CN109959601B - 基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，包括荧光互相关光谱检测模块、适配体、上转换颗粒以及能量共振转移纳米颗粒。上转换和能量共振转移纳米颗粒修饰在适配体的两端，荧光互相关光谱检测模块激发上转换和能量共振转移纳米颗粒发出辐射谱分离的光，并分别检测这两种光的荧光信号，计算机处理得到两种光的自相关和互相关谱，通过分析自相关和互相关谱精确得到适配体浓度等参数。本发明选取的上转换和能量共振转移纳米颗粒具有大的反斯托克斯位移，便于将信号光与激发光及环境噪声分离开，降低了背景噪声的干扰，同时光谱间隔大的上转换和能量共振转移纳米颗粒使得信道间干扰更小，具有检测精度及结果准确性高的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，尤其是涉及一种基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统。
背景技术
荧光相关谱(Fluorescence Correlation Spectroscopy，以下简称FCS)技术是一种单分子水平的检测技术。FCS技术是通过激发样品上特定区域的荧光，由探测器检测荧光强度变化。荧光分子或者粒子的扩散以及在化学反应会引起荧光强度发生变化。因而将检测到的荧光强度波动信息进行自相关运算可以获取溶液的浓度、粒子的扩散系数等信息。由于FCS技术是通过检测与粒子连接的单一荧光粒子发出的荧光信号，为了能在单分子水平区分不同的粒子，需要粒子和荧光粒子的质量相差4至8倍。在研究分子之间作用时，质量比的要求难以得到满足，限制了FCS的分子反应检测中的应用。
荧光互相关谱(Fluorescence cross-correlation spectroscopy，以下简称FCCS)技术是从FCS衍生出来的一种用于定量研究荧光和生物分子之间的相互作用的单分子检测技术。FCCS直接检测两种或者多种荧光信号，因而检测条件不受限于荧光粒子和研究粒子的质量比要求。相比于FCS，FCCS具有更广泛的应用。同时FCCS还可以与成像技术相连用获取更多的信息。虽然FCCS的检测条件不在受限于荧光粒子和待研究粒子的质量比，但采用了两种及以上的荧光信号作为检测信号而引起的信道间互相干扰产生的影响却不容忽视。
上转换纳米颗粒(Upconversion Nanoparticle，以下简称UCNP)是一种通过将两个或两个以上光子转变成为一个高能光子而发光的纳米粒子。相较于目前常使用的单光子荧光染料，UCNP具有独特的光学性质，使用近红外光代替可见光作为激发光源，从而显著减少自发荧光等背景噪声，提高信噪比，减少光漂白。同时，UCNP具有多个可调控的发射峰。
能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，以下简称FRET)意指发生在两种荧光分子间的能量传递过程。处于受激态的染料分子具有较高的能量，当分子距离很近时，可以通过无辐射的方式将能量传递给处于较低能级的受体分子。因此，FRET体系下的荧光纳米颗粒兼具给体染料分子的吸收和受体染料分子的发射，可以同时结合二者的优点。
聚集诱导发光(Aggregation Induced Emission,AIE)意指一些染料分子在高分子浓度状态下发生荧光增强的现象，相应的分子被称作AIE染料。AIE染料具有许多独特的性质，如斯托克斯位移大，抗光漂白能力强，易制备成荧光纳米颗粒等等。但其仍有些局限性，诸如染料种类较少，荧光波段不够广等。普通的荧光染料随着分子浓度升高，其荧光强度会减弱甚至发生猝灭。因此，普通的荧光染料不能直接制备成纳米颗粒。但是普通的荧光染料具有价格低廉易获取，荧光波段多样等优点。AIE染料和普通的荧光染料可以通过恰当的质量比例，共同包覆在纳米颗粒里，形成FRET荧光纳米颗粒。这种新型的荧光探针具有斯托克斯位移大，抗光漂白能力强，易制备成荧光纳米颗粒和大范围的荧光可调能力等优点。
适配体是一段经过体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，是一种具有高特异性识别的探针。相比于抗体，适配体可以与细胞等进行更高亲和力的结合，同时适配体的制备更加简单，针对的配体更为广泛，稳定性也高。适配体是现代生物医学研究的热点，具有良好的应用前景。检测已制成的适配体各种性质，对于适配体的应用研究有着重要的意义。
发明内容
本发明提出了一种基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，可在单分子水平研究适配体的浓度等性质。
本发明提供了一种基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，包括荧光互相关光谱检测模块、适配体、上转换纳米颗粒、能量共振转移纳米颗粒。
荧光互相关光谱检测模块激发修饰在适配体上的上转换纳米颗粒和能量共振转移纳米颗粒，分别发出辐射谱分离的荧光，并分别检测他们的荧光信号，通过计算荧光信号的自相关和互相关谱，分析自相关和互相关谱得到适配体的浓度、扩散系数等参数。
所述的荧光互相谱检测模块主要由激光器、扩束器、激发光二向色分束器、物镜、聚焦透镜、小孔、辐射光二向色分束器、光电探测器组成。
更进一步具体实施中，所述的上转换纳米颗粒和能量共振转移纳米颗粒分别修饰在适配体两端。
更进一步具体实施中，所述的能量共振转移纳米颗粒由聚集诱导发光染料和普通染料按照一定的质量比包裹在纳米颗粒中，形成可以改变质量比实现荧光可调的能量共振转移荧光纳米颗粒。
更进一步具体实施中，所述的上转换和能量共振转移纳米颗粒吸收谱和辐射谱的间距大，且这两种发光基团的辐射谱相分离。
更进一步具体实施中，所述的荧光互相谱检测模块由激光器、扩束器、激发光二向色分束器、物镜、聚焦透镜、小孔、辐射光二向色分束器、光电探测器以及相关器组成。
更进一步具体实施中，所述的激光器发出的光可以激发上转换纳米颗粒和能量共振转移荧光纳米颗粒发出辐射谱分离的两种光。
更进一步具体实施中，所述的扩束器将点光源扩束为面光源，使得激发光通过二向色分束器反射后均匀地照射在待检测物上，激发荧光。
更进一步具体实施中，所述的激发光二向色分束器，激发光波段的光不能透射过二向色分束器，辐射光的光谱在激发光二向色分束器的透射波段范围内。
更进一步具体实施中，所述的聚焦透镜使得小孔和物镜检测部分互为共轭，滤去背景杂光。
更进一步具体实施中，所述的辐射光二向色分束器，辐射光谱分离的两种光经过二向色分束器后一种被反射，一种被透射，从而实现两种光的分离检测。
本发明的有益效果：本发明选取的上转换和能量共振转移纳米颗粒具有大的反斯托克斯位移，便于将信号光与激发光及环境噪声分离开，降低了背景噪声的干扰，同时光谱间隔大的上转换和能量共振转移纳米颗粒使得信道间干扰更小，具有检测精度及结果准确性高的特点。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步详细的说明，其中：
图1为荧光互相关光谱检测模块系统示意图；
图2为适配体与两种发光基团的连接图；
附图标记说明：
1-激光器2-扩束器3-激发光二向色分束器4-物镜5-样本池6-聚焦透镜7-小孔光阑8-辐射光二向色分束器9-光电探测器A 10-光电探测器B 11-计算机12-包覆层13-AIE染料14-普通染料15-适配体16-UCNP。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详述：
如图1所示，基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统包括：激光器1、扩束器2、激发光二向色分束器3、物镜4、样本池5、聚焦透镜6、小孔光阑7、辐射光二向色分束器8、光电探测器A9、光电探测器B10、计算机11、包覆层12、AIE染料13、普通染料14、适配体15、UCNP16。激光器1发出的光经扩束器2的准直扩束。激发光二向色分束器3将激光反射，经过物镜4照射在样品池上，并激发修饰在适配体15上的能量共振转移荧光纳米颗粒和UCNP 16发出荧光。发出的荧光和在样品表面反射的激发光一同传输至激发光二向色分束器3。激发光二向色分束器3在选定时，选择能量共振转移颗粒和UCNP的辐射光均可透射过而激发光不能透射的二向色分束器。因而激发光被激发光二向色分束器3滤去，两种辐射光从激发光二向色分束器3透射后，由聚焦透镜6聚焦于小孔光阑7平面。小孔光阑7滤去背景光，使得通过小孔后检测到的光的背景噪声降低。二向色分束器二向色分束器8在选定时，选择能量共振转移颗粒和UCNP16两种颗粒发出的辐射光只有一种可以透射过二向色分束器8，另一种光会被反射的二向色分束器。因而通过二向色分束器8后，两种辐射光被分在反射光路和透射光路。UCNP16和能量共振转移荧光纳米颗粒的辐射光分别在反射光路和透射光用光电探测器9、10检测到其荧光信号，计算机11完成相关运算过程，计算两种荧光的相关光谱曲线。计算机对荧光的相关光谱进行自相关和互相关计算拟合，并得到相应的参数信息。
如图2所示，能量共振转移荧光颗粒由AIE染料13和普通染料14按照一定质量比例用包覆层12包裹而成。UCNP16和能量共振转移荧光颗粒通过化学反应修饰在适配体15的两端。两种纳米颗粒均选择吸收谱和辐射谱远远分离的粒子，使得在激发光二向色分束器3更容易实现将激发光滤去。同时，UCNP16和能量共振转移纳米颗粒的辐射谱也需要相隔较开，以便辐射光二向色分束器8实现对两种粒子的辐射光进行分离。
本实施例中给出计算机从荧光相关谱得到适配体参数的分析原理。
FCCS是检测荧光强度的涨落，假定激发光强度是稳定的，那么荧光强度的涨落可被定义为强度I与信号时间平均值<I(t)>的偏离。
δI(t)＝I(t)-<I(t)> (1)
则归一化的自相关函数定义式为：
其中τ表示时间的延迟。在所有荧光强度的涨落来自于激发点的有效体积Veff的情况下，则单分子的自相关函数为：
其中<C>表示在有效体积Veff内的平均浓度，τD表示相关函数的特征延迟时间，r0表示激发光的横向束腰半径，z0表示激发光强度下降到最大值
的纵向距离。因而根据式(3)可知，单个荧光分子的浓度为：
而采用两个发光基团的FCCS系统，自相关和互相关函数式可以写出以下公式：
其中i＝1，2分别对应于两种荧光，Mii＝1,2表示两种荧光分子的扩散系数。因而被标记了两种发光基团的适配体15浓度为：
因此FCCS可以从连接在适配体15上的UCNP16和能量共振转移荧光纳米颗粒的辐射光的自相关和互相关谱，分析得到适配体的浓度信息。此外对荧光信号处理，还能得到适配体15的其他信息。例如，自相关运算得到的衰减曲线形状反映了适配体15的动力学特征等。在本实例中不再一一详细列出。
本发明陈述了基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，将上转换荧光颗粒和能量共振转移荧光颗粒修饰在适配体上，采用双波长荧光互相关谱分析技术减小信道间的干扰，对适配体的浓度等参数进行检测，具有准确性高的特点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，其特征在于：包括荧光互相关光谱检测模块、适配体、上转换纳米颗粒和能量共振转移纳米颗粒；荧光互相关光谱检测模块激发修饰在适配体上的上转换纳米颗粒和能量共振转移纳米颗粒，使得它们分别发出辐射谱分离的荧光，并分别检测他们的荧光信号，通过计算荧光信号的自相关和互相关谱，分析自相关和互相关谱得到适配体参数，包括浓度和扩散系数；
其中上转换纳米颗粒和能量共振转移纳米颗粒分别修饰在适配体两端，两种颗粒的吸收谱和辐射谱的间距大，且这两种发光基团的辐射谱相分离；
所述的能量共振转移纳米颗粒由聚集诱导发光染料和普通染料按照一定的质量比包裹在纳米颗粒中，形成可以改变质量比实现荧光可调的能量共振转移纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，其特征在于：所述的荧光互相关光谱检测模块主要由激光器、扩束器、激发光二向色分束器、物镜、聚焦透镜、小孔、辐射光二向色分束器、光电探测器组成。
3.根据权利要求2所述的基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，其特征在于：所述的激光器发出的光可以激发上转换纳米颗粒和能量共振转移纳米颗粒发出辐射谱分离的两种光。
4.根据权利要求2所述的基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，其特征在于：所述的扩束器将点光源扩束为面光源，使得激发光通过二向色分束器反射后均匀地照射在待检测物上，激发荧光。
5.根据权利要求2所述的基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，其特征在于：所述的激发光二向色分束器激发光波段的光不能透射过激发光二向色分束器，辐射光的光谱在激发光二向色分束器的透射波段范围内。
6.根据权利要求2所述的基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，其特征在于：所述的聚焦透镜使得小孔和物镜检测部分互为共轭，滤去背景杂光。
7.根据权利要求2所述的基于上转换和能量共振转移纳米颗粒的互相关检测系统，其特征在于：所述的辐射光二向色分束器中辐射光谱分离的两种光经过二向色分束器后一种被反射，一种被透射，从而实现两种光的分离检测。
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