CN113189065B - 光学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光学检测设备及光学检测方法,上述光学检测设备包括荧光激发源、出光耦合透镜以及检测单元;检测单元还进一步包括光环行器、光纤布拉格光栅以及荧光探测器;荧光激发源发出的激发光照射到待测样品上形成检测信号,检测信号经出光耦合透镜耦合后由光环行器的第一端口进入光环行器中,并由光环行器的第二端口传输至光纤布拉格光栅,当检测信号在光纤布拉格光栅中符合布拉格条件时,检测信号能够由光纤布拉格光栅反射回光环行器并经由其第三端口射出至荧光探测器中。本发明的光学检测设备可以大幅度提高光信号通量,采用光纤布拉格光栅与光环行器的配合使用,光纤布拉格光栅的反射图谱反射率能达到99%以上,可以提高检测精度。
Description
技术领域
本发明涉及光学检测领域,特别是涉及一种光学检测方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,主要经历由高温变性、低温退火、适温延伸等反应组成的热循环过程,使目标DNA得以成指数倍扩增,其过程包括:目标DNA在高温(约95℃)时变性解离成单链;在低温(55~60℃)下单链DNA与设计的引物对杂交,形成DNA-引物的复合物;在合适的温度(约72℃)下以dNTP为反应原料,靶序列为模板,根据“碱基互补”原则进行延伸,获得新的DNA分子。PCR技术因具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简便和省时等优势,在生物医学基础研究等领域已经得到了广泛的应用。PCR技术自问世以来除了传统PCR技术还经历了实时荧光定量PCR技术以及数字PCR技术三个阶段。第一代PCR技术是一种定性技术,手动式水浴基因扩增,该方法设备简单,成本低,实验时间短,但是人工强度大,操作者易疲劳,另外标准品在移动时暴露在空气中,容易引发污染,影响检测精度,没有自动检测功能。第二代实时荧光定量PCR技术,通过在反应体系中加入荧光染料或荧光探针,当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子)的激发光谱重叠时,供体荧光分子自身的荧光强度衰减,受体荧光分子的荧光强度增强。在每一个反应进行的过程中,通过实时检测并记录每一个时间段,样品的荧光强度。再结合标准曲线得出目标DNA模版的拷贝数。与普通PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术可以利用样本核酸扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。此方法成本较高,是一种相对定量的方法,且对标准品要求较高,因实验不能保证每次反应扩增的效率一样,因此依赖标准曲线的实时荧光定量PCR技术检测精度还无法满足分子生物学定量的要求。第三代数字PCR技术作为一种全新的高效的核酸绝对定量技术,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与qPCR不同的是,数字PCR不依赖于Ct值,因此不受扩增效率影响,扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度(含量),能够将误差控制在5%以内,数字PCR技术可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析,解决了实时荧光PCR技术依赖Ct值无法保证检测精确度的问题,通过成千上万个独立的微单元扩增,结合泊松分布数出阳性微滴的个数,就能够知道目标DNA的拷贝数。
作为PCR技术中的检测方法,传统光学检测方法一般是采用带通滤波片或二向色镜在自由空间里对背景光进行过滤,包括光源、反光镜、聚焦透镜、二向色镜、流式芯片和荧光探测器。光源发出激发光,通过反射镜和二向色镜调整光路,照射在芯片上,微滴被激发光照射激发出荧光信号,荧光信号同激发光被聚焦透镜收集射向荧光探测器,探测器前端放置二向色镜过滤出背景光,荧光信号透过二向色镜被荧光探测器检测。然而传统的光学检测方法中多集成了透镜、反射镜、二向色镜棱镜等各种光学元件光路结构固定且复杂,从而需要额外的辅助结构加以固定,增加了加工难度同时降低了仪器的稳定性;另一方面,在自由空间进行滤波的光学系统为防止背景光的干扰,多是采用斜照射式或共聚焦式的结构,但该类系统对光能损耗较大、集光能力欠佳以及传输效率较差,因此导致荧光检测灵敏度低,要使用光电倍增管或雪崩二极管才能对荧光信号进行检测,提高了成本。
发明内容
基于此,有必要提供一种能够减少光学检测中光能损耗并提高检测精度的光学检测方法。
本发明提供一种光学检测设备,包括荧光激发源、出光耦合透镜以及检测单元;所述检测单元包括光环行器、光纤布拉格光栅以及荧光探测器;
所述荧光激发源发出的激发光用于照射到待测样品上形成检测信号,所述检测信号经所述出光耦合透镜耦合后经过所述光环行器的第一端口进入所述光环行器中,并经过光环行器的第二端口传输至所述光纤布拉格光栅,当所述检测信号在所述光纤布拉格光栅中符合布拉格条件时,所述检测信号能够由所述光纤布拉格光栅反射回所述光环行器并经由其第三端口射出至所述荧光探测器中。
在其中一个实施例中,所述荧光激发源包括光源、光源耦合透镜以及第一传输光纤;
所述光源发出所述激发光,所述激发光经由所述光源耦合透镜耦合后经由所述第一传输光纤照射至所述待测样品上。
在其中一个实施例中,所述光源选自激光光源和/或发光二极管。
在其中一个实施例中,所述出光耦合透镜和所述光源耦合透镜各自独立地选自单透镜或透镜组。
在其中一个实施例中,所述荧光探测器选自光电二极管、雪崩二极管和光电倍增管中的一种。
在其中一个实施例中,还包括第二传输光纤,所述第二传输光纤位于所述出光耦合透镜及所述光环行器之间,经由所述出光耦合透镜耦合的检测信号经由所述第二传输光纤传输至所述光环行器的第一端口。
在其中一个实施例中,所述检测单元有多个,位于后方的所述检测单元中的光环行器的第一端口与前一检测单元中的光纤布拉格光栅的出光侧对应,以用于收集经前一检测单元的光纤布拉格光栅出射的检测信号,不同检测单元的光纤布拉格光栅的周期不同。
进一步地,本发明还提供一种光学检测方法,将待测样品经如上述的光学检测设备进行光学检测;
控制所述荧光激发源发出的激发光照射到所述待测样品上形成检测信号,所述检测信号经所述出光耦合透镜耦合后经过所述光环行器的第一端口传输至所述光环行器中,并经过光环行器的第二端口传输至所述光纤布拉格光栅,当所述检测信号在所述光纤布拉格光栅中符合布拉格条件时,所述检测信号由所述光纤布拉格光栅反射回所述光环行器并经由其第三端口射出至所述荧光探测器中,所述荧光探测器对收集的检测信号进行检测。
在其中一个实施例中,所述待测样品在流式芯片上进行扩增。
在其中一个实施例中,根据所述检测信号中心波长设置所述光纤布拉格光栅的周期。
本发明提供的上述光学检测设备,由荧光激发源发出激发光照射在待测样品,例如含有荧光染料的微滴,激发光以及待测样品发出的荧光信号经由出光耦合透镜耦合后进入检测单元进行检测,可以大幅度提高光信号通量。进一步地,检测单元中采用光纤布拉格光栅与光环行器的配合使用,光纤布拉格光栅的反射图谱反射率能达到99%以上,能较好的保留荧光信号,提高检测精度。
附图说明
图1为光学检测方法的检测设备结构示意图;
图2为光学检测方法中检测单元的光路图;
图3为光学检测方法的检测设备中流式芯片的结构示意图;
图4为光学检测方法中光纤布拉格光栅的反射图谱;
附图标号说明如下:
100:光学检测系统的检测设备,101:荧光激发源,1011:光源,1012:光源耦合透镜,1013:第一传输光纤,102:流式芯片,103:出光耦合透镜,104:第二传输光纤,105:光环行器,1051:光环行器的第一端口,1052:光环行器的第二端口,1053:光环行器的第三端口,106:光纤布拉格光栅,107:荧光探测器。
具体实施方式
本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。当然,它们仅仅为示例,并且目的不在于限制本发明。此外,本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚的目的,其本身不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中,“若干”的含义是至少一个,例如一个,两个等,除非另有明确具体的限定。
需要说明的是,在本发明的描述中,对于方位词,如有术语“中心”、“横向”、“纵向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示方位和位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于叙述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定方位构造和操作,不能理解为限制本发明的具体保护范围。
在描述位置关系时,除非另有规定,否则当一元件例如层、膜或基板被指为在另一膜层“上”时,其能直接在其他膜层上或亦可存在中间膜层。进一步说,当层被指为在另一层“下”时,其可直接在下方,亦可存在一或多个中间层。亦可以理解的是,当层被指为在两层“之间”时,其可为两层之间的唯一层,或亦可存在一或多个中间层。
在使用本文中描述的“包括”、“具有”、和“包含”的情况下,意图在于覆盖不排他的包含,除非使用了明确的限定用语,例如“仅”、“由……组成”等,否则还可以添加另一部件。
除非相反地提及,否则单数形式的术语可以包括复数形式,并不能理解为其数量为一个。
此外,附图并不是以1:1的比例绘制,并且各元件的相对尺寸在附图中仅以示例地绘制,以便于理解本发明,但不一定按照真实比例绘制,附图中的比例不构成对本发明的限制。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
如图1所示,本发明提供一种光学检测设备100,其中包括荧光激发源101、出光耦合透镜103以及检测单元,检测单元包括光环行器105、光纤布拉格光栅106以及荧光探测器107;荧光激发源101发出的激发光用于照射到待测样品上形成检测信号,检测信号经出光耦合透镜103耦合后经过光环行器的第一端口1051进入光环行器105中,并经过光环行器的第二端口1052传输至光纤布拉格光栅106,当检测信号在光纤布拉格光栅中符合布拉格条件时,检测信号能够由光纤布拉格光栅106反射回光环行器并经由其第三端口1053射出至荧光探测器107中。
在一个具体示例中,荧光激发源101包括光源1011、光源耦合透镜1012以及第一传输光纤1013,光源1011发出激发光,激发光经由光源耦合透镜1012耦合后经由第一传输光纤1013照射至待测样品上。
可以理解地,光源1011、光源耦合透镜1012和第一传输光纤1013的端头在同一轴线,可以使光源耦合透镜1012对光源1011的成像位置在第一传输光纤1013的端头处。
在一个具体示例中,光源1011选自激光光源和/或发光二极管。
进一步地,光源耦合透镜1012选自单透镜或透镜组。
具体地,透镜是以两个折射曲面为边界的透明体,通常以光学玻璃为原材料,磨制成形后将折射面抛光而成。可以理解地,两个折射面中可以有一个平面,但两个折射面都是平者不能称为透镜。透镜由于两个表面的折射,具有对束的会聚或发散作用,能在任何要求位置形成物体的像。
可以理解地,耦合透镜103耦合激发光以及激发光照射在待测样品上的荧光信号共同形成检测信号。
在一个具体示例中,耦合透镜103选自单透镜或透镜组。
进一步地,检测单元有多个,位于后方的检测单元中的光环行器的第一端口与前一检测单元中的光纤布拉格光栅的出光侧对应,以用于收集前一检测单元的光纤布拉格光栅出射的检测信号。如图2检测单元的光路图所示,检测信号进入光环行器的第一端口1051由光环行器的第二端口1052传输至光纤布拉格光栅106,经光纤布拉格光栅106的反射光由同一检测单元的光环行器的第三端口1053传输至同一检测单元的荧光探测器107,经光纤布拉格光栅106的但未反射的检测信号传输至下一检测单元中的光环行器的第一端口。
可以理解地,不同检测单元的光纤布拉格光栅的周期不同,可根据实际需要对检测单元个数以及分别对不同检测单元中的光纤布拉格光栅周期进行设置。
在一个具体示例中,上述光学检测设备还包括第二传输光纤104,第二传输光纤104位于出光耦合透镜103及光环行器之间105,经由出光耦合透镜103耦合的检测信号经由第二传输光纤104传输至光环行器的第一端口1051。
在一个具体示例中,荧光探测器107选自光电二极管、雪崩二极管和光电倍增管中的一种。
可以理解地,光电二极管是由一个PN结组成的半导体器件,具有单方向导电特性。光电二极管是在反向电压作用之下工作的,在一般照度的光线照射下,所产生的光电流。如果在外电路上接上负载,负载上就获得了电信号,电信号随着光的变化而相应变化;雪崩二极管是p-n结型的光检测二极管,其中利用了载流子的雪崩倍增效应来放大光电信号以提高检测的灵敏度。雪崩二极管在工作时加较大的反向偏压,使得其达到雪崩倍增状态即光电流成倍地激增得状态;光电倍增管是将微弱光信号转换成电信号的真空电子器件。
荧光探测器107优选为光电二极管,在不影响检测结果的情况下还可以进一步降低检测成本。
本发明还提供一种光学检测方法,利用上述上述光学检测设备对待测样品进行检测。
在一个具体示例中,待测样品在流式芯片102上进行扩增。如图3所示为流式芯片102的结构示意图,上述流式芯片102上的待测样品是含有荧光染料的微滴,经荧光激发源101发出的激发光照射后可以产生荧光信号。
在一个具体示例中,流式芯片102的中心、耦合透镜103、第二传输光纤104的端头和第一个检测单元的光环行器的第一端口1051在同一轴线,可以使出光耦合透镜103对检测信号的成像位置在第二传输光纤104的端头处传输至检测单元。
进一步地,光纤布拉格光栅106的反射光中心波长取决于光栅周期和光纤的有效折射率,根据荧光信号中心波长,设置不同周期的布拉格光栅可以对所需的荧光信号进行反射。
本发明还进一步提供上述光学检测方法具体为由光源1011发出光由光源耦合透镜1012耦合为激发光经由第一传输光纤1013的端头传导后照射在流式芯片102中心含有荧光染料的微滴上,微滴受激发光照射辐射出多种荧光信号,荧光信号和激发光形成检测信号,检测信号透过流式芯片102,经过耦合透镜103被耦合后经第二传输光纤104进入检测单元的光环行器的第一端口1051,光环行器的第一端口1051入射的光信号从光环行器的第二端口1052传输至光纤布拉格光栅106。经过光纤布拉格光栅106时荧光信号符合布拉格条件由光环行器的第二端口1052被反射回光环行器105中,从光环行器的第三端口1053出去被荧光探测器107检测。光纤布拉格光栅106的反射光中心波长取决于光栅周期和光纤的有效折射率,根据荧光信号中心波长,设置不同周期的布拉格光栅可以对所需的荧光信号进行反射。不满足反射条件的检测信号透过光纤布拉格光栅106进入下一检测单元的光环行器的第一端口1051,可以通过对检测单元数量的限制,直至检测信号的所有所需信号被荧光探测器107检测完成后,由最后一个检测单元的光纤布拉格光栅106的末端射出。
上述光学检测方法由荧光激发源101发出激发光照射在流式芯片102上含有荧光染料的微滴,激发光以及微滴发出的荧光信号形成检测信号经由出光耦合透镜103耦合后进入检测单元进行检测,可以大幅度提高光信号通量,同时使用流式芯片102,可以对此检测方法能对待测样品中的核酸进行绝对定量,不受扩增曲线限制。此外,本发明中检测单元中采用光纤布拉格光栅106与光环行器105的配合使用,光纤布拉格光栅106的反射图谱反射率能达到99%以上,能较好的保留荧光信号,提高检测精度。
进一步地,上述光学检测方法中无论是激发光的传输还是荧光信号与激发光的分离都是在光纤中进行,结构简单,光路灵活可变,空间占用小,受环境光的影响小。此外此检测方法最终获得的保留较好的荧光信号,使用光电二极管就能对其进行检测,降低了成本。
利用本发明提供的光学检测方法可以作为非疾病的诊断和治疗方法的聚合酶链式反应检测方法,检测待测样品的核苷酸数量或检测待测样品的核苷酸含量。
使用本发明中的流式多通道检测方法检测准确,受到环境光干扰小,此外本发明中的流式多通道检测方法的检测设备中各元件也具有较高的集成度以及加工难度低的优势。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种光学检测方法,其特征在于,所述光学检测方法用于聚合酶链式反应检测领域,将待测样品经光学检测设备进行光学检测;所述光学检测设备包括荧光激发源、出光耦合透镜、第二传输光纤以及检测单元;所述检测单元包括光环行器、光纤布拉格光栅以及荧光探测器;
控制所述荧光激发源发出的激发光照射到所述待测样品上形成检测信号,所述检测信号经所述出光耦合透镜耦合后经过所述第二传输光纤传输至所述光环行器的第一端口,并由所述第一端口传输至所述光环行器中,并经过光环行器的第二端口传输至所述光纤布拉格光栅,当所述检测信号在所述光纤布拉格光栅中符合布拉格条件时,所述检测信号由所述光纤布拉格光栅反射回所述光环行器并经由其第三端口射出至所述荧光探测器中,所述荧光探测器对收集的检测信号进行检测;
所述检测单元有多个,位于后方的所述检测单元中的光环行器的第一端口与前一检测单元中的光纤布拉格光栅的出光侧对应,以用于收集经前一检测单元的光纤布拉格光栅透射出的检测信号,不同检测单元的光纤布拉格光栅的周期不同;根据所述检测信号中心波长设置所述光纤布拉格光栅的周期;
所述待测样品为含有荧光染料的微滴,将所述待测样品设置在流式芯片上,经所述荧光激发源发出的激发光照射后产生荧光信号。
2.如权利要求1所述的光学检测方法,其特征在于,所述荧光激发源包括光源、光源耦合透镜以及第一传输光纤;
所述光源发出所述激发光,所述激发光经由所述光源耦合透镜耦合后经由所述第一传输光纤照射至所述待测样品上。
3.如权利要求2所述的光学检测方法,其特征在于,所述光源选自激光光源和/或发光二极管。
4.如权利要求2所述的光学检测方法,其特征在于,所述出光耦合透镜和所述光源耦合透镜各自独立地选自单透镜或透镜组。
5.如权利要求2所述的光学检测方法,其特征在于,所述光源、所述光源耦合透镜和所述第一传输光纤的端头在同一轴线,以使所述光源耦合透镜对所述光源的成像位置在所述第一传输光纤的端头处。
6.如权利要求1所述的光学检测方法,其特征在于,所述荧光探测器选自光电二极管、雪崩二极管和光电倍增管中的一种。
7.如权利要求1~5任一项所述的光学检测方法,其特征在于,所述待测样品在流式芯片上进行扩增。
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