CN108449958A - 高通量核酸测序系统中用于颜色探测的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

一种测序仪器光学系统具有：组合光源，具有多束共线的激发光束，这些激发光束具有各自不同的激发波长；测序表面，具有DNA模板和碱基标记，这些碱基标记被配置成，当其被一束或多束激发光束激发时，以各自不同的发光波长发出相应的发射光；彩色摄像机，配置为用以探测每个碱基标记的发射光；第一光路，配置成将这些共线的激发光束从组合光源引导至测序表面；以及第二光路，配置成将发射光从测序表面引导至彩色摄像机。

Description

高通量核酸测序系统中用于颜色探测的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月1日提交的美国第62/212,820号临时申请的权益，在此针对所有目的而通过援引整体纳入该临时申请的内容。
技术领域
概括而言，本发明涉及用于探测与在合成测序(sequencing-by-synthese)或其它测序过程期间使用的碱基关联的荧光染料或其它发光标记的仪器。
背景技术
DNA测序过程用于确定DNA分子中的碱基对的顺序。该技术具有多种多样的用途，如确定DNA分子的一致性或者确定DNA分子是否包括特别的特征(例如，表明先天条件的特征)，等等。可使用多种技术确定DNA序列。例如，在典型的合成测序(SBS)过程中，可使用专门设计的核苷酸和DNA聚合酶来以受控方式读取表面束缚的单链DNA模板的序列。该过程使用标记(也称为探测物或标签)来识别构成DNA分子的特定的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)。其它测序技术可使用天然的核苷酸和/或聚合酶或标记的寡核苷酸以及链接酶(ligation enzymen)来确定核酸序列。
以其最基本的意义，SBS过程通过一次使DNA模板分子的长度延伸一个碱基，并且记录所增加的碱基的序列来进行操作。更具体而言，该过程通过使DNA模板延伸一个碱基，并以光学方式检查(“读取”)生成的分子来确定在DNA模板位置是否存在标记(或者存在什么种类的标记)。标记的存在表示与该特定标记关联的碱基已被加入到DNA模板。随后，该过程被重复多次以确定构成DNA模板的碱基对序列。为了提高处理速度且使该过程更具实用性，通常期望处理数百万个DNA模板，每个DNA模板可包括更大的DNA分子的片段。例如，可将数百万个DNA模板置于测序表面上的有序的位置或随机位置(“模板位置”)，并且一起被处理。每个DNA模板自身可包括单个分子或多个本质上相同的分子。在处理了DNA模板以确定它们的序列之后，可将各个的序列彼此相比较并进行核对以确定初始完成的DNA分子的性质。
依靠以光学方式检查碱基标记的传统的SBS方法和其它方法必须以非常小尺度的DNA模板以及低光照强度的碱基标记来操作。典型的碱基标记包括荧光分子，其具有当被外部“激发”光源激发时发光的荧光复合物。所发出的光的波长取决于特定的荧光团。由于光子的能量损失(一种被称为“斯托克斯位移”的现象)，所发出的光的平均波长通常稍微大于激发光的平均波长。所述光的密度非常低，这在一定程度上可以通过在原位放大每个DNA模板，以在每个模板点处聚集多个相同的碱基标记来解决。然而，即使借助这种放大，仍需要采取措施以将来自背景噪声的核苷酸标记以及可能处于附近其它标记的核苷酸标记产生的信号仔细地地区分开。
在一些情况下，这种延伸和读取的过程是通过仅呈现单种碱基(例如，腺嘌呤)以在每个延伸步骤中接合DNA模板，执行读取以探测哪个DNA模板已被延伸，并随后对其余的每种碱基(鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)分别重复相同过程而连续地执行。这种连续过程使得在读取步骤期间一个碱基会被错读为另一个的可能性最小化，因为在每个延伸和读取循环期间仅能增加一种碱基。然而，该过程是耗时的，因为其需要大量处理步骤：四个完整的延伸循环以及四个完整的读取循环，以使所有DNA模板延长一单个碱基对。
在其它情况下，能够通过在每个延伸循环期间将一些或所有碱基呈现到DNA模板而并行地执行此延伸步骤。此方法加速了该过程，因为每个DNA模板理论上将在单个延伸循环期间被延伸。然而，该过程可能仍然需要连续的四个不同的读取步骤，以精确地识别与每种碱基关联的标记。该过程还可能与依次处理相比要求更加高的光学性能，因为一些碱基标记具有相似的照明波长(如绿色和黄色，或者红色或暗红色)，这就可能使得这些标记的区别更困难。
典型的SBS仪器被配置成在多个单独的处理步骤期间读取四种类型的碱基中的每一种。这样的设备可采用移动光学装置，如图1中的现有技术示例中所示。在该示例中，仪器100包括测序表面102，DNA模板被置于该测序表面上。测序表面102可包括其上定位有DNA模板的任何合适的表面，如基片、小珠(bead)、流动池(flow cell，流动室)或其它结构，试剂经过该表面以执行延伸DNA模板所需的多种化学步骤或这些步骤的结合。通过一固定的CCD(电荷耦合器件)摄像机104经由物镜106来检查测序表面102。CCD摄像机传感器通常不包括局部滤色镜，从而其仅确定光密度而不是波长。这是优选的(方式)，因为滤光器减小发光密度，并且通常减小传感器的空间分辨率。因此，摄像机104本身不能用于在不同的碱基标记之间加以区分，并且仪器100必须在单独的各个相应读取操作期间读取四种碱基标记中的每一种。为实现这一点，仪器100包括四个单独的照明模块108，它们各具有光源110(例如，LED灯或类似物)、激发滤光器112、分色镜114以及发光滤光器(emission filter)116。还可在整个系统中使用多种光导120和类似物来防护光学部件之间的光路。线A示出从光源110到摄像机104之间的光的行进路径。
照明模块108通常被配置为使得每个特定碱基标记的发光的密度最大化。例如，如果一特定的碱基标记吸收具有495纳米(“nm”)波长的激发光并且发出520nm波长的光，则光源110可被选择为以约495nm的波长发出高密度的光，激发滤光器112可被选择为将激发光过滤为约495nm的窄的频带(band，频段)，分色镜114可被选择为反射约495nm的光，并且透射(transmit，传播)约520nm的光，并且发光过滤器116可被选择为将发出的光过滤为约520nm的窄的频带。此类过滤器和分色镜的使用能够帮助防止光源108疏忽地激发其它碱基标记并提供错误读取，或者使摄像机104的操作饱和或影响其操作。
在延长步骤之后，测序表面102在四个步骤中被读取。在每个读取步骤之间，仪器100以机械方式移动不同的照明模块108，以将新的模块的分色镜114和发光过滤器116定位在物镜106与摄像机104之间。用于探测每个单独标记的该光学装置必须精确地且重复地对齐(对准)，以便精确地比较后续的延伸和/或读取期间的单个DNA模板位置处的读数，因为即使非常小的不对齐都无法使DNA模板的位置从一个读数到下一个读数相互关联。这样的光学装置制造成本通常较高，且可能需要迫切且频繁的校准和维护。
一些仪器还采用可动的测序表面台118和/或移动物镜106。例如对于检查大于摄像机104的视场的测序表面102而言，这种运动性可能是期望的，从而在其它处理步骤期间使测序表面102能够从光学系统被移除，或者利用图像传感器来适当的登记测序表面102。在这样的设备中，在多个光学部件之间具有高精度且可重复对齐的需求增加。在检查和区分单独DNA模板所需的放大率下，表面的小的不对齐能够引起光学系统的视场的巨大位移。这样，不具有固定的测序表面102的系统可能需要以电算方式使来自每个读取步骤的数据对齐的复杂的软件技术，以便为每个单独的DNA模板提供正确的碱基对序列。
设备及类似技术的示例在美国第2014/0267669号和第2009/0298131号专利申请公开文献和美国第8,940,481号和第8,481,259号专利中示出，其全部通过援引而纳入本文。
尽管现有技术提供了某些有益的仪器和进步，但是本发明人确定仍然有需要对测序的仪器的现有技术的状态进行改进。
发明内容
在一个实施例中，提供一种测序仪器(测序仪)光学系统，该系统具有：组合光源(combined light source)，其具有多束共线的激发光束，每束激发光束具有各自不同的激发波长；测序表面，具有多个DNA模板和多个碱基标记，所述多个碱基标记被配置成当被一束或多束所述激发光束激发时，以各自不同的发光波长发出相应的发射光；彩色摄像机，配置为用以探测每个所述碱基标记的发射光；第一光路，配置成将所述共线的激发光束从所述组合光源引导至所述测序表面；以及第二光路，配置成将所述发射光从所述测序表面引导至所述彩色摄像机。
在该第一示例性实施例中，所述组合光源可具有四束共线的激发光束，且组合光源可具有第一光源以及至少一个附加的光源，所述附加的光源通过分色镜而导向到与第一光源的共线的路径上。
在该第一示例性实施例中，所述彩色摄像机可具有：传感器，具有多个感光像素；以及过滤器阵列，具有多个颜色过滤器，每个颜色过滤器均与相应的感光像素关联。所述多个颜色过滤器可包括红色过滤器、绿色过滤器和蓝色过滤器。
该第一示例性实施例的所述过滤器阵列可以是高光谱过滤器。在该实施例中，颜色过滤器可以是多个法布里-珀罗光谱过滤器。这些颜色过滤器可包括：第一组过滤器，配置成能透射具有与第一碱基标记发射光关联的第一波长的光；第二组过滤器，配置成能透射具有与第二碱基标记发射光关联的第二波长的光；第三组过滤器，配置成能透射具有与第三碱基标记发射光关联的第三波长的光；以及第四组过滤器，配置成能透射具有与第四碱基标记发射光关联的第四波长的光。与所述第一、第二、第三和第四碱基标记发射光关联的所述第一、第二、第三和第四波长中的每一者可分别包括与各碱基标记的相应的第一、第二、第三和第四最大(peak，峰值)发光波长对应的波长。所述第一最大发光波长可以为约525nm，所述第二最大发光波长可以为约565nm，所述第三最大发光波长可以为约630nm，而所述第四最大发光波长可以为约680nm。所述第一、第二、第三和第四波长还可包括各自的最大发光波长附近的相应范围的波长。在一些实例中，所述相应范围的波长可不超过20nm的范围，或者5nm的范围。所述波长的范围可不包括任何重叠波长。
在一个实施例中，过滤器阵列可包括布置成马赛克样式的第一组过滤器、第二组过滤器、第三组过滤器和第四组过滤器。在另一实施例中，这些组过滤器可被布置成一扫描样式，其中每组过滤器被布置成一连续的排。
所述测序表面沿第一方向相对于所述彩色摄像机可移动，且所述第一光路可包括透镜组件，所述透镜组件配置成将所述共线的激发光束沿垂直于所述第一方向的线投射到所述测序表面上。
所述彩色摄像机可以是具有多个传感器的多传感器摄像机。其可具有三个或四个传感器，这些传感器被配置成用以接收具有不同波长的发射光。所述彩色摄像机还可以是高光谱摄像机，而所述多个传感器包括：第一传感器，配置成用以探测第一发光波长；第二传感器，配置成用以探测第二发光波长；第三传感器，配置成用以探测第三发光波长；以及第四传感器，配置成用以探测第四发光波长。第一、第二、第三和第四发光波长可包括相应的第一、第二、第三和第四碱基标记的各自的第一、第二、第三和第四最大发光波长。第一、第二、第三和第四发光波长还均可包括不超过20nm、或不超过5nm的波长的范围。第一、第二、第三和第四发光波长还可以不包括任何重叠波长。多传感器彩色摄像机可包括多个棱镜，每个棱镜均配置成将相应的发射光引导到相应的传感器。
第一光路和第二光路可包括共享的多频带分色镜，所述共享的多频带分色镜被配置成透射所述发射光，并且将所述多束共线的激发光束朝向所述测序表面反射。所述第一光路和所述第二光路中的至少一者可相对于所述测序表面倾斜。
在另一示例性实施例中，提供一种测序仪器光学系统，该系统具有：第一激发光束，具有第一激发波长；第二激发光束，具有与所述第一激发波长不同的第二激发波长；以及测序表面。该测序表面具有：多个DNA模板；第一碱基标记，其配置成当被所述第一激发光束激发时，以第一发光波长发出第一发射光；以及第二碱基标记，其配置成当被所述第二激发光束激发时，以第二发光波长发出第二发射光。该仪器还包括：第一透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第一激发光束投射到所述测序表面上的第一位置上；第二透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第二激发光束投射到所述测序表面上的第二位置上，所述第二位置不同于所述第一位置；以及传感器，其配置成用以探测每个所述碱基标记的发射光，且配置成能够沿第一方向相对于所述测序表面移动。配置成透射所述第一发光波长的第一颜色过滤器位于所述测序表面上的第一位置与所述传感器的第一部分之间；而配置成透射所述第二发光波长的第二颜色过滤器位于所述测序表面上的第二位置与所述传感器的第二部分之间。
第二示例性实施例还可包括：第三激发光束，具有第三激发波长；第三碱基标记，其配置成当被所述第三激发光束激发时，以第三发光波长发出第三发射光；第三透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第三激发光束投射到所述测序表面上的第三位置上，所述第三位置不同于所述第一位置和所述第二位置；以及第三颜色过滤器，其配置成透射所述第三发光波长，且位于所述测序表面上的第三位置与所述传感器的第三部分之间。该实施例还可包括：第四激发光束，具有第四激发波长；第四碱基标记，其配置成当被所述第四激发光束激发时，以第四发光波长发出第四发射光；第四透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第四激发光束投射到所述测序表面上的第四位置上，所述第四位置不同于所述第一位置、所述第二位置和所述第三位置；以及第四颜色过滤器，其配置成透射所述第四发光波长，且位于所述测序表面上的第四位置与所述传感器的第四部分之间。
在该第二示例性实施例中，可设置一个或多个透镜，以在传感器的第一部分处沿着第一离散线投射所述第一发光波长，并且在所述传感器的第二部分处沿着第二离散线投射所述第二发光波长。
在第一或第二示例性实施例中，测序表面可安装在可动台(movable stage，活动台面)上，从而使所述传感器能够沿相对于所述测序表面的第一方向移动。
其它替代方案对于阅读了本发明的本领域一般技术人员而言将是显而易见的。
以上对本发明的概括描述并非意在限制该申请或者任何相关或非相关的申请的权利要求书。所请求保护的本发明的其它方面、实施例、改型和特征对于阅读了本发明的本领域一般技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
通过参照附图可以更好地理解这些示例性示例，其中相似的附图标记指代相似的部件。附图是示例性的，而并非意在以任何方式对权利要求进行限制。
图1是现有技术的测序仪器光学系统的示意图；
图2是仪器光学系统的第一实施例的示意图；
图3是常规的颜色数字图像传感器的一部分的示意图；
图4是第一高光谱数字图像传感器的一部分的示意图；
图5是法布里-珀罗光谱过滤器的示意图；
图6是测序仪器光学系统的第二实施例的示意图；
图7是测序仪器光学系统的第三实施例的示意图；
图8是测序仪器光学系统的第四实施例的示意图；
图9是测序仪器光学系统的第五实施例的示意图。
具体实施方式
已确定的是，以光学方式读取加标记的碱基或其它化学标记的SBS仪器和其它仪器可有益地以多种方式被修改，并且特别是通过减少或消除了在连续的碱基标记读取之间以机械方式移动仪器的光学部件的需求。该说明书提供了仪器光学系统的若干示例，与现有的系统相比，这些示例可提供一个或多个的益处，例如提高的速度、更大的可靠性、更高的精度、更低的成本等等。
在图2中示意性地示出了用于测序仪器200的光学系统的第一示例性实施例。仪器200使用组合光源202，该组合光源产生一个或多个波长的光，这些波长被选择为用以激发在测序过程期间要使用的两种、三种或全部四种碱基标记。在示出的示例中，组合光源202包括第一、第二、第三和第四光源204。每个光源204被选择为用以发出一激发波长，该激发波长被选择为激发其中一个碱基标记，且该激发波长例如为蓝色(例如，470nm)、绿色(例如，520nm)、黄色(例如，570nm)和红色(例如，615nm)。这些碱基标记可包括荧光染料(例如，Alexa 488、Cy3、德克萨斯红(Texas Red)和Cy5)或者其它与特定核苷酸关联的组分，如第8,481,259号美国专利中所描述的，其在此通过援引而纳入(本文)。在这些或其它实施例中可使用现有技术中已知的或今后研发的、具有不同的激发和发光波长的其它组分、标记和荧光团。
在碱基标记中使用的荧光团经常能够被一定范围的不同入射波长激发。这样，被选择为激发一种碱基标记的光源还可能在一定程度上激发其它碱基标记。在一些情况下，单个(光)源可用于有效地激发两个或更多标记。然而，更优选地是使单个光源以最有效的波长或接近最有效的波长来工作以激发各个单独的碱基标记。合适的光源204的示例包括激光、LED灯、二极管以及其它被配置为或被过滤为发出期望波长的光源。这样的设备在现有技术中是已知的，不需要在此详细描述。
光源204被配置为用以发出沿着如箭头A所示的单个轴线共线(即，沿着相同的直线对齐)的多个光束。这可以通过沿着此期望轴线引导一个光源204，并且使用镜部件206来使其余的光源204沿着相同轴线重新导向而实现。镜部件206可包括分色镜或者类似装置，其使上游光源的那些波长能够穿过后表面，但是反射上述被重新导向的特定光源206的波长。也可通过使光束穿过一个或多个棱镜或通过现有技术已知的其它方法和设备而使这些光束沿着共同轴线被重新导向。
每个光源204优选地被配置成产生具有单一波长的光，或者具有非常窄的波长的范围的光(例如，约20nm-30nm的范围内的光)。这里所使用的“波长的范围”是指跨越不同的波长值的光谱范围的连续部分。例如，当以波长的组合强度曲线的半最大值处的全宽度上测量时，不超过20nm的波长范围可包括20nm宽的电磁谱的部分(例如，从520nm到540nm)。使用这种测量技术，光仍然可能包括所限定的范围之外的波长(但这种波长的量相对少)。这可以通过使用仅自然地发出一窄范围波长的光源(例如，激光二极管)，或者通过使用另外的光学元件来滤除非期望的波长来实现。例如，可在光源204和其关联的镜子206之间设置一带通滤波器，或者镜子206可包括分色镜，该分色镜仅反射一窄范围的期望波长。光学过滤器、分色镜和类似装置可以通过多种来源(例如新泽西州，巴灵顿的Edmund Optics Inc.公司)获得。
共线的组合光束A被镜子208反射，该镜子将该光束重新导向为通过物镜并到达测序表面102。测序表面102(其可以是基片、小珠、流动池或其它合适的基材或多个基材类型的组合)包括多个DNA模板，碱基标记已通过现有的延伸步骤而附接到这些DNA模板，但是还可构想到的是，可容易地利用多个实施例在延伸步骤期间观察测序过程。可选地，测序表面102可包括平坦的平面，该平面在一位置处从共线的组合光束A的轴线正交地延伸，在上述位置处光束A照射在测序表面102上。每个碱基标记可被由共线的组合光束A提供的激发波长的至少一种来激发。共线的组合光束A同时地激发所有对入射光束波长敏感的碱基标记，这导致碱基标记以它们各自的发光波长发出荧光。发出的光返回穿过物镜106，通过镜子208并且到达摄像机212。镜子208优选地反射共线的组合激发光束，但是透射来自碱基标记的发射光。为此，该镜子优选地包括多频带分色镜，其具有与每个碱基标记发光波长匹配的透射波长。多频带和四频带分色镜可从纽约州布法罗的Iridian Spectral Technologiesof Ottawa,Ontario,Semrock,Inc.公司或者其它来源获取。还可在组合光源202与镜子208之间的光路中设置一个或多个激发过滤器(未示出)，以去除处于期望范围之外的波长的激发光。
一个或多个发光过滤器(见图1)可设置在镜子208与摄像机212之间的光路中。典型的碱基标记发出横跨宽的光谱的波长(范围)的光，但是大部分光通常是以特定波长或窄的频带的波长发出(“发光波长”)。可使用发光过滤器来使发光的范围缩窄成发光波长或发光波长附近的小范围(例如，20-30nm)。这可能对于将透射到摄像机212的光限制成仅为相应于四种碱基标记中的每一种的最大发光值(发光峰值)而言是特别有帮助的，以便减小在读取由多个不同的碱基标记产生的波长的强度时可能出现的不确定性。
还可想到的是，可以不在所有实施例中都使用经过所有四个波长的单个多频带分色镜。在这样的实施例中，可设置多个不同的镜子作为可动单元210，并在连续的读取操作期间以机械方式移动就位以读取碱基标记。例如，一个备选实施例可使用四个镜子单元210，每个镜子单元透射单个发光波长。另一备选实施例可使用两个镜子单元210，每个镜子单元透射两个发光波长。在使用多个镜子的情况下，读取过程将以连续方式来操作。无论如何，可预期的是将移动部件限制为仅包括这些镜子仍然能够获得成本、效率和精度方面的益处。其它选择对于阅读了本发明的本领域一般技术人员来说将是显而易见的。
该示例中的摄像机212可包括彩色摄像机，该彩色摄像机能够同时探测和区分仪器中所使用的碱基标记的全部发光波长(例如，约525nm、约565nm、约630nm以及约680nm)。这使得当使用单个分色镜208时，读取过程能够以一个步骤来执行。传统的彩色CCD和CMOS(互补金属氧化物半导体)传感器可被用于该目的。传统的彩色数字摄像机使用正好位于探测入射光子的像元(photosite)阵列上面的滤色镜阵列。该滤色镜阵列包括红色光谱、绿色光谱和蓝色光谱下的过滤器。在常见的彩色摄像机传感器中，这些过滤器被配置成使得允许与其它颜色相比约两倍的绿光量到达传感器，使得传感器影像更精确地反映人眼的感光性的分布。
图3是一示例性的常规彩色CCD传感器300的一部分的简化示意图。传感器300包括一感光的“像素”层302，每个像素层均为一单独的光接收器。在像素层302上方是过滤层304，该过滤层包括红色(“R”)、绿色(“G”)和蓝色(“B”)过滤器的样式(所示的该样式通常称为“拜耳”过滤器)。为了清楚起见，过滤层304被示出为与像素层302间隔开，但是通常在各层之间没有或者几乎没有间隙，每个单独的像素仅能接收穿过一个过滤器的光。每个过滤器均在三原色中的一种上具有最大透射值，并且每个过滤器允许其下面的像素仅接收该过滤器的特定原色附近的所选范围的波长。在这种类型的传感器中，过滤器颜色的位置将不总是与具有应穿过过滤器的波长的光的位置一致，这会导致一些取样误差。例如，非常小(“针尖型”)的彩色光源可直接照射(strike，冲击)被不同颜色的过滤器覆盖的像素，并且仅部分地照射同一颜色的过滤器，这样会导致错误的、对光源而言小的强度值测量。此外，因为过滤器彼此物理的偏置，因此需要对从接收红色、绿色和蓝色光的像素获得的数据的强度及物理位置加以更改(interpolate，插值)，以便在图像中产生代表光源的物理位置和强度的“全色”图像。如现有技术中已知的，所谓的去马赛克和去拜耳化算法通常被用于该目的。尽管这样的算法被认为在重构原始图像特征位置的方面很出色，但它们并不能提供原始图像的完美重构。
在碱基标记之间的像差显著的情况下，可使用常规的彩色数字传感器来同时读取所有存在于测序表面102的视场中的碱基标记。一示例性的过程将包括下列步骤：第一，在存在所有四种标记的碱基的情况下延伸(延长)DNA模板，以将四种碱基标记之一添加到每个DNA模板；第二，利用所有四个光源204激发测序表面102；第三，操作摄像机212以捕获测序表面102的图像，该图像示出从所有四种碱基标记发出的光；第四，处理图像数据，以确定哪个碱基标记已与每个DNA模板结合；然后，重复以上步骤。如果测序表面102大于物镜106的视场，则可通过移动物镜106或测序表面102而在沿着测序表面102的多个位置处重复激发和捕获的步骤。或者，当利用可动台118或通过在表面102上越过光学装置而移动测序表面102时，测序表面102可通过捕获依时刻序列的图像而被扫描。为了清楚起见而省略了在SBS仪器中使用的其它步骤，但是将如本领域一般技术人员应理解的那样，这些其它步骤能够被包括在该过程中。
在一些情况下，可预期的是，常规的彩色数字传感器将不能够精确地区分由特定碱基标记发出的不同波长。其一个原因可能是常规的彩色数字摄像机中的红色、绿色和蓝色过滤器通常具有含有大量重叠频谱范围的较宽频谱范围(例如，“红色”、“绿色”和“蓝色”过滤器均可能在约540nm的中间绿色范围内透射一些光)。这导致颜色值之间的串扰，并且导致最终颜色确定的不确定性。因此，常规的颜色传感器可能不能够以期望的精度来区分黄色和绿色光谱中的某些发光波长。在这样的情况下，以上过程可被更改为选择性地依次启用第一、第二、第三和第四光源204的每一个，并且一旦处于四个光源启用周期(循环)期间，则操作摄像机212以捕获测序表面102的图像。使用该技术，所有四种碱基标记均能够被快速读取，而不需要移动任何部件。或者，如果发现常规的彩色传感器能够区分一些发光波长，而不能区分另一些，则这些光源204可在不存在区分问题的情况下被成组地启用(例如，在第一循环中启用“蓝色”、“黄色”和“红色”，且在第二循环中启用“绿色”，或者在第一循环中启用“蓝色”和“黄色”，且在第二循环中启用“绿色”和“红色”)，并且一旦每个启用循环开始，则摄像机212可被操作以读取碱基标记，从而一次性读取两种类型的碱基标记。而且，如果光源204被成组地操作，那么(本发明的)实施例还可以使用多个合适的双道分色镜208，该双道分色镜在每个光(源)启用循环期间被选择性地移动到光路。其它替代方案对于阅读了本发明的本领域一般技术人员而言将是显而易见的。
或者，摄像机212可包括高光谱摄像机，该高光谱摄像机被配置成直接探测在仪器中使用的碱基标记的发光波长，且优选为仅探测这些发光波长。与常规的彩色摄像机不同的是，高光谱摄像机能够直接探测特定波长，而不需要更改已穿过红色、绿色和蓝色过滤器的颜色信息。例如，如图4中所示，高光谱摄像机传感器400可使用大体而言常规的传感器层402，但将常规的过滤层304替换为过滤器阵列404，该过滤器阵列404被调整到使得由碱基标记发射的波长λ1、λ2、λ3、λ4通过，以分开传感器层402上的像素。每个波长λ1、λ2、λ3、λ4可被选择为对应于每个碱基标记的发光的峰值(最大值)，但应理解的是也可选择其它值。在一个示例中，这些波长包括：包含约525nm的第一范围、包含约565nm的第二范围、包含约630nm的第三范围、以及包含约680nm的第四范围，但是其它实施例可使用不同的波长。
还应理解的是，每个波长λ1、λ2、λ3、λ4可包括一波长范围。例如，每个波长λ1、λ2、λ3、λ4可包括相应于一个碱基标记的发光峰值加上该峰值附近的不超过20nm的范围。这样就可预期到提供了不同碱基标记的较大的差异，却不会过度地减小光强度。如果期望更大的差异，峰值附近的范围可减小到不超过约5nm的范围，但是在该实施例中，可减小信噪比。还可构想到的是，一个或多个波长λ1、λ2、λ3、λ4可包括这样的波长范围：其不包括对应于特定碱基标记的最大发光波长。这在以下情况下是有帮助的：第一碱基标记的最大发光波长接近第二碱基标记的主要的发光强度，但是第一碱基标记发光范围另外包括相对强的、可读取的区域，该区域更明显地不同于第二碱基标记发光范围。其它替代方案对于本领域一般技术人员而言将是显而易见的。同样优选的是(但并非严格要求如此)，波长λ1、λ2、λ3、λ4并不包括重叠波长。在此处使用的“重叠波长”包括处于任何特定波长的有效量的光强度的重叠(例如，波长的透射范围的半峰全宽值的重叠)。由于在反射或阻挡期望范围之外的波长方面不能提供100％效率的镜子或过滤器，可能发生一些不显著的重叠，但是这样的低效率不会导致对分析图像数据的可感知的改变，因此并不认为这样的低效率会导致“重叠波长”。
高光谱过滤器阵列404例如可包括多个法布里-珀罗光谱过滤器，其每一个仅透射窄范围的波长(例如，5-20nm FWHM(半峰全宽))。在图5中示出法布里-珀罗过滤器的示例。在该示例中，过滤器500包括平行的第一反射表面502和第二反射表面504，它们被分开一距离L以形成间隙506。光穿过一个表面502而进入间隙506。在间隙506内侧，多重干涉导致过滤器输出光谱特性在窄的波长频带上具有尖锐的顶点。根据已知的方程式，透射的波长取决于入射角θ以及表面502、504之间的距离L。通过调整表面502、504的反射率，能够调整通过法布里-珀罗光谱过滤器所透射的波长的范围，其中更多的反射表面会导致较窄的透射带(所谓的高“精细度”)。这样的法布里-珀罗过滤器和其它合适的装置在本领域中是已知的，不需要在此进一步解释。合适的高光谱过滤器可以从比利时海弗莱的IMECInternational公司获得。在其它实施例中，高光谱过滤器阵列404可配置成探测更大量的波长。
高光谱传感器具有以下优点：其不需要更改红色、绿色和蓝色数据来确定由图像产生的光源的波长，这样就提高了颜色精度，且能够减少解释输入信号所需的处理能量。在碱基标记具有相对近间隔的发光波长的测序系统中，可预期的是具有调整到发光波长的传感器像素的高光谱传感器将能够区分这些发光波长，并且提供合适的输出用以精确确定哪个碱基标记已与每个DNA模板结合。分别探测各个发光波长还提供这样的可能性：使用用于光谱串扰分析(如在所有不同的碱基标记的强度上确定每个单独的激发光束波长的影响的分析)的颜色“通道”之间的光谱信息。能够使用这种分析来建立串扰参数及相互关系，并且实时地重新计算发光信号强度。此外，高光谱摄像机能够被定做，以便读取以几乎任何波长(无论该波长对于人眼是可见还是不可见)发光的碱基标记。
在图4的实施例中，高光谱过滤器阵列404使用马赛克样式的过滤器。因此，需要在原始数据上执行去马赛克算法，以便更精确地确定探测的光源的位置。
图6中示出的另一实施例大体上与图2的实施例相同，但是仪器600使用多传感器摄像机602，而不是单传感器摄像机212。所示的多传感器摄像机602是具有将所发出的光分成四种不同波长λ1、λ2、λ3、λ4的棱镜604的装置的高光谱摄像机，上述四种不同的波长是由测序过程中使用的碱基标记发出。每个棱镜604可包括将具有四种波长λ1、λ2、λ3、λ4之一的光朝向相应的传感器608反射以分别读取颜色信息的二色性反射镜606。如之前所说明的，波长λ1、λ2、λ3、λ4的每一者可包括相应的碱基标记的最大发光波长，或者可以是一波长范围(例如，不超过约20nm，或者不超过约5nm)，并且这些波长范围优选不重叠。二色性反射镜606可包括陷波滤波器(即，反射特定的窄范围波长的过滤器)，低通量过滤器、高通量过滤器或者其组合。四个传感器608能够被光学地对齐(对准)，使得每个传感器608上的每个像素关联到其它传感器608上的相同像素，使得当将来自一个传感器608的图像与来自另一个传感器的图像相比较时，不需要重测碱基标记位置。然而，即使传感器608未被光学对齐，以数学方式重测图像属于例行事务。使用二色性棱镜分离器和多个传感器的多传感器摄像机(包括四传感器摄像机)能够从例如丹麦哥本哈根的JAI A/S公司和日本滨松的HamamatsuPhotonics K.K.公司购得。
多传感器摄像机602被认为可提供多个优点。例如，每个传感器608的每个像素探测所有透射到传感器608的光，因此不需要执行任何去马赛克处理来重构碱基标记的精确位置。在所有其它条件相同时，与使用马赛克过滤器的系统相比，这提供了分辨率更高一些的图像和更好的几何精度，并且能够避免当针尖型彩色光仅(或几乎仅)照射阻挡该波长的过滤器时可能发生的保真度损失。这些单独的过滤器还被认为更不容易受到在附近像素被不同波长的颜色(光)照射时可能发生的、被照射的像素的边缘附近产生的像素间串扰和噪声。单独的传感器还能够被单独地校准(例如，增益控制等等)以说明各个波长的不同的光强度，并且能够实时地调整信号强度。其它特征和优点对于阅读了本发明的本领域一般技术人员而言将是显而易见的。
多个单独的传感器608的使用还允许相对简单的校准和与波长相关(依赖)现象的修正，如像差(色差)的修正。当透镜并未将不同波长的光束聚焦于精确的相同位置时引起像差。在全色图像中，这通常表现为朝向图像帧的外径的颜色条纹，其中光通过透镜而被弯折更大程度。在典型的SBS操作的级别，像差可能是非常重要的。例如，以蓝色光谱发出的碱基标记可在与以红色光谱发出的附近的碱基标记的相同位置出现，这导致错误的读取。当对于每种颜色使用不同传感器时，由像差引起的光学畸变可被相对容易地修正。例如，多个传感器可分别被单独地聚焦以消除像差，或者可利用传统算法单独地调整来自每个传感器的数据，从而在数据被结合以识别碱基标记位置之前减小或消除像差。
其它使用多传感器摄像机602的实施例可使用其它装置(如一个或多个三角棱镜，或者类似装置)来分离多个分量光波长。而且，多传感器摄像机602不需要为高光谱摄像机。多传感器摄像机602的其它实施例可具有三个传感器以收集红色、绿色和蓝色波长，并且使用该数据来产生全色合成图像，以读取碱基标记。该实施例可受到色差问题的影响，但是这类问题能够通过如上文结合图2所论述的方式连续地操作光源来克服。还应理解的是，在所有碱基标记上同时执行读取的能力将取决于分色镜208是否能够在同一时间透射所有四个波长。如果不能，则需要至少部分地依次执行该过程，并且在多次读取之间更换镜子208(如上文所述)。
图2的实施例使用第一光路来将激发光束引导到测序表面102，并且使用第二光路来将发射的光引导到摄像机212。第一光路和第二光路都包括共享的分色镜208，该分色镜用于将激发光束向下再引导到物镜，并且与发射光束路径的至少一部分平行。在一个备选实施例中，共享的分色镜208可被省略。例如，图7中示出仪器的另一实施例。仪器700包括常规的测序表面102和物镜106，并且可包括光导120或其它特征以引导光束。在该实施例中，组合的激发光束A沿着直接导向测序表面102的第一光路被透射，而不是被分色镜反射而以平行于发射光束的光路行进。可沿着第一光路设置聚焦光学装置、多频带过滤器以及类似装置(未示出)。在该实施例中，第一光路优选地与用于将发射的光引导到摄像机702的第二光路完全分离。在此，组合光源202(通过转动(光)源自身或者通过使用如透镜、棱镜和镜子等光学元件而再引导这些光束)被转向而将激发光束A倾斜地朝向测序表面102引导，并且物镜被定向为读取与测序表面102垂直地行进的发射光束。在其它实施例中，激发光束A可被定向为垂直于测序表面102，并且发射光束的光路可相对于测序表面102成角度倾斜，或者激发光束A和发出的光路均可被倾斜地定向。阅读了本发明的本领域一般技术人员将会理解其它的离轴布置和替代方案。
仪器700还包括摄像机702，该摄像机可以是常规的彩色数字传感器摄像机、高光谱传感器摄像机、常规的多传感器摄像机或高光谱多传感器摄像机。仪器700可如在本文以上部分所描述的那样被操作，但是期望去掉分色镜以减少成本并且简化仪器设计。如需要，还可在从组合光源202到测序表面102的光路中，以及从测序表面102到摄像机702的光路中设置一个或多个激发过滤器、发光过滤器或其它光学部件。其它替代方案对于阅读了本发明的本领域一般技术人员而言将是显而易见的。
图8中示出离轴仪器的另一示例。仪器800被配置成在移动测序表面102的连续扫描期间同时读取两个不同的碱基标记颜色。测序表面102安装在可动台118上，但是备选地，测序表面102可以是静止的，而光学系统部件被移动。仪器800具有两个光源802，这两个光源通过线形光学装置804(例如，柱形透镜)指向测序表面102，该线形光学装置使激发光弯折，以形成垂直于行进方向并且完全或部分地跨过测序表面102的宽度延伸的线。在光源802与测序表面102之间的光路中(如果期望或需要的话)还可设置聚光透镜806、激发过滤器808或其它光学部件。
从测序表面102发出的光被物镜810朝向聚光透镜812聚焦，并随后到达摄像机传感器814(例如，CCD或CMOS传感器)。在从测序表面102到摄像机传感器814的光路中也可包括另外的光学特征(如发光过滤器818和光束聚焦或塑形透镜)。两个发射光束过滤器816被设置在聚光透镜812与传感器814之间。每个发射光束过滤器816被选择为透射由所述光源802之一的启用而产生的发射光。例如，左侧的光源802会以第一激发波长发光，该第一激发波长引起第一碱基标记以第一发光波长发光，而右侧的光源802会以第二激发波长发光，该第二激发波长引起第二碱基标记以不同于第一发光波长的第二发光波长发光。
在使用中，每个光源802将线形光束在沿着测序表面102的不同位置处投影到测序表面102上，以在该位置处激发碱基标记。物镜810和聚光透镜812将碱基标记发出的光经由发光过滤器816透射到传感器814。右侧的发射光束过滤器816被配置成使第一发光波长传递到传感器814的第一部分，而左侧的发射光束过滤器816被配置成使第二发光波长传递到传感器814的第二部分。透镜810、812被配置成使得发射的光产生照射测序表面102的第一部分和第二部分的单独的线形光束。这种单独的激发光束和单独的发射光束的布置提供多个优点。例如，其有助于防止如果激发光束激发多于四个的不同碱基标记之一时可发生的错误读取。其还有助于隔离传感器图像，以帮助防止传感器噪声和相关问题。然而，应理解的是，并非所有实施例中都严格需要将激发光束的位置分开。
当测序表面102相对于物镜810移动时，传感器814在测序表面102的全部或部分宽度上连续扫描，以产生一系列图像。这些依时序的一系列图像能够使用线扫描的现有技术中已知的算法，能够被容易地整理到一起而成为碱基标记的位置的二维地图。传感器814同时读取用于两个不同碱基标记的这些二维图像，每个标记的发光波长在传感器814上的不同位置处被探测。
图8的实施例可被修改为读取全部四种碱基标记波长。例如，每个光源802可被改变为发出两个激发波长，可将一个光源802设置为发出全部四个波长，或者一个光源802可提供三个激发波长，而另一光源可提供一个激发波长。在这些实施例中，传感器可被替换为上文所描述的常规的彩色传感器或高光谱传感器。作为另一示例，另外两组光源可被设置为在测序表面102上的另外两个不同的位置处投射单独的激发光束，并且所发出的光可在穿过合适的发光过滤器之后，在传感器814上的另外两个不同位置处被读取。
图8的实施例还可被修改为使用高光谱或常规彩色传感器。彩色传感器可配置为马赛克传感器(例如参见图3和图4)，或者扫描传感器。例如，图9示出了使用布置为扫描传感器的高光谱过滤器902的扫描仪器900。在该示例中，组合光源202将四个激发波长通过线形光学透镜804投射到测序表面102。碱基标记通过物镜810、发光过滤器818和投影透镜812而将发射光发出到传感器814。扫描高光谱过滤器902位于传感器814附近。扫描高光谱过滤器902类似于与图4关联地描述的过滤器，但是并未将不同的法布里-珀罗光谱过滤器布置成马赛克样式，它们被布置成垂直于可动台118的扫描方向延伸的四排。当测序船102被扫描时，每排扫描高光谱过滤器902将四种碱基发光波长之一连续地透射到相邻的传感器像素，以产生一组发出相应的波长的碱基标记的位置的依时序的图像。用于每个波长的这组依时序的图像随后能够使用线扫描的现有技术中已知的算法而被整理成用于每个类型的碱基标记的二维地图。在该示例中，投影透镜812可包括线形(例如圆柱形)透镜，该线形透镜使发出的光束散焦，以将它们分布在四排光谱过滤器上。其它光学装置和布置对于阅读了本发明的本领域一般技术人员而言将是容易理解的。
相对于使用马赛克样式的过滤器的常规的彩色传感器和高光谱传感器而言，与图8和图9关联地被提供和讨论的示例性实施例被认为具有优点，因为不需要对结果图像去马赛克。这些实施例还可提供相对于多传感器摄像机系统的优点，因为能够收集图像数据而不需要使用二向色棱镜和多个传感器来分离和读取不同的波长(虽然这样的装置仍然可在图8和图9的实施例中使用)。然而，可能需要提供更耐用和有效的聚焦控制，以确保碱基标记在整个扫描操作中保持焦点对准。还可能在机械方面更复杂，并且包含计算，以与在连续延伸过程之后产生的扫描图像对准。这些和其它方面的考虑对于阅读了本发明的本领域一般技术人员而言将是可理解的。
本发明描述了多个新的、有用的且非显而易见的特征和/或可以单独或一起使用的特征的组合。可以预期的是，(本发明的)实施例特别有助于在高生产量核酸测序系统的背景下提高处理速度，但是也可提供其它的益处，并且应理解的是，提高的处理速度并非在所有实施例中都是必要的。尽管本文描述的这些实施例总体上是在合成测序过程的背景下被说明，但应理解的是，可配置(获得)用于其它使用化学标记的视觉观察的测序过程的多个实施例。在此描述的实施例都是示例性的，并非用以表示本发明的范围。应理解的是，在此描述的本发明能够被修改并且以多种且等同的方法而被应用，并且所有这些变型和应用均应被包括在本发明和所附权利要求书的范围内。

Claims (26)

1.一种测序仪器光学系统，包括：
组合光源，包括多束共线的激发光束，每束激发光束具有各自不同的激发波长；
测序表面，包括多个DNA模板和多个碱基标记，所述多个碱基标记配置成当被一束或多束所述激发光束激发时，以各自不同的发光波长发出相应的发射光；
彩色摄像机，配置成用以探测每个所述碱基标记的发射光；
第一光路，配置成将所述共线的激发光束从所述组合光源引导向所述测序表面；以及
第二光路，配置成将所述发射光从所述测序表面引导向所述彩色摄像机。
2.根据权利要求1所述的测序仪器光学系统，其中，所述组合光源包括四束共线的激发光束。
3.根据权利要求1所述的测序仪器光学系统，其中，所述彩色摄像机包括：
传感器，具有多个感光像素；以及
过滤器阵列，具有多个颜色过滤器，每个颜色过滤器均与相应的感光像素关联。
4.根据权利要求3所述的测序仪器光学系统，其中，所述多个颜色过滤器包括红色过滤器、绿色过滤器和蓝色过滤器。
5.根据权利要求3所述的测序仪器光学系统，其中，所述过滤器阵列包括高光谱过滤器。
6.根据权利要求5所述的测序仪器光学系统，其中，所述高光谱过滤器包括多个法布里-珀罗光谱过滤器。
7.根据权利要求5所述的测序仪器光学系统，其中所述高光谱过滤器包括：
第一组过滤器，配置成透射具有与第一碱基标记发射光关联的第一波长的光；
第二组过滤器，配置成透射具有与第二碱基标记发射光关联的第二波长的光；
第三组过滤器，配置成透射具有与第三碱基标记发射光关联的第三波长的光；以及
第四组过滤器，配置成透射具有与第四碱基标记发射光关联的第四波长的光。
8.根据权利要求7所述的测序仪器光学系统，其中：
与所述第一碱基标记发射光关联的所述第一波长包括与所述第一碱基标记的第一最大发光波长对应的波长；
与所述第二碱基标记发射光关联的所述第二波长包括与所述第二碱基标记的第二最大发光波长对应的波长；
与所述第三碱基标记发射光关联的所述第三波长包括与所述第三碱基标记的第三最大发光波长对应的波长；以及
与所述第四碱基标记发射光关联的所述第四波长包括与所述第四碱基标记的第四最大发光波长对应的波长。
9.根据权利要求8所述的测序仪器光学系统，其中，所述第一最大发光波长为约525nm，所述第二最大发光波长为约565nm，所述第三最大发光波长为约630nm，而所述第四最大发光波长为约680nm。
10.根据权利要求7所述的测序仪器光学系统，其中：
所述第一波长包括具有位于电磁谱的第一频带内的半峰全宽值的第一波长分布；
所述第二波长包括具有位于电磁谱的第二频带内的半峰全宽值的第二波长分布；
所述第三波长包括具有位于电磁谱的第三频带内的半峰全宽值的第三波长分布；
所述第四波长包括具有位于电磁谱的第四频带内的半峰全宽值的第四波长分布。
11.根据权利要求10所述的测序仪器光学系统，其中，所述第一频带、所述第二频带、所述第三频带和所述第四频带并不包括任何重叠波长。
12.根据权利要求10所述的测序仪器光学系统，其中，所述第一频带、所述第二频带、所述第三频带和所述第四频带中的每一者均包括20nm宽的电磁谱的部分。
13.根据权利要求7所述的测序仪器光学系统，其中，所述第一组过滤器、所述第二组过滤器、所述第三组过滤器和所述第四组过滤器被布置成马赛克样式。
14.根据权利要求7所述的测序仪器光学系统，其中，所述第一组过滤器、所述第二组过滤器、所述第三组过滤器和所述第四组过滤器被布置成扫描样式，其中每组过滤器被布置成一连续的排。
15.根据权利要求14所述的测序仪器光学系统，其中，所述测序表面能沿第一方向相对于所述彩色摄像机移动，且所述第一光路包括透镜组件，所述透镜组件配置成将所述共线的激发光束沿垂直于所述第一方向的线投射到所述测序表面上。
16.根据权利要求1所述的测序仪器光学系统，其中，所述彩色摄像机包括具有多个传感器的多传感器摄像机。
17.根据权利要求16所述的测序仪器光学系统，其中，所述多个传感器包括三个或四个传感器，每个传感器分别被配置成接收具有不同波长的发射光。
18.根据权利要求17所述的测序仪器光学系统，其中，所述彩色摄像机包括高光谱摄像机，而所述多个传感器包括：第一传感器，配置成用以探测第一发光波长；第二传感器，配置成用以探测第二发光波长；第三传感器，配置成用以探测第三发光波长；以及第四传感器，配置成用以探测第四发光波长。
19.根据权利要求16所述的测序仪器光学系统，其中，所述多传感器摄像机包括多个棱镜，每个棱镜均配置成将相应的发射光引导到相应的传感器。
20.根据权利要求1所述的测序仪器光学系统，其中，所述第一光路和所述第二光路包括共享的多频带分色镜，所述共享的多频带分色镜配置成透射所述发射光，并且将所述多束共线的激发光束朝向所述测序表面反射。
21.根据权利要求1所述的测序仪器光学系统，其中，所述第一光路和所述第二光路中的至少一者相对于所述测序表面倾斜。
22.一种测序仪器光学系统，包括：
第一激发光束，具有第一激发波长；
第二激发光束，具有与所述第一激发波长不同的第二激发波长；
测序表面，其包括：多个DNA模板；第一碱基标记，其配置成当被所述第一激发光束激发时，以第一发光波长发出第一发射光；以及第二碱基标记，其配置成当被所述第二激发光束激发时，以第二发光波长发出第二发射光；
第一透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第一激发光束投射到所述测序表面上的第一位置上；
第二透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第二激发光束投射到所述测序表面上的第二位置上，所述第二位置不同于所述第一位置；
传感器，其配置成用以探测每个所述碱基标记的发射光，所述传感器能够沿第一方向相对于所述测序表面移动；
第一颜色过滤器，其配置成透射所述第一发光波长，且所述第一颜色过滤器位于所述测序表面上的第一位置与所述传感器的第一部分之间；以及
第二颜色过滤器，其配置成透射所述第二发光波长，且所述第二颜色过滤器位于所述测序表面上的第二位置与所述传感器的第二部分之间。
23.根据权利要求22所述的测序仪器光学系统，还包括：
第三激发光束，具有第三激发波长；
第三碱基标记，其配置成当被所述第三激发光束激发时，以第三发光波长发出第三发射光；
第三透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第三激发光束投射到所述测序表面上的第三位置上，所述第三位置不同于所述第一位置和所述第二位置；以及
第三颜色过滤器，其配置成透射所述第三发光波长，且所述第三颜色过滤器位于所述测序表面上的第三位置与所述传感器的第三部分之间。
24.根据权利要求23所述的测序仪器光学系统，还包括：
第四激发光束，具有第四激发波长；
第四碱基标记，其配置成当被所述第四激发光束激发时，以第四发光波长发出第四发射光；
第四透镜组件，其配置成沿垂直于所述第一方向的线将所述第四激发光束投射到所述测序表面上的第四位置上，所述第四位置不同于所述第一位置、所述第二位置和所述第三位置；以及
第四颜色过滤器，配置成透射所述第四发光波长，且所述第四颜色过滤器位于所述测序表面上的第四位置与所述传感器的第四部分之间。
25.根据权利要求22所述的测序仪器光学系统，其中，所述测序表面被安装在可动台上，从而使所述传感器能沿第一方向相对于所述测序表面移动。
26.根据权利要求22所述的测序仪器光学系统，还包括一个或多个透镜，所述透镜被配置成在所述传感器的第一部分处沿着第一离散线投射所述第一发光波长，并且在所述传感器的第二部分处沿着第二离散线投射所述第二发光波长。
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