JP4174003B2

JP4174003B2 - 分光学的識別定量システム

Info

Publication number: JP4174003B2
Application number: JP2003092307A
Authority: JP
Inventors: 憲明木村; 恭二土井; 孝佳弓井; 卓史吉田
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2023-03-28
Also published as: JP2004301561A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プランクトンや細菌などの微生物の繁殖状態などを調べるのに好適な分光学的識別定量システムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、微生物やタンパク質の中で蛍光を発するものを観測する場合には、当該微生物やタンパク質のサンプルを蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダを用いて測定する方法が取られていた。この観測方法では、当然のことながら、少量のサンプルしか測定できず、広範囲な測定を行うということができなかった。したがって、前記従来の観測方法では、例えば植物プランクトンなどのように種類によって生活の場や繁殖の時期が異なり、かつ、広い海中に分布するような微生物について種類及び量を観測することは、非常に困難で多大な労力を必要としていた。また、上述した従来の観測方法では、繁殖の様子や時間的経過をとらえることが困難である。
【０００３】
このような不都合を解消するために、従来、例えば植物プランクトン濃度の定量方法が提案された（例えば、特許文献１参照）。この植物プランクトン濃度の定量方法は次のようにしている。まず、人工海水等の移送液をポンプでインジェクタに圧送し、その圧力を用いてインジェクタで海水試料を吸い込み、その移送液と海水試料の混合液を混合器に送り込む。また、発光試薬をポンプで混合器に送り込む。前記混合器で移送液と海水試料と発光試薬とが混合されて、暗箱内に設置されたフローセルに送られる。暗箱内には、フローセルと光電子倍増管とが設けられており、フローセル中を流れる移送液と海水試料と発光試薬との混合液が発生する化学発光を前記光電子倍増管で検出して記録するものである。この植物プランクトン濃度の定量方法によれば、時間的な測定ができ、かつ、多量の海水の観測が可能になる。
【０００４】
一方、生きた細胞（生細胞）および死んだ細胞（死細胞）と結合して励起光により蛍光を放射する物質と、死細胞とのみ結合して励起光により異なる波長の蛍光を放射する物質との混合溶液を試料に加え、生細胞と死細胞とを同時に観察することが提案されている（特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１１−７５８９３号公報
【特許文献２】
特開２００１−２８６２９６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献１に記載された従来の植物プランクトン濃度の定量方法によれば、大量の海水試料を観測できる利点はあるものの、いまだ自然に近い状態でプランクトンの種類及び量を正確に測定することができないという不都合があった。このため、繁殖の状態など、他の微生物との競合関係などを観察することができない。
【０００７】
また、特許文献２に記載の生細胞と死細胞とを同時に観察する方法は、細胞または微生物を付着させた小さなプレートまたは少量の試料を使用して観察するようになっており、実際の繁殖の様子や時間的経過を観察することができない。また、特許文献２においては、生細胞と死細胞とを観察する場合に、フィルタを交換するようにしており、迅速な観察を行なうことができない。
本発明は、上述した従来技術の欠点を解消し、微生物の繁殖の様子などを観察できるようにすることを目的としている。
【０００８】
【課題を解決しようとする手段】
上記目的を達成するために、本発明に係る分光学的識別定量システムは、波長可変または波長の異なるレーザ光を放射する励起光光源と、前記レーザ光を拡散し、フラットトップビームにして試料計測面に一様な強度の光を照射する光学系と、前記試料から放射された蛍光を複数の波長帯域に分ける分光部と、前記各波長帯域に対応して複数設けられ、受光量に応じた電気信号を出力する光検出部と、前記光検出部は各々マトリックス状に配列して前記試料計測面の座標に対応した検出信号を出力可能としたマイクロキャピラリーを有してなり、前記各光検出部の出力信号に基づいて、対応する前記各波長帯域の蛍光を放射した前記試料中に含まれる微生物または細胞の位置を特定して分布状態を出力可能とするとともに、前記試料計測面からの蛍光を複数の波長帯域に分けて同時に出力可能としたデータ処理手段と、を有することを特徴としている。
【０００９】
参考的には、レーザ光を放射する励起光光源と、前記レーザ光を拡散し、フラットトップビームにして試料計測面に一様な強度の光を照射する光学系と、前記試料から放射された蛍光を波長分散する分光部と、この分光部が波長分散した前記蛍光の複数の波長帯域のそれぞれに対応して複数設けられ、受光量に応じた電気信号を出力する光検出部と、前記光検出部は各々マトリックス状に配列して前記試料計測面の座標に対応した検出信号を出力可能としたマイクロキャピラリーを有してなり、前記各光検出部の出力信号に基づいて、対応する前記各波長帯域の蛍光を放射した前記試料中に含まれる微生物または細胞の位置を特定して分布状態の出力を可能としたデータ処理手段と、を有する構成も考えられる。
【００１０】
このようになっている本発明は、広い範囲に励起光であるレーザ光を照射することができ、シャーレや水槽などの大きな容器内の試料を観察することができる。したがって、自然に近い状態で微生物の繁殖の様子などを容易に観察することができる。しかも、複数の波長帯域において同時に観察できるため、微生物の繁殖や生死の推移などを容易、正確に観察することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に係る分光学的識別定量システムの好ましい実施の形態を、添付図面に従って詳細に説明する。
図１は、本発明の第１実施の形態に係る分光学的識別定量システムの概略を示すブロック図である。この図１において、本発明に係る分光学的識別定量システム２は、計測すべき微生物であるプランクトンの存在する計測面Ｓに試薬を投入し、計測面Ｓのどの部分も均一の強度としたパルスレーザ光を照射し、前記計測面Ｓからプランクトンの状態に応じて発する蛍光を取り込み、広範囲に観測できる装置としたものである。試薬は、プランクトンと結合し、励起光によって蛍光を放射する物質からなっている。本発明に係る分光学的識別定量システム２の具体的構成例は次のとおりである。
【００１２】
すなわち、実施形態に係る分光学的識別定量システム２は、大別すると、パルスレーザ光を発するレーザ光源（励起光光源）４と、レーザ光源４が放射したパルスレーザ光を拡散するとともに、フラットトップビームにする第１の光学系６を有する。第１の光学系６は、フラットトップビームからなる励起光を広範囲な計測面Ｓに照射する。また、分光学的識別定量システム２は、計測面Ｓにおいて試料から放射される蛍光を集光して平行光にする第２の光学系８と、第２の光学系８からの光を分光する分光部１４と、分光部１４からの光を電気的な検出信号に変換して所定の検出データにする光検出手段１０と、光検出手段１０からの検出データを取り込み所定の処理するデータ処理手段１２とを備えている。
【００１３】
前記第１の光学系６は、光学レンズとディフューザ（拡散板）との組合せからなり、レーザ光源４の出力した強度分布がガウス分布をなすレーザ光を、広範囲な計測面Ｓに対して一様な強度の光（フラットトップビーム）にして計測面Ｓに照射できるものである。なお、計測面Ｓは、適宜の大きさのシャーレや水槽などによって形成される。
【００１４】
前記第２の光学系８は、広範囲な計測面Ｓからの蛍光を集光する光学系凸レンズ、凹レンズの組合せからなり、広範囲な計測面Ｓにおいて試料が発する蛍光を集光して平行光にして分光部１４に供給できるような光学系である。
【００１５】
第１実施形態の分光部１４は、図２のようになっていて、第２の光学系８から入射した蛍光を複数の波長帯域に分けるようにしてある。すなわち、分光部１４は、実施形態の場合、第２の光学系８からの蛍光を３つの波長帯域に分けるようになっていて、例えば波長が６００ｎｍ以上の光を反射し、６００ｎｍ以下の光を透過するダイクロイックフィルタからなる第１フィルタ１４ａと、第１フィルタ１４ａの後方側に配置され、例えば波長が５００ｎｍ以上の光を反射し、５００ｎｍ以下の光を透過するダイクロイックフィルタからなる第２フィルタ１４ａと、第２フィルタ１４ｂの後方側に配置されて第２フィルタ１４ｂを透過した光を反射する反射鏡１４ｃとから構成してある。
【００１６】
前記光検出手段１０は、分光部１４からの蛍光を電気信号に変換する光電気変換手段１６と、前記光電気変換手段１６からの電気信号を読み取り所定の検出データにするデータ読取部１８とから構成されている。光電気変換手段１６は、分光部１４が分けた３つの波長帯域に対応して光検出部である光電変換部１７（１７ａ〜１７ｃ）を備えている。また、データ読取部１８は、各光電変換部１７に対応してデータ読取回路２１（２１ａ〜２１ｃ）を有している。なお、分光部１４の反射鏡１４ｃを設けずに、第２フィルタ１４ｂを透過した光を直接光電変換部１７ｃに入射させるようにしてもよい。
【００１７】
光電気変換手段１６を構成している各光電変換部１７ａ〜１７ｃは、同じように構成してあって、第１フィルタ１４ａ、第２フィルタ１４ｂ、反射鏡１４ｃによって反射された蛍光が入射し、入射した蛍光を電子（光電子）に変換する光電変換面と、この光電変換面に対面して設けた電子を増幅する複数の光電子増倍管(Photomultiplier Tube 以下「ＰＭＴ」という)１９、………とを有する。複数のＰＭＴ１９は、平面状（マトリックス状）に整然と並べてある。
【００１８】
すなわち、各光電変換部１７は、図３に示したようになっていて、真空容器３１の前面に光電変換面３３を有する。また、光電変換部１７は、光電変換面３３に対面させたマイクロチャンネルプレート３５と、検出モジュール３７とがこの順で配設してある。そして、光電変換部１７は、光電変換面３３とマイクロチャンネルプレート３５と検出モジュール３７とが相互に密接するように配置してある。マイクロチャンネルプレート３５は、多数のＰＭＴ（マイクロキャピラリー）１９がマトリックス状に配列してある。
【００１９】
すなわち、光電変換部１７は、真空容器３１を有し真空容器３１の前面に光電変換面３３を備えている。光電変換面３３は、蛍光である光子ｐの入射によって電子ｅを放出する。そして、光電変換部１７は、光電変換面３３に対向配置されて光電変換面３３が放出した電子ｅを増幅するマイクロチャンネルプレート３５と、前記マイクロチャンネルプレート３５を構成しているＰＭＴ（マイクロキャピラリー）１９に対応して設けられ、ＰＭＴ１９で増幅された電子εが入射する検出電極が複数設けられてなる検出モジュール３７とを有する。この検出モジュール３７は、動作制御部３９に接続してあって、動作制御部３９によって駆動され、データ読取部１８を構成しているデータ読取回路２１に検出信号を出力する。データ読取回路２１は、動作制御部３９が出力する駆動制御信号に同期して検出モジュール３７の出力信号を読み込み、検出データとして出力する。
【００２０】
図４は、検出モジュール３７の一例を示す説明図である。検出モジュール３７は、図４に示すように、マイクロチャンネルプレート３５のＰＭＴ（マイクロキャピラリー）１９の出力側に対面してｎ個×ｎ個マトリックス状に設けた検出電極５１、５１、………を有している。
【００２１】
さらに説明すると、検出モジュール３７は、ＭＯＳトランジスタからなる複数の検出トランジスタ５３（５３_ij）と、ＭＯＳトランジスタからなる複数の読み出しトランジスタ５５（５５ａ、５５ｂ、……… ）とを備えている。検出トランジスタ５３_ij（ｉ＝１、２、３、………ｎ、ｊ＝１、２、３、………ｎ）は、マイクロチャンネルプレート３５を構成しているＰＭＴ１９に対応してｎ×ｎ個がマトリックス状に配置してある。また、読み出しトランジスタ５５は、マトリックス状に配置した検出トランジスタ５３の各列に対応してｎ個設けてある。
【００２２】
検出トランジスタ５３は、各行ごとにゲートがゲート制御線６３（６３ａ、６３ｂ、………）に接続され、これらのゲート制御線６３が動作制御部３９を構成しているスイッチング用集積回路６５のゲート切替回路６７に接続してある。また、検出トランジスタ５３は、ドレインが各列ごとにデータ線６９（６９ａ、６９ｂ、………）を介して読み出しトランジスタ５５のソースに接続してある。そして、各読み出しトランジスタ５５は、ドレインがデータ読取回路２１に接続してあり、それぞれのゲートが対応する読み出し線７１（７１ａ、７１ｂ、………）に接続してある。また、各検出トランジスタ５３のソースには、ＰＭＴ１９の出力側に対面して設けた検出電極５１が接続してある。
【００２３】
各読み出し線７１は、集積回路６５を構成している読み出し線切替回路７５に接続してある。動作制御部３９を構成している集積回路６５は、ゲート切替回路６７、読み出し線切替回路７５、切替制御部７７などから構成してある。そして、切替制御部７７は、２値直交変調パターン（直交変調パターン）に基づいて切替制御信号を生成し、この切替制御信号をゲート切替回路６７と読み出し線切替回路７５とに与え、各検出トランジスタ５３を直交変調パターンに基づいて切替動作させるようになっている。実施形態の場合、この切替え動作は、直交変調パターンであるアダマール行列を構成する変調パターンによって切替えるようにしてある。なお、アダマール行列に基づく変調、復調については、本願出願人の出願に係る特開２００３−４６３６号公報に詳しく説明されている。
【００２４】
データ読取部１８を構成しているデータ読取回路２１は、各検出トランジスタ５３の出力する電流信号を取り込み、これを電圧に変換して出力する。そして、各データ読取回路２１は、実施形態の場合、各光電変換部１７を構成している各ＰＭＴ１９の出力を、アダマール行列を構成する直交変調パターンを利用する手法で読み取り、それらを信号処理して検出データとして出力できる信号処理が可能な回路である。なお、前記各ＰＭＴ１９は、計測面Ｓの直交するｘ軸、ｙ軸に対応させて整然と配置されており、計測面Ｓのｘ座標、ｙ座標に対応した検出信号を出力するようになっている。もちろん、各検出トランジスタ５３の出力を１つずつ順次読み出すようにしてもよい。
【００２５】
前記データ処理手段１２は、例えばコンピュータシステムで構成すればよく、前記データ読取部１８からの検出データを当該コンピュータシステムに読み込んで、コンピュータシステムで実行する解析プログラムによって解析し、その解析結果を表示するように構成したものである。このコンピュータシステムは、図示しないが、各種入出力インターフェースを備えかつ各種の演算処理を実行するコンピュータ本体と、前記コンピュータ本体に必要な指令やデータを入力する入力装置（例えば、キーボード、マウスなど）と、コンピュータ本体で処理した結果等を表示したり、ハードコピーを取る出力装置（表示装置、プリンタなど）とから構成されている。
【００２６】
前記コンピュータ本体は、各種の演算処理や解析処理を実行する中央処理部と、オペレーティングシステムと解析プログラムを記憶するメインメモリと、マウス・キーボード・プリンタが接続される入力出力ポートと、前記データ読取部１８からのデータを読み取るためのインターフェースと、オペレーティングシステムと解析プログラムと各種定数と、その他必要なデータベースを格納するハードディスク装置と、その他の機器と、これらを接続するバスラインとが内蔵されている。そして、データ処理手段１２は、各データ読取回路２１の出力信号をアダマール逆変換してマイクロチャンネルプレート３５の電子ｅが入射した位置、すなわち計測面Ｓの蛍光が放射された位置と、その蛍光を放射した微生物の数を予め与えられているデータと比較して求める。
【００２７】
このような第１実施形態に係る分光学的識別定量システム２の作用について、図１ないし４に基づいて、図５を参照して簡単に説明する。ここで、図５は、分光学的識別定量システム２によって解析したある時刻における計測データの模式図である。この図５においては、横軸に計測面Ｓのｘ軸を、縦軸に計測面Ｓのｙ軸を、それぞれとったものである。
【００２８】
まず、計測面Ｓを構成している容器（例えばシャーレや水槽）中の試料に試薬（蛍光物質）を投入する。この試薬（蛍光物質）は、例えば蛍光物質ＤＡＰＩ（4′6 Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride）とＰＩ（Propidium Iodide）との混合溶液であって、これらの試薬によって試料中に存在するプランクトンなどの微生物を二重染色する。これらの試薬は、微生物（細胞の核）と結合することにより、励起光に励起されて蛍光を発するようになる。実施形態の場合、分光学的識別定量システム２では、前述した２種類の試薬（蛍光物質）を使用しており、試薬（蛍光物質）を計測面Ｓに投入後、１分経過すると、計測が可能になる。なお、ＤＡＰＩは、細胞の核と結合すると、波長３９７ｎｍ以下の紫外線によって励起され、波長４６０ｎｍの青色の蛍光を放射する。また、ＰＩは、波長４６８ｎｍに励起のピーク値をもち、波長６１０〜６２０ｎｍの赤色の蛍光を放射する。
【００２９】
そこで、レーザ光源４からパルスレーザ光を第１の光学系６に入射する。なお、レーザ光源４は、実施形態の場合、波長可変の色素レーザ光源を用いている。これは、例えば生細胞と死細胞とを同時に観察する場合、上記のように励起波長の異なる２種類の蛍光物質を使用する必要がある。したがって、レーザ光源４から放射するレーザ光の波長を、使用する蛍光物質の励起光に合わせて切り替えることにより、２種類の蛍光物質を励起することが可能となり、生細胞と死細胞とを同時に観察することができる。なお、出力（放射）波長の異なる複数のレーザ光源を用意し、これらを同時にまたは交互に駆動するようにしてもよい。
【００３０】
第１の光学系６は、入射したレーザ光を計測面Ｓのどの面でも均一の強さのフラットトップビームにして計測面Ｓに照射する。すると、生菌体（あるいは生きているプランクトン）は青い蛍光を発し、死菌体（あるいは死滅しているプランクトン）は赤い蛍光を発する。
【００３１】
これらの蛍光は、第２の光学系８が集光して平行光にして分光部１４に入射する。分光部１４は、第１フィルタ１４ａが赤色の蛍光を反射し、光電気変換手段１６の光電変換部１７ａに入射する。また、青色の蛍光は、第１フィルタ１４ａ、第２フィルタ１４ｂを透過し、反射鏡１４ｃによって反射され、光電気変換手段１６の光電変換部１７ｃに入射する。各光電変換部１７ａ、１７ｃは、図３に示したように、蛍光（光子ｐ）が入射すると、光電変換面３３が光子ｐを電子ｅに変換する。電子ｅは、マイクロチャンネルプレート３５のＰＭＴ１９に入射する。ＰＭＴ１９は、電子ｅを増幅して増幅された電子εを検出モジュール３７の検出電極５１に入射する。検出モジュール３７を構成している検出トランジスタ５３は、検出電極５１に増幅された電子εが入射すると、検出信号を出力する。各検出トランジスタ５３の出力信号は、アダマール変調されてデータ読取回路２１に読み取られ、検出データとしてデータ処理手段１２に入力される。
【００３２】
データ処理手段１２は、予め与えられているプログラムにしたがって、検出データをアダマール逆変換して検出信号を出力した検出トランジスタ５３、すなわちマイクロチャンネルプレート３５を構成しているＰＭＴ１９の位置を求める。これにより、計測面Ｓの蛍光を発している位置を特定することができる。すなわち、プランクトンなどの微生物が存在している位置を得ることができる。
【００３３】
また、データ処理手段１２は、検出トランジスタ５３の出力した検出信号の数、すなわちＰＭＴ１９に入射した電子ｅの数を、予め与えられているデータと比較し、赤色の蛍光を放射した死滅した菌体（あるいは死滅したプランクトン）の数や濃度と、生菌体（あるいは生きているプランクトン）の数や濃度とを演算して求める。蛍光の強さと微生物の数とは相関関係にあることが知られており、予めこの関係を求めておくことにより、微生物の数を容易に求めることができる。そして、データ処理手段１２は、例えば生菌体（あるいは生きているプランクトン）の分布状態などを、図５のように示したように、図示しない表示装置に表示する。図５は、ある時刻の解析結果を表示装置に表示させた模式図である。この図５において、蛍光強度（計測データのカウント数）が大きいほど、色が濃く表示されることになる。なお、データ処理手段１２は、解析プログラムの処理により、時々刻々と変化する試料中に含まれる菌体（あるいはプランクトン）の状態をある時間内で表示させることができる。また、データ処理装置１２は、生菌体と死菌体とのいずれか一方または双方の数や濃度を異なった色によって表示可能であり、波長の異なる蛍光体を使用することにより、複数種類のプランクトンなどの微生物の表示が可能である。
【００３４】
以上説明したように本発明に係る分光学的識別定量システム２によれば、ある時間内で状態を知ることが可能で、かつ、広範囲な計測面Ｓにおけるプランクトンの種類（生死）とその具体量を定量的に観測することができる利点がある。しかも、レーザ光を広い範囲にわたって照射することができるため、大きな容器内の微生物を観察することが可能となる。このため、自然に近い状態の観察が可能で、プランクトンなどの繁殖状態や他の微生物との競合関係などを容易、確実に観察することができる。また、実施形態においては、計測面Ｓからの蛍光を複数の波長帯域に分けて同時に検出するようにしているため、繁殖の状態、生死の時間的経過を容易に観察することができる。
【００３５】
なお、上述した第１の実施の形態では、菌体（あるいはプランクトン）を観測するために上述した試薬（蛍光物質）を使用したが、例えば珪藻類をはじめとする微細藻類が含有するクロロフィル由来の蛍光を利用する場合には、生きている珪藻類をはじめとする微細藻類は赤色の蛍光を放射させ、死滅している珪藻類をはじめとする微細藻類は黄色の蛍光を放射させる試薬（蛍光物質）(TO-PRO-1 iodide)を用いることもできる。また、上記実施形態においては、微生物の検出について説明したが、細胞の検出などにも適用することができる。
【００３８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、広い範囲にレーザ光を照射することができ、シャーレや水槽などの大きな容器内の試料を観察することができるため、自然に近い状態で微生物の繁殖の様子などを容易に観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る分光学的識別定量システムの概略を示すブロック図である。
【図２】第１実施の形態に係る分光部の詳細説明図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る光電変換部の詳細説明図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る検出モジュールの詳細図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る分光学的識別定量システムによる計測データの模式図である。
【符号の説明】
２………分光学的識別定量システム、４………励起光光源（レーザ光源）、６………第１の光学系、８………第２の光学系、１０………光検出手段、１２………データ処理手段、１４………分光部、１６………光電気変換手段、１７ａ〜１７ｅ………光検出部（光電変換部）、１８………データ読取部、１９………電子増倍管、２１ａ〜２１ｅ………データ読取回路。

Claims

波長可変または波長の異なるレーザ光を放射する励起光光源と、
前記レーザ光を拡散し、フラットトップビームにして試料計測面に一様な強度の光を照射する光学系と、
前記試料から放射された蛍光を複数の波長帯域に分ける分光部と、
前記各波長帯域に対応して複数設けられ、受光量に応じた電気信号を出力する光検出部と、
前記光検出部は各々マトリックス状に配列して前記試料計測面の座標に対応した検出信号を出力可能としたマイクロキャピラリーを有してなり、
前記各光検出部の出力信号に基づいて、対応する前記各波長帯域の蛍光を放射した前記試料中に含まれる微生物または細胞の位置を特定して分布状態を出力可能とするとともに、前記試料計測面からの蛍光を複数の波長帯域に分けて同時に出力可能としたデータ処理手段と、
を有することを特徴とする分光学的識別定量システム。