CN103091298A - 一种实时荧光定量pcr检测系统 - Google Patents

Abstract

一种实时荧光定量PCR检测系统，涉及PCR检测。提供结构简单、操作简便、能同时对所有样品进行荧光检测成像的一种实时荧光定量PCR检测系统。设光源、多通带激发滤光片、多通带二向色镜、透镜组、热循环系统、多通带荧光滤光片、彩色面阵光电探测器和信息分析处理单元；所述激发滤光片为多通带激发滤光片，二向色镜为多通带二向色镜，荧光滤光片为多通带荧光滤光片；所述光源和激发滤光片设在与水平方向成45°的二向色镜水平轴上，所述光源发出的光经激发滤光片射到二向色镜上；所述透镜组、荧光滤光片和彩色面阵光电探测器自下而上设在与水平方向成45°的二向色镜的竖直轴线上，彩色面阵光电探测器与信息分析处理单元相连接。

Description

一种实时荧光定量PCR检测系统

技术领域

本发明涉及PCR检测，尤其是涉及一种实时荧光定量PCR检测系统。

背景技术

荧光定量PCR检测系统工作原理是使反应物在指定的变性温度、复性温度和延伸温度之间自动循环的仪器，通过变性、复性和延伸的温度循环可在短时间内将靶DNA扩增数百万倍。同时，通过使用不同波长的激发光照射试管，当试管中的试剂被激发出荧光时，光学传感器(PMT,PD,CCD等)采集到荧光强度信号并传送到计算机进行实时数据显示和分析。

传统的实时荧光定量PCR仪（如中国专利200810120084.7）采用扫描方式获得试剂的荧光信号，这种检测方式具有以下缺点：1）荧光检测模块不固定，电机带动光纤探头运动，在进行扫描的同时，光纤的震动会影响光路的稳定，从而影响检测精确度；2）仪器扫描部分机械结构复杂，成本高、质量大。扫描探头在电机的带动下，在X和Y方向上扫描，需要两个电机协同工作，不利于小型化。

此外，目前主流定量PCR检测系统的多波长扫描工作模式是:采用激发光滤镜轮和荧光滤镜轮。使用步进电机，以机械传动方式逐一选择需要的激发光滤光片和多通带荧光滤光片。在此模式下，滤镜轮的重复定位精度受运动机构限制，其可靠性由于运动而降低。要实现多波长检测，必须依次切换滤光片组，依次控制激发光，每次只有一种波长的发光工作，其总检测时间相当长。中国专利200910153874.X提出了一种能实现实时同步检测的定量PCR的多波长荧光检测方法及装置，实现了多波长荧光实时同步检测。类似的还有中国专利200680019254.1和200410066294.4。美国专利US20110151550A1发明了一种能同时采集530-710nm波长范围荧光信号的检测系统，该系统能精确检测出6种不同波长荧光信号，可操作性好，但该系统所用光学透镜、滤光片和PMT数量多，结构复杂且成本高。其光路结构简图如图1。以上几个专利的共同特点是只能对同一管样品进行多波长荧光检测方法，无法对孔板上的所有样品同时进行实时荧光检测。如要获得所有样品的荧光信号，必须控制检测装置的移动，这种检测方式所需实验时间长，效率低，且机械结构复杂，成本高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述缺陷，提供结构简单、操作简便、能同时对所有样品进行荧光检测成像的一种实时荧光定量PCR检测系统。

本发明设有光源、多通带激发滤光片、多通带二向色镜、透镜组、热循环系统、多通带荧光滤光片、彩色面阵光电探测器和信息分析处理单元；

所述激发滤光片为多通带激发滤光片，所述二向色镜为多通带二向色镜，所述荧光滤光片为多通带荧光滤光片；所述光源和激发滤光片设在与水平方向成45°的二向色镜水平轴上，所述光源发出的光经激发滤光片射到二向色镜上；所述透镜组、荧光滤光片和彩色面阵光电探测器自下而上设在与水平方向成45°的二向色镜的竖直轴线上，彩色面阵光电探测器与信息分析处理单元相连接。

所述光源发出的光照射到所述多通带激发滤光片，所述多通带激发滤光片滤除通带外的光，余下通带的光作为荧光物质的激发光照射到所述多通带二向色镜上，经所述多通带二向色镜反射，多通带的激发光射入并穿过所述透镜组，照射到被检样品，被检样品中的荧光基团受激产生的荧光经所述透镜组照射到所述多通带二向色镜，所述多通带二向色镜初步滤除背景光，多通带荧光和少量的背景光透过所述多通带二向色镜，照射到所述的多通带荧光滤光片，经过所述多通带荧光滤光片进一步滤除背景光，多通带荧光进入所述彩色面阵探测器,最后将所述彩色面阵探测器检测的荧光图像送往所述信息分析处理单元进行分析处理，实现对整个孔板上的样品同时进行多个波段的荧光检测。

所述光源可采用卤钨灯或LED阵列等。

所述彩色面阵光电探测器可采用彩色CCD相机或彩色CMOS相机等。

所述通带的数目可为≥2。

所述多通带荧光滤光片前可依次设有多通带二向色镜和反射镜组，所述反射镜组可采用棱镜，或反射镜片，或棱镜和反射镜片构成。

以下是信息处理的算法原理：

假设所获图像的每个像素由红(R)、绿（G）、蓝（B）三基色组成，其灰度值为G_R、G_G、G_B，波长为λ_i(i=1,2,3)的光的强度为I_λi，α_Xi(i=1,2,3；X=R,G,B)为光电转化系数，那么G_X=α_X1I_λ1+α_X2I_λ2+α_X3I_λ3，即对于三基色彩色面阵探测器而言，可以用如下矩阵形式来描述图片上每个像素的三基色灰度值：

$\left[\begin{array}{c}{G}_R\\ G_G\\ G_B\end{array}\right]=\left[\begin{array}{ccc}{\mathrm{\α}}_{R1}& {\mathrm{\α}}_{R2}& {\mathrm{\α}}_{R3}\\ {\mathrm{\α}}_{G1}& {\mathrm{\α}}_{G2}& {\mathrm{\α}}_{G3}\\ {\mathrm{\α}}_{B1}& {\mathrm{\α}}_{B2}& {\mathrm{\α}}_{B3}\end{array}\right]\left[\begin{array}{c}{I}_{\mathrm{\λ}1}\\ I_{\mathrm{\λ}2}\\ I_{\mathrm{\λ}3}\end{array}\right]$

或者说，

G=AI

其中， $G=\left[\begin{array}{c}{G}_R\\ G_G\\ G_B\end{array}\right],$ $A=\left[\begin{array}{ccc}{\mathrm{\α}}_{R1}& {\mathrm{\α}}_{R2}& {\mathrm{\α}}_{R3}\\ {\mathrm{\α}}_{G1}& {\mathrm{\α}}_{G2}& {\mathrm{\α}}_{G3}\\ {\mathrm{\α}}_{B1}& {\mathrm{\α}}_{B2}& {\mathrm{\α}}_{B3}\end{array}\right],$ $I=\left[\begin{array}{c}{I}_{\mathrm{\λ}1}\\ I_{\mathrm{\λ}2}\\ I_{\mathrm{\λ}3}\end{array}\right]$

那么，I=A^-1G，这样即可得到相应通带的荧光光强I；

本发明所述信息处理的算法原理也可以是：

假设所获图像的每个像素都是由青色(C)、紫红色（M）、黄色（Y）和绿色（G）四种颜色组成，其灰度值为G_C、G_M、G_Y、G_G，波长为λ_i(i=1,2,3，4)的光的强度为I_λi，α_Xi(i=1,2,3,4；X=C,M,Y,G)为光电转化系数，那么G_X=α_X1I_λ1+α_X2I_λ2+α_X3I_λ3+α_X4I_λ4，即对于四颜色彩色面阵探测器而言，可用如下矩阵形式来描述图片上每个像素的四颜色灰度值：

$\left[\begin{array}{c}{G}_C\\ G_M\\ G_Y\\ G_G\end{array}\right]=\left[\begin{array}{cccc}{\mathrm{\α}}_{C1}& {\mathrm{\α}}_{C2}& {\mathrm{\α}}_{C3}& {\mathrm{\α}}_{C4}\\ {\mathrm{\α}}_{M1}& {\mathrm{\α}}_{M2}& {\mathrm{\α}}_{M3}& {\mathrm{\α}}_{M4}\\ {\mathrm{\α}}_{Y1}& {\mathrm{\α}}_{Y2}& {\mathrm{\α}}_{Y3}& {\mathrm{\α}}_{Y4}\\ {\mathrm{\α}}_{G1}& {\mathrm{\α}}_{G2}& {\mathrm{\α}}_{G3}& {\mathrm{\α}}_{G4}\end{array}\right]\left[\begin{array}{c}{I}_{\mathrm{\λ}1}\\ I_{\mathrm{\λ}2}\\ I_{\mathrm{\λ}3}\\ I_{\mathrm{\λ}4}\end{array}\right]$

或者说，

G=AI,

其中， $G=\left[\begin{array}{c}{G}_C\\ G_M\\ G_Y\\ G_G\end{array}\right],$ $A=\left[\begin{array}{cccc}{\mathrm{\α}}_{C1}& {\mathrm{\α}}_{C2}& {\mathrm{\α}}_{C3}& {\mathrm{\α}}_{C4}\\ {\mathrm{\α}}_{M1}& {\mathrm{\α}}_{M2}& {\mathrm{\α}}_{M3}& {\mathrm{\α}}_{M4}\\ {\mathrm{\α}}_{Y1}& {\mathrm{\α}}_{Y2}& {\mathrm{\α}}_{Y3}& {\mathrm{\α}}_{Y4}\\ {\mathrm{\α}}_{G1}& {\mathrm{\α}}_{G2}& {\mathrm{\α}}_{G3}& {\mathrm{\α}}_{G4}\end{array}\right],$ $\left[\begin{array}{c}{I}_{\mathrm{\λ}1}\\ I_{\mathrm{\λ}2}\\ I_{\mathrm{\λ}3}\\ I_{\mathrm{\λ}4}\end{array}\right]$

那么I=A^-1G，这样即可得到相应通带的荧光光强I。

与现有实时荧光定量PCR检测系统相比，本发明具有以下优点：

1)代替传统滤镜轮，结构简单，操作简便。

2)整个荧光检测装置固定不动，避免了机械振动带来的检测误差。

3)实现对所有样品同时进行多波长荧光检测，检测效率大大提高。

4)最大限度缩短了检测总时间，有利于克服试剂样本中物质(酶，引物，内参品等)衰变降解的影响，获得准确的定量PCR分析结果。

5)所用的镜片量少，光路系统简单可靠，成本低，实用性强。

附图说明

图1为本发明实施例的光路示意图。

图2为本发明实施例的五通道光路示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

参见图1，本发明实施例包括：光源1、多通带激发滤光片2、多通带二向色镜3、透镜组4、热循环系统5、多通带荧光滤光片6、彩色面阵光电探测器7和信息分析处理单元8。

所述光源1和所述多通带激发滤光片2设在与水平方向成45°的所述多通带二向色镜3水平轴上，所述光源1发出的光经所述多通带激发滤光片2射到所述多通带二向色镜3上；所述透镜组4、所述多通带荧光滤光片6和所述彩色面阵光电探测器7自下而上设在与水平方向成45°的所述多通带二向色镜3的竖直轴线上，最后所述彩色面阵光电探测器7与所述信息分析处理单元8相连接。

图中示例，所述光源1为卤钨灯。所述多通带激发滤光片2为三通带激发滤光片，其波长为407nm、494nm和576nm。所述多通带二向色镜3为三通带二向色镜，其反射波段为394～414nm，484～504nm，566～586nm；透射波段为446～468nm，520～540nm，614～642nm。所述多通带荧光滤光片6为三通带荧光滤光片，其波长为457nm，530nm和628nm。所述彩色面阵光电探测器7为彩色CCD相机。

所述卤钨灯1发射的光线透过所述多通带激发滤光片2滤出407nm、494nm和576nm三种波长光线射入到所述多通带二向色镜3上，经所述多通带二向色镜3反射的三种波长光线射入并穿过所述透镜组4射入被检样品中，被检样品中的荧光基团被激发产生的三种波长荧光经所述透镜组4射入到所述多通带二向色镜3，穿过所述多通带二向色镜3的三种荧光射向所述多通带荧光滤光片6，经过所述多通带荧光滤光片6的三种波长荧光射入到所述彩色CCD相机7的接收端，这样所述彩色CCD相机7就能对整个孔板上的所有样品同时进行三波长荧光检测成像,最后将所述彩色CCD相机7检测的荧光图像送往所述信息分析处理单元8进行分析处理。

参见图2，本发明的五通道检测实施方案：包括光源1、多通带激发滤光片2、多通带二向色镜3、透镜组4、热循环系统5、多通带二向色镜9、反射镜组10、多通带荧光滤光片组6、彩色面阵光电探测器7和信息分析处理单元8。

所述光源1和所述多通带激发滤光片2设在与水平方向成45°的所述多通带二向色镜3水平轴上，所述光源1发出的光经所述多通带激发滤光片2射到所述多通带二向色镜3上；所述透镜组4、所述多通带二向色镜9自下而上设在与水平方向成45°的所述多通带二向色镜3的竖直轴线上，所述彩色面阵光电探测器7与所述信息分析处理单元8相连接。

图中示例，所述光源1为卤钨灯，所述多通带激发滤光片2为五通带激发滤光片，所述多通带二向色镜3和所述多通带二向色镜9均为五通带二向色镜，所述多通带荧光滤光片组6为一片三通带荧光滤光片和一片两通带荧光滤光片，所述彩色面阵光电探测器7为彩色CCD相机。

所述卤钨灯1发射的光线透过所述多通带激发滤光片2滤出五种波长光线射入到所述多通带二向色镜3上，经所述多通带二向色镜3反射的五种波长光线射入并穿过所述透镜组4射入被检样品中，被检样品中的荧光基团被激发产生的五种波长荧光经所述透镜组4射入到所述多通带二向色镜3，穿过所述多通带二向色镜3的五种荧光射向所述多通带二向色镜9，经过所述多通带二向色镜9的五种波长荧光分离成反射部分荧光和透射部分荧光，反射部分荧光和透射部分荧光经由所述反射镜组10分别入射到所述多通带荧光滤光片组6的两片多通带荧光滤光片，经由所述多通带荧光滤光片组6的反射部分荧光和透射部分荧光入射到所述彩色CCD相机7的接收端，这样所述彩色CCD相机7就能对整个孔板上的所有样品同时进行五波长荧光检测成像,最后将所述彩色CCD相机7检测的荧光图像送往所述信息分析处理单元8进行分析处理。

Claims (6)

1.一种实时荧光定量PCR检测系统，其特征在于设有光源、多通带激发滤光片、多通带二向色镜、透镜组、热循环系统、多通带荧光滤光片、彩色面阵光电探测器和信息分析处理单元；

所述激发滤光片为多通带激发滤光片，所述二向色镜为多通带二向色镜，所述荧光滤光片为多通带荧光滤光片；所述光源和激发滤光片设在与水平方向成45°的二向色镜水平轴上，所述光源发出的光经激发滤光片射到二向色镜上；所述透镜组、荧光滤光片和彩色面阵光电探测器自下而上设在与水平方向成45°的二向色镜的竖直轴线上，彩色面阵光电探测器与信息分析处理单元相连接。

2.如权利要求1所述一种实时荧光定量PCR检测系统，其特征在于所述光源采用卤钨灯或LED阵列。

3.如权利要求1所述一种实时荧光定量PCR检测系统，其特征在于所述彩色面阵光电探测器采用彩色CCD相机或彩色CMOS相机。

4.如权利要求1所述一种实时荧光定量PCR检测系统，其特征在于所述通带的数目为≥2。

5.如权利要求1所述一种实时荧光定量PCR检测系统，其特征在于所述多通带荧光滤光片前依次设有多通带二向色镜和反射镜组。

6.如权利要求5所述一种实时荧光定量PCR检测系统，其特征在于所述反射镜组采用棱镜，或反射镜片，或棱镜和反射镜片构成。

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