JP5021615B2 - 複数の光学モジュールを共通の検出器に結合するファイバ束を有する多重蛍光検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、評価分析システムに関し、より具体的には、蛍光染料を使用した多重標的種の検出技法に関する。

光ディスクシステムは、様々な生物学的検定、化学的検定または生化学的検定を実施するためにしばしば使用されている。典型的なシステムにおいては、血液、血漿、血清、尿または他の液体など、液体検体を格納および処理するための基材として、回転式ディスクが使用されている。

分析法の一種類がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、このポリメラーゼ連鎖反応は、核酸配列解析にしばしば用いられている。具体的には、ＰＣＲは、ＤＮＡ塩基配列決定法、クローニング、遺伝子マッピング、および他の形式の核酸配列解析にしばしば用いられている。

一般に、ＰＣＲは、ＤＮＡ複製酵素の能力に依存して、高温において安定性を維持している。ＰＣＲには、変性、アニーリング、および伸長の３つの主な工程がある。変性の間、液体試料は約９４℃で加熱される。このプロセスの間、二本鎖ＤＮＡは「融解」して一本鎖ＤＮＡへと開く。アニーリングの間、一本鎖ＤＮＡは約５４℃に冷却される。この温度では、プライマーは、複製されるＤＮＡ断片の端部へ結合または「徐冷」する。伸長の間、試料は７５℃に加熱される。この温度において、酵素はヌクレオチドを標的配列に追加し、最終的に、ＤＮＡ鋳型の相補的コピーが形成される。新たなＤＮＡ鎖が、次の事象の配列すなわち「サイクル」に対する新たな標的となる。

ＰＣＲの間に試料中の特定のＤＮＡおよびＲＮＡ配列のレベルをリアルタイムで決定するように設計された既存のＰＣＲ計測器は多数存在する。その計測器のうちの多くは、蛍光染料の使用に基づいている。具体的には、多くの従来のリアルタイムＰＣＲ計測器は、ＰＣＲ産物の増幅の間、比例して生成される蛍光信号を検出する。

従来のリアルタイムＰＣＲ計測器は、異なる蛍光染料の検出には異なる方法を用いている。例えば、ある従来のＰＣＲ計測器は、それぞれの染料をスペクトルに関して分解するためのフィルタホイールに白色光源を組み合わせている。その白色光源は、数千時間の最大寿命を有するタングステンハロゲン電球である。フィルタホイールは、典型的には、摩耗を受けやすい複雑な電気機械的部品である。

一般に、本発明は、リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）において複数の標的種を検出するための、本明細書において多重ＰＣＲと呼ぶ技法に関する。具体的には、複数の光学モジュールを組み込んだ多重蛍光検出装置について説明する。光学モジュールのそれぞれは、別個の波長帯域において各蛍光染料を検出するために最適化することができる。換言すれば、光学モジュールは、多重併発反応を異なる波長において調べるために使用することができる。その反応は、例えば、回転ディスクの単一のプロセスチャンバ（例えばウェル）内で発生させることができる。

複数の光学モジュールは、多脚式の光ファイバ束によって単一の検出器に光学的に結合されている。このようにして、多重化は、複数の光学モジュールと、単一の検出器、例えば光電子増倍管とを使用することによって達成される。それぞれの光学モジュール内の光学構成要素は、感度を最大化し、かつスペクトルのクロストーク、すなわち別の光学モジュール上のある染料からの信号の量を最小化するように選択することができる。

一実施形態において、装置は、複数のプロセスチャンバを有する回転ディスクを備えており、前記プロセスチャンバは、各サンプルと複数の蛍光染料とを保持している。前記装置は、複数の光学モジュールをさらに含んでおり、前記複数の光学モジュールのそれぞれは、染料の異なる１つに対して選択された光源を含んでいる。前記複数の光学モジュールの前記光源は、前記回転ディスクの異なる領域を励起し、前記ディスクから放出された蛍光を捕捉する。前記複数の光学モジュールから単一の検出器へ前記蛍光を伝達するために、１本の光ファイバ束が前記複数の光学モジュールに結合されている。

別の実施形態において、システムは、データ取得装置を備えている。前記システムは、前記データ取得装置に結合された検出装置をさらに備えており、前記検出装置は、それぞれが異なる波長で蛍光を放出する複数の種を有するプロセスチャンバを複数有する回転ディスクと、それぞれが前記種を励起しかつ異なる波長で前記種によって放出された前記蛍光を捕捉するように、光学的に構成された複数の光学モジュールと、検出器と、前記複数の光学モジュールから前記検出器へ前記蛍光を伝達するために、前記複数の光学モジュールに結合された光ファイバ束と、を備えている。

付加的な実施形態において、一方法は、それぞれが異なる波長で蛍光を放出する複数の種を有するプロセスチャンバを複数有するディスクを回転させるステップと、複数の放出蛍光光線を生成するように、複数の光線で前記ディスクを励起するステップと、複数の異なる光学モジュールで前記蛍光光線を捕捉するステップであって、前記光学モジュールは、前記異なる波長に対して光学的に構成されるステップと、前記蛍光光線を前記複数の光学モジュールから単一の検出器へ光ファイバ束で伝達するステップと、前記蛍光光線を表す信号を前記検出器から出力するステップと、を含む。

前記装置は、リアルタイムＰＣＲを実施することが可能である一方で、いかなる種類の生体反応をも、その生体反応が生じている間に解析することが可能である。前記装置は、それぞれの反応の温度を独立してまたは選択した群として調整することが可能であり、また、前記装置は、２つのチャンバの間に弁を含めることによって、多段階の反応をサポートすることが可能である。この弁は、エネルギーのバーストを弁に供給するレーザーを使用することにより、反応中にも開くことができる。

ある実施形態において、前記装置は、遠隔地または仮設の実験室で操作できるように、持ち運び可能にすることができる。前記装置は、反応をリアルタイムで解析するためのデータ取得コンピュータを含むことができ、また、前記装置は、有線または無線の通信インタフェースを介して、データを別の装置に通信することができる。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の説明で示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は、その説明と図面から、また特許請求の範囲から明らかとなろう。

図１は、多重蛍光検出装置１０の例示的実施形態を示す構成図である。図示の例において、装置１０は、４つの異なる染料の光学検出のための４つの「チャネル」を提供する４つの光学モジュール１６を有している。具体的には、装置１０は、回転ディスク１３の異なる領域を所与のいかなるときにも励起し、かつ放出された異なる波長の蛍光エネルギーを染料から収集する４つの光学モジュール１６を有している。その結果、光学モジュール１６は、試料２２中に生じる多重併発反応を調べるために使用することができる。

多重反応は、例えば、回転ディスク１３の単一のチャンバ内で同時に発生することがある。光学モジュール１６のそれぞれは、ディスク１３が回転するとき、試料２２を調べ、異なる波長で蛍光エネルギーを収集する。例えば、モジュール１６内の励起源を、対応する波長でデータを収集するのに十分な期間にわたって、順次活性化することができる。すなわち、光学モジュール１６Ａをある期間にわたって活性化して、第１の反応に対応する第１の染料に対して選択された第１の波長範囲においてデータを収集することができる。次いで励起源を非活性化することができ、また、モジュール１６Ｂ内の励起源を活性化して、第２の反応に対応する第２の染料に対して選択された第２の波長範囲において試料２２を調べることができる。このプロセスは、データがすべての光学モジュール１６から捕捉されるまで継続する。一実施形態において、光学モジュール１６内の励起源のそれぞれは、約２秒間という初期期間にわたって活性化されて定常状態に達し、その定常状態の後に、ディスク１３の１０〜５０回転にわたって持続する問い合わせ期間が続く。他の実施形態において、励起源は、それより短い期間（例えば、１ミリ秒もしくは２ミリ秒）またはそれより長い期間にわたって順序づけられてもよい。ある実施形態において、ディスク１３が回転する間に試料２２の同時問い合わせを行うために、複数の光学モジュールを一斉に活性化することができる。

単一の試料２２を示してあるが、ディスク１３は、試料を保持する複数のチャンバを含んでもよい。光学モジュール１６は、異なるチャンバの一部またはすべてに異なる波長で問い合わせることができる。一実施形態において、ディスク１３は、ディスク１３の円周に配置された９６個のチャンバを有する。９６個のチャンバディスクおよび４個の光学モジュール１６を用いると、装置１０は、３８４個の異なる種からデータを得ることができる。

一実施形態において、光学モジュール１６は、廉価な高出力発光ダイオード（ＬＥＤ）である励起源を含んでおり、その高出力発光ダイオードは、様々な波長で市販されており、かつ長寿命（例えば１００，０００時間以上）を有している。別の実施形態においては、従来のハロゲン電球または水銀ランプを励起源として使用することができる。

図１に示すように、光学モジュール１６のそれぞれは、光ファイバ束１４の１本の脚部に結合することができる。光ファイバ束１４は、感度を損なうことなく光学モジュール１６から蛍光信号を収集するための柔軟な機構を提供している。一般に、光ファイバ束は、複数の光ファイバを備えており、その光ファイバは並んで置かれ、端部で互いに結合され、柔軟な保護ジャケットに包まれている。あるいは、光ファイバ束１４は、共通の端部を有する、より少数で個別の大直径多モードファイバ（ガラスまたはプラスチック）を備えていてもよい。例えば、４光学モジュール装置の場合、光ファイバ束１６は、それぞれが１ｍｍのコア直径を有する４本の個別の多モードファイバを備えていてもよい。束の共通端部は、互いに縛られた４本のファイバを含んでいる。この例において、検出器１８の開口部は８ｍｍであってもよく、これは４本のファイバに結合するのに十分なものである。

この例において、光ファイバ束１４は、光学モジュール１６を単一の検出器１８に結合している。光ファイバは、光学モジュール１６によって収集した蛍光を伝え、また、捕捉した光を検出器１８に効果的に送る。一実施形態において、検出器１８は、光電子増倍管である。別の実施形態において、前記検出器は、複数の光電子増倍素子を、単一の検出器内に、各光ファイバごとに１つ含んでもよい。他の実施形態において、１つ以上の固体検出器を使用することができる。

単一の検出器１８を使用することは、単一の検出器のみ使用が必要となることによる最小コストを維持する一方で、高感度でかつおそらくは高価な検出器（例えば光電子増倍管）を使用することができるという点で有利となりうる。単一の検出器について本明細書で論じるが、しかしながら、１つ以上の検出器を、多数の染料の検出のために含めてもよい。例えば、１枚のディスクから放出された８つの異なる波長の検出を可能にするために、４つの付加的な光学モジュール１６および第２の検出器をシステムに追加することができる。

光学モジュール１６は、装置から取り外し可能であり、また、異なる波長での問い合わせに対して最適化された他の光学モジュールと容易に交換可能である。例えば、光学モジュール１６は、ハウジングの場所内に物理的に装着することができる。光学モジュール１６のそれぞれは、光学モジュールの１つ以上のマーキング（例えばガイドピン）とかみ合うガイド（例えばくぼんだ溝）に沿って、ハウジングの各場所内に容易に挿入することができる。各光学モジュールは、光ファイバ束１４の１本の脚部に結合するための光出力ポート（図２に示す）を含んでいる。光出力ポートは、脚部のねじ付きコネクタに結合されるねじ付き端部を有することができる。あるいは、光ファイバ束１４を光出力ポートとの間で摺動自在に係合および解放する「クイック接続」の形式（例えば、Ｏリングとキャッチピンを有する摺動自在な接続部）を用いてもよい。さらに、光学モジュール１６のそれぞれは、完全に挿入されたとき制御ユニット２３に電気的に結合する１つ以上の電気接点を有することができる。回転ディスク１３と共に使用する例示的な取り外し式光学モジュールが、「取り外し式光学モジュールを有する多重蛍光検出装置（MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE HAVING REMOVABLE OPTICAL MODULES）」と題された２００５年７月５日出願の米国特許出願第１１／１７４，７５４号に記載されている。

装置１０は、モジュール式の構成となっていることにより、多重ＰＣＲなど、所与の解析環境において使用される蛍光染料のすべてに容易に適合する。装置１０において使用しうる他の化学作用には、インベーダー（Invader）法（ウィスコンシン州マジソン（Madison）のサードウェーブ社（Third Wave））、ＴＭＡ（Transcripted-mediated Amplification）法（カリフォルニア州サンディエゴ（San Diego）のジェンプローブ社（GenProbe））、蛍光標識酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）が挙げられる。装置１０のモジュール構成は、対応する染料を多重反応において選択的に励起し検出する目的で、小さな特定の目標範囲の波長に対して対応する励起源（不図示）と励起および検出フィルタを選択することによって、各光学モジュール１６の感度を最適化できるという点で、別の利点をもたらすことができる。

例として、装置１０は４色多重構成で示してあるが、さらに多数または少数のチャネルを適切な光ファイバ束１４と共に使用することができる。このモジュール設計により、ユーザーは、単に別の光学モジュール１６をベース２０に追加し、光ファイバ束１４の１本の脚部をその新たな光学モジュールに挿入することによって、装置１０を現場で容易に改良することができる。光学モジュール１６は、光学モジュールを識別しかつ装置１０の内部制御光学モジュールまたは他の内部電子装置（例えば制御ユニット２３）に較正データをダウンロードする集積電子装置を有してもよい。

図１の例において、試料２２は、ディスク１３のチャンバ内に収容されており、ディスク１３は、制御ユニット２３の制御下にある回転プラットフォームに装着されている。スロットセンサトリガ２７は、制御ユニット２３が利用する出力信号を提供し、ディスクの回転中にデータ取得をチャンバ位置と同期化するためのデータ取得をもたらす。スロットセンサトリガ２７は、機械的または光学的なセンサとすることができる。例えば、センサは、光線をディスク１３に送るレーザーであってもよく、また、制御ユニット２３は、ディスク１３内のスロットを通過する光を検出するセンサを使用して、ディスク上のチャンバの位置を突き止める。光学モジュール１６は、回転プラットフォーム２５の上に物理的に装着することができる。結果として、光学モジュール１６は、異なるチャンバと一度に重なり合う。

また、検出装置１０は、ディスク１３上での試料２２の温度を調整するための発熱体（不図示）を含んでいる。発熱体は、反射エンクロージャ内に収容された円筒形のハロゲン電球を備えることができる。反射チャンバは、電球からの電磁線をディスク１３の放射切片に集束するように形作られている。一般に、ディスク１３の加熱領域は、ディスク１３が回転すると環に似たものとなる。この実施形態において、反射エンクロージャの形状は、正確な集束を可能にする楕円形と球形の幾何学形状の組み合わせとすることができる。他の実施形態において、反射エンクロージャは、異なる形状のものであってもよく、また、電球はより大きな領域を広く照射してもよい。他の実施形態において、反射エンクロージャは、試料２２を含む単一のプロセスチャンバなど、ディスク１３の単一の領域上に電球からの電磁線を集束するように形作ることができる。

ある実施形態において、発熱体は空気を加熱し、その熱空気を１つ以上の試料に送り込んで温度を調整することができる。加えて、試料は、ディスクによって直接加熱されてもよい。この場合、発熱体は、プラットフォーム２５内に配置し、ディスク１３に熱的に結合することができる。発熱体内の電気抵抗により、制御ユニット２３によって制御されるディスク１３の選択された領域を加熱することができる。例えば、領域は１つ以上のチャンバ、場合によってはディスク全体を含むことができる。回転ディスク１３と共に使用する例示的発熱体が、「回転多重蛍光検出装置用の発熱体（HEATING ELEMENT FOR A ROTATING MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE）」と題された２００５年７月５日出願の米国特許出願第１１／１７４，６９１号に記載されている。

別法としてまたは加えて、装置１０はまた、冷却用構成要素（不図示）を含むことができる。冷たい空気、すなわち室温の空気をディスク１３に供給するために、ファンが装置１０に含められる。冷却は、試料の温度を適切に調整しかつ実験が完了した後に試料を保管するために必要となることがある。他の実施形態において、プラットフォーム２５はその温度を必要に応じて減じることができるので、冷却用構成要素は、プラットフォーム２５とディスク１３との熱結合を含むことができる。例えば、ある生体試料は、酵素活性またはタンパク質変性を減じるために、摂氏４度で保管することができる。

また、検出装置１０は、プロセスチャンバ内に含まれた反応種を制御することもできる。例えば、ある種をプロセスチャンバに装填して１つの反応を発生させ、後に、第１の反応が終了次第、別の種をその試料に追加すると有益となることがある。レーザーホーミング弁機構を追加して、内部保持チャンバをプロセスチャンバから分離する弁を制御し、それによって、ディスク１３の回転中に種をチャンバに追加するのを制御することができる。このレーザーホーミング弁機構は、光学モジュール１６の１つの中に、または光学モジュールとは分離して配置することができる。ディスク１３の下のレーザーの真下に、レーザーをディスク１３に対して位置決めするためのレーザーセンサがあってもよい。

一実施形態において、レーザーは、少なくとも２つの電力設定を有する近赤外線（ＮＩＲ）レーザーである。低電力設定において、レーザー位置決めセンサは、ディスク１３内のスロットを通じてＮＩＲ光を認識することによって、レーザーがチャンバ弁を越えた所定の位置にあることを示すことができる。レーザーが所定の位置に入ると、制御ユニット２３は、高出力エネルギーの短いバーストを出力して弁を加熱し弁を開けるように、レーザーに指示する。次いで、弁を開くことによって、内部の流体試料を内部チャンバから外部プロセスチャンバに向かって流れさせ、第２の反応を行わせることができる。ある実施形態において、ディスク１３は、複数の反応を順次発生させるために、複数の弁を含むことができる。また、複数のチャンバ弁を利用するとき、レーザーとレーザーセンサの複数のセットを使用することもできる。回転ディスク１３と共に使用する例示的レーザーホーミング弁制御システムが、「回転多重蛍光検出装置用の弁制御システム（VALVE CONTROL SYSTEM FOR A ROTATING MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE）」と題された２００５年７月５日出願の米国特許出願第１１／１７４，９５７号に記載されている。

データ取得システム２１は、装置１０からデータを各染料ごとに、順次にまたは同時に収集することができる。一実施形態において、データ取得システム２１は、光学モジュール１６からデータを順次に収集し、スロットセンサトリガ２７から測定される光学モジュールの１つごとに、空間的な重なり合いをトリガ遅延によって修正する。

装置１０の１つの用途はリアルタイムＰＣＲであるが、本明細書で説明する技法は、複数の波長における蛍光検出を利用する他のプラットフォームに拡張することができる。装置１０は、発熱体を利用した急速熱循環と、核酸の分離、増幅、および検出のための遠心駆動式マイクロフルイディクスとを組み合わせることができる。多重蛍光検出を用いることにより、多重標的種を同時に検出し解析することができる。

リアルタイムＰＣＲの場合、蛍光は、３つの一般的技法のうちの１つにおいて増幅量を測定するために使用される。第１の技法は、二本鎖ＤＮＡに結びつけられると蛍光性が向上するＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（オレゴン州ユージン（Eugene）のモレキュラー・プローブ社（Molecular Probes）製）などの染料を使用することである。第２の技法では、増幅された標的配列に結びつけられたときに蛍光性が変化する蛍光標識プローブ（ハイブリダイゼーションプローブ、ヘアピンプローブなど）を使用する。この技法は、二本鎖ＤＮＡ結合染料を使用することと類似しているが、プローブは標的配列の特定の切片にのみ結合するため、より特定的なものである。第３の技法は、加水分解プローブ（カリフォルニア州フォスター・シティ（Foster City）のアプライドバイオシステムズ（Applied BioSystems）社製のＴａｑｍａｎ（商標））を使用することであり、この技法において、ポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性により、クェンチャー分子は、ＰＣＲの伸長段階の間にプローブから分裂されて蛍光活性となる。

これらの手法のいずれにおいても、蛍光性は、増幅した標的濃度と線形に比例する。データ取得システム２１は、ＰＣＲ反応の間に検出器１８からの（または別法として、任意選択で制御ユニット２３によってサンプリングされ通信された）出力信号を測定して、増幅をほぼリアルタイムで観測する。多重ＰＣＲにおいて、多重標的は、独立して測定される異なる染料で標識化される。概して、各染料は、異なる吸光度および発光スペクトルを有する。この理由により、光学モジュール１６は、異なる波長でのサンプル２２の問い合わせのために光学的に選択された励起源、レンズおよび関連するフィルタを有することがある。

本発明に関連した使用に適合しうる好適な構成技法または材料の一部の例が、例えば、本発明の譲受人に譲渡された「改良された試料処理装置システムおよび方法（ENHANCED SAMPLE PROCESSING DEVICES SYSTEMS AND METHODS）」（ベディンガム（Bedingham）ら）と題された米国特許第６，７３４，４０１号および「試料処理装置（SAMPLE PROCESSING DEVICES）」と題された米国特許出願公報ＵＳ２００２／００６４８８５に記載されている。他の有用な装置構成が、２０００年６月２８日に出願され「熱処理の装置および方法（THERMAL PROCESSING DEVICES AND METHODS）」と題された米国仮特許出願第６０／２１４，５０８号、２０００年６月２８日に出願され「試料処理の装置、システムおよび方法（SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS）」と題された米国仮特許出願第６０／２１４，６４２号、２０００年１０月２日に出願され「試料処理の装置、システムおよび方法（SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS）」と題された米国仮特許出願第６０／２３７，０７２号、２００１年１月６日に出願され「試料処理の装置、システムおよび方法（SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS）」と題された米国仮特許出願第６０／２６０，０６３号、２００１年４月１８日に出願され「改良された試料処理の装置、システムおよび方法（ENHANCED SAMPLE PROCESSING DEVICES, SYSTEMS AND METHODS）」と題された米国仮特許出願第６０／２８４，６３７号、および「試料処理の装置およびキャリア（SAMPLE PROCESSING DEVICES AND CARRIERS）」と題された米国特許出願ＵＳ２００２／００４８５３３に見出すことができる。他の実現可能な装置構成が、「試料処理装置の遠心充填（CENTRIFUGAL FILLING OF SAMPLE PROCESSING DEVICES）」と題された米国特許第６，６２７，１５９号に見出すことができる。

図２は、例示的光学モジュール１６Ａを示す概略図であり、この光学モジュール１６Ａは、図１の光学モジュール１６のいずれにも対応しうるものである。この例において、光学モジュール１６Ａは、高出力励起源であるＬＥＤ３０と、コリメーティングレンズ３２と、励起フィルタ３４と、ダイクロイックフィルタ３６と、集束レンズ３８と、検出フィルタ４０と、レンズ４２とを含んでおり、そのレンズ４２は、光ファイバ束１４の１本の脚部に結合された光出力ポート１９に蛍光を集束するためのものである。

結果として、ＬＥＤ３０からの励起光は、コリメーティングレンズ３２によって平行にされ、励起フィルタ３４によってフィルタ処理され、ダイクロイックフィルタ３６を透過し、集束レンズ３８によってサンプル２２に集束される。結果として生じるサンプルから放出される蛍光は、同じ集束レンズ３８によって集められ、ダイクロイックフィルタ３６から反射され、検出フィルタ４０によってフィルタ処理された後、光出力ポート１９に結合された光ファイバ束１４の１本の脚部に集束される。次いで、光束１４は、光を検出器１８に伝送する。

ＬＥＤ３０、コリメーティングレンズ３２、励起フィルタ３４、ダイクロイックフィルタ３６、集束レンズ３８、検出フィルタ４０、およびレンズ４２は、光学モジュール１６Ａと共に用いられる多重染料の特定の吸収帯および発光帯に基づいて選択されている。このようにして、複数の光学モジュール１６は、異なる染料を標的とするように構成し装置１０内に搭載することができる。

表１は、種々の蛍光染料に対して４チャネル多重蛍光検出装置１０において使用することができる例示的な構成要素を示す。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＲＯＸは、カリフォルニア州ノーウォーク（Norwalk）のアプレラ（Applera）社の商標である。Ｔａｍｒａは、カリフォルニア州サンノゼ（San Jose）のアナスペック（AnaSpec）社の商標である。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは、モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社の商標である。Ｃｙ ５は、英国バッキンガムシャー州のアマシャム（Amersham）社の商標である。

説明したモジュール式の多重検出構成の１つの利点は、多種多様な染料に対して検出を最適化する上での柔軟性である。おそらく、ユーザーは、必要に応じて装置１０に差し込むことができる複数の異なる光学モジュールのバンクを有することができ、その複数の光学モジュールのうち、Ｎ個を一度に使用することができるが、ここでＮは、装置によってサポートされるチャネルの最大数である。したがって、装置１０および光学モジュール１６は、任意の蛍光染料およびＰＣＲ検出法と共に使用することができる。より大きな光ファイバ束を使用して、より多数の検出チャネルをサポートすることもできる。さらに、複数の光ファイバ束を複数の検出器と共に使用することもできる。例えば、２本の４脚光ファイバ束を、８台の光学モジュール１６と２台の検出器１８と共に使用することができる。

図３は、多重蛍光検出装置１０の機能ブロック図である。具体的には、図３は、装置構成要素同士の電気的接続およびその構成要素を通じた光の全体的経路を示す。図３の例において、装置１０は、少なくとも１台のプロセッサ４４または他の制御論理回路と、メモリ４６と、ディスクモータ４８と、光源３０と、励起フィルタ３４と、レンズ３８と、検出フィルタ４０と、集合レンズ４２と、検出器１８と、スロットセンサトリガ２７と、通信インタフェース５０と、発熱体５４と、レーザー５５と、電源５２とを含んでいる。図３に示すように、レンズ３８および集合レンズ４２は、別の構成要素に電気接続される必要がない。さらに、光源３０、フィルタ３４および４０、レンズ３８ならびに集合レンズ４２は、１台の光学モジュール１６を代表するものである。図３には示していないが、装置１０は、先に説明したように、付加的な光学モジュール１６を含んでもよい。その場合、それぞれの付加的な光学モジュールは、図３に示すものとほぼ同様に構成された構成要素を含むことができる。

光は、図３における複数の構成要素を通じて、特定の経路をたどる。光は、光源３０から放出されると、励起フィルタ３４に入り、離散的波長の光として去る。次いで、光は、レンズ３８を通過し、そのレンズ３８において、検出装置１０を去り、試料２２をプロセスチャンバ（不図示）内で励起する。試料２２は、異なる波長で蛍光することによって応答し、その時点で、この光は、レンズ３８に入り、検出フィルタ４０によってフィルタ処理される。フィルタ４０は、望ましい蛍光性の範囲外にある波長の背景光を試料２２から除去する。残りの光は、集合レンズ４２を介して送られ、光ファイバ束１４の脚部に入った後、検出器１８によって検出される。検出器１８は後に、受信した光信号を増幅する。

プロセッサ４４、メモリ４６および通信インタフェース５０は、制御ユニット２３の一部分となることができる。プロセッサ４４は、蛍光情報を収集したり、流体をディスク１３に通したりするために、必要に応じてディスク１３を回転またはスピンさせるようにディスクモータ４８を制御する。プロセッサ４４は、スロットセンサトリガ２７から受信したディスク位置情報を使用して、回転中のディスク１３上のチャンバの場所を識別し、ディスクから受信する蛍光データの取得を同期化することができる。

プロセッサ４４はまた、光学モジュール１６内の光源３０が、いつ電源を入れられまた切られるかを制御することができる。ある実施形態において、プロセッサ４４は、励起フィルタ３４および検出フィルタ４０を制御する。照明される試料に応じて、プロセッサ４４は、異なる波長の励起光が試料に達するように、または異なる波長の蛍光が集合レンズ４２に達するように、フィルタを変更することができる。ある実施形態において、一方または双方のフィルタを特定の光学モジュール１６の光源３０に対して最適化して、プロセッサ４４によって変更されないようにすることができる。

集合レンズ４２は、集合レンズから検出器１８への光路をもたらすファイバ束１４の１本の脚部に連結されている。プロセッサ４４は、検出器１８の動作を制御することができる。検出器１８は、すべての光を常に検出することができるが、ある実施形態では他の収集モードを利用することができるプロセッサ４４は、検出器１８がデータをいつ収集するかを決定することができ、また、検出器１８の他の構成パラメータをプログラム的に設定することができる。一実施形態において、検出器１８は、集合レンズ４２によって供給される光からの蛍光を捕捉する光電子増倍管である。応答の際、検出器１８は、受信した光を表す出力信号４３（例えばアナログ出力信号）を生成する。図３には示していないが、検出器１８は、装置１０の他の光学モジュール１６から光を同時に受信することもできる。その場合、出力信号１９は、各種の光学モジュール１６から検出器１８によって受信される光入力の組み合わせを電気的に表すものとなる。

プロセッサ４４はまた、装置１０からのデータ流れを制御することもできる。検出器１８からのサンプリングされた蛍光、発熱体５４および関連するセンサからのサンプルの温度、ならびにディスク回転情報などのデータは、解析のためにメモリ４６内に記憶することができる。プロセッサ４４は、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、書替え可能ゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または他のデジタル論理回路のうちのいずれか１つ以上を含むことができる。さらに、プロセッサ４４は、メモリ４６などのコンピュータ読み取り可能な媒体に記憶されたファームウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを動作環境に提供する。

メモリ４６は、種々の情報を記憶するための１つ以上のメモリを含むことができる。例えば、１つのメモリが、特定の構成パラメータ、実行命令を含むことができ、また、１つのメモリが、収集されたデータを含むことができる。したがって、プロセッサ４４は、装置の動作および較正を制御するために、メモリ４６内に記憶されたデータを使用することができる。メモリ４６は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、電気的消去可能ＲＯＭ（ＥＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリなどのうちのいずれか１つ以上を含むことができる。

プロセッサ４４は、さらに発熱体５４を制御することができる。メモリ４６内に含まれる命令に基づいて、発熱体５４は、所望の加熱プロファイルに従って１つ以上のチャンバの温度を制御するように、選択的に駆動することができる。一般に、発熱体は、ディスク１３の１つの放射切片を、そのディスクが回転するときに加熱する。発熱体５４は、加熱エネルギーをディスク１３の特定の領域に集中させるためのハロゲン電球および反射体を備えることができる。他の実施形態において、発熱体５４は、１つ以上のチャンバを順次に加熱することができる。この実施形態では、チャンバが加熱される間、ディスク１３が静止していることが必要となる。任意の実施形態において、発熱体５４は、必要に応じてきわめて迅速にオンおよびオフとなることができる。

レーザー５５は弁の開きを制御するために使用されており、その弁の開きによって、内部チャンバの内容物をディスク１３上の別のチャンバ、すなわちプロセスチャンバに流れさせることができる。プロセッサ４４および補助ハードウェアは、ディスク１３に含まれる特定の弁を選択的に開くように、レーザー５５を駆動する。プロセッサ４４は、所望の弁に対するレーザーの位置を決定するために、ディスク１３の下方にあるレーザーセンサと相互作用することができる。所定位置にあるとき、プロセッサ４４は、弁を標的とするエネルギーのバーストを生成するようにレーザー５５に指示する信号を出力する。場合によっては、そのバーストは、約０．５秒にわたって持続することができ、一方で、他の実施形態は、持続時間のより短いまたはより長い開き時間を含むことができる。レーザーエネルギーおよびパルス持続時間は、レーザー５５との通信を通じてプロセッサ４４によって制御することができる。

プロセッサ４４は、通信インタフェース５０を利用してデータ取得システム２１と通信する。通信インタフェース５０は、データを転送するために、単一の方法または複数の方法の組み合わせを含むことができる。ある方法は、高いデータ転送速度でのハードウェア接続性のために、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）ポートまたはＩＥＥＥ１３９４ポートを含むことができる。ある実施形態において、後処理用のデータ記憶のために、記憶装置をこれらのポートの１つに直接取り付けることができる。データは、プロセッサ４４によって前処理し、確認に備えることができ、また、生データは完全に処理されなければ、解析を開始できないことがある。

また、検出装置１０との通信は、無線（ＲＦ）通信またはローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）接続によって達成することもできる。さらに、接続性は、直接接続によって、または、有線もしくは無線通信をサポートできるハブもしくはルーターなどのネットワークアクセスポイントを通じて達成することができる。例えば、検出装置１０は、ターゲットのデータ取得装置２１によって受信するための特定のＲＦ周波数で、データを送信することができる。データ取得装置２１は、汎用コンピュータ、ノートブックコンピュータ、ハンドヘルド計算装置、または特定用途装置であってもよい。さらに、複数のデータ取得装置がデータを同時に受信することもできる。他の実施形態において、データ取得装置２１は、検出装置１０と共に、１つの一体化した検出および取得システムとして含めることができる。

加えて、検出装置１０は、更新されたソフトウェア、ファームウェア、および較正データを、インターネットなどのネットワークを介して遠隔装置からダウンロードすることを可能にすることができる。通信インタフェース５０はまた、プロセッサ４４によって、残留量報告のいかなる故障の監視も可能となるようにすることができる。動作に関する問題が発生した場合、プロセッサ４４は、エラー情報を出力して、ユーザーがその問題をトラブルシューティングするのを、動作データを提供することによって支援できることがある。例えば、プロセッサ４４は、故障した発熱体または同期の問題をユーザーが診断するのを助けるために、情報を提供することができる。

電源５２は、動作電力を装置１０の構成要素に供給する。電源５２は、標準的な１１５ボルトの電気コンセントから電気を利用するか、または、蓄電池および発電回路を含んで動作電力を生成することができる。ある実施形態において、蓄電池は、長期に及ぶ動作を可能にするために、充電式とすることができる。例えば、装置１０は、被災地など、緊急時における生体試料の検出のために持ち運び可能とすることができる。充電は、１１５ボルトの電気コンセントを通じて達成することができる。他の実施形態において、従来の蓄電池を使用することができる。

図４は、光ファイバ束の４本の光ファイバに結合された単一の検出器１８の機能ブロック図である。この実施形態において、検出器１８は光電子増倍管である。光ファイバ束１４、光ファイバ１４Ａ、光ファイバ１４Ｂ、光ファイバ１４Ｃおよび光ファイバ１４Ｄのそれぞれの脚部は、検出器１８の光入力インタフェース５５に結合している。このようにして、光ファイバ１４のいずれかによって伝達された光は、検出器１８の単一の光入力インタフェース５５に供給される。ある実施形態において、光ファイバ束１４のそれぞれの脚部は、直径、長さ、またはその双方が異なるものであってもよい。例えば、光ファイバ１４Ａは、直径をより大きくして、光ファイバ１４の他の光ファイバよりも多くの光を検出器１８に伝送するようにしてもよい。光入力インタフェース５５は、取得した光を電子増倍管５６に供給する。アノード５８は電子を収集し、対応するアナログ信号を出力信号として生成する。

換言すれば、図示のように、光ファイバ１４は、検出器１８の入力光開口部に嵌る。結果として、検出器１８は、光束１４のそれぞれの脚部から光を同時に検出するために使用することができる。光入力インタフェース５５は、光を電子増倍管５６に供給する。光電子増倍管の場合、光ファイバからの光子がまず光電効果カソードに当たり、その光電効果カソードが次いで光電子を解放する。光電子は次いで、一連のダイノードに当たることによって電子なだれを生じ（cascade）、より多くの光電子がそれぞれのダイノードとの接触の際に放出される。結果として生じる一群の電子は、元々は光ファイバ１４によって伝送されたわずかな光信号を、事実上増幅した。数の増加した電子は最終的に、アノード５８によって収集される。アノード５８からのこの電流は、複数の光学モジュール１６によって供給された、試料からの光学的蛍光信号を表すアナログ出力信号として、電圧増幅器５９への電流によって伝達される。

制御用光学モジュール２３は、アナログ信号を、サンプリングされたデジタルデータの流れ、すなわちデジタル信号に変換するアナログ−デジタル（Ａ／Ｄ）変換器６０を含んでいる。プロセッサ４４は、上述のように、デジタル信号を受信し、サンプリングされたデータをデータ取得装置２１との通信のためにメモリ４６内に記憶する。ある実施形態において、Ａ／Ｄ変換器６０は、制御用光学モジュール２３の代わりに、検出器１８内に含めることができる。

このようにして、単一の検出器１８を利用して、光束１４からすべての光を収集し、その光を表す信号を生成することができる。信号が増幅器５９によって増幅され、デジタル信号に変換されると、その信号は、それぞれの個別の光学モジュール１６によって収集された光に対応するデータに、デジタル方式で分離することができる。全体的（すなわち集合的）信号は、それぞれお蛍光性を表すそれぞれの検出信号に、周波数範囲ごとに分離することができる。これらの周波数は、データ取得装置２１によってまたは装置１０内で作用されるデジタルフィルタによって分離することができる。

他の実施形態において、増幅された信号は、アナログフィルタを使用して周波数ごとに分離し、Ａ／Ｄ変換器６０の前の別個のチャネルに送信することができる。次いで各チャネルは、別個にデジタル化され、データ取得装置に送信される。いずれの場合も、単一の検出器で、各光学モジュール１６からのすべての蛍光情報を捕捉することが可能である。次いでデータ取得装置２１は、複数の検出器を必要とすることなく、ディスク１３の各チャンバから取得された信号をリアルタイムでプロットし解析することができる。

ある実施形態において、検出器１８は、光電子増倍管でなくてもよい。一般に、検出器１８は、光学的伝達機構、すなわち光束１４の複数の脚部から光を捕捉し、かつ捕捉した光の伝達可能な表現を生成することが可能な、いかなるタイプのアナログまたはデジタル検出装置であってもよい。他の実施形態は、増幅フォトダイオードまたはフォトトランジスタである検出器を含むことができる。

図５は、多重蛍光検出装置１０の動作を示す流れ図である。最初に、ユーザーが、データ取得装置２１上でまたはインタフェースを介して制御ユニット２３を用いて、プログラムパラメータを指定する（６２）。例えば、これらのパラメータは、ディスク１３を回転させる速度および期間を含み、反応の温度プロファイルを規定し、ディスク１３上の場所をサンプリングすることができる。

次に、ユーザーがディスク１３を検出装置１０に載せる（６４）。装置１０を固定すると、ユーザーがプログラムを開始し（６６）、制御ユニット２３が、指定した速度でディスクをスピンさせ始める（６８）。ディスクがスピンし始めた後、２つの並行プロセスが発生することがある。

まず、検出装置１０が、１つ以上の反応によって１つ以上の試料内に生成された励起光から蛍光を検出し始める（７０）。検出器１８は、蛍光が放出されたそれぞれのサンプルおよび時刻に同期された、各サンプルからの蛍光信号を増幅する（７２）。このプロセスにおいて、プロセッサ４４は、捕捉したデータをメモリ４６に保存し、また、実行の進捗を監視するために、そしてさらなる処理のために、データをデータ取得装置１０にリアルタイムで通信することができるあるいは、プロセッサ４４は、プログラムが完了するまで、データを装置１０内に保存することができる。プロセッサ４４は、引き続き試料の蛍光を検出し、プログラムが完了するまでデータを保存する（７４）。実行が完了すると、制御ユニット２３は、ディスクのスピンを停止する（７６）。

このプロセスの間、制御ユニット２３は、ディスク温度を監視し（７８）、その時間に対する目標温度を達成するように、ディスクまたは各サンプルの温度を調整する（８０）。制御ユニット２３は、プログラムが完了するまで、引き続き温度を監視し制御する（８２）。実行が完了すると、制御ユニット２３は、試料の温度を目標の保管温度、通常は摂氏４度に保つ（８４）。

装置１０の動作は、図５の例と異なってもよい。例えば、ディスクの毎分回転数は、プログラム全体を通じて変更されてもよく、また、レーザー５５を利用して、多重反応が可能となるようにディスク上のチャンバ間の弁を開いてもよい。これらの工程は、ユーザーが定義するプログラムに応じて、動作中にいかなる順序で生じてもよい。

図６および７は、多重ＰＣＲ用の装置１０で利用できる、広く使用されている蛍光染料の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを示す。これらの例において、染料の吸収極大は４８０ｎｍ〜６２０ｎｍで変化し、結果として生じる発光極大は５２０ｎｍ〜６７０ｎｍで変化している。図６の各染料に対する信号は、ＦＡＭを８８、Ｓｙｂｒを９０、ＪＯＥを９２、ＴＥＴを９４、ＨＥＸを９６、ＲＯＸを９８、Ｔｘ Ｒｅｄを１００、Ｃｙ５を１０２として符号を付けている。図７の信号は、ＦＡＭが１０４、Ｓｙｂｒが１０６、ＴＥＴが１０８、ＪＯＥが１１０、ＨＥＸが１１２、ＲＯＸが１１４、Ｔｘ Ｒｅｄが１１６、Ｃｙ５が１１８である。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＲＯＸは、カリフォルニア州ノーウォーク（Norwalk）のアプレラ（Applera）社の商標である。Ｔａｍｒａは、カリフォルニア州サンノゼ（San Jose）のアナスペック（AnaSpec）社の商標である。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄは、モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社の商標である。Ｃｙ ５は、英国バッキンガムシャー州のアマシャム（Amersham）社の商標である。

一例において、９６のチャンバディスクを、標準的なＰＣＲ反応緩衝剤に希釈された異なる濃度のＦＡＭおよびＲＯＸ染料で充填した。各染料の４つの複製を、２００ｎＭ ＦＡＭおよび２０００ｎＭ ＲＯＸから開始して、２倍の希釈系列に加えた。各サンプルの体積は１０μＬであった。チャンバ８２は、５μＬの２００ｎＭ ＦＡＭと５μＬの２０００ｎＭ ＲＯＸの混合物を有していた。装置１０は、染料の検出用に２つの光学モジュール１６を有する２チャネル多重ＰＣＲ検出装置として構成した。

第１の光学モジュール（ＦＡＭ光学モジュール）は、青色のＬＥＤと、４７５ｎｍの励起フィルタと、５２０ｎｍの検出フィルタとを具備していた。第２の光学モジュール（ＲＯＸ光学モジュール）は、５６０ｎｍの励起フィルタと６１０ｎｍの検出フィルタとを有する緑色のＬＥＤを具備していた。別の選択肢は、オレンジ色のＬＥＤおよび５８０ｎｍの励起フィルタを組み込んでＲＯＸ検出を最適化することである。

ＰＣＲ解析を実施し、試料からの蛍光信号を二又の光ファイバ束に同時伝送した。ファイバ束は、単一の検出器、具体的には光電子増倍管（ＰＭＴ）と接続した。データは、汎用コンピュータ上で実行されるＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃのデータ取得プログラムと連結された、ナショナルインスツルメンツ（National Instruments）社のデータ取得（ＤＡＱ）ボードによって収集した。データは、ディスクが１０４．７ｒａｄ／ｓ（毎分１０００回転）（公称）でスピンする間に取得した。ＦＡＭ光学モジュールおよびＲＯＸ光学モジュールを順次使用して、試料との問い合わせを行った。各スキャンは、平均５０回転からなるものであった。２つの光学モジュールからの生データを図８Ａおよび８Ｂに示す。

図８Ａのグラフは、ＦＡＭ光学モジュール内のＬＥＤに給電することによって得られたものであり、８Ｂのグラフは、ＲＯＸ光学モジュール内のＬＥＤに給電することによって得られたものである。

解析の間、収集したデータが明確に示したこととして、光学モジュールが異なるチャンバにわたって常時、物理的に位置することに関連する時間オフセットが存在した。オフセット値は、特定のチャンバ、すなわちこの場合はチャンバ８２に対し、光学モジュール１と２の間の時間オフセットを決定することによって計算した。換言すれば、時間オフセットは、同じチャンバに対して、ＦＡＭ光学モジュールによって捕捉されたデータと、ＲＯＸ光学モジュールによって捕捉されたデータとの間の時間遅延の量を示している。

図９は、各チャンバに対する、オフセットを差し引いた総合データを示す。ＦＡＭは、細切れの（hash marked）棒で示され、ＲＯＸは開いた（open）棒で示され、ＲＯＸデータはＦＡＭデータの上に置かれている。データが示すところによれば、光学モジュール１のＲＯＸ染料からの信号はなく、また、光学モジュール２のＦＡＭ染料からの信号はなかった。光学モジュール１にはより高度な背景が存在し、その背景は、最適化されたフィルタのセットを使用することによって、修正することができる。データを解析して、基準ノイズレベルに相当する信号として表される検出限界（ＬＯＤ）を決定した。基準ノイズレベルは、空のチャンバを１０回スキャンした平均値に標準偏差の３倍を加えたものとして定義される。

ＬＯＤは、ＦＡＭおよびＲＯＸ基準の濃度に対してプロットされた総合信号の線形最小二乗フィットによって決定した。ＦＡＭおよびＲＯＸ光学モジュールのＬＯＤは、図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、計算するとそれぞれ１ｎＭおよび４ｎＭとなった。

多重蛍光検出装置の例示的実施形態を示す構成図。 例示的光学モジュールを示す概略図であり、この光学モジュールは、図１の蛍光検出装置の複数の光学モジュールのいずれにも対応しうるものである。 多重蛍光検出装置の例示的実施形態をより詳細に示す構成図。 光ファイバ束の４本の光ファイバに結合された単一の検出器の機能ブロック図。 多重蛍光検出装置の例示的動作を示す流れ図。 多重ＰＣＲ用に利用できる、広く使用されている蛍光染料の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを示す。 多重ＰＣＲ用に利用できる、広く使用されている蛍光染料の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを示す。 ＰＣＲ解析の間に単一の検出器で２つの例示的な光学モジュールから取得された生データを示す。 ＰＣＲ解析の間に単一の検出器で２つの例示的な光学モジュールから取得された生データを示す。 時間オフセットに対して調整した後のデータを示すグラフである。 ２つの例示的な光学モジュールから受信したデータに対する検出限界（ＬＯＤ）を示す。 ２つの例示的な光学モジュールから受信したデータに対する検出限界（ＬＯＤ）を示す。

Claims (3)

1. 各サンプルと複数の蛍光染料とをそれぞれに保持する複数のプロセスチャンバを有するディスクを回転させるためのモータと、
   前記複数の蛍光染料の異なる１つに対して選択された光源と前記ディスクから放出された異なる波長の蛍光を捕捉するためのレンズとをそれぞれに含む複数の光学モジュールと、
   単一の検出器と、
   前記複数の光学モジュールから前記単一の検出器へ前記蛍光を伝達するように、前記複数の光学モジュールに結合された光ファイバ束と、を備える検出装置。
2. データ取得装置と該データ取得装置に結合された検出装置とを備える検出システムであって、
   前記検出装置は、
   異なる波長で蛍光を放出する複数の種をそれぞれに有する複数のプロセスチャンバを有するディスクを回転させるためのモータと、
   前記種を励起しかつ異なる波長で前記種によって放出された異なる波長の蛍光を捕捉するように、それぞれが光学的に構成された複数の光学モジュールと、
   単一の検出器と、
   前記複数の光学モジュールから前記単一の検出器へ前記蛍光を伝達するように、前記複数の光学モジュールに結合された光ファイバ束と、を備える検出システム。
3. 異なる波長で蛍光を放出する複数の蛍光染料をそれぞれに有する複数のプロセスチャンバを有するディスクを回転させるステップと、
   異なる波長の複数の放出蛍光光線を生成するように、複数の光線により前記ディスクを励起するステップと、
   複数の異なる光学モジュールにより前記蛍光光線を捕捉するステップであって、前記光学モジュールは、前記異なる波長に対して光学的に構成されるステップと、
   前記蛍光光線を前記複数の光学モジュールから単一の検出器へ光ファイバ束により伝達するステップと、
   検出した前記光線を表す信号を前記検出器から出力するステップと、を含む方法。

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