CN105092544A - 一种荧光定量pcr检测仪光学激发和检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，属于生物学和医学检测领域。包括光学激发单元和光学检测单元，其中所述光学激发单元包括若干个光源、激发光滤光片、全反射镜；所述光学检测单元包括若干个分光片、滤光片、成像传感器，以及检测电路。光源发出的光经过激发光滤光片后成特定波长的激发光，再经过全反射镜反射后射入PCR试管中，激发光照射试剂中的荧光物质产生发射光，一部分发射光通过反应池的侧面开孔进入光学检测单元，最后经过光学检测单元的分光、滤光后在相应的成像传感器上成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，属于生物学和医学检测领域。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
目前，市面上的荧光定量PCR检测仪，各个产品之间最大的不同在于光学激发和检测模块，这些产品的光学激发和检测模块主要存在以下不足：
1．有些荧光定量PCR检测仪光学激发和检测模块使用光电二极管作为探测器，每个光电二极管一次只能检测一个样品，所以需要通过机械扫描的方式扫描所有样品，这些机械装置的存在增加了体积和功耗降低了可靠性，更重要的是不同样品有检测时间差，影响实验精度。如BIO-RAD公司的CFX96Touch荧光定量PCR仪；
2.有些荧光定量PCR检测仪的光路设计非常复杂，这就增加了产品的体积和成本，降低了可靠性，如Biometra公司的TOpticalThermocycler荧光定量PCR仪；
3.有些荧光定量PCR检测仪通过在光路中增加可转动的激发光滤光片色轮和发射光滤光片色轮，达到多光路检测的目的，这些机械装置的存在增加了功耗降低了可靠性。如Roche公司的LightCycler480荧光定量PCR仪；
4.此外，目前市场上的绝大部分荧光定量PCR检测仪是用于实验室检测的中大型机器，光学激发和检测模块结构复杂、价格昂贵，便携性差。使用者必须将制备好的样品拿到实验室中进行检测，这种方式影响了一些突发性疾病的快速诊断。
有鉴于此，本发明人对此进行研究，专门开发出一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的是提供一种光路简洁、可进行多光谱通道多样品同时检测、无机械移动装置、检测灵活且成本低的荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统。
为了实现上述目的，本发明的解决方案是：
一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，包括光学激发单元和光学检测单元，其中所述光学激发单元包括若干个光源，设置在各个光源出光方向上的激发光滤光片，以及与光源射出的激发光呈倾斜设置的全反射镜；所述光学检测单元包括若干个分光片、滤光片、成像传感器，以及用于控制光学成像的检测电路。光源发出的光经过激发光滤光片后成特定波长的激发光，再经过全反射镜反射后射入PCR试管中，激发光照射试剂中的荧光物质产生发射光，一部分发射光通过反应池的侧面开孔进入光学检测单元，最后经过光学检测单元的分光、滤光后在相应的成像传感器上成像。
作为优选，上述光源包括反光杯和安装在反光杯中心的单色LED，光源采用单色LED，与传统的卤钨灯相比具有发热少，波长利用率高，体积小，寿命长的优点，而采用反光杯可保证LED光源能量得到最高效的利用，同时也可保证激发光保持准直均匀。
为保证光源的均匀性，作为优选，所述荧光定量PCR检测仪的光源与PCR试管之间的光路上进一步安装有阵列透镜组，通过阵列透镜组可以使整束光线在各个部位的亮度都相对一致。
作为优选，上述激发光滤光片采用中心波长在400~650nm的带通滤光片。
作为优选，所述全反射镜与水平方向呈倾斜设置，使激发光经全反射后，垂直射入PCR试管中，保证全反射后的激发光与发射光呈一定角度，从而减小发射光背景噪声。为了减少激发光与发射光之间的干扰，激发光光路与发射光光路最好成一定角度，而直角的干扰最小，使用全反光镜可在保证发射光光路最佳角度的前提下最有效的利用空间，做到整机小型化。
作为优选，所述光学检测单元设有多个检测光路，每个检测光路依次有对应波长的分光片、滤光片、透镜和成像传感器等组成，从多个PCR试管射出的发射光进入光学检测单元后，先经过第一分光片进行分光，分出的第一束特定波长的光束射入对应的第一滤光片和第一透镜，最后在第一成像传感器上成像，余下的发射光再经过第二分光片进行二次分光，分出第二束特定波长的光射入对应的第二滤光片和第二透镜，最后在第二成像传感器上成像，按上述方法依次分光，直至最后一路光束在最后一个成像传感器上成像。
作为优选，各个PCR试管射出的发射光与光学检测单元的主光轴之间的夹角为α，其中0≤α≤12°。因为α的存在，会引起分光片和滤光片的光谱向短波偏离，这样就有可能使激发光透过干扰到测试结果，为避免这种困扰，需要将α控制在一定角度以内。
作为优选，上述成像传感器采用高灵敏度的CMOS成像传感器或CCD成像传感器，例如anitoa公司的ULS24CMOSImager，QImaging公司的EXiBlueCCDImager。
作为优选，上述光学检测单元的检测电路包括图像采集与处理微处理器和LED驱动电路，微处理器的输入端与成像传感器相连，输出端与LED驱动电路相连，所述LED驱动电路的输出端分别与各个单色LED相连。一个温度循环后光学检测模块开始工作，微处理器向LED驱动电路发出指令点亮多个波段的LED，发出激发光。同时微处理器开始采集各个通道上成像传感器的图像，然后对图像进行处理得到各试管的荧光强度。
本发明所述的荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，用低功耗小体积的LED作为激发光源，同时照射到所有的反应池上，并且用高灵敏度的CMOS或者CCD成像传感器作为探测器，对所有的反应池进行同时成像。同时使用滤光片和分光片将不同波长的光在几个光路上同时成像，从而可以在一个样品中检测多种不同的荧光物质，可以对多个样品同时检测。不再需要庞大的机械扫描装置对各样品逐个检验，简化了系统设计，避免由于样品光学检验时间不同造成的不准确性，特别适用于小型快速的核酸检测解决方案。此外，上述荧光定量PCR光学激发和检测系统与现有技术相比，还具有如下优点：
（1）光学激发和检测系统无机械传动装置，避免了后期使用过程的机械故障问题；
（2）可以实现所有样品同时检测，避免了因为扫描的时间差带来的误差，提高检测的可重复性；
（3）光学激发和检测系统结构简洁、体积小巧，可以携带移动，方便就地检测，减少了样品运输带来的时间成本和样品降解变质风险，而且成本降低，大大减少实时荧光PCR仪的价格门槛，提高PCR技术的普及率。
以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述。
附图说明
图1为本实施例的荧光定量PCR检测仪内部结构示意图；
图2为本实施例的光学激发和检测系统光路示意图；
图3为本实施例的荧光定量PCR检测仪光学检测单元内部光路示意图；
图4为本实施例的光学检测单元的检测电路微处理器原理图。
具体实施方式
本发明所述的光学激发和检测系统主要用于便携式荧光定量PCR检测仪，一种便携式荧光定量PCR检测仪，如图1所示，包括光学激发和检测系统、温度控制单元2，其中光学激发和检测系统包括光学激发单元1、光学检测单元3，所述光学激发单元1包括若干个光源11，设置在各个光源11出光方向上的激发光滤光片12，以及与光源射出的激发光呈倾斜设置的全反射镜13；所述温度控制单元2包括用于放置PCR试管4的反应池21、设置在PCR试管4顶部的热盖22、设置在PCR试管4底部的加热/制冷片23、设置在加热/制冷片23下方的散热部件24，以及用于调节热盖和加热/制冷片23温度高低的温度控制电路；所述光学检测单元3包括若干个分光片、滤光片、成像传感器，以及用于控制光学成像的检测电路。光源11发出的光经过激发光滤光片12后成特定波长的激发光，再经过全反射镜13反射后射入PCR试管4中，激发光照射试剂中的荧光物质产生发射光，一部分发射光通过反应池21的侧面开孔212进入光学检测单元3，最后经过光学检测单元3的分光、滤光后在相应的成像传感器上成像。
在本实施例中，如图2所示，所述光学激发和检测系统包括3个检测通道，因此所述光源11包括3个反光杯111和安装在各个反光杯111中心的单色LED112，光源11采用单色LED112，与传统的卤钨灯相比具有发热少，波长利用率高，体积小，寿命长的优点，而采用反光杯111可保证LED光源能量得到最高效的利用，同时也可保证激发光保持准直均匀。为保证光源11的均匀性，可以在光源11与PCR试管4之间的光路上进一步安装阵列透镜组，通过阵列透镜组可以使整束光线在各个部位的亮度都相对一致。
为了减少激发光与发射光之间的干扰，激发光光路与发射光光路最好成一定角度，而直角的干扰最小，因此，本实施例所述的全反射镜13与水平方向呈45°倾斜设置，使水平方向射来的激发光经全反射后，垂直射入PCR试管4中，荧光物质产生发射光再水平射出，保证全反射后的激发光与发射光呈直角，使用全反光镜13可在保证发射光光路最佳角度的前提下最有效的利用空间，做到整机小型化。
在本实施例中，所述激发光滤光片12采用3个不同中心波长的带通滤光片，具体如表1所示。
表1三个通道的激发光与发射光中心波长
| 激发光中心波长（nm） | 发射光中心波长(nm) | 可检测的荧光物质举例 |
| 470 | 510 | FAM，SYBR Green I,Fluorescein,EvaGreen,Alexa Fluor 488 |
| 530 | 550 | JOE,VIC,HEX,TET,MAX,CAL Fluor,Gold 540,Yakima Yellow |
| 570 | 610 | ROX,CAL Fluor Red 610,Cy3.5,Texas Red, lexa Fluor 568 |
如图3所示，所述光学检测单元3设有3个检测光路，每个检测光路依次有对应波长的分光片、滤光片、透镜和成像传感器组成，从多个PCR试管4射出的发射光进入光学检测单元3后，先经过第一分光片31进行分光，分出的第一束特定波长（510nm）的光束射入对应的第一滤光片33和第一透镜36，最后在第一成像传感器39上成像，余下的发射光再经过第二分光片32进行二次分光，分出第二束特定波长（550nm）的光射入对应的第二滤光片34和第二透镜37，最后在第二成像传感器40上成像，剩下的第三束特定波长（610nm）的光射入对应的第三滤光片35和第三透镜38，最后在第三成像传感器41上成像。
各个PCR试管4射出的发射光与光学检测单元3的主光轴之间的夹角为α，其中0≤α≤12°。因为α的存在，会引起光学检测单元3内的分光片和滤光片的光谱向短波偏离，这样就有可能使激发光透过干扰到测试结果，为避免这种困扰，需要将α控制在一定角度以内。
上述第一成像传感器39、第二成像传感器40和第三成像传感器41采用高灵敏度的CMOS成像传感器，在本实施例中，具体anitoa公司的ULS24CMOSImager，上述成像传感器也可以采用CCD成像传感器，例如QImaging公司的EXiBlueCCDImager。
上述光学检测单元3的检测电路包括图像采集与处理微处理器和LED驱动电路，图像采集与处理微处理器的输入端与各个成像传感器相连，输出端与LED驱动电路相连，LED驱动电路分别与3个单色LED112相连。一个温度循环后光学检测单元开始工作，图像采集与处理微处理器向LED驱动电路发出指令点亮多个波段的LED，发出激发光。同时微处理器开始采集各个通道上成像传感器的图像，然后对图像进行处理得到各试管的荧光强度，本实施例中，成像部分检测电路的微处理器采用STM32F103ZE型号的微处理器芯片，如图4所示。此外，本实施例所述的荧光定量PCR光学激发和检测系统还可以通过设置与图像采集与处理微处理器相连的通信模块（如蓝牙模块等），实现荧光定量PCR检测仪与其他设备（手机、上位机等）的通讯。
本实施例采用三通道设计，可以一个样品中同时检测三种荧光物质。工作原理如下：
470nm单色LED打开，经过激发光滤光片12后被全反镜13反射到试管4内的试剂上，带有FAM荧光物质的样品被激发，发出510nm左右的发射光。发射光进入光学检测单元3后被第一分光片31(530nm长通分光片）反射，经过发射光带通滤光片后在第一成像传感器39上成像，查看像的形状和亮度可以判断哪些样品含有FAM荧光物质，以及浓度大小。
530nm单色LED打开，经过激发光滤光片12后被全反镜13反射到试管4内的试剂上，带有JOE荧光物质的样品被激发，发出550nm左右的发射光。发射光进入光学检测单元3后穿过第一分光片31，然后被第二分光片32（585nm长通分光片）反射，经过发射光带通滤光片后在第二成像传感器40上成像，查看像的形状和亮度可以判断哪些样品含有JOE荧光物质，以及浓度大小。
570nm单色LED打开，经过激发光滤光片12后被全反镜13反射到试管内的试剂上，带有ROX荧光物质的样品被激发，发出610nm左右的发射光。发射光进入光学检测单元3后穿过第一分光片31和第二分光片32，经过发射光带通滤光片后在第三成像传感器41上成像，查看像的形状和亮度可以判断哪些样品含有ROX荧光物质，以及浓度大小。
本实施例以三通道举例，但是并不局限于三个通道，可以有2通道、4通道、5通道等，以FAM，JOE，ROX三种荧光物质举例，但是并不局限于这几种，如表1所示FAM如果换成相同工作波段的SYBRGreenI也可以。
本实施例所述的荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，用低功耗小体积的LED作为激发光源，同时照射到所有的反应池上，并且用高灵敏度CMOS或者CCD成像传感器作为探测器，对所有的反应池进行同时成像。同时使用滤光片和分光片将不同波长的光在几个光路上分别在同一时间成像，从而可以在一个样品中检测多种不同的荧光物质，并且可以对多个样品同时检测。不再需要庞大的机械扫描装置对各样品逐个检验，简化了系统设计，避免由于样品光学检验时间不同造成的不准确性，特别适用于小型快速的核酸检测解决方案。
上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。
Claims (9)
1.一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，包括光学激发单元和光学检测单元，其中所述光学激发单元包括若干个光源，设置在各个光源出光方向上的激发光滤光片，以及与光源射出的激发光呈倾斜设置的全反射镜；所述光学检测单元包括若干个分光片、滤光片、成像传感器，以及用于控制光学成像的检测电路等；光源发出的光经过激发光滤光片后成特定波长的激发光，再经过全反射镜反射后射入PCR试管中，激发光照射试剂中的荧光物质产生发射光，一部分发射光通过反应池的侧面开孔进入光学检测单元，最后经过光学检测单元的分光、滤光后在相应的成像传感器上成像。
2.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：所述光源包括反光杯和安装在反光杯中心的单色LED。
3.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：所述荧光定量PCR检测仪的光源与PCR试管之间的光路上进一步安装有阵列透镜组，通过阵列透镜组使整束光线在各个部位的亮度都相对一致。
4.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：所述激发光滤光片采用中心波长在400~650nm的带通滤光片。
5.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：所述全反射镜与水平方向呈倾斜设置，使激发光经全反射后，垂直射入PCR试管中。
6.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：所述光学检测单元设有多个检测光路，每个检测光路依次主要有对应波长的分光片、滤光片、透镜和成像传感器组成，从多个PCR试管射出的发射光进入光学检测单元后，先经过第一分光片进行分光，分出的第一束特定波长的光束射入对应的第一滤光片和第一透镜，最后在第一成像传感器上成像，余下的发射光再经过第二分光片进行二次分光，分出第二束特定波长的光射入对应的第二滤光片和第二透镜，最后在第二成像传感器上成像，按上述方法依次分光，直至最后一路光束在最后一个成像传感器上成像。
7.如权利要求6所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：各个PCR试管射出的发射光与光学检测单元的主光轴之间的夹角为α，其中0≤α≤12°，以保证分光片和滤光片因入射角度偏离引起的工作波长偏离较小。
8.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：所述成像传感器采用CMOS成像传感器或CCD成像传感器。
9.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测仪光学激发和检测系统，其特征在于：所述光学检测单元的检测电路包括图像采集与处理微处理器和LED驱动电路，微处理器的输入端与成像传感器相连，输出端与LED驱动电路相连，所述LED驱动电路的输出端分别与各个单色LED相连，微处理器发送指令给驱动电路，点亮LED产生激发光，同时微处理器采集成像传感器收集的发射光信号。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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