CN105008878A - 光学探询器件 - Google Patents

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Abstract

一种探询器件，用于探测样品中分析物产生的发光光线，该样品中的分析物被多种激发光束激发，每一光束具有各自的光谱成分，该探询器件包括多个光源，每个光源产生激发光束；至少一个探测器，用于探测由样品产生的发光光线；以及光学组件，为每个激发光束限定从光源到样品上的共用激发位置的不同的且固定的激发光路并且为发光光线限定从样品上的激发位置到至少一个探测器的共用的发光光路，激发光路径和发光光路在样品的相同侧上，光学组件包括样品侧光学系统，其朝样品投射激发光并收集来自样品的发光光线。

Description

光学探询器件
技术领域
本发明涉及光学探询技术，并且更具体地涉及一种器件，用于探询样品中不同的荧光团或类似物。
背景技术
荧光团是光激发导致产生光的化合物。它们被用于多个领域，例如诊断测定。例如，医疗诊断系统在测定溶液上使用荧光团的光学探询来测量容器内部的核酸扩增，如微流体盒。
典型地，基于荧光的方法涉及在特定荧光团的元素上引导激发光，公知吸收特定激发波长带内的光，最终发射不同波长范围内的荧光。所发射的光被收集并过滤以便只保留荧光并被探测。
对于一些应用而言，有利的是使用不同波段内的光，激发相同的测定或样品。例如，当使用多个荧光团测试样品时，每个荧光团均具有特定激发光谱曲线的情况。研究其他光学现象，其中样品由在一个波长的光激发而发射光在另一波长的应用也是已知的技术。
在某些情况下，需要光学器件能够迅速地在不同波长之间切换。例如，实时聚合酶链反应(rtPCR)系统中不同样品圆周地安装在用于光学分析的旋转保持器上的情况。当保持器旋转时，为每个热循环被执行荧光测量。为了在不同波长下进行这种采集探询系统需要在激发光源之间足够快的转换以限制采集之间向下的时间，其影响PCR过程的总时间。在不同的光源或荧光滤波器(如滤光轮)之间使用机械转换的传统系统经常引入在采集过程中的大量延误。为了不同的波长其他系统一起使用不同的光学探询器件，其会大大增加系统的总成本和复杂性。
因此，需要一种改进的光激发和探询器件允许使用不同的激发和探测波长并且快速探测样品中的多种荧光团。
发明内容
本发明的实施例提供一种光学探询器件，使用多个波长的激发光用于探测来自样品中被分析物的发光光线。该器件包括多个光源组件，每个光源组件发射各自光谱成分的激发光。激发光被投射在样品上激发分析物。在输出用于探测之前所得的发光光线行进返回通过该器件，并进行过滤，以从寄生光(例如激发光)分离出感兴趣的光谱成分。
在一个实施例中，光学探询器件可用于探测来自被称为荧光团的分子种类的发光。发明的实施例可用于探测因各种光学现象例如磷光、荧光、生物发光、时间分辨荧光、偏振荧光等导致的来自样品中分析物的发光光线。例如，荧光探测可用在实时PCR、核酸测序、蛋白质分析、细胞分析等中。
根据一个方面，提供了一种探询器件，用于探测通过具有独立光谱成分的多种激发光束激发的样品产生的荧光，该探询器件包括：多个光源组件，每个光源组件产生一个激发光束；至少一个探测器，用于探测由样品产生的发光光线；以及光学组件，为每个激发光束限定从光源组件到样品上的共同激发位置的不同激发光路并为发光光线限定从样品上激发位置到至少一个探测器的发光光路。
所述光学组件被包含在单个壳体中。
所述光学组件可包括塑造激发光和发光光线的空间和/或光谱曲线的部件，以防止寄生光到达探测器。例如，限制沿相应光路的给定光束的尺寸的空间滤波器可以在组件内的多个位置提供。具有不含激发光束的光谱成分的光谱曲线的光谱滤波器也可被设置在发光光路中。
所述光学组件可包括样品侧光学系统，朝向样品投射激发光，并从样品收集荧光光线。还可提供探测器端的光学系统，输出用以探测的滤波荧光。
在示范性实施例中，光学组件的光学部件刚性地附接在壳体内并考虑几何因素限定整个器件中的不同的光路。例如，在一个实施例中，光源为关于主轴圆周分布并且包括外部反射元件的反射镜组件被布置在来自光源的激发光束的光路中以向内重定向。可以进一步提供内部反射元件，该内部反射元件接收来自所述外部反射元件的激光束并在向前的方向重定向。然而，应当进一步理解的是，其它构造可以在不脱离本发明范围的情况下设计出来。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种测试装置，用于光学测试样品，包括如上所述的光学探询器件。例如测试装置可以通过如下系统来实施，非限制性地，聚合酶链式反应(PCR)，实时聚合酶链反应(RTPCR)，等温扩增，如重组聚合酶扩增(RPA)或其它核酸探测方法。
根据本发明的再一个方面，提供了一种探询器件，用于探测由多个激发光束激发的样品中被分析物产生的发光光线，其中每个激发光束具有各自光谱成分。所述探询器件包括多个光源，每个光源产生多个激发光束中的一个，被投射在样品上以激发分析物；至少一个探测器，用于探测由样品产生的发光光线；以及光学组件，其为每个激发光束限定从光源到样品上共同激发位置的不同的且固定的激发光路并为发光光线限定从样品上的激发位置到至少一个探测器的共用发光光路，激发光路和发光光路在样品上的同一侧，该光学组件包括样品侧光学系统，朝向样品投射激发光，并从样品收集发光光线，该光学组件在所有的激发光路和共用的发光光路中提供样品侧光学系统。
在一个实施例中，光学组件还包括提供在共用的发光光路中的滤波器，其中所述滤波器是固定滤波器和驱动滤波器之一，并且其中所述滤波器是单带通滤波器和多带通滤波器之一。
在一个实施例中，光学组件被包含在单个壳体中。
在一个实施例中，光学组件包括塑造激发光束和发光光线至少一个的空间和光谱曲线至少之一的部件。
在一个实施例中，该部件是空间滤波器，限制沿相应光路的给定光束的尺寸。
在一个实施例中，光谱滤波器具有不含激发光束光谱成分的光谱曲线并布置在发光光路中。
在一个实施例中，光学组件包括探测器侧光学系统，其输出经滤波的发光光线用于探测。
在一个实施例中，光源关于主轴圆周分布，并且其中所述光学组件包括反射镜组件，该反射镜组件包括设置在来自光源的激发光束光路中的外部反射元件以向内重定向激发光束。
在一个实施例中，反射镜组件包括内部反射元件，以从外部反射元件接收所述激发光束并朝样品侧光学系统重定向激发光束。
在一个实施例中，光学组件包括波导以引导激发光束朝向样品侧光学系统。
在一个实施例中，样品中分析物的发光光线来自至少一个光学现象，该光学现象是荧光、磷光、生物发光、时间分辨发光和偏振荧光中的一个。
根据本发明的再一个方面，提供了一种用于光学测试样品的测试装置，包括光学探询器件。
在一个实施例中，测试装置由执行如下功能的系统实现：聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(rtPCR)、等温扩增重组聚合酶扩增(RPA)和其它核酸探测方法中的一种。
进一步的实例包括如上所述的光学探询器件，包括核酸测序、蛋白质分析、细胞分析和需要激发并使用多个波长探测的任何其他系统。
本发明的实施例的其它特征和优点将在阅读实施例时参照所附附图更好被理解。
附图说明
至此一般性地描述了本发明的本质，现在参考附图，以说明的方式示出其优选的实施例，并且其中：
图1A和1B是示例光学探询器件的示意性表示；
图2是限定荧光器件的示例性光学组件的横截面侧视图；
图3是图2器件的横截面立体图；
图4是图2器件的示例性支撑结构的立体图；
图5是图2器件的部分透明正视图；
图6A至6B分别是荧光团的吸收和发射光谱图，图6C示出了单荧光团的归一化吸收和发射的曲线图；
图7是限定荧光器件的示例性光学组件的横截面侧视图；图7A是图7的图7A部分的放大视图；
图8A至8E是上述使用不同配置的光源组件的示范性实施例的变型的示意图；
图9示出一个示例实施例，其中用于分析的样品之间的运动是线性的；
图10A至10H是上述使用不同的滤波配置的示范性实施例的变型的示意图；
图11A示出，使用包括示例性光学探询器件的仪器探测到两个荧光团的校准结果；图11B和图11C示出了相应的校准曲线；
图12是测试装置的示意图，其中可使用示例性光学探询器件，例如作为PCR系统的一部分；
图13A示出可置换的流体向心力设备，图13B示出了使用如在图12所示的测试装置获取的信号迹线。图13C示出了为图13A中所示类型的8个流体向心力设备完整旋转获得的原始信号；
图14显示了示例性光模块部件和组件的分解视图，包括图14A-远端管，图14B-PMT管，图14C-光学系统，图14D-LED印刷电路板和图14E-探测器模块；
图15A示出了图14的示例性光学模块的组装图并且图15B示出了图14的组装的模块的横截面图；
图16是示例性光学模块的工作流程；
图17A示出了实时PCR核酸扩增期间，有和无背景减除的荧光读数的示例性结果，图17B显示Σ形曲线拟合的示例性结果以及图17C示出了用于Σ形曲线拟合的第二导数的示例性结果；
图18A和18B显示了在示例性实验中的原始数据(减除背景)和井1的曲线拟合；
图19A和19B示出图18的示例实验中的原始数据(减除背景)及井2的曲线拟合；以及
图20A和20B示出图18的示例实验中的原始数据(减除背景)及井3的曲线拟合。
应该注意，在整个附图中，相同的特征由相同的参考数字表示。
具体实施方式
本发明的示例性实施例涉及光学探询设备。
提供探询器件，用于探测由多个激发光束激发的样品中的分析物所产生的发光光线，其中每个多个激发光束具有独立的光谱成分。所述探询器件包括多个光源，每个光源产生一个激发光束；至少一个探测器，用于探测由样品产生的发光光线；以及光学组件，其为每个激发光束限定从光源到样品上共同激发位置的不同的且固定的激发光路并为发光光线限定从样品上的激发位置到至少一个探测器的共用发光光路，激发光路和发光光路在样品的同侧，该光学组件包括样品侧光学系统。朝向样品投射激发光，并从样品收集发光光线。
在一个示范性实施例中，光学探询器件20可在如图12示意性所示的测试装置100中发挥作用。这样的测试装置100包括转子102，在转子上径向设置多个流体向心力设备103。用于分析的样品加载在流体向心力设备103上，并且被包含到微流体容器104内。流体向心力设备的实例适合于PCT专利申请公开号No.2012/120463所示的实时PCR采集技术等，其通过参考并入这里。转子102的旋转运动由接收来自进程控制器110的控制信号的致动器106产生。编码器108提供位置信号反馈给控制器，用于精确反馈环控制。致动器106和光学探询器件20共同由进程控制器110控制，该进程控制器110根据期望采集的路线激活所述探询器件。数据采集和信号处理在与转子102旋转的适当同步中使用编码器信号执行，后者限定数据采集“窗口”。
示例的流体向心力设备103示于图13A。该示例性流体向心力设备103具有三个微流体容器C1、C2、C3ABC和废物容器W，总共4个容器。在示例性实施例中，数据采集需要小于每光信道(即每个荧光团)1s。包括PMT加热时间和数据处理的总过程，需要小于10秒，以在每个PCR循环完成。
例如图13B示出装有FAM(羧基荧光)荧光团溶液的流体设备(103)以800RPM旋转过程中原始信号采集的实例。图13C上的信号迹线代表获得插入到转子102的8个流体向心力设备103完全旋转的原始信号。底部图形上的信号迹线126是单一的流体设备信号迹线的缩放(具有4个容器104包括容器C1、容器C2、容器C3和废物W)并且是荧光信号。方形迹线124是从编码信号中产生的数据采集“窗口”的代表。对于每个微流体容器104，容纳在预定研究区(ROI)的信号的仅一小部分是由控制器电子设备110处理的。该ROI在图13B上由数据处理“窗口”表示。这种方法提高了信号-背景比，并且独立于旋转速度的波动。
将容易理解的是，在图12中所示的测试装置100的配置仅通过示例的方式呈现，并且根据本发明的各种实施例的光学探询器件可在不同的配置中使用。在另外的实施例中，用于分析的样品之间的运动可以是线性的，即保持所述样品的结构可以相对于所述探询器件线性的被扫描，或相对于所述样品线性的扫描探询器件。图9示出该变化的示例性实施例。
在一些实施例中，探询器件可用于探测来自样品中荧光团的荧光。如本领域技术人员容易理解，荧光的概念一般是指化合物或分子的光学特性，其吸收预定光谱带“激发带/曲线”中的激发光，并最终发出不同光谱波段的光，“荧光”或“荧光光线”。荧光团是通常被理解为表现出这样光学特性的，通常以已知方式的化合物或分子。任选地，所述荧光团可以共价或以其它方式结合于DNA，抗体或其它分子或作为标记物的研究底物。荧光团的实例包括氨基酸，蛋白质，染料和诸如色氨酸聚合物，GFP(绿色荧光蛋白)，荧光素和衍生物如6-FAMTM，JOE，曙红，Cy3TM，若丹明和衍生物如ROX、Cy5TM、德州 及其他。
本器件可用于各种应用中，其中分析物通过给定光谱曲线的光激发，最终返回具有不同光谱曲线的光，该返回光被统称为发光。实施例也可用于探测来自样品中磷光分析物的磷光。
参考图6A和6B，这里分别示出激发曲线80和几个荧光团的荧光曲线82，这里仅作为示例的方式呈现。图6C对比了6-FAM的激发和荧光曲线80和82。可以看到，这两个曲线有轻微的重叠，但荧光峰值相对于吸收(激发)峰移位到较长波长。本领域的技术人员将理解的是，本发明的实施例并不限于上述的特定荧光团和如这里所示的那些光谱图。
荧光团通常用做医疗、工业、法医和安全测试以及诊断方案的工具。例如，犯罪现场专家通过观察来自相对少量蛋白质暴露在不可见紫外光照射时的可见光谱发射的荧光，揭示具有高对比度的表面体液的痕迹。商业可获得的方法存在使用光学探询器件和荧光团尤其是放大的荧光聚合物探测从表面或环境空气取样的爆炸物痕量。荧光颜料通常被纳入到货币、文档，商业包装等其他产品，以减轻假冒。最后，医疗和实验室仪器经常使用荧光，例如，通过具有不同的光谱曲线分子的荧光团选择性地标记它们，以确定并从野生型细胞中分类突变的细胞。
本光学探询器件可用于激发和收集样品中多个荧光团的荧光。根据应用，样品例如可以通过包含荧光团的大量水溶液体现，荧光团可以共价的或以其他方式结合至研究的分子，包含在透明塑料或玻璃容器中或探测细胞等内。本发明的实施方式可以在如下情况使用：具有不同的激发和荧光光谱图的不同的荧光团，存在于相同样品中，并需要被探询。
虽然本说明书主要指荧光探测，但本领域技术人员容易理解的是，本发明的实施例也可以在观察其他光学现象的情况下使用。研究其他光学现象的应用，其中样品由在一个波长的光激发而发射另一波长的光，例如包括磷光分子如色氨酸或四碘荧光素(赤藓红B，EryB)，它已被用于监测溶液中蛋白质的生物分子的移动性并研究无定形生物材料的化学和物理稳定性。
光学探询器件
参考图1A，示出了用于从样品22中的荧光团探测荧光的示例性光学探询器件20中元件的示意化表示。光模块基于落射荧光光学配置，其中不同的激发光路和发光光路在样品上的同一侧。至少一个共用的光学组件用于投射激发光到样品，并收集荧光发射。图2至5示出了包括该器件的光学组件，如将在下面进一步描述。如上所述，样品22可以包含多个具有不同激发光谱图的不同荧光团。如图6A、6B和6C示出荧光发射光谱图。
光源组件
所述的光学探询器件20首先包括多个光源或光源组件24。光源组件通常包括光源和伴随着光源的附加部件。术语“光源”和“光源组件”在本文可互换使用，因为本领域技术人员将容易地确定附加的部件是否需要与所选择的光源一起使用。
每个光源24(或光源组件)输出具有单独的光谱成分的激发光束28。光源的各光谱成分可以不同于或类似于其它光源24。在一些实施例中，一个或多个激发光束的光谱成分是专适应于所需应用的，例如通过匹配每个激发光束28的光谱曲线以在靶荧光团的吸收曲线内拟合，同时保持在发射曲线的外侧。虽然不同的光源24的光谱成分是不同的，但是其中的一些光谱成分可能重叠。
在图1A所示的例子中各光源组件连续地包括：LED 30，其产生相应的激发光束28，空间滤波器32，其设置在从LED 30产生的光的光路中，从而限定源对象。有利的是，针孔的大小可被设计或调整以定义或改变源对象的大小。任选地，聚光透镜和/或其它光学元件或元件(未示出)可包括在LED 30和针孔32之间，以增加来自LED 30的光通量通过针孔32和光激发光功率。其他类型的光源也可以考虑，例如激光器，激光二极管，白炽灯或气体灯等。在其它变型中，光源可以位于靠近或离所述光学探询器件20一段距离，且所产生的光可通过光纤，光导管，波导或其他手段被馈送到光学探询器件。
仍参照如图1A所示，光源透镜34和/或其它光学元件或元件在向前方向上准直来自针孔32的激发光束28，以控制沿其光路的光分散。任选地，带通滤波器36可提供在源组件24内，以便光谱过滤激发光束28和/或调整其波长曲线。带通滤波器36可以是干涉，衍射或吸收基础的，可包括偏振元件和/或例如可以由玻璃盘或长方形状的基板体现，该玻璃盘或长方形状的基板上施加材料涂层以提供特定波长的透射率。
在示例应用中，该器件用于连续地探询不同的荧光团，即，通过在不同时间激活各光源。例如，这可以在嵌入式微控制器的帮助下通过为每个光源及时切换独立恒流控制器的输出而实现，本身接收来自监督控制器或计算机的命令，例如图12的进程控制器110。任选地，提供给每个源的电功率可以如下方式来控制：该光激发光功率，如由相关可选的光学系统和电子元件以及探测器取样，转换后在所希望的时间间隔达到所希望的值，并保持稳定的探询持续时间和随后的探询。在示例实施例中，所需的时间间隔是很短的时间间隔。在一些变型中多于一个的光源可在给定时间被激活，同时探询不同的荧光团。
所述的光学探询器件20可包括至少两个并且最多到任何适当数量的光源组件24。例如，可提供四个这样的组件，以圆形设置分布。本领域技术人员将理解，该结构仅通过示例的方式示出。图8A、8B、8C、8D和8E示出用于光源组件其它可能的配置。壳体90内，光源92朝向样品侧光学系统88和样品86发出激发光。荧光束到达滤波器94、探测器侧光学系统96和最后的探测器98。
探测器
探测器组件通常包括探测器和伴随探测器的附加部件。术语“探测器”和“探测器组件”在本文可互换使用，因为本领域技术人员将容易地确定附加部件是否需要与所选择的探测器一起使用。
所述的光学探询器件20可包括探测器57，或者可以是可连接到独立于该器件的探测器57。探测器被选择并设置以接收和探测来自样品的荧光(或其他发光)，如将在下面更详细地说明。例如探测器57可以由以下实施：光电倍增管(PMT)，光电二极管，其可在雪崩模式下运行，矩阵，包括象限光电二极管，CCD或CMOS传感器以及相关的电子器件。在光学探询器件用在如图12所示的一个测试装置中的情况下，例如实施实时PCR系统，利用光电倍增管作为探测器是特别有利的，因为它提供该应用所需的灵敏度和快速响应时间的级别。
在示例实施例中，光电倍增管，根据以下要求选择：
高灵敏度，低噪声：满足收集的典型皮瓦荧光的低探测限要求，PMT提供本征增益(1M至10M)和噪音低；
大有效面积(毫米)：PCR反应杯是毫米大小，光电阴极直径8mm；
速度：PCR反应杯以800RPM转动，典型的PMT Tr＝几毫微秒；
环境稳定性：仪器进行温度循环超过50℃，光电倍增管比硅基探测器较少受到热的影响。
在示例实施例中，可使用来自制造商Hamamatsu的PMT(光电倍增管)探测器，包含所有高压控制电路和信号调节电子器件。
光学组件
所述的光学探询器件20还包括在光源组件24之间引导光的光学组件25、样品22和探测器57。更具体地，光学组件25首先为每个激荧光束28定义了从对应的光源组件24到样品22上的共同激发位置23的不同激发光路。光学组件25为发光光线进一步限定了从样品22上的激发位置23到探测器57的发光光路48。
所述光学组件为每个激发光束限定从光源到样品上的共同激发位置的不同的(独立)且固定的激发光路。在激发光路的光学组件中没有移动部件。该光学组件还为发光光线限定了从样品激发位置到探测器的共用发光光路。激发光路和发光光路都限定在样品的同一侧。该光学组件包括样品侧光学系统，朝向样品投射激发光，并从样品收集发光。该光学组件在所有的激发光路与共用的发光光路中提供样品侧光学系统。
激发光路是固定的。事实上，该光学组件提供一组部件，其以不可移动的方式被永久设置在位置中，并一起定向，重定向，引导或影响该器件内的激发光路。有利的是，提供的器件内不同的固定光路缓解了旋转反射镜/滤波器或其它致动器件用于顺序地引导来自不同光源的光(产生的光路)朝向样品的需求。
共用发光光路也由该光学组件所定义。在发光光路中的光学部件可以是致动滤波器的支撑，用于过滤发光光线。该滤波器可以是固定滤波器。该滤波器可以是单带通滤波器或多带通滤波器。
在图1A所示的实施例中，光源组件26相对主轴26圆周分布。每个光源组件24在向前的方向投射对应的激发光束28，大致平行于主轴26。在本实施例中，光学组件25包括反射镜组件38，它重定向来自各光源组件24的光朝向样品22。在一个实施例中，反射镜组件38包括两个部件：外部反射元件40和内部反射元件42。外部反射元件布置在来自光源组件24的激发光束28的光路中并向内重定向激发光束，即，偏离所述激发光束朝向器件的主轴26。应该理解的是，外部和内部反射元件40和42之间的光路上不必相对于那些元件成直角，且不必是直接的光路。例如外部反射元件40可以由环状锥形反射镜实现，其具有面向光源组件的内表面41(参见例如图3)。在其它实施例中，外部反射元件40可以由各个反射镜来实施，每个与一个光源组件成对。内部反射元件42接收来自外部反射元件40的激发光束28并朝样品22重定向激发光束。在一个例子中，如图5最佳所示，内部反射元件42可以通过设置在外部的反射元件40周围内的锥体反射镜来实现并可与其同心布置。
可以设计光学元件的各种组合和配置以实现内部反射元件42。在一些实施方式中，反射镜实现外部或内部反射元件可通过在该器件的光学部件上沉积反射层来制造。
在图1A所示的实施例中，光源组件相对于所述光学探询器件的主轴26圆周分布，激发光束被向内重定向，使得它们朝向样品靠近主轴26输出。来自样品的发光沿着发光光路循环返回到器件。然而还可以设想其它配置。例如，参考图1B，在替代实施例中，在通过样品侧光学系统44朝向样品重定向之前，激发光束跟随外围激发光路。
图8A至8E示出了光学组件的变化，不同的光学部件和组合用于限定激发和发光光路。
在一些实施例中，光源组件可各自包括波导，如光纤，以引导激发光束。图8D示意性示出。各光源组件连续地包括，发光二极管，气产生相应的激发光束，和第一透镜针孔，其配置在LED所产生的光的光路中，准直激发光。带通激发滤波器随后提供为后接第二透镜，第二透镜聚焦和耦合经过滤的来自LED激发光到波导120。例如波导可以是500μm的光纤。在每个波导的输出端，微透镜准直激发光。每个波导投射其准直光到样品侧光学透镜，其聚焦并投射光到样品中的激发体积。各激发光以不同的激发波长投射到样品中的相同激发体积。如图8E所示，反射光学器件122用于创建光束光路。
在一些实施例中，空间滤波器可提供在激发光光束28的光路中，以限制行进光束的物理尺寸并降低与杂散光相关的噪声(图1A，元件72，74)。本领域技术人员将容易理解，从LED光源发射的光被发散，发射的光束具有沿其传播轴扩大的横截面。这种效果可以通过将空间滤波器放置在沿光束光路不同位置被限制。
参照图1A和图7A，在一个实施例中，第一空间滤波器72位于来自外部反射元件40的略微上游侧的每个激发光束光路中。例如，第一空间滤波器72可以由其中设置有开口的遮挡板来实施。开口的尺寸可以被选择为使得允许通过第一空间滤波器72的激发光束28的尺寸充分小于该反射元件40的尺寸。遮挡板可基本上吸收和/或基本上非镜面漫射激发光束受阻部分，以减少杂散反射的存在。
第二空间滤波器74可设置在由外部反射元件反射之后的激发光束28的光路中。例如第二空间滤波器74可通过其中设有开口的类似遮挡板来实现。开口的尺寸可被选择为使得允许通过第二空间滤波器74的激发光束28的尺寸充分小于内部反射元件42的该反射表面62(面)的尺寸(参照图4)。遮挡板基本上吸收和/或基本上非镜面漫射激发光束的阻塞部分，以进一步减少杂散反射40的存在。
其他空间滤波元件可以沿着激发束28的光路设置，以提供进一步的滤波和杂散光控制/拒绝。空间滤波器的数量，位置和结构在很大程度上取决于激发源空间分布(例如，充分准直的激光束比高度发散的LED光源需要较少(或没有)空间滤波。也依赖于激发源光谱曲线和应用的S/N要求。例如，具有对应于该探测器的峰值灵敏度的光谱曲线的光源，或与具有小斯托克斯频移荧光团组合使用的光源(其激发和探测光谱频带非常接近)一般将需要更多的空间滤波，以达到良好的性能。
所述的光学探询器件20可包括样品侧光学系统44，引导从内部反射元件42激发的光束28朝向样品22。优选的，样品侧光学系统包括至少一个会聚透镜46，在样品22中相同的位置23上聚焦来自不同光源组件24的激发光束28，从而使激发光经过每个针孔32被投射在或约在样品22的激发平面。优选的，所有的或大部分的激发光束28会聚在样品23的相同区域，或者在用于目标应用的足够小的小体积上。任何数量的其它或附加的光学部件可以提供作为样品侧光学系统44的部分。如本领域技术人员容易理解的，上述结构和其变体提供对激发体积的大小和形状的方便控制。
在样品22的激发体积中，如果该光束的光谱成分与荧光团的激发光谱曲线至少重叠，则给定的荧光团将吸收从其中一个激发光束28的光。然后，它会根据荧光曲线发射荧光48。荧光通常是从散料液以各向同性的方式发出，并因此至少一些荧光48将朝向所述探询器件20被发射回，并由聚光透镜46收集。从该方向上聚光透镜46准直收集光，使其作为准直的或接近准直的光束在向后的方向通过所述探询器件20传播。
一般地，构造并设置上述器件20的部件，以便尽可能不阻塞向后方传播的荧光48。荧光48的至少一部分向后传输穿过器件到达探测平面50，这是在光被收集用于探测的位置。在所示实施例中，探测平面50在光源组件24的平面的后面延伸。优选地，输出光谱滤波器52布置在探测平面50前的荧光48光路中。输出光谱滤波器不包括不希望的光谱成分，如那些来自激发光束28的。以这种方式，引向探测平面50的激发光束28的寄生反射或散射将被过滤掉，从而减少噪声和/或背景信号。输出滤波器可以是干涉，衍射或基于吸收的，和/或例如可通过在其上施加的材料涂层提供特定波长的透射率的玻璃盘或长方形状的基板来实施。
可提供探测器侧光学系统54，其输出用于探测的过滤荧光48。例如，探测器侧光学系统54可包括输出透镜55以向探测平面50会聚荧光48。可以另外地或替代地设置其他光学部件。例如，输出空间滤波器76可提供在荧光光路中，例如邻近所述探测平面50。例如输出空间滤波器76可通过提供具有适当尺寸的开口的遮挡板来实施，例如等于或小于在样品22的激发光束足迹的投射图像。有利的是，提供这样的滤波器，可大大减少杂散背景辐射到达探测器的数量，改善了信号-噪声比。在其它变型中，可以使用衍射元件(例如透射光栅或棱镜)，适当的探测器侧光学系统54和空间滤波器76提供光谱和空间滤波的组合，其中空间滤波器由合适尺寸的开口或具有在成象平面限定研究的光谱带的位置和尺寸的波导构成。
图10A至10H示出了发光光束的过滤和发光光线与探测器耦合的不同配置。在一些实施例中，探测器57被设置在探测平面50并直接耦合到探测器侧光学系统54以接收来自其的荧光48。这是图10A中所示的实施例，用于顺序激发/探测方案(一个又一个的波长)单探测器，单(多频带)滤波器。在替代实施例中，荧光48可以由探测平面50和探测器57之间的波导引导，诸如光线。在单探测器配置中，多个滤波器，无论是顺序或并行，可提供在发光光路中。这示于图10B，其中多个滤波器用于顺序探测方案，单个探测器实施例。还可设想多个探测器配置，如图10C到10F所示。在图10C中，多个探测器与光谱成分的空间分布同时(同时激发/探测方案)使用。在图10D中，多个探测器与使用透射光栅光谱成分的空间分布同时使用。在图10E中，多个探测器与使用折射材料光谱成分的空间分布同时使用，例如prim。在图10F中，多个探测器与使用带通干涉滤波器的光谱成分空间分布同时使用的。
在一个实施例中，测量方法包括基于LED的染料激发和由PMT探测器所发射的荧光的同时探测。为了激发样品中的多种荧光团，多个LED被顺序激活。因为LED发射是宽光谱，利用窄带干扰滤波器允许调节所选的荧光团的吸收特性和多频带发射滤波器的传输特性的发射光谱曲线。可使用单个五频探测滤波器。因为OM配置使用多频带发射滤波器，存在与多于一个荧光团激发(光串扰)相关联的风险。在这种情况下，来自多个荧光的发射将不用光谱选择性来探测。使用位于PMT前面的多频带干涉滤波器，由OM从PCR反应杯收集的发射荧光被光谱过滤，以除去不需要的波长。每个滤波器的传输频带对应于所选择的荧光团的发射光谱。
在图10G和10H所示的一些实施例中，探测滤波器可通过致动探测滤波器来提供。致动滤波器组件可以包括转盘。测量方法仍将涉及通过适当的窄带探测滤波器基于LED的染料激发和由PMT探测器对所发射荧光的探测。后者将被顺序地放置在探测光路。所有信道的激发/探测将被顺序地执行。
本实施例的优点很多：在最好的情况下较少的串扰，激发/探测频带更好的控制，对荧光团更好的控制/滤波器选择，使用染料数量的灵活性。的确，激发/探测信道可以使用常用的荧光团来实现。荧光团可以从单一供应商如Biosearch公司获得。例如，可使用其在485nm处和705nm之间被激发并发射的荧光团(fluorophones)。
本实施例提供了一些缺点，包括较长的探测时间和移动部分，该移动部分经受长时间使用设备后易故障。
示例性实施例
参考图2至5、7和7A中通过示例的方式示出其可以实现上述光学探询器件20的光学组件。优选地，所述光学组件被设计成便于其制造和限制或忽略光学部件的精确对准的必要性。
在这些实施例中，在各种组件中，提供用于光源组件24的支撑结构。支撑结构56可具有一个或多个外围框架元件58，光源组件安装在其上。在示出的元件中外围框架元件通常是盘状的，最好参见图4。该支撑结构还可包括中心柱60，从由外围框架元件58限定的平面垂直伸出。中心柱支持内部反射元件42。在所示的实施例中，从外围框元件58伸出的中心轴60末端加工成限定具有多个定位和定向以重定向如上所述激发光束的小面62的金字塔形。每个小面62可以由反光材料制造和/或涂覆，该反光材料如镍、铝、银、金或它们的组合。
该支撑结构还可以包括多个连接肋64，其连接外围框架元件58和中心轴60。在示出的实施例中，各连接肋64在其周边末端形成壳体66以接收其中之一的光源组件。优选地，连接肋64塑造为围绕中心轴60占据限定的空间，以限定它们之间的一个或多个光通道68，用于允许所述发光光线透过。
该支撑结构或器件的任何结构可进一步包括或调适一个或几个光挡板70(图2)，具有光吸收/光漫射表面和/或几何形状，其目的是为了防止或至少减少超出预期设计的光路的杂散光的透射，镜面反射或散射的重要性。例如这样的挡板可以被制造或被涂覆光吸收/光漫射材料。
此外，任何透射，反射或吸收表面可以如下方式被设计和/或涂覆：它设有特定波长的透射率、反射率和/或吸收以帮助获得期望的激发和探测光谱图，减少了透射、反射和/或散射的散射光的数量，或者实现与系统所需功能相关的任何其他目的。
所述光学组件25可以基于涉及各种类型的反射镜、透镜、棱镜、光导管、挡板和其它光学元件的配置。
图14示出用于图12所示的测试装置的实例光模块的分解图。光模块(OM)及其部件可以分为图14所示的5个子组件。远端管(图14A)包含反射表面，引导LED光进入模块，以及透镜，引导激发光到PCR反应杯，并且收集发射的荧光。PMT管(图14B)包含多波段滤波器和将荧光聚焦到PMT探测器的透镜。LED的光学组件(图14C)还包含引导LED光进入模块的反射表面，以及LED激发滤波器和LED光束调节部件(针孔&微型透镜)。激发滤波器和微型透镜胶合到LED光学组件主体用于结实和稳定的操作。LED印刷电路板(图14D)支撑LED芯片，并提供了光学控制器板上LED驱动器的电接口。最后，该探测器模块(图14E)包括电压输出的PMT和用于与OM的接口的配合板。使用细螺纹螺钉和O形环在接口之间安装所有子组件确保不透光组件。
图15A示出了图14的示例性光学模块的组装图且图15B示出了图14的组装模块的截面图。OM 130安装到仪器132的底板。多亏在毫米范围内的景深，在OM上，在底板上和在微流体保持器上的严格的制造公差，提供了相对于到PMCD反应杯的OM自由取向组件(Χ、Y、Z)。远端管134(在图14A中分解的)，中央管136、PMT管138(在图14B中分解的)、PMT板140、PMT探测器142(在图14E中分解的)、聚光透镜144、LED光学器件146(在图14C中分解的)、LED激发滤波器148、LED光学器件150、LED PCB 152(在图14D中分解的)、五频荧光滤波器154、间隙壁156和平凸透镜158在图15A和15B中示出。
图16是示例性光学模块流程图200。如图16所示，在每个PCR循环202执行光学测量。当进行冷却(退火步骤204)，且温度达到57℃，持续20秒时，所述仪器处理&控制单元(PCU)触发光学控制器并且平行于执行温度循环执行信号采集过程214，它包括到72℃的2秒持续时间的扩展步骤206和到95℃的1秒持续时间的变性步骤208。重复温度循环，直至运行完成210。当运行完成时，PCR结束212。在光学探测处理214中，在每个测量周期的开始提供3秒的PMT稳定时间。在测量过程中LED被顺序激活218。为每个反应杯220获取信号并与向心力致动编码器同步222。该LED关闭224。一旦荧光测量完成226，数据被发送到PCU 228和光学控制器等待下一个触发。在每个PCR循环重复此过程。一旦PCR循环完成后，数据被进一步处理230和分析。结果可以被显示232。
实验结果
实例1
如上所述，根据上述示例性实施例的光学探询器件可用于实时PCR系统，例如通过图12所示的测试装置。
图11A示出通过系统荧光探测旋转盘上的两种染料(FAM和红610染料)所获得的结果。图11B和11C示出了系统使用的校准曲线。该样品含有两种染料。在以800RPM旋转过程中，进行连续的探测。所记录的信号重叠，表示使用致动器与编码器作为同步信号的优点，并在样品内相交激发光束的重叠。FAM染料具有485纳米的激发波长和520nm的探测波长。该LOD3σ是2.3nM且LOQ10σ是7.7nM。红610染料具有560nm的激发波长和607nm的探测波长。该LOD3σ是3.0nM且LOD10σ是10.1nM。
实例2
为具有蓝、绿、红和近红外(NIR)激发信道的光模块和五频探测滤波器获得量化指标(探测限制(LOD)和量化限制(LOQ)的荧光图。
光学控制板(OCB)，包括LED控制器系统和LED功率的电子调节。表1示出用于每个光信道的LED和滤波器以及表2示出了用于该评价的染料。Roithner产品可从Roithner Lasertechnik GmbH公司获得且Semrock产品可从Semrock公司获得。
表1：光学信道配置
表2：染料的选择
对于每一染料，八(8)个DFCD装载有浓度为0～0.2μΜ(0，0.003，0.006，0.012，0.025，0.05,0.1和0.2μΜ)的溶液。在所有信道为DFCD(一次性液体向心器件)测量荧光并获得与染料浓度荧光测量相关的校正曲线。
仅装载PCR矩阵的DFCD(“0μΜ”浓度；lOmM的Tris-HCl pH 8.0，50mM氯化钠，5mM的MgCl2)，用来量化背景噪声和背景噪声的标准偏差，由此评估LOD和LOQ。通过测量其他信道而不是研究信道中的荧光染料(即其他激发波长)评估串扰。
荧光与浓度数据在所有光学信道的所有染料中获得。表3给出的所有光学信道获得的斜率。
表3：为所有信道确定R2、LOD&LOQ的斜率、系数
为所有信道成功获得线性荧光校准曲线。
对于在此实验中使用的光学设计，当染料激发光谱与其他光信道的激发频带重叠时发生串扰，使得难以分离一个特定染料的荧光响应。从上述提出结果，人们可以看到串扰发生在光信道之间。为了量化(并最终补偿)串扰，在每个可获得的激发波长的每个染料需要校准曲线。
表4和表5示出了串扰出现时关联荧光和染料浓度的荧光补偿矩阵。通过计算一个信道中所有染料的斜率与在特定信道的研究染料的斜率的比值获得归一化的补偿矩阵。只有在斜率具有确定系数R2>0.50时才显著考虑串扰。
在具有蓝/绿/红色/NIR信道和FAM/CAL红610染料/Cy5/Alexa 750染料的设置中，光学串扰发生在Cy5染料(R2＝0.94)存在的绿色信道中以及存在Alexa750染料(R2＝0.92)的红色信道中。如表6所示，没有任何其他的染料表现出显著串扰(即R2<0.50)。串扰是5％或更低的所有其他信道/染料的组合。
表4：在蓝、绿、红色和NIR光信道中FAM、红610染料、Cy5和Alexa 750的荧光补偿矩阵(斜率mV/μΜ)
表5：在蓝、绿、红色和NIR光信道中FAM、红610染料、Cy5和Alexa 750的归一化荧光补偿矩阵(％)
表6：在蓝、绿、红色和NIR光信道中FAM、红610染料、Cy5和Alexa 750的测定系数(R2)
实例3
在本实例中描述了相同DFCD内的两个目标的典型多重探测的协议和结果。
DFCD配置用在每3个反应杯中分配和干燥的PCR混合物制备(参照图13A)。表7描述了在跟随样品再悬浮的每个反应杯中最终PCR混合物的组合。
表7每个反应杯中最终PCR混合物的组成。
表8描述引物和探针序列。
表8引物和探针序列
名称 序列
Sag59 TTTCACCAGCTGTATTAGAAGATA
Sag190 GTTCCCTGAACATTATCTTTCAT
cfbSag-T1-A1 CCCAGCAAATGGCTCAAAAGC
ciGBS-T1-F2 TCTCTTGGATCTTGCTCATGCCCC
内部对照由来自枯草芽孢杆菌(基因thyA修饰菌)的纯化基因组DNA组成。枯草芽孢杆菌subsp.subtilis str.168(BGSCID 1A1)的thyA基因已通过同源重组修饰。这个内部对照序列的扩增用相同的引物作为S.agalactiae cfb基因来完成，但使用标记为CalFluorREd 610的不同探针探测。内部对照的浓度已调整到每PCR反应500个基因组份。
DFCD配置装载有1000份阳性控制并且以3000RPM离心分离使样品体积进入反应杯。这个实验使用以下参数进行50PCR扩增循环：在57℃退火20秒；在72℃扩展2秒并在95℃变性1秒钟。在图16所描述的热循环期间进行光学探测。
数据分析
由仪器产生的数据用下面描述的算法脱机处理。不是50个PCR循环被执行，仅在头45个PCR扩增的循环有必要进行数据处理。
来自每个运行的数据记录在文件中，其中包含通过仪器程序测量的旋转速度，温度和荧光。
背景减除
数据分析之前使用线性回归(斜率和y轴截距)从数据集去除背景。这个背景可以由多个现象产生，如猝灭染料的残留荧光，在DFCD透明度和/或散射的差异，来自DFCD材料或试剂的背景荧光，背景噪声，标记的探针降解等。
来自15至25循环的荧光测量用于计算每个样品的背景校正。选择这些数据点，因为它们荧光稳定的足够晚但又足够早使得PCR扩增没有产生尚待探测的足够的目标。图17A示出了不具有(顶部曲线)和具有(底部曲线)背景减除的荧光数据。
Σ曲线拟合(SCF)用于执行阳性样品中目标浓度的相对定量。拐点(最大二阶导数)用来确定极大精度的周期阈值(Ct)。之所以选择这种方法，因为在实验前没有任何Ct阈值被确定。
以下形式的Σ曲线用于拟合荧光数据：
F SCP = a 1 + e - ( c - c 0 / b )
其中FSCF是通过Σ曲线拟合模型计算出的荧光，C是周期，a，b和C0是SCF参数。
最小二乘最佳拟合算法用于确定参数a，b和Co，以便最小化SCF函数与背景减除荧光读数差。每个曲线的相关因子也被计算且对于周期为10～45，一般观察到R2的值大于0.99。图17B显示了Σ曲线拟合(实线)与背景减除的荧光读数(虚线)的典型结果。对于周期为10～45的相关系数R2是0.9986。图17C示出了相同数据集的第二导数。循环阈值是32.54。
得到的结果在图18、19和20中给出。正向对照探针标记为FAM荧光团。荧光信号由蓝色迹线(每个图形中的顶部曲线(多个)表示。每个阱还含有与目标一起扩增的内部对照。内部对照探针标记为CalFluorRed610荧光团。荧光信号由绿色迹线(各图中的底部曲线(多个))表示。图18A和图18B示出了原始数据(减除背景)和曲线拟合井1。图19A和19B示出了原始数据(减除背景)和曲线拟合井2且图20A和20B示出了原始数据(减除背景)和曲线拟合井3。
PCR数据表明，它有可能使用光学探询器件来测量，实时在PCR扩增期间由两个不同的荧光团(不同的激发/发射波长)产生的荧光运行到相同的微流体器件上的3个相邻井中。
容易理解，在不背离本发明的范围的情况下对上述实施例可以作出许多修改。
以上描述的实施例仅旨在示例性。因此，本发明的范围旨在由所附权利要求书限定。

Claims (13)

1.一种探询器件，用于探测由样品中的分析物产生的发光光线，样品中的分析物由多个激发光束激发，各激发光束具有各自光谱成分，所述探询器件包括：
多个光源，每个光源产生所述多个激发光束之一，所述激发光束投射在样品上以激发分析物；
至少一个探测器，用于探测由样品产生的发光光线；以及
光学组件，其为每个激发光束限定从光源到样品上共同激发位置的不同的和固定的激发光路并且为发光限定从样品激发位置到所述至少一个探测器的共用发光光路，所述激发光路径和所述发光光路在所述样品的同一侧，所述光学组件包括样品侧光学系统，其朝向样品投射激发光，并从所述样品收集发光，所述光学组件在所有的所述激发光路和所述共用的发光光路提供所述样品侧光学系统。
2.如权利要求1所述的探询器件，其中所述光学组件进一步包括在所述共用的发光光路中提供的滤波器，其中所述滤波器是固定滤波器和致动滤波器之一，并且其中所述滤波器是单带通滤波器和多带通滤波器之一。
3.如权利要求1和2任一项所述的探询器件，其中所述光学组件被包含在单个外壳中。
4.如权利要求1至3中任一项所述的探询器件，其中所述光学组件包括部件，该部件塑造所述激发光束和所述发光光线至少之一的空间和光谱曲线的至少一个。
5.如权利要求4所述的探询器件，其中所述部件是空间滤波器，其沿相应光路限制给定光束的大小。
6.如权利要求5所述的探询器件，其中所述光谱滤波器具有不含激发光束光谱成分的光谱曲线，并布置在发光光路中。
7.如权利要求1至6中任一项所述的探询器件，其中所述光学组件包括探测器侧光学系统，其输出用于探测的经过滤的发光光线。
8.如权利要求1至7中任一项所述的探询器件，其中所述光源绕主轴圆周地分布，并且其中所述光学组件包括反射镜组件，该反射镜组件包括设置在来自光源激发光束路径中的外部反射元件以向内重定向所述激发光束。
9.如权利要求8所述的探询器件，其中所述反射镜组件包括内部反射元件，以接收来自外部反射元件的激发光束，并向所述样品侧光学系统重定向所述激发光束。
10.如权利要求1至9中任一项所述的探询器件，其中所述光学组件包括波导，以朝所述样品侧光学系统引导所述激发光束。
11.如权利要求1至10中任一项所述的光学探询器件，其中来自所述样品中的分析物的发光光线由至少一种光学现象导致，所述光学现象为荧光、磷光、生物发光、时间分辨发光和偏振荧光之一。
12.一种用于光学测试样品的测试装置，包括：
权利要求1至11中任一项所述的光学探询器件。
13.如权利要求12的测试装置，其中所述测试装置由执行以下之一的系统实现：聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(rtPCR)、等温扩增重组聚合酶扩增(RPA)和其他核酸探测方法。
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