JP6501714B2 - 光学調査装置 - Google Patents

Description

本発明は、光学調査技法に関し、具体的には、サンプル内の様々な蛍光体などを調査するための装置に関する。

蛍光体は、光励起の結果として発光する化合物である。それらは、例えば診断検査などのいくつかの分野で用いられる。例えば、医療診断システムは、ミクロ流体カートリッジなどの容器内の核酸増幅を計測するために検査溶液内の蛍光体の光学調査を用いる。

通常、蛍光発光ベースの処理は、特定の励起波長帯域における光を吸収し、その結果、異なる波長範囲で蛍光を発光することが知られる、特定の蛍光成分に励起光を向けることを含む。発光した光は集光され、蛍光のみが残って検出されるようにフィルタされる。

いくつかの適用事例の場合、同じ試料やサンプルを励起するために様々な波長帯域内の光を用いることが有利である。これは例えば、各々が固有の励起スペクトルプロファイルを有する複数の蛍光体を用いてサンプルが検査される場合である。サンプルが１つの波長の光によって励起され別の波長で発光する他の光学現象を調査する事例も、当該技術において知られている。

いくつかの場合、光学装置は、異なる波長間で迅速に切り換え可能であることが望ましい。例えば、光学分析のために様々なサンプルが回転保持器の全周に取り付けられる、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）システムを用いる場合である。保持器が回転すると、熱サイクルごとに蛍光計測が実行される。そのような様々な波長での取得を実行するために、調査システムは、ＰＣＲ手順の合計時間に影響を及ぼす取得間でのダウンタイムを範囲内に収めるために十分迅速に励起光源を切り換える必要がある。様々な光源や（例えばフィルタホイールなどの）蛍光フィルタの機械式切換えを用いる従来のシステムは、多くの場合、取得プロセスにおける大幅な遅延を引き起こす。他のシステムは、様々な波長について様々な光学調査装置を併用し、システム全体の費用および複雑性を大幅に増加させうる。

従って、様々な励起および検出波長の使用およびサンプル内の複数の蛍光体の迅速な検出が可能な改良された光励起および調査装置へのニーズがある。

本発明の実施形態は、複数の波長の励起光を用いてサンプル内の被検体からのルミネセンス光を検出するための光学調査装置を提供する。装置は、各々が個々のスペクトルコンテンツを有する励起光を発する複数の光源アセンブリを含む。励起光は、被検体を励起するためにサンプルに投射される。その結果生じるルミネセンス光は、装置を通過し後方へ進行し、検出のために出力される前に（例えば励起光などの）寄生光から対象のスペクトルコンテンツを分離するためにフィルタされる。

一実施形態において、光学調査装置は、蛍光体と称される分子の種からルミネセンスを検出するために用いられうる。本発明の実施形態は、例えば燐光発光、蛍光発光、生物発光、時間分解発光、蛍光偏光などの様々な光学現象の結果生じるサンプル内の被検体からのルミネセンス光を検出するために用いられうる。例えば、蛍光検出は、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列決定、タンパク質分析、細胞分析などに用いることができる。

一態様によると、個々のスペクトルコンテンツを有する複数の励起光線によって励起されるサンプルによって生じるルミネセンス光を検出するための調査装置が提供され、装置は、各々が励起光線の１つを発する複数の光源アセンブリと、サンプルによって生じるルミネセンス光を検出するための少なくとも１つの検出器と、光源アセンブリからサンプル上の共通励起点へ励起光線の各々について異なる励起光路を定め、サンプル上の励起点から少なくとも１つの検出器へのルミネセンス光のルミネセンス光路を定める光学アセンブリとを備える。

光学アセンブリは、単一の筐体に含まれる。
光学アセンブリは、励起光およびルミネセンス光の両方の空間プロファイルおよび／またはスペクトルプロファイルを定め、寄生光が検出器に到達することを防ぐための構成部品を含んでよい。例えば、対応する光路に沿って所与の光線のサイズを制限する空間フィルタがアセンブリ内のいくつかの箇所に提供されうる。励起光線のスペクトルコンテンツを排除するスペクトルプロファイルを有するスペクトルフィルタもまたルミネセンス光路に配置されうる。

光学アセンブリは、サンプルに励起光を投射し、サンプルからの蛍光を集光するサンプル側光学部品を含んでよい。検出のためにフィルタされた蛍光を出力する検出器側光学部品も提供されうる。

典型的な実施形態において、光学アセンブリの光学部品は、筐体内に強固に取り付けられ、幾何学的考察を考慮して装置全体の様々な光路を定める。例えば一実施形態において、光源は、主軸の周囲を取り巻くように配置され、外側反射部品を含むミラーアセンブリは、光源からの励起光線を内側に方向換えするように励起光路に配置される。外側反射部品からの励起光線を受け、それを順方向に方向換えする内側反射部品が更に提供されうる。しかし、本発明の範囲から逸脱することなく他の構成が考案されうることが更に理解されるであろう。

本発明の別の態様によると、上述した光学調査装置を含む、サンプルを光学的に検査するための試験装置も提供される。試験装置は例えば、限定的ではなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）、例えば再結合ポリメラーゼ増幅などの等温増幅、または他の核酸検出法のためのシステムによって具現化されうる。

本発明のまた別の態様によると、各々が個々のスペクトルコンテンツを有する複数の励起光線によって励起されるサンプル内の被検体によって生じるルミネセンス光を検出するための調査装置が提供される。調査装置は、被検体を励起するためにサンプルに投射される複数の励起光線の１つを各々が発する複数の光源と、サンプルによって生じるルミネセンス光を検出するための少なくとも１つの検出器と、光源からサンプル上の共通励起点へ励起光線の各々について異なる一定の励起光路を定め、サンプル上の励起点から少なくとも１つの検出器へのルミネセンス光の共有ルミネセンス光路を定める光学アセンブリとを備え、励起光路およびルミネセンス光路はサンプルの同じ側にあり、光学アセンブリは、サンプルへ励起光を投射しサンプルからのルミネセンス光を集光するサンプル側光学部品を含み、全ての励起光路および共有ルミネセンス光路にサンプル側光学部品を提供する。

一実施形態において、光学アセンブリは更に、共有ルミネセンス光路に提供されるフィルタを備え、フィルタは、固定フィルタおよび作動式フィルタの１つであり、シングルバンドパスフィルタおよびマルチバンドパスフィルタの１つである。

一実施形態において、光学アセンブリは、単一の筐体に含まれる。
一実施形態において、光学アセンブリは、励起光線およびルミネセンス光の少なくとも１つの空間プロファイルおよびスペクトルプロファイルの少なくとも１つを定めるための構成部品を含む。

一実施形態において、構成部品は、対応する光路に沿って所与の光線のサイズを制限する空間フィルタである。

一実施形態において、スペクトルフィルタは、励起光線のスペクトルコンテンツを排除するスペクトルプロファイルを有し、ルミネセンス光路に配置される。

一実施形態において、光学アセンブリは、検出のためにフィルタされたルミネセンス光を出力する検出器側光学部品を含む。

一実施形態において、光源は、主軸の周囲を取り巻くように配置され、光学アセンブリは、励起光線を内側に方向換えするように光源からの励起光線の光路に配置された外側反射部品を含むミラーアセンブリを含む。

一実施形態において、ミラーアセンブリは、外側反射部品からの励起光線を受け、サンプル側光学部品の方へ励起光線を方向換えするための内側反射部品を含む。

一実施形態において、光学アセンブリは、サンプル側光学部品に向けて励起光線を導くための導波管を備える。

一実施形態において、サンプル内の被検体からのルミネセンス光は、少なくとも１つの光学現象の結果生じ、光学現象は、蛍光発光、燐光発光、生物発光、時間分解発光、および蛍光偏光の１つである。

本発明のまた別の態様によると、光学調査装置を含む、サンプルを光学検査するための試験装置が提供される。

一実施形態において、試験装置は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）、等温増幅再結合ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、および他の核酸検出法の１つを実行するためのシステムによって具現化される。

上述したような光学調査装置を含む更なる例は、核酸配列決定、タンパク質分析、細胞分析、および複数の波長を用いる励起および検出を必要とする他の任意のシステムを含む。

本発明の実施形態の他の特徴および利点は、添付図面を参照してそれらの実施形態を読解することによってより深く理解されるであろう。

本発明の本質を大まかに説明するために、好適な実施形態を例示的に示す添付図面について言及する。

例示的な光学調査装置の概略図である。 例示的な光学調査装置の概略図である。 蛍光装置を定める例示的な光学アセンブリの断側面図である。 図２の装置の断面等角図である。 図２の装置の例示的な支持構造の等角図である。 図２の装置の部分透過正面図である。 それぞれ蛍光体の吸光スペクトルプロファイルおよび発光スペクトルプロファイルのグラフである。 それぞれ蛍光体の吸光スペクトルプロファイルおよび発光スペクトルプロファイルのグラフである。 １つの蛍光体に関する正規化された吸光および発光のグラフを示す。 蛍光装置を定める例示的な光学アセンブリの断側面図である。 図７の７Ａ部分の拡大図である。 光源アセンブリに関する様々な構成を用いる、上述した典型的な実施形態の変形例の概略図である。 光源アセンブリに関する様々な構成を用いる、上述した典型的な実施形態の変形例の概略図である。 光源アセンブリに関する様々な構成を用いる、上述した典型的な実施形態の変形例の概略図である。 光源アセンブリに関する様々な構成を用いる、上述した典型的な実施形態の変形例の概略図である。 光源アセンブリに関する様々な構成を用いる、上述した典型的な実施形態の変形例の概略図である。 分析するサンプル間の動きが直線状である例示的な実施形態を示す。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 様々なフィルタリング構成を用いる、上述した典型的な実施永代の変形例の概略図である。 例示的な光学調査装置が組み込まれた計器を用いて検出された２つの蛍光体の校正結果を示す。 対応する校正曲線を示す。 対応する校正曲線を示す。 例えばＰＣＲシステムの一部として例示的な光学調査装置が用いられうる試験装置の概略図である。 ディスポーザブル流体求心装置を示す。 図１２に示すような試験装置を用いて取得される信号トレースを示す。 図１３Ａに示す種類の８つの流体求心装置の一回転ごとに取得される生の信号を示す。 図１４Ａの遠位管、図１４ＢのＰＭＴ管、図１４ＣのＬＥＤ光学部品、図１４ＤのＬＥＤプリント基板、および図１４Ｅの検出器モジュールを含む例示的な光モジュール構成部品およびアセンブリの分解図を示す。 図１４の例示的な光モジュールの集合図を示す。 図１４の集合モジュールの断側面図を示す。 例示的な光モジュールのワークフローである。 バックグラウンド除去がある場合およびない場合の、核酸のリアルタイムＰＣＲ増幅中の蛍光読取りの結果を示す。 Ｓ状曲線近似に関する結果の例を示す。 Ｓ状曲線近似に関する第２の導関数の結果の例を示す。 実験例におけるウェル１の近似曲線および生データ（バクグラウンド除去）を示す。 実験例におけるウェル１の近似曲線および生データ（バクグラウンド除去）を示す。 図１８の実験例におけるウェル２の近似曲線および生データ（バックグラウンド除去）を示す。 図１８の実験例におけるウェル２の近似曲線および生データ（バックグラウンド除去）を示す。 図１８の実験例におけるウェル３の近似曲線および生データ（バックグラウンド除去）を示す。 図１８の実験例におけるウェル３の近似曲線および生データ（バックグラウンド除去）を示す。

添付図面全体を通して、同様の特徴は同様の参照番号が付されることに留意する。
本発明の典型的な実施形態は、光学調査装置に関する。

各々が個々のスペクトルコンテンツを有する複数の励起光線によって励起されるサンプルにおける被検体によって発するルミネセンス光を検出するための調査装置を提供する。調査装置は、各々が励起光線を発する複数の光源；サンプルによって生じるルミネセンス光を検出するための少なくとも１つの検出器；および、光源からサンプル上の共通励起点まで励起光線の各々について異なる一定の励起光路を定め、かつ、サンプル上の励起点から少なくとも１つの検出器へのルミネセンス光の共有ルミネセンス光路を定める光学アセンブリを備え、励起光路およびルミネセンス光路はサンプルの同じ側にあり、光学アセンブリは、サンプルに励起光を投射しサンプルからのルミネセンス光を集光するサンプル側光学部品を含む。

１つの典型的な実施形態において、光学調査装置２０は、例えば図１２に概略的に示す装置などの試験装置１００において有用である。そのような試験装置１００は、複数の流体求心装置１０３が放射状に配置されたロータ１０２を含む。分析用のサンプルは、流体求心装置１０３上に充填され、マイクロ流体コンテナ１０４に入る。リアルタイムＰＣＲ取得法等に適した流体求心装置の例が、ＰＣＴ特許出願公報ＷＯ２０１２／１２０４６３号に示され、これは、参照によって本願に組み込まれる。ロータ１０２の回転運動は、プロセスコントローラ１１０からの制御信号を受信するアクチュエータ１０６によって生じる。エンコーダ１０８は、精密なフィードバックループ制御のためにコントローラへ位置信号フィードバックを提供する。アクチュエータ１０６および光学調査装置２０は、所望の取得ルーチンに従って調査装置を作動させるプロセスコントローラ１１０によって連帯的に制御される。データ取得および信号処理は、エンコーダ信号を用いてロータ１０２の回転と正確に同期して実行され、後者は、データ取得「ウィンドウ」を定める。

例示的な流体求心装置１０３が図１３Ａに示される。この例示的な流体求心装置１０３は、３つのマイクロ流体コンテナＣ１、Ｃ２、Ｃ３ＡＢＣと廃棄物コンテナＷとの合計４つのコンテナを有する。例示的な実施形態において、データ取得には、光学チャネルごとに（すなわち、各蛍光体につき）１秒未満しかかからない。ＰＭＴウォームアップ時間およびデータ処理を含む手順全体では、各ＰＣＲサイクルで完了するまでに１０秒未満しか必要でない。

ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）蛍光体を含む溶剤が充填された流体装置（１０３）の８００ＲＰＭで回転中の生信号取得の例が図１３Ｂに一例として示される。図１３Ｃの信号トレースは、ロータ１０２に挿入された８つの流体求心装置１０３の１回転につき取得される生信号を表す。下のグラフの信号トレース１２６は、（コンテナＣ１、コンテナＣ２、コンテナＣ３、および廃棄物Ｗを含む４つのコンテナ１０４を有する）１つの流体装置の信号トレースの拡大図であり、蛍光信号である。四角形状のトレース１２４は、エンコーダ信号から発生したデータ取得「ウィンドウ」を表す。各マイクロ流体コンテナ１０４について、既定の関心領域（ＲＯＩ）内に含まれる信号の僅かな一部のみがコントローラエレクトロニクス１１０によって処理される。このＲＯＩは、データ処理「ウィンドウ」によって図１３Ｂに示される。このアプローチは、信号対バックグラウンド比を向上させ、回転速度の変動とは無関係である。

図１２に示す試験装置１００の構成は単なる一例として提示され、本発明の様々な実施形態に係る光学調査装置は様々な構成で用いられうることが容易に理解されるだろう。追加の例において、分析用サンプル間での動きは直線状であってよい、すなわち、サンプルを保持する機構は調査装置に対して直線的にスキャンされうるか、あるいは調査装置がサンプルに対して直線的にスキャンされうる。そのような変形例に関する例示的な実施形態は図９に示される。

いくつかの実施形態において、調査装置は、サンプル内の蛍光体から蛍光発光を検出するために用いられうる。当業者は、蛍光発光の概念が一般に、既定のスペクトル帯である「励起帯／プロファイル」における励起光を吸収し、その結果、異なるスペクトル帯「蛍光発光」すなわち「蛍光」における光を発する化合物や分子の光学特性を称することを容易に理解するであろう。蛍光体は一般に、既知の方法において通常、そのような光学特性を示す化合物や分子として理解される。任意選択的に、蛍光体は、マーカとして関心が高いＤＮＡ、抗体、または他の分子や基質に共有結合するか、あるいは結合しうる。蛍光体の例は、アミノ酸、タンパク質、例えばトリプトファンなどの色素およびポリマー、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、例えば６−ＦＡＭ（商標）などのフルオレセインおよび派生物、ＪＯＥ、エオシン、Ｃｙ３（商標）、例えばＲＯＸなどのローダミンおよび派生物、Ｃｙ５（商標）、テキサスレッド（登録商標）、クエーサー（登録商標）７０５、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００などを含む。

本装置は、被検体が所与のスペクトルプロファイルの光によって励起され、その結果、異なるスペクトルプロファイルを有する光を返す様々な応用において用いられ、そのような戻り光は一般にルミネセンスと称される。実施形態は、サンプル内の燐光を発する被検体からの燐光性光を検出するために用いることもできる。

図６Ａおよび６Ｂを参照すると、単なる一例として提示される、いくつかの蛍光体の励起プロファイル８０および蛍光発光プロファイル８２がそれぞれ示される。図６Ｃは、６−ＦＡＭの励起プロファイル８０と蛍光発光プロファイル８２とを対比させる。示されるように、両方のプロファイルはわずかに重なるが、蛍光発光ピークは吸収（励起）ピークと比べて長い波長にシフトする。当業者は、本発明の実施形態が、上述した特定の蛍光体および本明細書に示すようなスペクトルプロファイルに限定されないことを理解するであろう。

蛍光体は多くの場合、医療検査、工業検査、法医学検査、セキュリティテスト、および診断スキームにおけるツールとして用いられる。例えば、犯罪現場の専門家は、不可視紫外照明に晒されると比較的少量のタンパク質から可視スペクトルで発される蛍光発光を観察することによって、高いコントラストで表面上の体液の痕跡を露わにする。光学調査装置および蛍光体を用いること、とりわけ蛍光ポリマーを増幅することにより、表面や周囲空気から抽出される微量の爆薬を検出するための市販の方法が存在する。蛍光顔料は通常、偽造を防止するために、貨幣、文書、商用包装、および他の製品に含まれる。最後に、医療機器および実験器具は、例えば、特徴的なスペクトルプロファイルを有する分子蛍光体によって変異細胞を選択的に分類することによって野生型細胞から変異細胞を特定および選別するために、日常的に蛍光発光を使用する。

本願の光学調査装置は、サンプル内の複数の蛍光体からの蛍光発光を励起および集光するために用いられうる。適用事例によって、サンプルは例えば、透明プラスチックやガラスの容器または検出セルなどに入った、対象となる分子に共有結合あるいは結合しうる蛍光体を含む大量の水溶液によって具現化することができる。本発明の実施形態は、様々な励起スペクトルプロファイルおよび蛍光発光スペクトルプロファイルを有する様々な蛍光体が同一サンプル内に存在し、照合される必要があるという状況で用いられうる。

本説明は主に蛍光検出に言及するが、当業者は、本発明の実施形態が他の光学現象の観察に関連して用いられてもよいことを容易に理解するであろう。サンプルがある波長の光によって励起され別の波長で光を発する他の光学現象を観察する適用事例は、例えばトリプトファンやテトラヨードフルオレセイン（エリトロシンＢ、ＥｒｙＢ）などの分子の燐光を含み、これは、溶液中のタンパク質の生体分子流動性を観察し、非晶質生体材料の化学安定性および物理安定性を調査するために用いられてきた。

光学調査装置
図１Ａを参照すると、サンプル２２内の蛍光体による蛍光発光を検出するための例示的な光学調査装置２０の要素が図示的に示される。光モジュールは、様々な励起光路およびルミネセンス光路がサンプルの同じ側にあるエピ蛍光光学構成に基づく。少なくとも１つの共通光学部品が、サンプルに励起光を投射し蛍光発光を集光するために用いられる。図２〜５は、以下で更に詳述するように、それらの装置を具現化する光学アセンブリを示す。上述したように、サンプル２２は、図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃに示すように、異なる励起スペクトルプロファイルおよび蛍光発光スペクトルプロファイルを有する複数の様々な蛍光体を含んでよい。

光源アセンブリ
光学調査装置２０は、第１に、複数の光源または光源アセンブリ２４を含む。光源アセンブリは通常、光源と、光源に付随する追加部品とを含む。当業者は、選択された光源と併用するために追加部品が必要であるかを容易に判断することができるので、「光源」および「光源アセンブリ」という用語は本明細書において相互置換的に用いられる。

各光源２４（または光源アセンブリ）は、個々のスペクトルコンテンツを有する励起光線２８を出力する。光源の個々のスペクトルコンテンツは、他の光源２４のスペクトルコンテンツと異なっても同様であってもよい。いくつかの実施形態において、１または複数の励起光線のスペクトルコンテンツは、例えばターゲット蛍光体の吸光プロファイルに収まると同時に発光プロファイルの外側にあるように各励起光線２８のスペクトルプロファイルを合致させることによって、所望の適用事例のために調整される。様々な光源２４のスペクトルコンテンツは異なるが、それらのスペクトルコンテンツのいくつかは重なることがある。

図１Ａに示す例において、各光源アセンブリは、対応する励起光線２８を発するＬＥＤ３０、およびＬＥＤ３０から発する光の経路に配置される空間フィルタ３２を連続的に含み、それによってソースオブジェクトを定める。有利には、ピンホールのサイズは、ソースオブジェクトのサイズを定める、または変化させるために設計あるいは調整されうる。任意選択的に、ＬＥＤ３０からピンホール３２を通る光束を増加させ、その結果光励起光パワーを増加させるために、集光レンズおよび／または他の１または複数の光学部品（不図示）がＬＥＤ３０とピンホール３２との間に含まれうる。例えばレーザ、レーザダイオード、白熱灯やガス灯などの他の種類の光源も考慮されうる。他の変形例において、光源は、光学調査装置２０の付近に、またはいくらか離れて配置され、発生した光は、光ファイバ、光導体、導波管、または他の手段によって光学調査装置へ供給されうる。

図１Ａを参照すると、ソースレンズ３４および／または他の１または複数の光学部品は、経路に沿って光分散を制御するためにピンホール３２からの励起光線２８を順方向において視準する。任意選択的に、励起光線２８をスペクトルフィルタするため、および／または励起光線２８の波長プロファイルを調整するために、バンドパスフィルタ３６がソースアセンブリ２４内に提供されうる。バンドパスフィルタ３６は、干渉、回析、あるいは吸光度ベースであるか、偏光素子を含むか、および／または例えば波長固有の透過率を提供するように材料が塗装されたガラスの円盤または長方形状の基板によって具現化されうる。

例示的な適用事例において、装置は、様々な蛍光体を連続的に、すなわち各光源を異なる時間に作動させることによって、照合するために用いられる。これは例えば、図１２のプロセスコントローラ１１０などの監視コントローラまたはコンピュータからのコマンドを受信する埋込み型マイクロコントローラを用いて、各光源の個々の定電流コントローラの出力を時間通りに切り換えることによって実現することができる。任意選択的に、光励起光パワーは、関連する追加の光学部品および電子素子および検出器によってサンプリングされると、スイッチが入った後所望の時間間隔で特定の所望の値に到達し、照合の持続期間および後続する照合の間安定した状態を保つように、各光源に供給される電力が制御されうる。例示的な実施形態において、所望の時間間隔は短い時間間隔である。いくつかの変形例において、様々な蛍光体を同時に照合するために、所与の時間に複数の光源が作動しうる。

光学調査装置２０は、少なくとも２つの、かつ任意の適切な数を最大とする光源アセンブリ２４を含んでよい。例えば４つのそのようなアセンブリが提供され、円形状に配置されうる。当業者は、この構成が単なる一例として示されることを理解するであろう。図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、および８Ｅは、光源アセンブリに関して可能な他の構成を示す。筐体９０内で、光源９２は、サンプル側光学部品８８およびサンプル８６に向けて励起光を発する。蛍光発光線はフィルタ９４、検出器側光学部品９６、および最終的に検出器９８に到達する。

検出器
検出器アセンブリは通常、検出器と、検出器に付随する追加部品とを含む。当業者は、選択された検出器と併用するために追加の部品が必要であるかを容易に判断できるので、本明細書において「検出器」および「検出器アセンブリ」という用語は相互置換的に用いられる。

光学調査装置２０は、検出器５７を含むか、あるいは装置から独立した検出器５７に接続することができる。検出器は、以下で詳述するように、サンプルからの蛍光（あるいはルミネセンス）光を受け取り検出するために選択および配置される。検出器５７は例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェモードで作動しうるフォトダイオード、クアドラントフォトダイオードを含むマトリクス、ＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサ、および関連電子部品によって具現化されうる。例えばリアルタイムＰＣＲシステムを具現化する図１２に示すような試験装置において光学調査装置が用いられる場合、ＰＭＴはそのような適用事例に必要な高レベルの感度および迅速な応答時間を提供するので、ＰＭＴを検出器として用いることが特に有利である。

１つの例示的な実施形態において、ＰＭＴは、以下の要件に準拠して選択される。
高感度、低ノイズ：低検出に関する要件は、一般的にｐワットの集光された蛍光に制限し、ＰＭＴは固有利得（１Ｍ〜１０Ｍ）および低ノイズを提供する。

広い活動領域（ｍｍ）：ＰＣＲキュベットはミリサイズであり、フォトカソードは直径８ｍｍである。

速度：ＰＣＲキュベットは８００ＲＰＭで回転し、通常、ＰＭＴ Ｔ_ｒ＝数ナノ秒である。

環境安定度：計器は、５０℃を上回る温度サイクルを実行し、ＰＭＴはシリコンベースの検出器よりも熱による影響を受けにくい。

例示的な実施形態において、全ての高電圧制御回路および信号調整電子機器を組み込んだ、浜松ホトニクス社製のＰＭＴ（光電子増倍管）検出器が用いられうる。

光学アセンブリ
光学調査装置２０は更に、光源アセンブリ２４、サンプル２２、および検出器５７の間で光を方向付ける光学アセンブリ２５を含む。具体的には、光学アセンブリ２５はまず、対応する光源アセンブリ２４からサンプル２２上の共通励起点２３への、励起光線２８の各々の様々な励起光路を定める。光学アセンブリ２５は更に、サンプル２２上の励起点２３から検出器５７へのルミネセンス光４８のルミネセンス光路を定める。

光学アセンブリは、光源からサンプル上の共通励起点へ、励起光線の各々について特定の（異なる）一定の励起光路を定める。励起光路に関して光学アセンブリ内の可動部品は存在しない。光学アセンブリは、サンプル上の励起点から検出器へのルミネセンス光の共有ルミネセンス光路も定める。励起光路およびルミネセンス光路はサンプルの同じ側に定められる。光学アセンブリは、サンプルに向けて励起光を投射しサンプルからのルミネセンス光を集光するサンプル側光学部品を含む。光学アセンブリは、全ての励起光路および共有ルミネセンス光路にサンプル側光学部品を提供する。

励起光路は一定である。実際、光学アセンブリは、非可動式で永続的に設置された、全体として装置内の励起光路を方向付け、方向換えし、誘導し、あるいは励起光路に作用する部品のグループを提供する。好都合に、固定された様々な光路を装置内に提供することにより、様々な光源からの（光路を生成する）光をサンプルの方へ連続して方向付けるための回転ミラー／フィルタや他の作動装置の必要性が軽減される。

共有ルミネセンス光路もまた光学アセンブリによって定められる。ルミネセンス光路における光学部品は、ルミネセンス光をフィルタ処理するために用いることができる作動フィルタの支持体となりうる。フィルタは、固定式フィルタであってよい。フィルタは、シングルバンドパスフィルタまたはマルチバンドパスフィルタであってよい。

図１Ａに示す実施形態において、光源アセンブリ２６は、主軸２６の周囲を取り巻くように配置される。各光源アセンブリ２４は、一般に主軸２６に対して平行に、対応する励起光線２８を順方向に投射する。この例において、光学アセンブリ２５は、各光源アセンブリ２４からの光をサンプル２２の方へ方向換えするミラーアセンブリ３８を含んでよい。一実施形態において、ミラーアセンブリ３８は、外側反射部品４０および内側反射部品４２の２つの構成要素を含む。外側反射部品は、光源アセンブリ２４からの励起光線２８の光路に配置され、励起光線２８を内側に方向換えする、すなわち、装置の主軸２６の方へ励起光線を逸らす。外側反射部品４０と内側反射部品４２との間の光路はそれらの部品に対して直角である必要はなく、直路である必要もないことが理解されるであろう。外側反射部品４０は、例えば、光源アセンブリに面した内側表面４１（例えば図３を参照）を有する環状の円錐型ミラーによって具現化されうる。他の実施形態において、外側反射部品４０は、各々が光源アセンブリの１つと対になった個々のミラーによって具現化されうる。内側反射部品４２は、外側反射部品４０からの励起光線２８を受け、それを順方向においてサンプル２２の方へ方向換えする。図５に最もよく見られる一例において、内側反射部品４２は、外側反射部品４０の外周に配置され、かつそれらと同心円状に配置されうるピラミッド型ミラーによって具現化されうる。

内側反射部品４２を具現化するために、光学部品の様々な組み合わせおよび構成が考案されうる。いくつかの実現形態において、外側または内側反射部品を具現化するミラーは、装置の光学部品に反射層を被覆することによって製造されうる。

図１Ａに示す実施形態において、光源アセンブリは、光学調査装置の主軸２６の周囲を取り巻くように配置され、励起光線は、主軸２６に近接するサンプルへ向けて出力されるように内側に方向換えされる。サンプルからのルミネセンスは、ルミネセンス光路に沿って装置内に還流する。しかし、他の構成も想定されうる。例えば図１Ｂを参照すると、別の実施形態において、励起光線は、サンプル側光学部品４４によってサンプルへ向けて方向換えされる前に周辺励起光路を辿る。

図８Ａ〜８Ｅは、励起光路およびルミネセンス光路を定めるために様々な光学部品およびそれらの組み合わせが用いられる、光学アセンブリの様々な例を示す。

いくつかの実施形態において、光源アセンブリは、各々が、励起光線を誘導するための例えば光ファイバなどの導波管を含んでよい。これは、図８Ｄに図示される。各光源アセンブリは、対応する励起光線を発するＬＥＤ、および励起光を視準するためにＬＥＤから発する光の光路に配置された第１のレンズピンホールを連続的に含む。バンドパス励起フィルタは、フィルタされたＬＥＤからの励起光を導波管１２０に集中させ結合させる第２のレンズに続いて提供される。導波管は、例えば５００μｍの光ファイバであってよい。各導波管の出力において、マイクロレンズが励起光を視準する。各導波管は、視準された光をサンプル側光学レンズに焦点を当て投射し、サンプル側光学レンズはそれをサンプル内に定められた励起体積に投射する。様々な励起波長の各励起光は、サンプル内の同じ励起体積に投射される。図８Ｅにおいて、光線路を生成するために反射光学部品１２２が用いられる。

いくつかの実施形態において、移動光線の物理的サイズを制限し、かつ迷光に関連するノイズを低減するために、励起光線２８の光路に空間フィルタが提供されうる（図１Ａ、部品７２、７４）。当業者は、ＬＥＤ光源から発する光は散開し、出射光はその伝搬軸に沿って次第に広幅化する断面を有することを容易に理解するであろう。この効果は、光線の光路に沿って様々な位置に空間フィルタを設置することによって制限することができる。

図１Ａおよび７Ａを参照すると、一実施形態において、第１の空間フィルタ７２は、外側反射部品４０から僅かに上流の各励起光線の光路に位置付けられる。例えば、第１の空間フィルタ７２は、内部に開口部が提供された遮蔽板によって具現化されうる。開口部のサイズは、第１の空間フィルタ７２を通過できる励起光線２８の寸法が反射部品４０の寸法よりも大幅に小さくなるように選択されうる。遮蔽板は、逸れた反射の存在を低減するために、励起光線の被遮蔽部分を大幅に吸光し、および／または非鏡面的に大幅に拡散させうる。

第２の空間フィルタ７４は、外側反射部品による反射の後、励起光線２８の光路に配置されうる。第２の空間フィルタ７４は、例えば、内部に開口部が提供された同様の遮蔽板によって具現化されうる。開口部のサイズは、第２の空間フィルタ７４を通過できる励起光線２８の寸法が内側反射部品４２の反射面６２（ファセット）（図４参照）の寸法より大幅に小さくなるように選択されうる。遮蔽板は、逸れた反射４０の存在を更に低減するために、励起光線の被遮蔽部分を大幅に吸光し、および／または非鏡面的に大幅に拡散させる。

更なるフィルタリングおよび迷光の制御／排除を提供するために、他の空間フィルタリング部品が励起光線２８の光路に沿って配置されうる。空間フィルタの数、位置、および配置は、励起源空間プロファイルに多大に依存する（例えば、良好に視準されたレーザ光線は、大幅に散光するＬＥＤ光源と比べて少ない空間フィルタリングしか（あるいは一切の空間フィルタリングを）必要としない）。これはまた、励起光源スペクトルプロファイルおよび適用事例のＳ／Ｎ要件にも依存する。例えば、検出器のピーク感度に対応するスペクトルプロファイルを有する光源、または小さいストークスシフトを有する（励起および検出スペクトルバンドが非常に近い）蛍光体と併用される光源は一般に、良好な性能を実現するために多くの空間フィルタリングを必要とする。

光学調査装置２０は、内側反射部品４２からの励起光線２８をサンプル２２の方へ方向付けるサンプル側光学部品４４を含んでよい。好適には、サンプル側光学部品は、様々な光源アセンブリ２４からの励起光線２８をサンプル２２上の同じ箇所２３に集中させる少なくとも１つの収束レンズ４６を含み、それによって、各ピンホール３２を通過する励起光が、サンプル２２の励起面に、または概ねそこに投射されることが可能となる。好適には、励起光線２８の全部または大部分はサンプル２３の同じ領域に、あるいは、対象となる適用事例の目的のために十分に小さいサンプル２３の体積の小部分に収束する。任意の数の他の光学部品や追加の光学部品が、サンプル側光学部品４４の一部として提供されうる。当業者には容易に理解されるように、上述した構成およびそれらの変形例は、励起体積のサイズおよび形状を都合よく調整する。

サンプル２２の励起体積において、所与の蛍光体は、励起光線２８のスペクトルコンテンツが蛍光体の励起スペクトルプロファイルと少なくとも重なる場合、励起光線２８の１つからの光を吸収する。蛍光体はその後、その蛍光発光プロファイルに従って蛍光４８を射出する。蛍光発光は多くの場合、大容量溶液から等方性に射出されるので、蛍光４８の少なくとも一部は調査装置２０の方へ射出され、収束レンズ４６によって集光される。この方向から、収束レンズ４６は集光した光を視準し、平行化またはほぼ平行化された光線として調査装置２０を通り後方へ伝搬させる。

一般に、上述した装置２０の構成要素は、後方へ伝搬する蛍光４８を可能な限り妨害しないような形状および配置にされる。装置を通り後方へ進行する蛍光４８の少なくとも一部は、光が検出のために集光される検出面５０に到達する。例示した実施形態において、検出面５０は、光源アセンブリ２４の面の後方へ広がる。好適には、出力スペクトルフィルタ５２は、検出面５０の前にルミネセンス光４８の光路に配置される。出力スペクトルフィルタ５２は、例えば励起光線２８によるスペクトルコンテンツなどの不所望のスペクトルコンテンツを排除する。このように、検出面５０の方へ向けられた励起光線２８の非励振反射または散光が取り除かれ、ノイズおよび／またはバックグラウンド信号が低減する。出力フィルタは干渉、回析、または吸光ベースであるか、および／または、例えば波長固有の透過率を提供するように材料が塗装されたガラスの円盤または長方形状の基板によって具現化されうる。

検出のためにフィルタされた蛍光４８を出力する検出器側光学部品５４が提供される。例えば、検出器側光学部品５４は、検出面５０へ向けて蛍光４８を収束させる出力レンズ５５を含んでよい。他の光学部品が追加または代替として提供されうる。例えば、出力空間フィルタ７６は、蛍光の経路において例えば検出面５０の付近に提供されうる。出力空間フィルタ７６は、例えば、サンプル２２における励起光線フットプリントの投射画像と等しいか、またはそれよりも小さい適切なサイズの開口部が提供された遮蔽板によって具現化されうる。有利には、そのようなフィルタの提供により、検出器に到達する迷光バックグラウンド放射の量が大幅に低減され、信号対ノイズ比が改善される。他の変形例において、回析素子（例えば透過回析格子またはプリズム）、適切な検出器側光学部品５４、および対象となるスペクトルバンドを定める画像面における位置およびサイズに適したサイズの開口部または導波管から成る空間フィルタ７６を用いて、スペクトルフィルタリングおよび空間フィルタリングの併用が提供されうる。

図１０Ａ〜１０Ｈは、ルミネセンス光線のフィルタリングおよびルミネセンス光と検出器との連結に関する様々な構成を示す。いくつかの実施形態において、検出器５７が検出面５０に提供され、検出器側光学部品５４に直接連結され、そこからの蛍光４８を受け取る。これは、一連の励起／検出スキームの（波長を相次いで）単一の検出器、単一の（マルチバンド）フィルタに関する図１０Ａに示す実施形態である。別の実施形態において、蛍光４８は、例えば検出面５０と検出器５７との間の光ファイバなどの導波管によって誘導されうる。単一検出器構成において、複数のフィルタが、連続的に又は平行にルミネセンス経路に提供されうる。これは、連続検出スキーム、単一検出器の実施形態に関して複数のフィルタが用いられる図１０Ｂに示される。例えば図１０Ｃ〜１０Ｆに示すように、複数の検出器の構成も図示されうる。図１０Ｃにおいて、スペクトルコンテンツの空間分布と同時に複数の検出器が用いられる（同時励起／検出スキーム）。図１０Ｄにおいて、透過回析格子を用いたスペクトルコンテンツの空間分布と同時に複数の検出器が用いられる。図１０Ｅにおいて、例えばプリムなどの反射材料を用いたスペクトルコンテンツの空間分布と同時に複数の検出器が用いられる。図１０Ｆにおいて、バンドパス干渉フィルタを用いたスペクトルコンテンツの空間分布と同時に複数の検出器が用いられる。

一実施形態において、計測法は、色素のＬＥＤベースの励起、およびＰＭＴ検出器による発光した蛍光の同時検出を含む。サンプル内の複数の蛍光体を励起するために、複数のＬＥＤが連続して作動される。ＬＥＤ発光はスペクトル幅が広いので、狭帯域干渉フィルタの使用により、選択された蛍光体の吸光特性およびマルチバンド発光フィルタの透過特性に発光スペクトルプロファイルを合わせることが可能になる。単一のペンタバンド検出フィルタを用いることができる。ＯＭ構成はマルチバンド発光フィルタを用いるので、複数の蛍光体の励起（光相互干渉）に関連する危険性が存在する。その場合、複数の蛍光体からの発光は、スペクトル選択性を伴わず検出されることになる。ＰＣＲキュベットからＯＭによって集光された発光蛍光は、不所望の波長を除去するためにＰＭＴの正面に位置するマルチバンド干渉フィルタを用いて鏡面的にフィルタされる。フィルタの伝送帯域の各々は、選択された蛍光体の発光スペクトルに対応する。

図１０Ｇおよび１０Ｈに示すいくつかの実施形態において、検出フィルタは、作動式検出フィルタによって提供されうる。作動式フィルタアセンブリは、カルーセルを含んでよい。計測法はやはり、色素のＬＥＤベースの励起、および適切な狭帯域検出フィルタを通るＰＭＴ検出器による発光蛍光の検出を含む。後者は、検出経路に連続的に配置される。全てのチャネルの励起／検出は、連続して実行される。

この実施形態の利点は、最適な状況における少ない相互干渉、励起／検出バンドの良好な制御、蛍光体／フィルタ選択の良好な制御、用いられる色素の数の適応性など数多くある。実際、励起／検出チャネルは、共通して利用可能な蛍光体を用いて実現されうる。蛍光体は、例えばBiosearch社などの単一の業者から得ることができる。例えば、励起され、４８５ｎｍ〜７０５ｎｍで発光する蛍光体が用いられうる。

この実施形態は、長い検出時間、および長期にわたり装置を使用した後に誤作動を引き起こす可動部分を含むいくつかの欠点を示す。

典型的な実施形態
図２〜５、７および７Ａを参照すると、一例として、上述した光学調査装置２０を具現化しうる光学アセンブリが示される。好適には、光学アセンブリは、製造を容易にし、光学部品の精密なアライメントの必要性を最低限にするか、またはなくすように設計される。

これらの実施形態において、様々な構成要素の中で、光源アセンブリ２４のための支持構造５６が提供される。支持構造５６は、光源アセンブリが取り付けられた１または複数の周辺フレーム部材５８を有してよい。図示された部品において、図４に最もよく示されるように、周辺フレーム部材は一般に円盤状である。支持構造は更に、周辺フレーム部材５８によって定められた面から垂直に突出する中心柱６０を含んでよい。中心柱は、内側反射部品４２を支持する。図示された実施形態において、周辺フレーム部材５８から突出している中心軸６０の先端は、上述したように励起光線を方向換えするような位置および方向にある複数のファセット６２を有するピラミッド型の形状となるように加工される。各ファセット６２は、例えばニッケル、アルミニウム、銀、金、またはそれらの組み合わせなどの反射材料によって製造され、および／またはそれらで被覆されうる。

支持構造は、周辺フレーム部材５８と中心軸６０とを連結する複数の連結リブ６４を更に含んでよい。例示した実施形態において、連結リブ６４の各々はその末端部に筐体６６を形成し、光源アセンブリの１つをその中に受け入れる。好適には、連結リブ６４は、中心軸６０の周りの限られた空間を占めるような形状であり、間に、ルミネセンス光が通過することができる１または複数の光通路６８を定める。

装置の支持構造または任意の構造は、光吸収面および／またはジオメトリ／光拡散面および／またはジオメトリを特徴とする１またはいくつかの光バッフル７０（図２）に関する調整を更に含むか、または提供してよく、その目的は、設計によって意図された光路からはみ出す迷光の伝達、鏡面反射、または散乱を防止するか、あるいは少なくともそれらの重要度を軽減することである。そのようなバッフルは、例えば、光吸収／光拡散材料を用いて製造または被覆されうる。

更に、あらゆる透過面、反射面、または吸光面は、所望の励起および検出スペクトルプロファイルを得るための助けとなるように波長固有の透過率、反射率、および／または吸光度を特徴とするように設計および／または被覆され、伝達、反射、および／または散乱する迷光の量を低減する、あるいはシステムの所望の機能に関する他の任意の目的を達成する。

光学アセンブリ２５は、様々な種類のミラー、レンズ、プリズム、光導体、バッフル、および他の光学部品を含む他の構成に基づいてよい。

図１４は、例えば図１２に示すような試験装置と併用するための例示的な光モジュールの分解図を示す。光モジュール（ＯＭ）およびその構成要素は、図１４に示すように５つのサブアセンブリに分割することができる。遠位管（図１４Ａ）は、モジュール内にＬＥＤ光を向ける反射面、およびＰＣＲキュベットの方へ励起光を向け、発光した蛍光を集光するレンズを含む。ＰＭＴ管（図１４Ｂ）は、マルチバンドフィルタ、および蛍光をＰＭＴ検出器に収束させるレンズを含む。ＬＥＤ光学アセンブリ（図１４Ｃ）はまた、モジュールにＬＥＤ光を向ける反射面と、ＬＥＤ励起フィルタおよびＬＥＤ光線調整部品（ピンホールおよび小型レンズ）とを含む。励起フィルタおよび小型レンズは、頑強かつ安定した動作のためにＬＥＤ光学アセンブリのボディに接着される。ＬＥＤプリント基板（図１４Ｄ）は、ＬＥＤチップを支持し、光学コントローラボード上にＬＥＤドライバを有する電気インタフェースを提供する。最後に、検出器モジュール（図１４Ｅ）は、電圧出力ＰＭＴ、およびＯＭとのインタフェースとなる接合板を含む。全てのサブアセンブリは細目ネジを用いて取り付けられ、インタフェース間のＯ型リングが遮光アセンブリを保証する。

図１５Ａは、図１４の例示的な光モジュールの集合図を示し、図１５Ｂは、図１４の集合であるモジュールの断面図を示す。ＯＭ１３０は、計器１３２の底板に取り付けられる。ＯＭにおける厳密な製造公差は、底板およびミクロ流体容器の上に、ｍｍ範囲の被写界深度のおかげで、ＰＭＣＤキュベットに関するＯＭのアライメントフリーアセンブリ（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を提供する。（図１４Ａに展開する）遠位管１３４、中心管１３６、（図１４Ｂに展開する）ＰＭＴ管１３８、ＰＭＴ板１４０、（図１４Ｅに展開する）ＰＭＴ検出器１４２、集光レンズ１４４、（図１４Ｃに展開する）ＬＥＤ光学部品１４６、ＬＥＤ励起フィルタ１４８、ＬＥＤ光学部品１５０、（図１４Ｄに展開する）ＬＥＤ ＰＣＢ１５２、ペンタバンド蛍光フィルタ１５４、スペーサ１５６、および平凸レンズ１５８が図１５Ａおよび１５Ｂに示される。

図１６は、例示的な光モジュールのワークフロー２００である。図１６に示すように、光学計測はＰＣＲサイクル２０２ごとに実行される。冷却が実行され（アニールステップ２０４）、２０秒の持続期間の間に温度が５７℃に達すると、計器処理制御ユニット（ＰＣＵ）が光学コントローラをトリガし、２秒の持続期間の７２℃までの拡張ステップ２０６および１秒の持続期間の９５℃までの変性ステップ２０８を含む温度サイクルと平行して信号取得手順２１４が実行される。温度サイクルは、実行が完了する２１０まで繰り返される。実行が完了すると、ＰＣＲは終了する２１２。光学検出プロセス２１４において、各計測サイクルの開始時に３秒のＰＭＴ整定時間が提供される２１６。計測手順中、ＬＥＤは連続して作動される２１８。各キュベットについて信号が取得され２２０、求心性アクチュエータエンコーダと同期される２２２。ＬＥＤがオフになる２２４。蛍光計測が完了すると２２６、ＰＣＵへデータが送信され２２８、光学コントローラは次のトリガを待機する。この手順が各ＰＣＲサイクルについて繰り返される。ＰＣＲサイクルが完了すると、データは更に処理され２３０、分析される。結果が表示されうる２３２。

実験結果
例１
上述したように、上述した例示的な実施形態に係る光学調査装置は、例えば図１２に示すような試験装置を介してリアルタイムＰＣＲシステムのために役立ちうる。

図１１Ａは、回転円盤上の２つの色素（ＦＡＭおよびCAL Fluor（登録商標）Red 610 Dye）の蛍光検出のためのそのようなシステムによって得られた結果を示す。図１１Ｂおよび１１Ｃは、用いられたシステムに関する校正曲線を示す。両方の色素にサンプルが含まれる。８００ＲＰＭでの回転中に連続検出が実行された。記録された信号は重なり、同期信号としてエンコーダとともにアクチュエータを使用する利点およびサンプル内で交差する励起光線の重なりを示す。ＦＡＭ色素は、４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの検出波長を有する。ＬＯＤ_３σは２．３ｎＭであり、ＬＯＱ_１０σは７．７ｎＭである。CAL Fluor（登録商標）Red 610 Dyeは、５６０ｎｍの励起波長および６０７ｎｍの検出波長を有する。ＬＯＤ_３σは３．０ｎＭであり、ＬＯＤ_１０σは１０．１ｎＭである。

例２
特徴（検出極限（ＬＯＤ）および数値化極限（ＬＯＱ））となる蛍光形態は、青色、緑色、赤色、および近赤外（ＮＩＲ）励起チャネルおよびペンタバンド検出フィルタに関して取得された。

光学制御盤（ＯＣＢ）は、ＬＥＤコントローラシステムおよびＬＥＤ電力の電子調整に含まれる。表１は、各光学チャネルに用いられるフィルタおよびＬＥＤを示し、表２は、この評価のために用いられる色素を示す。Roithner製品はRoithner Lasertechnik社から市販されており、Semrock製品はSemrock社から市販されている。

各色素につき、０〜０．２μＭ（０，０．００３，０．００６，０．０１２，０．０２５，０．０５，０．１および０．２μＭ）の濃度の溶液によって８つのＤＦＣＤが充填された。全てのチャネルにおける全てのＤＦＣＤ（ディスポーザブル流体求心装置）について蛍光発光が計測され、色素濃度に対する蛍光発光計測値に関する校正曲線が得られた。

ＰＣＲマトリクスのみが充填されたＤＦＣＤ（「０μＭ」濃度；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣ１２）がその後、バックグラウンドノイズおよびバックグラウンドノイズにおける標準偏差を数値化し、ＬＯＤおよびＬＯＱを評価するために用いられた。相互干渉は、対象チャネル以外の（すなわち、他の励起波長の）チャネルにおける色素蛍光発光を計測することによって評価された。

蛍光発光対濃度データは、全ての光学チャネルにおける全ての色素について取得された。表３は、全ての光学チャネルについて得られた傾斜を表す。

全てのチャネルについて、線形蛍光発光校正曲線が正しく取得された。
この実験で用いられた光学設計の場合、色素の励起スペクトルが他の光学チャネルの励起帯域と重なり合うと相互干渉が生じ、１つの特定の色素の蛍光反応を分離することが困難になる。上に示す結果から、光学チャネル間の相互干渉の発生が見られる。相互干渉を数値化（および最終的に補償）するために、利用可能な励起波長ごとに各色素について校正曲線が得られた。

表４および表５は、相互干渉が存在する場合の蛍光発光対色素濃度に関する蛍光補償マトリクスを示す。正規化補償マトリクスは、１つのチャネル内の全ての色素の傾斜対特定のチャネル内の対象となる色素の傾斜の比を計算することによって得られた。相互干渉は、決定係数Ｒ^２＞０．５０を有する傾斜に関してのみ有意と考えられた。

青色／緑色／赤色／ＮＩＲチャネルおよびＦＡＭ／CAL Fluor Red 610／Ｃｙ５／Alexa 750色素を用いる構成において、光学相互干渉は、Ｃｙ５色素が存在する緑色チャネル（Ｒ^２＝０．９４）およびAlexa 750色素が存在する赤色チャネル（Ｒ^２＝０．９２）において生じる。表６に示すように、他の色素はいずれも目立った相互干渉を示さなかった（すなわち、Ｒ^２＜０．５０）。他の全てのチャネル／色素の組み合わせについて相互干渉は５％
以下であった。

例３
同じＤＦＣＤ内の２つのターゲットの一般的な多重検出に関するプロトコルおよび結果がこの例で説明される。

ＤＦＣＤディスポーザブルは、３つのキュベットの各々に投与され乾燥されたＰＣＲ混合剤で準備される（図１３Ａ参照）。表7は、サンプルで再懸濁した後の各キュベット内の最終的なＰＣＲ混合剤の成分を示す。

プライマーおよびプローブのシーケンスが表８に示される。

内部制御は、バシラスサチリス由来の精製ゲノムＤＮＡ（遺伝子thyA改変株）から成る。バシラスサチリス亜種サチリスstr.１６８のthyA遺伝子（ＢＧＳＣＩＤ １Ａ１）が相同的組換えによって改変された。この内部制御シーケンスは、S.agalactiae cfb遺伝子のプライマーと同じプライマーによって実現されるが、CalFluorREd610でラベルされた異なるプローブを用いて検出される。内部制御の濃度は、ＰＣＲ反応ごとに５００ゲノムコピーに調整された。

ＤＦＣＤディスポーザブルには１０００コピーの陽性制御が充填され、キュベット内にサンプル体積を運び入れるために３０００ＲＰＭで高速回転する。以下のパラメータを用いてこの実験では５０ＰＣＲ増幅サイクルが実行された：２０秒の持続期間につき５７℃でのアニール；２秒の持続期間につき７２℃での拡張；１秒につき９５℃での変性。図１６に示すような熱サイクル中に光学検出が実行された。

データ分析
計器によって作成されたデータは、以下に示すアルゴリズムを用いてオフラインで処理された。実行された５０ＰＣＲサイクルの中で、ＰＣＲ増幅の最初の４５サイクルのみがデータ処理に必要であった。

実行ごとに得られたデータは、計器の手順によって計測された回転速度、温度、および蛍光発光を含むファイルに記録された。

バックグラウンド除去
データ分析の前にデータセットからバックグラウンドを除去するために線形回帰（傾斜およびｙ切片）が用いられた。このバックグラウンドは、例えば冷却された色素の残余蛍光、ＤＦＣＤ透過率および／または散乱における差分、ＤＦＣＤ材料または試薬によるバックグラウンド蛍光、バックグラウンドノイズ、標識プローブの変質などの複数の現象によって生じうる。

サンプルごとのバックグラウンド補正を計算するために、サイクル１５〜２５までの蛍光計測値が用いられた。これらのデータポイントは、蛍光発光が安定するために十分遅く、かつＰＣＲ増幅が生じておらず十分なターゲットが検出されていない程度に早いという理由で選択された。図１７Ａは、バックグラウンド除去がされていない場合（上の曲線）およびされた場合（下の曲線）の蛍光データを示す。

陽性のサンプルにおけるターゲット濃度の相対数値化を実行するためにＳ状曲線近似（ＳＣＦ）が用いられた。高い精度でサイクル閾値（Ｃｔ）を決定するために変曲点（第２の導関数の最大値）が用いられた。この方法は、Ｃｔの恣意的な閾値を実験前に決定さする必要がないという理由により選択された。

以下の形式のＳ状曲線が蛍光データを近似するために用いられた。

式中、Ｆ_ＳＣＦはＳ状曲線近似モデルによって計算される蛍光発光であり、Ｃはサイクルであり、ａ、ｂおよびＣ_０はＳＣＦパラメータである。

バックグラウンド除去された蛍光示度によるＳＣＦ関数の相違が最小限になるように、パラメータａ、ｂおよびＣ_０を決定するために最小二乗最良適合アルゴリズムが用いられた。各曲線の相関係数も計算され、０．９９を上回るＲ^２の値がサイクル１０〜４５について概ね観察された。図１７Ｂは、Ｓ状曲線近似（実線）対バックグラウンド除去された蛍光示度（点線）の典型的な結果を示す。サイクル１０〜４５に関する相関係数Ｒ^２は、０．９９８６である。図１７Ｃは、同じデータセットにおける第２の導関数を示す。サイクル閾値は３２．５４である。

得られた結果が図１８、１９および２０に示される。陽性の制御プローブはＦＡＭ蛍光体とラベルされる。蛍光信号は、青線（各グラフ内の上の曲線（複数可））によって示される。各ウェルが、ターゲットとともに増幅された内部制御も含んだ。内部制御プローブは、CalFluorRed610蛍光体とラベルされる。蛍光信号は、緑線（各グラフ内の下の曲線（複数可））によって示される。図１８Ａおよび１８Ｂは、ウェル１に関する生のデータ（バックグラウンド除去）および近似曲線を示す。図１９Ａおよび１９Ｂは、ウェル２に関する生のデータ（バックグラウンド除去）および近似曲線を示し、図２０Ａおよび２０Ｂは、ウェル３に関する生のデータ（バックグラウンド除去）および近似曲線を示す。

ＰＣＲデータは、同じミクロ流体装置上の３つの隣接するウェルに流れ込む２つの異なる蛍光体（異なる励起／発光波長）によるＰＣＲ増幅中の蛍光発光をリアルタイムで計測する光学調査装置を用いることが可能であることを示す。

容易に理解されるように、本発明の範囲から逸脱することなく上述した実施形態に対する数々の改変がなされうる。

上述した実施形態は、単なる例示として意図される。従って本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。

Claims (11)

1. 各々が個々のスペクトルコンテンツを有する複数の励起光線によって励起されるサンプル内の被検体によって生じるルミネセンス光を検出するための調査装置であって、
   前記被検体を励起するために前記サンプルに投射される前記複数の励起光線の１つを各々が発する複数の光源と、
   前記サンプルによって生じる前記ルミネセンス光を検出するための少なくとも１つの検出器と、
   光学アセンブリとを備え、
   前記光学アセンブリは、前記サンプルに励起光を投射し前記サンプルからのルミネセンス光を集光する共通のサンプル側光学部品と、
   前記共通のサンプル側光学部品から前記少なくとも１つの検出器への主軸を含み、前記複数の光源は前記主軸の周囲を取り巻くように配置され、前記光学アセンブリはさらに、
   前記周囲を取り巻く光源から前記サンプル上の共通励起点へ前記励起光線の各々について異なる一定の励起光路と、
   前記サンプル上の共通励起点から後方に伝播する前記少なくとも１つの検出器への前記ルミネセンス光の共有ルミネセンス光路と、
   前記励起光線を前記主軸に近い前記共通のサンプル側光学部品内に前記共通励起点の方へ内側に方向換えするために前記光源からの前記励起光路に配置された内側方向換えアセンブリを有し、
   前記励起光路および前記ルミネセンス光路は前記サンプルの同じ側に存在し、前記共通のサンプル側の光学部品はすべての前記励起光路内と前記ルミネセンス光路内に存在し、前記内側方向替えアセンブリは、前記励起光線を受け取り、前記共通のサンプル側光学部品の方へ前記励起光線を方向換えするために協働する外側反射部品と内側反射部品とを備える、調査装置。
2. 前記光学アセンブリは更に、前記共有ルミネセンス光路に提供されたフィルタを備え、前記フィルタは、固定フィルタおよび作動式フィルタの１つであり、シングルバンドパスフィルタおよびマルチバンドパスフィルタの１つである、請求項１に記載の調査装置。
3. 前記光学アセンブリは、単一の筐体内に含まれる、請求項１および２のいずれか１項に記載の調査装置。
4. 前記光学アセンブリは、前記励起光線および前記ルミネセンス光の少なくとも１つの空間プロファイルおよびスペクトルプロファイルの少なくとも１つを定める構成部品を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の調査装置。
5. 前記構成部品は、対応する光路に沿って所与の光線のサイズを制限する空間フィルタである、請求項４に記載の調査装置。
6. 前記光学アセンブリはさらに、スペクトルフィルタを含み、前記スペクトルフィルタは、前記励起光線のスペクトルコンテンツを排除するスペクトルプロファイルを有し、前記ルミネセンス光路に配置される、請求項５に記載の調査装置。
7. 前記光学アセンブリは、検出のために前記フィルタされたルミネセンス光を出力する検出器側光学部品を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の調査装置。
8. 前記光学アセンブリは、前記サンプル側光学部品に向けて前記励起光線を導くための導波管を備える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の調査装置。
9. 前記サンプル内の被検体による前記ルミネセンス光は、少なくとも１つの光学現象の結果生じ、前記光学現象は、蛍光発光、燐光発光、生物発光、時間分解発光、および蛍光偏光の１つである、請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の調査装置。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の光学調査装置を含む、サンプルを光学検査するための試験装置。
11. 前記試験装置は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔＰＣＲ）、等温増幅再結合ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）の１つを実行するためのシステムによって具現化される、請求項１０に記載の試験装置。

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