14 控制部
15 显微镜主体
16 存储部
17 显示部
18 AOTF控制器
19 照相机控制器
21、41 激光光源
22 快门
31 载物台
32 全反射镜
33 分色镜
34 照相机
42 AOTF
43 扫描器
61 水银灯
62 空间光变调装置
68 光变调控制器
L1激发光
L2、L3 活化光
S101 分布测定步骤
S102 照射强度设定步骤
S103 图像形成步骤

Claims (20)

1.一种显微镜装置，其特征在于，具有：
分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；
照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述活化光的照射强度；和
图像形成装置，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述活化光的动作、和对所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
2.一种显微镜装置，其特征在于，具有：
分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；
照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述激发光的照射强度；和
图像形成装置，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
3.一种显微镜装置，其特征在于，具有：
分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；
照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述活化光的照射强度；和
图像形成装置，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述活化光的动作、和对所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
4.一种显微镜装置，其特征在于，具有：
分布测定装置，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；
照射强度设定装置，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述激发光的照射强度；和
图像形成装置，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
5.根据权利要求1或3所述的显微镜装置，其特征在于，
所述图像形成装置使对所述观察区域照射所述活化光的动作、和对照射了活化光后的所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作交替地反复进行，由此取得多张所述荧光图像。
6.根据权利要求1或3所述的显微镜装置，其特征在于，
所述图像形成装置使对所述观察区域照射所述活化光的动作和照射所述激发光的动作在至少一部分的期间中同时执行。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的显微镜装置，其特征在于，
在所述图像形成装置中向所述试样照射的所述活化光或者所述激发光的照射强度，在所述荧光强度分布中所述荧光强度相对高的区域中被设定为相对低的强度，在所述荧光强度相对低的区域中被设定为相对高的强度。
8.根据权利要求7所述的显微镜装置，其特征在于，
所述照射强度设定装置将所述荧光强度分布按照每个规定的荧光强度的范围分类为多个水准，并对各个所述水准的每一个设定照射强度。
9.根据权利要求7所述的显微镜装置，其特征在于，
所述照射强度设定装置基于使所述荧光强度分布灰度反转而成的分布来设定照射强度。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的显微镜装置，其特征在于，
所述照射强度设定装置基于由所述图像取得装置取得的所述荧光图像中的荧光亮点的密度，对所述活化光的照射强度进行再设定。
11.根据权利要求10所述的显微镜装置，其特征在于，
所述照射强度设定装置反复进行所述活化光的照射强度的设定，直到由所述图像形成装置取得的所述荧光图像中的荧光亮点的平均间隔成为该显微镜装置的光学分辨率的两倍以上。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的显微镜装置，其特征在于，
所述照射强度设定装置将所述活化光或者所述激发光的照射强度以与所述荧光强度分布中的所述荧光物质的密度相对高的区域相配合的方式设定，
所述图像形成装置对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述活化光或者所述激发光。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的显微镜装置，其特征在于，
所述图像形成装置生成信息附加图像，所述信息附加图像是对所生成的所述试样图像附加所述活化光或者激发光的照射强度分布的信息而成的。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的显微镜装置，其特征在于，
所述图像形成装置在使多张所述荧光图像重叠而生成所述试样图像时，使在多张所述荧光图像间存在于视为相同的坐标处的多个荧光亮点为单一的荧光亮点。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的显微镜装置，其特征在于，
所述图像形成装置将多张所述荧光图像按照时序每隔规定的时间间隔或者规定的张数划分，且将属于各次划分的多张所述荧光图像重叠，由此生成多张时序图像。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的显微镜装置，其特征在于，
所述分布测定装置以及所述图像形成装置通过全反射荧光观察而取得所述荧光图像。
17.一种观察方法，其特征在于，具有：
分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；
照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述活化光的照射强度；和
图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述活化光的动作、和对所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
18.一种观察方法，其特征在于，具有：
分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；
照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定向所述观察区域照射的所述激发光的照射强度；和
图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射所设定的所述照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
19.一种观察方法，其特征在于，具有：
分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的活化光则活化、若在活化状态下被照射波长与所述活化光不同的所述激发光则发出荧光；
照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述活化光的照射强度；和
图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述活化光的动作、和对所述观察区域照射所述激发光而取得荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
20.一种观察方法，其特征在于，具有：
分布测定步骤，向配置了含有荧光物质的试样的观察区域照射激发光而取得荧光图像，且测定所述观察区域的荧光强度分布，所述荧光物质若被照射规定波长的所述激发光则自发地闪烁；
照射强度设定步骤，基于所述荧光强度分布来设定所述观察区域的每个部分的所述活化光的照射强度；和
图像形成步骤，将包括对所述观察区域照射按各所述部分设定的照射强度的所述激发光的动作、和取得所述观察区域的由所述激发光激发的荧光图像的动作的动作反复进行多次，由此取得多张所述荧光图像，且由多张所述荧光图像生成试样图像。
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