CN101484794A - 用于试样结构的空间高分辨率成像的方法和荧光显微镜 - Google Patents
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Abstract
为了使感兴趣的试样结构以空间高分辨率成像而实施以下步骤：选择利用转换信号能够重复地由具有第一光学特性的第一状态转换至具有第二光学特性的第二状态并且能够由第二状态返回第一状态的物质；用物质标记感兴趣的试样结构；用转换信号将变化比例的物质转换至第二状态；在传感器阵列上使试样成像，其中成像的空间分辨率极限大于试样中物质的紧邻分子之间的平均距离；及利用传感器阵列记录由第二状态的物质的各个部分发出的光学测量信号；其特征在于，在转换一部分物质至第二状态时调节转换信号的强度，从而使至少10％的物质各自转换至第二状态的分子与其紧邻的第二状态的分子的距离大于传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限。
Description
技术领域
本发明涉及试样结构的空间高分辨率成像方法。此外，本发明还涉及一种与此相反的方法。此外，本发明还涉及用于实施该方法的荧光显微镜。
背景技术
WO 2004/090617公开了一种方法。在此，在用转换信号将物质转换至第二状态时均只有试样的特定空间区域针对性地发出。该区域是具有零点的干涉模式的强度最小值，而转换信号的强度已经在零点的所有环境中的大小使其超过将物质完全转换至第二状态的饱和极限值。以此方式，从各自保留在第一状态下的一部分物质发出的光学测量信号可以设置针对性地用转换信号发出的试样区域。因此，在用物质标记的感兴趣的试样结构成像时，空间分辨率不再取决于在所用传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限。更精确而言，空间分辨率是由转换信号零点的延伸确定的，在此之内物质还处于第一状态，因为从零点周围环境没有测量信号，相应地也不必设置待从零点分离的空间位置。因此，在感兴趣的试样结构空间成像时，可能的是，不会超出分辨率极限(即通过双倍数量的口径分散的通过光波长给定的衍射条件的Abbe′sche极限)，其基本上限制了成像的光学方法的空间分辨率并且直接取决于最长波长的相关光学信号。
在试样内部的转换信号的零点位置的确定可以由测量信号的强度分布是通过具有比成像的空间分辨率极限更高精度的传感器阵列而进行的，只要确定测量信号仅来自于该零点的区域。在确定位置时可达到的精度除了取决于零点的大小外，原则上仅取决于传感器阵列的像素密度，该传感器阵列通常是CCD照相机或CMOS照相机，以及取决于所得的信噪比和成像的点成像函数的宽度。具体而言，在确定位置时可达到的精度甚至远远在通过成像比例分散的传感器阵列的像素的距离之下；在良好的信噪比时甚至远低于1纳米，这对于本领域技术人员是已知的。
众所周知，该现象即使在确定发荧光的单个分子在试样中的位置时也加以利用。但是在此的前提条件是，发荧光的单个分子与它们各自最近邻的分子的距离大于在传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限，因为另一方面从传感器阵列接收到的光学测量信号与发荧光的单个分子互相结合。在此发生时，单个分子的位置无法没有困难地加以确定。
在由WO 2004/090617 A2公开的方法和所有的其他方法中，用发出测量信号的物质，尤其是发荧光的物质，标记感兴趣的试样结构，物质分子在试样中的密度的大小，使得单个分子与它们最近邻的分子的距离仅对应于传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限的一小部分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法以及实施方法的装置，利用该方法在感兴趣的试样结构成像时无法超越衍射极限，而不必为此将具有空间上精细结构化的强度分布的转换信号施加在试样上。
本发明的目的是通过根据本发明的方法以及根据本发明的装置实现的。
在根据本发明的第一新方法中，记录从第二状态中的物质的各部分发出的光学测量信号，在将一部分物质转换至第二状态时，调节转换信号的强度，使得各自转换至第二状态的分子的主要百分比部分与其最近邻的第二状态中的分子的距离大于在传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限。对于属于该主要百分比部分的物质的每个分子，其在试样中的位置是以基本已知的极高的位置分辨率从由其发出的光学测量信号通过传感器阵列的强度分布而确定的，该位置分辨率明显低于在传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限。但这也允许用物质标记的感兴趣的试样结构以极高的位置分辨率成像。只须不断将物质的其他分子转换至第二状态，在此该分子属于第二状态中的物质的主要百分比部分的分子，其与第二状态中的与其最近邻的分子的距离大于在传感器上的试样成像的空间分辨率极限。但这不成问题，因为适合于这些条件的分子的选择是基于跃迁概率，因而服从统计学规律。因为通过每次变换循环以统计学方式看，物质的其他分子更早转换至第二状态，所以对于用物质标记的总是具有更高密度的试样结构询问单个物质分子的位置。这些位置之和是用新方法获得的感兴趣结构的成像，其具有远超过通常分辨率极限的位置分辨率。在此，甚至单个分子可重复属于满足在此提出的标准的选择。然后，在总是只有较小比例的总计存在于试样所考虑的范围内的分子转换至第二状态并满足距离标准时，其精确位置可多重确定的分子的比例对于在通常重复将一部分物质转换至第二状态时只有一次属于可精确地确定位置的主要百分比部分的分子而言是可忽略的。即使该比例更大，由此可能损害效率，特别是速度，但是不损害新方法的功能。基于此，通过选择用于以最高位置分辨率定位的分子，由于跃迁概率，实施其定位的分子的总量在足够大的数量时，即足够大的抽验数量时，根据统计学规律是存在于试样中的物质分子的总量的代表，因而是用其标记的感兴趣的试样结构的代表。
为了可以由来自第二状态中的物质分子的测量信号通过传感器阵列的强度分布确定的分子在试样中的位置的位置分辨率高于在传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限，应当理解传感器阵列的像素的栅距必须至少小于空间分辨率极限与成像的成像系数之积。栅距优选最大仅为空间分辨率极限与成像的成像系数之积的一半，从而使来自一个分子的测量信号分配到传感器阵列的至少四个像素上。传感器阵列的像素的更小的栅距是与在确定分子在试样中的位置时位置分辨率没有相应地提高相关联的。反而产生信噪比明显变差的危险。栅距是空间分辨率极限与成像的成像系数之积的60至10％，所以通常是最有利的。
各自在一个时间点转换至第二状态的分子的主要百分比至少为10％，其满足在第二状态中的分子的距离大于在传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限的标准。尤其是当第二状态中的相互距离较小的分子的与此互补的百分比比较大时，重要的是，将由此发出的测量信号或其通过传感器阵列的强度分布与由足够距离外的分子发出的测量信号分离。这可以如下方式进行，检验测量信号的总强度、测量信号通过传感器阵列的强度分布的形状和/或面积是否对应于单个或多个分子。仅对于相应于单个分子的情况，由强度分布确定这些分子的位置。应当理解有意义的是，对于尽可能大的百分比的所记录的局部强度分布，可以确定物质的单个分子的位置及因此感兴趣的试样结构的位置。因此，优选地尽可能大的百分比的均转换至第二状态的分子与第二状态中的相邻分子之间具有所需的距离。该百分比以该顺序以增加的量而占先。然而，意义不大的是，试验对于所有转换至第二状态的分子而言，避免其不具有同样处于第二状态且距离小于在传感器上的试样成像的空间分辨率极限的相邻分子，因为在此各自可处于第二状态的分子的平均距离非常大，所以在转换至第二状态的过程之后可以确定的分子位置的数量再次减少。利用转换信号的强度，感兴趣的试样结构最终可以最迅速地成像，即通过最少次重复的转换过程，最终取决于在测量信号通过传感器阵列的强度分布之间加以区分的复杂程度的大小，其归于仅一个第二状态的分子或者第二状态的两个或更多个相邻的分子。
虽然由于其更简单的可操作性而优选为光学转换信号，因为该新方法即使没有试样范围中的转换信号的空间结构化也是可以的，所以转换信号实际上也可以是非光学信号。利用光学转换信号例如可以容易地用转换信号的不同强度进攻试样的不同区域，从而考虑用以标记感兴趣的试样结构的物质在这些不同区域内以明显不同的浓度存在。然而，在该新方法中通过尺寸大于传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限的区域的转换信号的强度总是具有恒定的值。可以具体地确定该恒定的值与物质在试样的该区域中的平均局部浓度成反比。为了确定该浓度，首先物质转换至第二状态的比例大于之后在单个分子定位时的情况，为此也调节转换信号的强度大于用传感器阵列定位单个分子时的情况。因此，得出的测量信号通过传感器阵列的强度分布对应于通过试样的第二物质的浓度分布，其中该浓度分布的位置分辨率通过在传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限而加以确定。
为了非常迅速地确定，由试样对应于传感器阵列的多个像素的区域发出的测量信号归于物质的一个或多个分子，因而是否值得记录测量信号的强度分布以由此进行单个分子的定位，该区域可平行于光传感器上的传感器阵列而成像，用其可观察到由该区域发射单个光子的时间顺序。若在该区域中只有单个分子处于第二状态，则由此发射出的测量信号光子具有时间上的最小距离，因为该分子在其一个激发循环中只能发射一个光子。相应地，更短地彼此紧接着的光子表明它们是由在该区域中处于第二状态的多个分子发射出的。在此情况下，中断记录测量信号的强度分布的过程，并重新试验在该区域中将物质的仅单个分子转换至第二状态。用于观察由该区域发射单个光子的时间顺序的光传感器可以具有单个传感器单元，条件是其在记录第一个光子之后的时滞足够短。否则光传感器应由两个传感器单元构成，利用它们在重合传感器的意义上针对性地探测几乎同时由该区域发射出的光子。这是关于该物质的多个同时在该区域中处于第二状态的分子的暗示。
如本发明的说明书所述，尤其是涉及该新方法的这些实施方案，其中该物质选自以下亚组：在第二状态中利用光学激发信号可激发而自发地发射荧光的物质，该荧光利用传感器阵列被记录为光学测量信号。
此外，该物质还可选自以下亚组：利用光学反向信号可由第二状态转换返回至第一状态的物质。在此情况下，在利用转换信号将物质的其他部分转换至第二状态之前，可以针对性地利用反向信号将预先转换至第二状态的一部分物质转换返回至第一状态。因而无须等待一个时间段，在该时间段中物质分子例如由于热激发或者还在此处首先应激发以自发地发射荧光的光学评估信号的影响下由第二状态转换返回至第一状态。然而，若第二状态的物质分子的半衰期具有有利的数量级，则该新方法还可以非常有效地实施，条件是该物质无法利用光学反向信号由第二状态转换返回至第一状态。
用于该新方法中的物质的一个特别有利的组是由一个(能量)供体和一个(能量)受体构成的通常缩写为FRET对的所谓的
谐振能量传输对。首先是该FRET对特别适合用于该新方法中，其中受体是对光反应变色的，并利用转换信号加以转换，以改变供体的荧光特性。在此，受体本身可以是发荧光的，但是这在该新方法中通常无法利用。
在由蛋白质限定的感兴趣的试样结构的情况下，有利的是用以标记感兴趣的结构的物质在基因技术上嵌入该分子中或者悬挂在其上。在此，直接实施嵌入或悬挂，即标记物质本身可以在融合蛋白的意义上直接用于试样中的蛋白质中或者悬挂在其上。但是标记物质的仅一个连接位也可用于蛋白质中或者悬挂在其上，然后通过该连接位可以用物质进行标记。一个用于标记蛋白质的荧光蛋白质的原则上已知的连接位本身例如由蛋白质的氨基酸序列中的4个半胱氨酸序列组成，即由一个所谓的四半胱氨酸基序组成。特别有利的是，通过表达试样中的至少一个细胞中的如此改性的蛋白质以代替原来的蛋白质而在试样中于基因技术上将物质或物质的连接位嵌入蛋白质中或者悬挂在蛋白质上，从而使感兴趣的结构直接由此显示为标记物质或者这些改性蛋白质的连接位。
在标记物质的单个分子在试样中的位置定位时，极高的位置分辨率使得能够观察到试样中非常小的结构的空间排列。该结构可由单个蛋白分子组成，然后该蛋白分子于多个不同的点用物质标记。这些点完全典型地相邻接的距离小于蛋白质的各种可想象的光学成像时的空间分辨率极限。在该新方法中，在一个时间点各自在蛋白分子用物质标记的仅一个点询问物质的测量信号。在每次重复询问时，再次仅在一个标记点用转换信号将该物质转换至提取测量信号的第二状态。这甚至可以是之前的同一点。但是因为该过程通过跃迁概率加以控制，所以在足够多次重复询问时稳固地开始对该物质在蛋白分子的所有标记点进行询问，并相应地以最高的位置分辨率确定蛋白分子的所有标记点的位置。在此，位置分辨率的大小使得能够观察到蛋白分子的蛋白折叠及其他构象变化。
在该新方法中，所有用物质标记的结构的成像要求相对更多次重复将相对更小比例的物质转换至第二状态，在该状态下它们发射出的测量信号用传感器阵列记录。若这些重复进行得非常迅速，则感兴趣的试样结构成像总共所需的时间总是仍然相对较短。然而，它们可以在此情况下以如下方式加以缩短，用至少两种不同的物质平行地实施该新方法，这些物质在它们各自的第二状态下发出可区分的光学测量信号。以如下方式限制该新方法的速度，第二状态的物质的具有足够距离的分子的密度以及由此在该新方法的一个循环中其位置可被确定的分子的数量自然地被限制。只要区分用于标记感兴趣的结构的两种不同物质的光学测量信号，使它们可以分离，则通过使用此类不同物质，在该新方法的一个循环中其位置被确定的分子的数量可以与不同物质的量成比例地提高。
如前所述，根据本发明的第二方法是第一方法的变体。具体而言，在第二方法中用传感器阵列记录光学测量信号，该光学测量信号并不是由转换至第二状态的物质分子发出的，而是由仍处于第一状态的物质分子发出的。相应地，在此本发明方法的实施方案在于，在将一部分物质转换至第二状态时，调节转换信号强度的大小，使得各自处于第一状态的分子的主要百分比部分与其最近邻的第一状态的分子的距离大于在传感器阵列上试样成像的空间分辨率极限。在考虑该区别时，根据本发明的第一新方法的所有前述实施方案至优选的实施方案也适合于第二新方法。该区别在此基本上仅能看出，随着标记物质在试样中浓度的增长，所需的转换信号强度并不是下降而是上升，因为在各自所考虑的区域内的更大数量的物质分子的情况下，更多的分子必须被转换至第二状态，从而仅保留该新方法可容许的低密度的第一状态的分子。最后所述的密度与试样中分子的浓度无关。
用于实施该新方法的两种实施方案的荧光显微镜与已知荧光显微镜不同，利用它们达到的空间分辨率大于衍射极限，不存在用于精细结构化来自转换信号源的转换信号的措施，而是根据该新方法由转换信号源的操纵设备调节转换信号的强度。
可以额外存在至少一个光传感器，在其上使对应于传感器阵列的多个像素的试样区域成像，以观察由该区域发射单个光子的时间顺序。如与该新方法有关的描述，利用该光传感器可以非常迅速地，尤其是在读取传感器阵列之前确定是否在各个区域中记录仅一个或多个物质分子的测量信号强度以例如中断记录而有利于一次新的试验，条件是并不确定仅来自单个分子的强度。其意义大于，读取传感器阵列通常是在结束该新方法的一次循环时的限制速度的因素。必须读取该传感器阵列，然后可以利用转换信号重新选择物质分子，然后它们处于显示测量信号的状态，因而测量信号可来自于该新选择的分子。适合于实施该新方法以及新型荧光显微镜的传感器阵列包括常用结构类型的CCD传感器阵列及优选的CMOS传感器阵列，在其选择中除了可以迅速读取以外还应注意，暗场噪声及读取噪声损失小，因此在实施该新方法时得到良好的信噪比。
此外，用于实施该新方法的新型荧光显微镜可以具有用于用反向信号进攻试样的一个分离的反向信号源。但是，如在该新方法中所述，用以标记感兴趣的试样结构的物质也可以自发地即以热激发的方式，由其第二状态转换返回至第一状态，或者该转换过程也可通过激发信号引发，利用该激发信号首先激发该物质以发射测量信号。
在本发明的有利的实施方案中，在说明书引言部分中所述的特征和多个特征的组合的优点仅是示例性的，并且可以改变或累积地发挥作用，而这些优点并非必须由根据本发明的实施方案实现。由附图，尤其是所示几何形状及多个组件相互之间的相对尺寸以及它们的相对顺序和有效连接，可以得出其他特征。本发明的不同实施方案的特征的组合同样可以偏离本发明所选择的反向关系，并由此被激发。这还涉及在不同附图中所示的或者在其说明中所述的特征。这些特征还可与不同的其他特征相结合。
附图说明
下面依据附图中所示的优选的实施方案进一步阐述和说明本发明。
图1所示为在用于实施在第一实施方案中使感兴趣的试样结构以空间高分辨率成像的新方法的第一实施方案中的荧光显微镜的结构；
图2所示为用于标记感兴趣的试样结构的物质的发荧光的分子的致密的均匀分布以及所得的通过传感器阵列的对应区域的荧光强度分布，在该传感器阵列上该试样在根据图1的荧光显微镜的情况下成像；
图3所示为在试样的一个区域内的单个分子及两个紧邻分子的情况下在传感器阵列上的测量信号的强度分布；
图4所示为通过根据图3的对应于一个分子的传感器阵列上的强度分布的截面图；
图5所示为通过根据图3的对应于两个紧邻分子的传感器阵列上的测量信号强度分布的截面图；
图6所示为相对于图1补充了约一个反向信号源的第二实施方案中的荧光显微镜的结构；
图7所示为荧光显微镜的另一个实施方案，在此相对于图1补充了一个光传感器；
图8所示为在根据图7的光传感器的观察区域内的单个分子；
图9所示为来自根据图8的分子的由根据图7的光传感器接收的测量信号的光子的时间顺序；
图10所示为根据图7的光传感器的观察区域内的两个分子；
图11所示为根据图10的两个分子的测量信号的光子的顺序；
图12所示为根据图1的荧光显微镜的实施方案中不同光学信号的时间顺序；
图13所示为根据图6的荧光显微镜的实施方案中不同光学信号的时间顺序；
图14所示为在该新方法中可用作标记感兴趣的试样结构的物质的由供体和受体组成的FRET对的结构和功能；及
图15所示为利用多个根据图14的FRET对标记单个蛋白分子。
具体实施方式
图1中所示的荧光显微镜1用于使试样2中感兴趣的结构以空间高分辨率成像。试样2中感兴趣的结构在此没有突出显示，而是用其分子具有两种状态的物质标记，第一状态不发荧光，第二状态通过来自激发信号源4的光学激发信号3激发而自发地发射荧光，该信号被记录为来自传感器6的测量信号5。所述物质的分子可用来自转换信号源8的光学转换信号7在第一和第二状态之间转换。在此没有分别再次给出的转换信号源8的操纵设备如此设计，使其调节转换信号7的强度，从而用以标记试样2感兴趣的结构的第二状态的物质的分子的量各自仅使第二状态的发荧光的分子的距离大于在传感器阵列6上以图1中仅粗略显示的成像光学系统9成像试样2时的空间分辨率极限。这使得试样2中处于第二状态的物质分子的位置由于其附属的测量信号5的强度分布而能够通过传感器阵列6以远超过成像的空间分辨率极限的精度加以确定，其除了物质分子的尺寸以外基本上取决于传感器阵列6的像素密度、成像比例和信噪比。在此，定位甚至可以不超过传感器阵列6的像素距离。在图1中再次仅粗略显示的半透镜10用于叠加激发信号3和转换信号7的光路，或者用于分离由试样发出的测量信号5。在此在各种情况下额外使用狭带滤色片，从而从传感器阵列6仅记录感兴趣的测量信号5，而不是激发信号3或转换信号7由试样反射的部分。试样2前方的双箭头11表明试样2既被光学信号3，7进攻，也发射光学测量信号5。
图2所示为试样2中标记物质的分子12的均匀的统计学分布。所示分子12均处于其发荧光的第二状态。分子12的距离小于在传感器阵列6上以成像光学系统9成像试样2时的空间分辨率极限。具体而言，在此分子12的距离甚至远小于分辨率极限。由此获得通过传感器阵列6的测量信号5的强度分布，其在不考虑统计学波动和噪声时是恒定的，这在图2中用传感器阵列6的所示区域的均匀阴影表示。因此无法由用传感器阵列6记录的测量信号5确定单个分子12的位置。试样2中分子12分布的结构化在图2中不存在，其可以在发荧光的状态的分子12的距离仅如此小直至在传感器阵列6上以成像光学系统9成像试样2的空间分辨率极限时加以解决。在该新方法中，总是仅有小部分的分子12转换至其可发荧光的状态，主要存在的分子的密度是与此无关的。
图3所示为传感器阵列6上试样2区域的成像，其中总计3个分子12处于发荧光的第二状态。在此，两个分子12成对地相互紧邻，而第三个分子12与该对的距离13更大，甚至大于在传感器阵列6上以成像光学系统9成像试样2时的空间分辨率极限。与此相反，该对的两个分子12的距离小于该分辨率极限。由分子12发出的荧光被传感器阵列6记录为测量信号5的两个离散的强度分布14和15。在此，强度分布14对应于单个分子12，而强度分布15对应于分子12的对。
图4和5中再次给出通过强度分布14和15的截面。强度分布在其形状上没有明显区别。两种强度分布基本上都是Airy-Scheibe。但是强度分布15的积分大小是强度分布14的两倍，并具有更大的半值宽度。由强度分布14可以非常精确地得出分子12在试样2中的位置，其分辨率甚至尤其是大于在传感器阵列6上以成像光学系统9成像试样2的空间分辨率极限。在此，由传感器阵列6上的强度分布14的横向位置可以得出在试样2的x-y平面上的位置，而强度分布14的形状可以得出关于试样2中于Z方向上的位置的结论。强度分布15则不同。这甚至还可以归于试样中的一个位置。但是这仅是该对的两个分子12的中间位置。由强度分布15无法得知两个分子12相对于中间位置的位置。因此，在用于使试样2的用物质标记的结构以空间高分辨率成像的该新方法中，均只有如此小比例的分子12被根据图1的转换信号7转换至发荧光的第二状态，以使得尽可能多的分子12单独存在，即与紧邻的分子12的距离使得在传感器阵列6上成像时得到离散的强度分布14，由此可以各自精确地确定分子12的位置。
图6所示为荧光显微镜1的实施方案，相对于根据图1的实施方案补充了约一个用于用反向信号17进攻试样2的反向信号源16。为了叠加光学反向信号17的光路，还存在另一个半透镜10。利用反向信号17将试样2中的物质分子针对性地由其第二状态转换返回至第一状态，从而为了单个分子在试样2中的下一回定位而利用转换信号7重新选择分子。该新方法需要用于获得该位置的分子的数量，使试样2用其标记的结构代表性地成像，频繁重复用转换信号7选择单个分子，其中作为基础的跃迁概率导致总是变换的选择，即使多重选择单个分子。反向信号17并不是绝对必需的，条件是分子自动地即通过热激发在合理的时间内转换返回至其第一状态，或者也通过激发信号3的作用。否则反向信号17是绝对必需的。
图7中所示的荧光显微镜1不具有根据图6补充的反向信号源16；但其还可设置在该实施方案中。然而图7用于说明光传感器18的额外布置。设置光传感器18以记录来自试样对应于传感器阵列6的多个像素的区域的测量信号5的单个光子的时间顺序。在此，光子顺序的监测应当用于非常迅速地确定在各个区域内是否仅单个分子处于发荧光的状态，或者是否有多个分子由该区域发射荧光。若涉及多个分子，则这在该区域的尺寸小的情况下表明，由其发出的测量光线在传感器阵列6上的强度分布无法分离，即无法用于定位单个分子。相应地，可以停止用传感器阵列6记录测量信号5，有利于用转换信号7重新选择分子。至少可以省略读取传感器阵列6的对应区域。例如在此情况下有意义的是，试样2或传感器阵列6的不同区域的光传感器18被设计为另一个具有更少像素数的阵列的形式。具体而言，光传感器18在图7中被表示为重合传感器排列(Koinzidenzdetektoranordnung)，其中两个传感器单元19借助于作为分光器(Strahlteiler)的半透镜10平行地转换。重合传感器排列检测测量光线15在时间上非常接近的光子在两个传感器单元19上相遇的情况，即光子的重合。在单个发荧光的分子的情况下在试样2的由光传感器18所监测的区域中不会发生该重合，因为单个发荧光的分子由于其激发而总是仅可发射一个光子，并且由于其下一次激发才会发射下一个光子，其中在单次激发之间存在最短时间。
这些关系再一次依照图8至11加以说明。图8所示为根据图9发射测量信号5的具有最小时间间隔21的光子20的单个分子。但是若用根据图7的光传感器18记录测量信号5的光子20的时间顺序，如它们在图11中所示，在两个光子20之间存在远小于根据图9的间隔21的时间间隔22，则这表明至少两个发荧光的分子12在发出测量信号5的区域内。该情况如图10所示。
图12是根据图1的荧光显微镜的实施方案中的转换信号7、激发信号3和测量信号5的时间顺序的曲线图。在此应强调，信号形状在此仅是示意性的，并非一定真实地重复给出。应当基本上显示时间顺序，其中首先用转换信号7确定地将物质分子转换至第二状态，然后用激发信号3激发以发荧光。该荧光导致测量信号5，该测量信号在激发信号3减弱之后逐渐消失。图12所示为用荧光显微镜1实施的方法的仅一次循环。一旦通过热激发或者通过激发信号3将物质分子由第二状态转换返回至其第一状态，则以同样的信号顺序开始下一次循环。
根据图13的信号顺序对应于根据图6的荧光显微镜1的实施方案，其中该方法的下一次循环可以与下一个转换信号7立即相接，因为在各次循环结束时实施反向信号17，使物质分子在各种情况下转换返回至其第一状态。
图14所示为由一个供体23和一个受体24组成的FRET对，其形成分子12的亚单元(Untereinheiten)。供体23和受体24可以是融合成为分子12的蛋白质。具体而言，受体可以是已知为Dronpa的蛋白质，而供体可以是ECFP型蛋白质。在该新方法中根据图14的FRET对的功能如下。受体24是对光反应变色的，并由于转换信号7而改变其吸收光谱。在受体24的吸收光谱的情况下的移动导致供体23的荧光特性的改变。具体而言，供体23变为发荧光的，因为通过激发信号3激发供体通过改变受体24的吸收光谱无法由供体向受体传递能量，现在通过发射荧光即测量信号5而可以逐渐增大地实施供体的退激发。
图15所示为可用多个分子12于更多个点标记更大的蛋白质25，从而例如利用该新方法观察到蛋白质25的构象变化，如折叠。典型地，在此以根据图14的FRET对的形式显示的分子12所处的点比在蛋白质25光学成像时可能的空间分辨率极限更紧邻。然而，在该新方法中总是仅有一个于蛋白质25上的分子12转换至可发荧光的状态，然后其位置由于由其发出的测量信号而精确地确定。多次重复该过程，其中位置精确地确定的各个分子12的选择遵守统计学规律，从而在有限数量的于蛋白质25上的分子12的情况下在少次重复之后询问所有的蛋白质12，即使仅由跃迁概率确定每一次选择。
附图标记
1 荧光显微镜
2 试样
3 激发信号
4 激发信号源
5 测量信号
6 传感器阵列
7 转换信号
8 转换信号源
9 成像光学系统
10 半透镜
11 双箭头
12 分子
13 距离
14 强度分布
15 强度分布
16 反向信号源
17 反向信号
18 光传感器
19 传感器单元
20 光子
21 间隔
22 间隔
23 供体
24 受体
25 蛋白质
Claims (16)
1、用于使感兴趣的试样结构以空间高分辨率成像的方法，其包括以下步骤：
-从以下组中选择物质：利用转换信号能够重复地由具有第一光学特性的第一状态转换至具有第二光学特性的第二状态并且能够由该第二状态转换返回至该第一状态的物质；
-用该物质标记所述感兴趣的试样结构；
-用转换信号将变化比例的该物质转换至第二状态；
-在传感器阵列上使该试样成像，其中成像的空间分辨率极限大于(即差于)该试样中所述物质的紧邻分子之间的平均距离；及
-利用该传感器阵列以空间分辨的方式记录由第二状态的所述物质的各个部分发出的光学测量信号；
其特征在于，在转换一部分该物质至第二状态时调节转换信号(7)的强度，从而使至少10％的该物质各自转换至第二状态的分子(12)与其紧邻的第二状态的分子(12)的距离大于该传感器阵列(6)上该试样(2)成像的空间分辨率极限。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在转换一部分所述物质至第二状态时调节转换信号的强度，从而使至少25％，优选至少33％，更优选至少50％，再更优选至少66％，特别优选至少90％，尤其优选至少95％，最优选至少98％的所述物质各自转换至第二状态的分子(12)与其紧邻的第二状态的分子的距离大于所述传感器阵列(6)上所述试样(2)成像的空间分辨率极限。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将通过尺寸大于所述传感器阵列(6)上所述试样(2)成像的空间分辨率极限的区域的转换信号(7)的强度调节至恒定的值。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒定的值根据所述物质在所述试样(2)中的局部浓度来确定。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在将更大比例的所述物质转换至第二状态时预先确定所述物质在所述试样(2)中的局部浓度，其中调节转换信号(7)的强度大于利用所述传感器阵列(6)定位单个分子(12)时的情况。
6、根据权利要求1至5之一所述的方法，其特征在于，对应于所述传感器阵列(6)的多个像素的所述试样(2)的区域在光传感器(18)上成像，以观察由该区域发射单个光子(20)的时间顺序。
7、根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征在于，所述物质选自以下亚组：在第二状态中能够利用光学激发信号激发而自发地发射荧光的物质，该荧光利用所述传感器阵列(6)被记录为光学测量信号(5)。
8、根据权利要求1至7之一所述的方法，其特征在于，所述物质选自以下亚组：能够利用光学反向信号(17)由第二状态转换返回至第一状态的物质，以及在利用转换信号(7)将所述物质的其他部分转换至第二状态之前，利用该反向信号(17)将预先转换至第二状态的物质的部分转换返回至第一状态。
9、根据权利要求1至8之一所述的方法，其特征在于，所述物质选自具有一个供体(23)和一个受体(24)的
谐振能量传输(FRET)对，其中该受体(24)是对光反应变色的，并利用转换信号(7)加以转换，以改变该供体(23)的荧光特性。
10、根据权利要求1至9之一所述的方法，其特征在于，所述物质或所述物质的至少一个连接位在基因技术上嵌入所述试样(2)中的蛋白质中或者悬挂在其上。
11、根据权利要求1至10之一所述的方法，其特征在于，所述试样(2)中的蛋白分子(25)在多个不同的点用所述物质标记。
12、根据权利要求1至11之一所述的方法，其特征在于，该方法是利用至少两种不同的物质平行地实施的，由这些物质在其各自的第二状态发出能够区分的光学测量信号(5)。
13、用于使感兴趣的试样结构以空间高分辨率成像的方法，其包括以下步骤：
-从以下组中选择物质：利用转换信号能够重复地由具有第一光学特性的第一状态转换至具有第二光学特性的第二状态并且能够由该第二状态转换返回至该第一状态的物质；
-用该物质标记所述感兴趣的试样结构；
-用转换信号将变化比例的该物质转换至第二状态；
-在传感器阵列上使该试样成像，其中成像的空间分辨率极限大于(即差于)该试样中所述物质的紧邻分子之间的平均距离；及
-利用该传感器阵列记录由该物质各自处于第一状态的部分发出的光学测量信号；
其特征在于，在转换一部分该物质至第二状态时调节转换信号(7)的强度，从而使至少10％的该物质各自处于第一状态的分子(12)与其紧邻的第一状态的分子(12)的距离大于该传感器阵列(6)上该试样(2)成像的空间分辨率极限。
14、荧光显微镜，其具有用于用激发信号和光学转换信号进攻试样的激发信号源及转换信号源，还具有用于记录来自该试样的光学测量信号的传感器阵列以及用于在该传感器阵列上使该试样成像的成像光学系统，其中该传感器阵列的像素的栅距小于在该传感器阵列上该试样成像的空间分辨率极限与成像的成像系数之积，其特征在于，由转换信号源(8)的操纵设备控制根据权利要求1至10之一所述的方法的转换信号(7)的强度。
15、根据权利要求14所述的荧光显微镜，其特征在于，设置有至少一个光传感器(18)，在该光传感器上使对应于所述传感器阵列(6)的多个像素的试样(2)的区域成像，以观察从该区域发射单个光子(20)的时间顺序。
16、根据权利要求14或15所述的荧光显微镜，其特征在于，设置有用于用反向信号(17)进攻所述试样的反向信号源(16)。
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